Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів

Впроваджено молекулярні системи визначення генетичного поліморфізму для 100 сортів озимої пшениці: проведено скринінг наявності цінних алелів на основі полімеразних ланцюгових реакцій; з’ясовано рівень поширення алелів низької та середньої активності поліфенолоксидазних ферментів та проведено валід...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2016
Автори:	Моргун, Б.В., Степаненко, А.І., Степаненко, О.В., Банникова, М.О., Голубенко, А.В., Нітовська, І.О., Майстров, П.Д., Гродзинський, Д.М.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України 2016
Назва видання:	Наука та інновації
Теми:	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/116879
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів / Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко, М.О. Банникова, А.В. Голубенко, І.О. Нітовська, П.Д. Майстров, Д.М. Гродзинський // Наука та інновації. — 2016. — Т. 12, № 2. — С. 40—56. — Бібліогр.: 56 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-116879
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1168792017-05-18T03:02:39Z Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів Моргун, Б.В. Степаненко, А.І. Степаненко, О.В. Банникова, М.О. Голубенко, А.В. Нітовська, І.О. Майстров, П.Д. Гродзинський, Д.М. Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України Впроваджено молекулярні системи визначення генетичного поліморфізму для 100 сортів озимої пшениці: проведено скринінг наявності цінних алелів на основі полімеразних ланцюгових реакцій; з’ясовано рівень поширення алелів низької та середньої активності поліфенолоксидазних ферментів та проведено валідування. Виявлено сорти пшениці з житніми транслокаціями 1AL.1RS, 1BL.1RS, рецесивним алелем гена Tamyb10, геном стійкості до септоріозу Stb4, зчепленим з поліморфним локусом Xgwm111. Визначено сорт ваксі-пшениці та сорти-носії нетипового функціонального алелю Wx-B1е. Складено характеристику 100 елітних та перспективних сортів пшениці за наявністю цінних алелів генів, які детермінують якісні ознаки зерна (гени PPO, Tamyb10-A1, Wx) та стійкість до біотичних та абіотичних стресових факторів (житній транслокативний матеріал, Tamyb10-A1, Stb4). Внедрены молекулярные системы определения генетического полиморфизма для 100 сортов озимой пшеницы: проведен скрининг наличия ценных аллелей, на основе полимеразных цепных реакций; установлен уровень распространения аллелей низкой и средней активности полифенолоксидазных ферментов и проведена валидация. Определены сорта пшеницы с ржаными транслокациями 1AL.1RS, 1BL.1RS, рецессивным аллелем гена Tamyb10, геном устойчивости к септориозу Stb4, сцепленным с полиморфным локусом Xgwm111. Выявлен сорт вакси-пшеницы и сорта-носители нетипичного функционального аллеля Wx-B1е. Составлена характеристика 100 элитных и перспективных сортов пшеницы по наличию ценных аллелей генов, детерминирующих качественные признаки зерна (гены PPO, Tamyb10-A1, Wx) и устойчивость к биотическим и абиотическим стрессовым факторам (ржаной транслокационный материал, Tamyb10-A1, Stb4). The molecular genetic polymorphism detection systems to screen the presence of alleles in winter wheat 100 varieties were developed. Polymerase chain reactions were deployed to identify relevant genes. The level of allele prevalence of low and medium activity of polyphenol oxidase enzymes was defined and the validation was carried out. Wheat varieties carrying rye 1AL.1RS, 1BL.1RS translocations were characterized and those containing recessive allele of Tamyb10 gene, with Stb4 gene resistance to Septoria linked to polymorphic locus Xgwm111. Waxy wheat variety was discovered and other varieties carrying atypical functional Wx-B1e allele. Characteristics of 100 elite and perspective varieties of wheat were compiled for the presence of alleles of genes determining grain quality (genes PPO, Tamyb10- A1, Wx), resistance to biotic and abiotic stress (rye translocative material, Tamyb10-A1, Stb4). 2016 Article Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів / Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко, М.О. Банникова, А.В. Голубенко, І.О. Нітовська, П.Д. Майстров, Д.М. Гродзинський // Наука та інновації. — 2016. — Т. 12, № 2. — С. 40—56. — Бібліогр.: 56 назв. — укр. 1815-2066 DOI: doi.org/10.15407/scin12.02.040 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/116879 uk Наука та інновації Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
spellingShingle	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України Моргун, Б.В. Степаненко, А.І. Степаненко, О.В. Банникова, М.О. Голубенко, А.В. Нітовська, І.О. Майстров, П.Д. Гродзинський, Д.М. Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів Наука та інновації
description	Впроваджено молекулярні системи визначення генетичного поліморфізму для 100 сортів озимої пшениці: проведено скринінг наявності цінних алелів на основі полімеразних ланцюгових реакцій; з’ясовано рівень поширення алелів низької та середньої активності поліфенолоксидазних ферментів та проведено валідування. Виявлено сорти пшениці з житніми транслокаціями 1AL.1RS, 1BL.1RS, рецесивним алелем гена Tamyb10, геном стійкості до септоріозу Stb4, зчепленим з поліморфним локусом Xgwm111. Визначено сорт ваксі-пшениці та сорти-носії нетипового функціонального алелю Wx-B1е. Складено характеристику 100 елітних та перспективних сортів пшениці за наявністю цінних алелів генів, які детермінують якісні ознаки зерна (гени PPO, Tamyb10-A1, Wx) та стійкість до біотичних та абіотичних стресових факторів (житній транслокативний матеріал, Tamyb10-A1, Stb4).
format	Article
author	Моргун, Б.В. Степаненко, А.І. Степаненко, О.В. Банникова, М.О. Голубенко, А.В. Нітовська, І.О. Майстров, П.Д. Гродзинський, Д.М.
author_facet	Моргун, Б.В. Степаненко, А.І. Степаненко, О.В. Банникова, М.О. Голубенко, А.В. Нітовська, І.О. Майстров, П.Д. Гродзинський, Д.М.
author_sort	Моргун, Б.В.
title	Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів
title_short	Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів
title_full	Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів
title_fullStr	Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів
title_full_unstemmed	Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів
title_sort	впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів
publisher	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
publishDate	2016
topic_facet	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/116879
citation_txt	Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів / Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко, М.О. Банникова, А.В. Голубенко, І.О. Нітовська, П.Д. Майстров, Д.М. Гродзинський // Наука та інновації. — 2016. — Т. 12, № 2. — С. 40—56. — Бібліогр.: 56 назв. — укр.
series	Наука та інновації
work_keys_str_mv	AT morgunbv vprovadžennâmolekulârnihsistemviznačennâgenetičnogopolímorfízmuozimoípšenicídlâotrimannâvisokoproduktivnihspecíalízovanihsortív AT stepanenkoaí vprovadžennâmolekulârnihsistemviznačennâgenetičnogopolímorfízmuozimoípšenicídlâotrimannâvisokoproduktivnihspecíalízovanihsortív AT stepanenkoov vprovadžennâmolekulârnihsistemviznačennâgenetičnogopolímorfízmuozimoípšenicídlâotrimannâvisokoproduktivnihspecíalízovanihsortív AT bannikovamo vprovadžennâmolekulârnihsistemviznačennâgenetičnogopolímorfízmuozimoípšenicídlâotrimannâvisokoproduktivnihspecíalízovanihsortív AT golubenkoav vprovadžennâmolekulârnihsistemviznačennâgenetičnogopolímorfízmuozimoípšenicídlâotrimannâvisokoproduktivnihspecíalízovanihsortív AT nítovsʹkaío vprovadžennâmolekulârnihsistemviznačennâgenetičnogopolímorfízmuozimoípšenicídlâotrimannâvisokoproduktivnihspecíalízovanihsortív AT majstrovpd vprovadžennâmolekulârnihsistemviznačennâgenetičnogopolímorfízmuozimoípšenicídlâotrimannâvisokoproduktivnihspecíalízovanihsortív AT grodzinsʹkijdm vprovadžennâmolekulârnihsistemviznačennâgenetičnogopolímorfízmuozimoípšenicídlâotrimannâvisokoproduktivnihspecíalízovanihsortív
first_indexed	2025-07-08T11:15:07Z
last_indexed	2025-07-08T11:15:07Z
_version_	1837077164007096320
fulltext	40 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2): 40—56 doi: http://dx.doi.org/10.15407/scin12.02.040 Впроваджено молекулярні системи визначення генетичного поліморфізму для 100 сортів озимої пшениці: прове- дено скринінг наявності цінних алелів на основі полімеразних ланцюгових реакцій; з’ясовано рівень поширення алелів низької та середньої активності поліфенолоксидазних ферментів та проведено валідування. Виявлено сорти пшениці з житніми транслокаціями 1AL.1RS, 1BL.1RS, рецесивним алелем гена Tamyb10, геном стійкості до сеп- торіозу Stb4, зчепленим з поліморфним локусом Xgwm111. Визначено сорт ваксі-пшениці та сорти-носії нетипового функціонального алелю Wx-B1е. Складено характеристику 100 елітних та перспективних сортів пшениці за наявніс- тю цінних алелів генів, які детермінують якісні ознаки зерна (гени PPO, Tamyb10-A1, Wx) та стійкість до біотичних та абіотичних стресових факторів (житній транслокативний матеріал, Tamyb10-A1, Stb4). К л ю ч о в і с л о в а: пшениця, алель, праймер, якісні характеристики зерна, полімеразна ланцюгова реакція. © Б.В. МОРГУН, А.І. СТЕПАНЕНКО, О.В. СТЕПАНЕНКО, М.О. БАННИКОВА, А.В. ГОЛУБЕНКО, І.О. НІТОВСЬКА, П.Д. МАЙСТРОВ, Д.М. ГРОДЗИНСЬКИЙ, 2016 Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко, М.О. Банникова, А.В. Голубенко, І.О. Нітовська, П.Д. Майстров, Д.М. Гродзинський Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ ВПРОВАДЖЕННЯ МОЛЕКУЛЯРНИХ СИСТЕМ ВИЗНАЧЕННЯ ГЕНЕТИЧНОГО ПОЛІМОРФІЗМУ ОЗИМОЇ ПШЕНИЦІ ДЛЯ ОТРИМАННЯ ВИСОКОПРОДУКТИВНИХ СПЕЦІАЛІЗОВАНИХ СОРТІВ Однією з глобальних проблем сьогодення є питання поліпшення якості зерна пшениці. Пшениця м’яка (Triticum aestivum L.) — од на з найважливіших продовольчих зернових куль- тур, яка займає перше місце за посівними пло- щами та становить основу харчового раціону населення багатьох країн світі, в тому числі України. Розвиток сільського господарства і виробництво продуктів харчування вимагають створення стійких до стресів та хвороб сортів рослин та водночас високопродуктивних і здат- них давати стабільно якісне збіжжя. Особливо це актуально для України, яка заявляє про се- бе на світовому ринку постійним зростанням об’єму експортованого зерна. Ключовим моментом, який прискорює от- ри мання нових сортів пшениці, є пошук генів стійкості як у сучасних, так і в старих сортах пшениці, а також у віддалених видах та гібри- дах. Не менш важливим є використання моле- кулярно-генетичних підходів для ідентифіка- ції цінних генотипів та проведення скринінгу перенесення генів під час проведення селек- ційних схрещувань. У зв’язку з цим метою да- ної роботи є впровадження системи молеку- лярного визначення ступеня генетичного по- ліморфізму сортів пшениці та проведення мо- лекулярно-генетичного аналізу селекційного і сортового матеріалу насіння озимої пшениці з різних селекційних центрів України і зару- біжної селекції (див. табл. 1). Наявність генетичного поліморфізму послі- довностей, які детермінують якісні характе- 41ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці ристики зерна та стій кість до біотичних стре- сових факторів нав колишнього середовища. Завдання вдосконалення ефек тивних маркер- них систем до генів, які детермінують якісні показники зерна пшениці та стійкість до стре- сових факторів зовнішнього середовища вирі- шується в процесі проведення молекулярно- гене тич ного аналізу. 1. ГЕНИ ПШЕНИЦІ, ЯКІ ДЕТЕРМІНУЮТЬ ЯКІСНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЗЕРНА ТА СТІЙКІСТЬ ДО СТРЕСОВИХ ФАКТОРІВ ПШЕНИЦІ Селекційна цінність сортів м’якої пшени ці, які містять пшенично-житню транслокацію 1BL.1RS та транслокацію 1АL.1RS, зумовле- на стійкістю до абіотичних та біотичних чин- ників [1—4]. Сорти пшениці з транслокацією Таблиця 1 Перелік наданих для аналізу сортів пшениці Походження Сорти Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ Нива Київщини, Подолянка, Фаворитка, Володарка, Ново ки- їв ська, Ятрань 60, Київська остиста, Солоха, Чорнява, Сот ни ця, Полянка, Борія, Гілея, Золото України, Здобуток, Грез дів лиця, Доброслава, Новосмуглянка, Соломія, Щедрівка Київська Інститут фізіології рослин і генетики НАН України і Миронівський інститут пшениці ім. В.М. Ремесла НААН України, м. Миронівка Переяславка, Сонечко, Наталка, Пивна, Ласуня, Крижинка, Веснянка, Богдана, Колумбія, Золотоколоса, Смуглянка, Славна, Спасівка Миронівський інститут пшениці ім. В.М. Ремесла НААН України, м. Миронівка Миронівська 808, Миронівська 30, Миронівська 61, Миронівська 65, Українська 246 ННЦ «Інститут землеробства» НААН України, м. Київ Поліська 90 Інститут рослинництва ім. В.Я. Юр’єва НААН України, м. Харків Досконала, Статна Селекційно-генетичний інститут — Національний центр насіннєзнавства та сортовивчення НААН Ук- раїни, м. Одеса Антонівка, Господиня, Дальницька, Єдність, Заграва, Зви тя- га, Істина, Княгиня Ольга, Косовиця, Литанівка, Мі сія, Нива Одеська, Служниця, Чорноброва, Лебідка од., Ластівка од., Писанка, Пошана, Годувальниця, Ужинок, Білява, Куяльник, Одеська 51, Альбатрос од., Одеська 267, Ніконія, Селянка, Зорепад, Лановий, Кірія, Дюк, Небокрай, Ліона, Доброчин, Гурт, Красень, Турунчук, Бунчук, Польовик, Отаман Селекційно-генетичний інститут — Національний центр насіннєзнавства та сортовивчення НААН Ук- раїни, м. Одеса Ватажок, Зміна, Подяка, Борвій, Жайвір, Супутниця, За- по ру ка, Хист, Пилипівка, Соната, Гармонія, Софійка, Доб- рочинна, Ліра Білоцерківська дослідно-селекційна станція ім. О.К. Ко- ломієць Інституту цукрових буряків НААН України, м. Біла Церква Білоцерківська н/к Донецький інститут агропромислового виробництва НААН України, м. Донецьк Донецька 46, Донецька 48 Інститут фізіології рослин і генетики НАН України та Фермерське господарство «Теософ», с. Розношенське, Ульяновський район, Кіровоградська область Трипільська Краснодарський науково-дослідний інститут сільсько- го господарства ім. П.П. Лукьяненко, м. Краснодар, РФ Безоста 1 42 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко та ін. 1BL.1RS зазвичай містять гени, що контролю- ють стійкість до таких грибних патогенів, як бу- ра іржа (Lr26), стеблова іржа (Sr31), жовта іржа (Yr9), борошниста роса (Pm8) [5, 2, 6] та інші гени стійкості до хвороб та шкідників [7]. Транслока- ція 1АL.1RS набула поширення серед комерцій- них сортів завдяки присутності генів стійкості до біотипів попелиці (Gb2, Gb6), борошнистої роси (Pm17), кліща [8]. Рослини пшениці з жит- ньою транслокацією більш посухостійкі, з під- вищеною адаптаційною здатністю, вищою вро- жайністю, вмістом білка в зе рні [9, 10]. Прояв генів, локалізованих у короткому плечі 1RS жи- та, залежить від генотипу сортів пшениці [11, 12]. Білки секаліни мають виражений негатив- ний вплив на якість борош на [13]. Для іденти- фікації житньої 1R-хро мо соми або її короткого плеча 1RS у складі пше нично-житніх транслока- цій у сортів, ліній пше ниці використовують біо- хімічні, молекулярно-біо логічні, цитогенетичні, молекулярно-ге не тичні методи [11, 14—16]. Якість зерна пшениці характеризується рів- нем ак тивністі поліфенолоксидазних фермен- тів (ПФО), які призводять до небажаного по- темніння виробів з пшеничного борошна [17— 21]. Пшениця містить багато паралогічних ге нів PPO, які представлені мультигенною родиною, розміщуються у різних місцях і виникли шля- хом дуплікації і подальших мутацій [22—24, 5]. Активність поліфенолоксидази визначається, головним чином, алелями РРО, що знаходяться у хромосомах 2-ї гомеологічної групи геномів пшениці А і D [25—28]. Крім того, була іден- тифікована родина генів, що складається з ге нів Ppo-A2, Ppo-B2 та Ppo-D2, які також впливають на рівень активності ПФО [29]. Для визначен- ня активності РРО-генів ефективними вияви- лися STS (Sequence Tagged Site)-маркери [30, 31]. Алельний поліморфізм генів Ppo-A2, Ppo- B2 та Ppo-D2 виявляється за допомогою сис- тем молекулярних маркерів, основаних на по- лімеразних ланцюгових реакціях (ПЛР) [32]. Стійкість до проростання зерен у колосі (ПЗК) є також важливим якісним показником сорту. Червонозерні сорти пшениці, як прави- ло, більш стійкі до ПЗК, ніж білозерні. Ця асо- ціація між стійкістю до ПЗК і червоною піг- ментацією зерна швидше за все спричинена плейотропними ефектами генів, які контролю- ють колір зерна [33—35]. Забарвлення зерна пше ниці контролюється генами R-1 (гени Tamyb10), які є транскрипційними факторами, що регулюють біосинтез флавоноїдів. Один або більше домінантних алелей R-А1а, R-В1а, та/або R-D1a надають зерну червону пігмен- тацію [36, 37]. Контроль алельного стану генів Tamyb10 у червонозерних сортах дозволить прог нозувати їх стійкість до ПЗК. Важливим для збереження врожаю пшениці є її стійкість до грибних захворювань, зокрема до септоріозу. Гени стійкості до септоріозу (за Біфом) отримали назву Stb [38]. У 2004 р. розпо- чалася робота щодо картування гена Stb4. Було картовано сім локусів Stb на різних хромосомах [39—41]. Молекулярні системи для аналізу ге- нів Stb і зокрема гена Stb4 будуть корисними у відборі цінних генотипів, стійких до септоріозу. Зміна структури крохмалю є одним із пер- спективних напрямів селекції зернових та поді- ляється на два принципово відмінних підходи: збільшення кількості амілози та збільшення кіль- кості амілопектину [42]. Головним ферментом біосинтезу амілози є асоційована з гранулами синтазу крохмалю GBSS I з молекулярною ма- сою близько 60 кДа, яка має назву Wх-протеїн. У геномі м’якої пшениці три гомеологічні гени кодують ізоформи ферменту GBSS I: Wx-A1, Wx-B1 і Wx-D1, які розташовані у плечах хромо- сом 7AS, 4AL і 7DS відповідно [43]. У пшениці кожен з генів Wx має декілька алелів. Пшениця, у якої поєднання трьох неактивних алелів при- зводить до повного блокування синтезу фер- мента GBSS І та відповідно амілози, назива єть- ся ваксі (Wx). Сорти з кількома нуль-алелями, які мають де що знижений синтез амілози, на- зиваються частково ваксі (partial Waxy) [44]. Нуль-алелі генів Wx-A1, Wx-В1, Wx-D1 викли- кають нерівномірний вплив на рівень синтезу амілози. Най більш суттєве зниження показує нуль-алель ге на Wx-В1 [45]. Співвідношення 43ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці амі лоза/амілопектин у пшеничному крохмалі має надзви чайно важливе значення для техно- логічних властивостей крохмалю та борошна пше ниці: ваксі-борошно характеризується вищи- ми показ никами газоутворення та підйомної сили тіста [13, 46]. Додавання борошна з пшени- ці ваксі до звичайного хлібопекарського борош- на суттєво підвищує якість хліба [13]. Зерно Wx- культур — ефективна сировина для одержання етанолу завдяки кращій доступності крохмалю для ензимів і, відповідно, зниження витрат енер- гії та прискорення процесу ферментації [47]. 2. ПРОТОКОЛ ДЕТЕКЦІЇ ГЕНІВ, ЯКІ ДЕТЕРМІНУЮТЬ ЯКІСНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЗЕРНА ТА СТІЙКІСТЬ ПШЕНИЦІ Для розробки молекулярно-генетичних під- ходів з метою впровадження у селекційний про- цес нами було обрано ряд праймерів ПЛР для компонентів, які обумовлюють вибіркове детек- тування цільових алелів генів (табл. 2). В цілому було виділено загальну ДНК, спек- трофотометрично виміряно концентрацію очи- щеної ДНК, нормалізовано кон центрацію до 30 нг/мкл, проведено електрофорез загальної ДНК у агарозному гелі. Конт роль якості виді- леної ДНК проводився на референтні гени од- ночасно з реакцією на цільові гени у складі мультиплексних ПЛР. Виділення та очистку загальної ДНК прово- дили з паростків та сухого матеріалу пшениці за загальноприйнятою методикою [47]. Для пе- ревірки наявності загальної рослинної ДНК піс- ля процедури виділення застосовували метод електрофорезу нуклеїнових кислот в агароз- ному гелі. Для визначення розмірів фрагмен- тів ДНК в агарозному гелі їх порівнювали з маркером, який містив лінійні фрагменти ДНК відомої довжини і кількості. Як маркер мо- лекулярної маси використовували λ/HindIII (Thermo Scientific) з розміром ампліконів, п.н.: 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125, який вносився у лунку геля в кількості 400 нг. Вимірювання концентрації загальної ДНК про водили за допомогою компактного спект- рофотометра BioPhotometer Plus (Eppendorf) при довжині хвилі 260 нм. Чистоту виділеної ДНК оцінювали за співвідношенням поглинан- ня при довжинах хвиль 230, 260, 280 та 320 нм. Стандартизацію зразків, відповідно до виміря- них концентрацій, проводили шляхом розве- дення препаратів ДНК до 30 нг/мкл. Для оптимізації ряду реакцій використову- вали техніку нисхідної та градієнтної ПЛР. Для швидкої та надійної детекції досліджу- ваних генів або генетичних послідовностей, які детермінують якісні характеристики зерна та стійкість до біотичних та абіотичних стресо- вих факторів, було розроблено і оптимізовано методики проведення уніплексних та мульти- плексних полімеразних ланцюгових реакцій (табл. 3). Ме то дика мультиплексного визна- чення передбачає синтез в одній пробірці де- кількох ділянок ДНК, обмежених декількома різними парами праймерів. Для гена або ці- льової ділянки ДНК підбирають пари прайме- рів, за допомогою яких проводять ампліфіка- цію необхідних ділянок характерної довжини для чіткої ідентифікації. Реакційні суміші включали: специфічні прай- мери (Metabion) (табл. 2), по 2 мкл буфера для ПЛР 10хDreamTaq™ Green Buffer (Thermo Sci- en ti fic), по 0,2 мМ кожного дезокси ри бо нук- лео зид-3-фосфату (Thermo Scientific), 0,5 од. по- лімерази DreamTaq™ DNA Polymerase (Ther- mo Scientific), 30 нг сумарної ДНК, деіонізова- ну воду Milli-Q до кінцевого об’єму 20 мкл. Програми ампліфікацій були такими: 1. Мультиплексна ПЛР для виявлення ти- пу пшенично-житньої транслокації з викорис- танням гена TaTM20 як референтного: почат- кова денатурація 3 хв при 94 °С, 34 цикли де- натурація 30 с при 94 °С, ренатурація 30 с при 60 °С, елонгація 1 хв при 72 °С, фінальна елон- гація 5 хв при 72 °С. 2. Мультиплексна ПЛР для виявлення пше- нично-жит ньої транслокації 1AL.1RS з вико- ристанням гена actin як референтного: почат- кова денатурація 3 хв при 94 °С, 34 цикли — денатурація 30 с при 94 °С, ренатурація 30 с 44 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко та ін. Таблиця 2 Перелік праймерів, що використовувалися в дослідженні № пари Нуклеотидна послідовність Довжина фрагмента, який ампліфікується, п.н. Призначення, специфічність Референтні гени пшениці 1 5′-GAGGGATACACGCTTCCTCA-3′ 5′-GAAAGTGCTAAGAGAGGCCAAA-3′ [36] 547 actin — кодує пшеничний білок актин 2 5′-AAGGGTTGCTCCTCTTCGCGATCT-TG-3′ 5′-GTACATGCCAGCACCGTATGGATTG-3′ [10] 934 TaTM20 — ген білка-транс- пор тера іонів металів пше- ниці Пшенично-житні транслокації 3 5′-TGACAACCCCCTTTCCCTCGT-3′ 5′-TCATCGACGCTAAGGAGGACCC-3′ [52] 226 — 1AL.1RS 202 — 1BL.1RS SCM9 — визначення ти- пу транслокації 4 5′-AACGAGGGGTTCGAGGCC-3′ 5′-GAGTGTCAAACCCAACGA-3′ [51] 233, 338 — 1AL.1RS Жито — специфічні пов- то ри RT73, визначення 1AL.1RS Ppo-A1 та Ppo-D1 5 5′-CCAGATACACAACTGCTGGC-3′ 5′-TGATCTTGAGGTTCTCGTCG-3′ [31] 290 — Ppo-A1a 481 — Ppo-A1b Визначення алелів гена Ppo-A1 6 5′-TGAAGCTGCCGGTCATCTAC-3′ 5′-AAGTTGCCCATGTCCTCGCC-3′ [31] 490 — Ppo-D1b Визначення алелів гена Ppo-D1 Tamyb10-A1 7 5′-CTATGTGGATGGCCTTGGAT-3′ 5′-CTACCAGCTCGTTTGGGAAG-3′ [36] 665 — R-A1b Визначення алелю R-A1b (набір 1) 8 5′-TTTCAATCGAGTGGGCATAA-3′ 5′-CCTGACGATGAGCTCCTCTT-3′ [36] 536 — R-A1а Визначення алелю R-A1а (набір 2) Stb4 9 5′-TCTGTAGGCTCTCTCCGACTG-3′ 5′-ACCTGATCAGATCCCACTCG-3′ [39] 210 — стійкі форми Наявність локусу Xgwm111 Wx 10 5′-CCCCAAAGCAAAGCAGGAAAC-3′ 5′-CGGCGTCGGG TCCATAGATC-3′ [53] Після гідролізу рест рик- тазою HindIII 495+176 —Wx-A1a 652 — Wx-A1b Визначення алелів гена Wx-A1 11 5′-CTGGCCTGCTACCTCAAGAGCAACT-3′ 5′-GGTTGCGGTTGGGGTCGATGAC-3′ [54; 55] 778 — Wx-B1а 668 — Wx-B1b 804 — Wx-B1e Визначення алелів Wx-B1а і Wx-B1e (набір 1) 12 5′-GTAGTAAGGTGCAAAAAAGTGCCACG-3′ 5′-CAGCCTTATTGTACCAAGACCCATGTGTG-3′ [54; 55] Визначення алелю Wx-B1b (набір 2) 13 5′-GCCGACGTGA AGAAGGTGGTG-3′ 5′-CCCCTTGCGT CATTTGTTGTGT-3′ [56] 930 — Wx-D1a 342 — Wx-D1b Визначення алелів гена Wx-D1 45ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці при 61 °С, елонгація 24 с при 72 °С, фінальна елонгація 5 хв при 72 °С. 3. Мультиплексна ПЛР для виявлення але- лів гена РРO-A1: початкова денатурація 3 хв при 94 °C, 34 цикли — денатурація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 59 °С, елонгація 1 хв при 72 °С, фінальна елонгація 5 хв при 72 °С. 4. Мультиплексна нисхідна (Touchdown) ПЛР для виявлення алелів гена РРO-D1: початкова денатурація 3 хв при 94 °C, 8 циклів — денату- рація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 68 °С (з кожним циклом температура зменшується на 1 °С), елонгація 1 хв при 72 °С та 24 цик лів — денатурація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 61 °С, елонгація 1 хв при 72 °С, фінальна елон- гація 5 хв при 72 °С. 5. Мультиплексна нисхідна (Touchdown) ПЛР для виявлення домінантного алеля гена Tamyb10-A1 (набір праймерів 1): початкова де- натурація 3 хв при 94 °C, 5 циклів — денатура- ція 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 67 °С (з кожним циклом температура зменшується на 1 °С), елонгація 43 с при 72 °С та 27 цик- лів — де натурація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 61 °С, елонгація 43 с при 72 °С, фі- нальна елонгація 5 хв при 72 °С. 6. Мультиплексна ПЛР для виявлення реце- сивного алеля гена Tamyb10-A1 (набір прайме- рів 2): початкова денатурація 3 хв при 94 °C, 34 цикли — денатурація 30 с при 94 °C, ренату- рація 30 с при 56 °С, елонгація 35 с при 72 °С, фінальна елонгація 5 хв при 72 °С. 7. ПЛР для аналізу мікросателітного локусу Xgwm111, зчепленого з геном стійкості до сеп- торіозу Stb4: початкова денатурація 3 хв при 94 °C, 34 цикли — денатурація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 52 °С, елонгація 30 с при 72 °С, фінальна елонгація 5 хв при 72 °С. 8. ПЛР для визначення алелів гена Wx-A1: початкова денатурація 3 хв при 94 °C, 34 ци- кли — денатурація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 58 °С, елонгація 40 с при 72 °С, фі- нальна елонгація 5 хв при 72 °С. Після амплі- фікації проводиться гідроліз продуктів реак ції ендонуклеазою HindIII. 9. Мультиплексна нисхідна (Touchdown) ПЛР для визначення алелів гена Wx-В1: початкова денатурація 3 хв при 94 °C, 6 циклів — денату- Таблиця 3 Мультиплексні та уніплексні реакції з вказівкою кінцевої концентрації праймерів у реакції № пари Мета реакції Гени, які детектуються (концентрація праймерів) 1 Визначення транслокацій 1AL.1RS та 1BL.1RS SCM9 (0,5 мкМ) + TaTM20 (0,4 мкМ) 2 Визначення транслокації 1AL.1RS RТ73 (0,5 мкМ) + actin (0,25 мкМ) 3 Виявлення алелів гена РРO-A1 РРO-A1 (0,5 мкМ) + TaTM20 (0,25 мкМ) 4 Виявлення алелів гена РРO-D1 РРO-D1 (0,5 мкМ) + TaTM20 (0,3 мкМ) 5 Виявлення алелів гена Tamyb10-A1 (набір праймерів 1) Tamyb10-A1 (0,5 мкМ) + TaTM20 (0,3 мкМ) 6 Виявлення алелів гена Tamyb10-A1 (набір праймерів 2) Tamyb10-A1 (0,5 мкМ) + TaTM20 (0,15 мкМ) 7 Аналіз локусу Xgwm111, зчепленого з геном стійкості до септоріозу Stb4 Xgwm111 (0,5 мкМ) 8 Виявлення алелів гена Wx-А1 Wx-A1 (0,5 мкМ) + гідроліз ендонуклеазою HindIII 9 Виявлення алелів гена Wx-B1 Wx-B1 (набір 1, 0,75 мкМ) + Wx-B1 (набір 2, 0,75 мкМ) + TaTM20 (0,5 мкМ) 10 Виявлення алелів гена Wx-D1 Wx-D1 (0,5 мкМ) 46 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко та ін. рація 30 с при 94 °C, ренатурація 1 хв при 69 °С (з кожним циклом температура зменшується на 1 °С), елонгація 2 хв при 72 °С та 24 цик лів — денатурація 30 с при 94 °C, ренатурація 1 хв при 62 °С, елонгація 2 хв при 72 °С, фінальна елон- гація 5 хв при 72 °С. 10. Низхідна (Touchdown) ПЛР для визна- чення алелів гена Wx-D1: початкова денатура- ція 3 хв при 94 °C, 7 циклів — денатурація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 67 °С (з кож- ним циклом температура зменшується на 1 °С), елонгація 1 хв при 72 °С та 25 циклів — дена- турація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 60 °С, елонгація 1 хв при 72 °С, фінальна елон- гація 5 хв при 72 °С. Реакції ампліфікації проводили в термоцик- лерах Arctic Thermal Cycler (Fisher Thermo Sci- entific) та Mastercycler gradient (Eppendorf). Піс- ля про ведення ПЛР проводилась рестрикція продуктів ампліфікації послідовності гена Wx- A1, для чого готувалась реакційна суміш із про- дуктів ампліфікації (10 мкл), ендонуклеази ре стрикції HindIII (7,5 од.) та однократного буфера R (Ther mo Scientific, 10 мM Tris-HCl (pH 8,5), 10 мM магнію хлориду, 100 мМ калію хлориду, 0,1 мг/мл BSA). Рестрикція тривала 1,5 год при 37 °С. От ри мані гідролізовані фраг- менти надалі розділяли шляхом горизонтально- го гель-елект ро форезу в агарозному гелі з бро- мистим етидієм у SB-буфері при напрузі елек- тричного поля 5 В/см. Для визначення розміру продуктів ампліфікації використовували маркер моле кулярної маси GeneRulerTM DNA Ladder Mix (роз мір ампліконів, п.н.: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100). Ре зультати гель-електрофорезу візуалізували за допомогою трансілюмінатора ультрафіоле- тового світла. Бро мистий етидій інтеркалює між азотистими основами дуплексу і комплекс флуо ресціює в УФ-променях. Отримане зобра- ження обробляли за допомогою графічного ре- дактора GIMP та MS Power Point. Визначення активності поліфенолоксидаз- них ферментів виконували за допомогою фар- бу ван ня 1%-им фенолом. Наважки по 0,1 г шро- ту зерна пшениці заливали 700 мкл 1%-го фе- нолу, перемішували і витримували 16 год при кімнатній температурі (шрот з наважок пара- лельно аналізували шляхом мультиплексної ПЛР для визначення алельного стану генів Ppo-A1 та Ppo-D1). Центрифугували 3 хв при 6000 об./хв. Вимірю вали довжину хвилі за- барвленого розчину при 405 нм. Як контроль використовували 1%-ий фенол. Під час вимі- ру здійснювали промивку кю вети спочатку 70%-им етанолом, потім дистильованою во- дою. Через кожні 5 зразків для конт ролю про- водили вимірювання 1%-го фенолу. Для оцінки ефективності молекулярно-ге- не тич них підходів з визначення генів Wx про- водили фарбування зернівок розчином йоду: подрібнені зернівки переносили в пробірку на 1,5 мл, ку ди додавали 700 мкл розчину йоду (1:10 спиртовий розчин йоду : дистильована вода), перемішу вали короткочасно в шейкері. Результати визначали візуально за зміною за- барвлення розчину. Аналіз гліадинової фракції запасних білків пшениці здійснювали методом електрофорезу у поліакриламідному гелі [48]. Статистичний аналіз результатів біохіміч- них тестів виконували стандартними метода- ми [49], які включали розрахунок середнього значення дисперсії S2 і стандартного відхилен- ня S, визначення грубих похибок з використан- ням 3S-критерію, β-критерію і критерію Ро ма- нівського та розрахунок надійного інтервалу прямого вимірювання. 3. ВИЯВЛЕННЯ ПШЕНИЧНО-ЖИТНЬОГО ТРАНСЛОКАТИВНОГО МАТЕРІАЛУ У ході скринінгу зібраної колекції ДНК пше- ниці на наявність житнього інтрогресивного ма- теріалу за допомогою підібраних маркерних сис- тем було досліджено 100 сортів пшениці за до- помогою праймерів до мікросателітного локу- су SCM9 та житоспецифічних повторів R173. У всіх сортів був присутній амплікон 934 п.н., що свідчить про адекватний перебіг реакції. Для 47ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці сортів, які несуть транслокацію 1AL.1RS, спо- стерігали наявність ампліконів розміром 226 п.н., для сортів з 1ВL.1RS — 206 п.н., для інших — відсутність сигналу. Наявність пшенично-житніх транслокацій різних типів було виявлено у 29-и сортів. З них у 19-и була виявлена 1AL.1RS транслокація, а у 10-и — 1ВL.1RS. 27 сортів належать до київ- ського та миронівського селекційних центрів, а 2 — до одеського. Це може свідчити про вищу стійкість сортів з півночі України. Транслокації були виявлені як у сортах, які вже десятиріччя вирощуються на території України, так і серед нових, що показує напрямки роботи в селекцій- них центрах центральної України. Проте в но- вих сортах одеської селекції житнього транс- локативного матеріалу виявлено не бу ло, що можна пояснити значним зниженням показни- ків хлібопекарської якості у сортів пше ниці з транслокаціями в умовах степового клімату Ук- раїни [13]. Підвищення частоти виявлення сор- тів з транслокацією 1AL.1RS пояснюється ймо- вірно незначним її впливом на хлібопекарські властивості озимої пшениці м’якої [50]. Додаткове дослідження гліадинової фракції білків пшениці за допомогою розділення їх ме- тодом електрофорезу дозволило підтвердити достовірність виявлення житньої транслокації та можливості використання молекулярних сис тем для аналізу сортового та селекційного матеріалу [49]. 4. АНАЛІЗ СОРТОВОГО РІЗНОМАНІТТЯ ПШЕНИЦІ НА НАЯВНІСТЬ АЛЕЛІВ ГЕНІВ ПОЛІФЕНОЛОКСИДАЗНОЇ АКТИВНОСТІ При виявленні алелів генів Ppo-A1 та Ppo-D1 були обрані маркери PPO33 (кодомінантний тип, ген Ppo-A1) та РРО29 (домінантний тип, ген Ppo-D1). З метою отримання ефектив них маркерних систем для впровадження у прик- ладну селекцію запропоновано ввести в реак- цію праймери до референтного гена ТаТМ20. Для маркера PPO33 було запропоновано викорис- тання градієнтної ПЛР (рис. 1), для РРО29 — техніку низхідної ПЛР (рис. 2). Спостерігали амплікони 391 та 582 п.н., які підтверджуються аналізом відповідної послі- довності гена Ppo-A1 з Генетичного банку (Na- tional Center for Biotechnology Information). Для деяких сортів (зокрема, Гурт, Заграва, Гі- лея) спостерігали наявність обох ампліконів, що свідчить про гетерогенність зерна даних сортів. За використання маркера PPO-29 спостері- гали очікуваний амплікон 490 п.н., який свід- чить про наявність алеля b гена Ppo-D1. У всіх сортах виявляли амплікон розміром 934 п.н., який свідчить про адекватність реакції. Скринінг вибірки 100 сортів пшениці вітчиз- няної селекції здійснювали за допомогою роз- роблених мультиплексних ПЛР. Алель Ppo-A1b було виявлено лише у сортах Єдність та Біля- ва (український районований сорт білозерної пшениці), що складає 2 % від загальної вибірки. У 12-и сортах спостерігали гетерогенність зер- на за геном Ppo-A1. Це було виявлено як у ста- ровинних (Миронівська 808), так і в сучасних сортах. У інших сортах ідентифікували алель Ppo-A1а, який визначає високий рівень актив- ності поліфенолоксидаз. У 36-и сортах вибірки (36 %) був визначений алель Ppo-D1a, який обумовлює низькоактивну поліфенолоксидаз- ну активність, у решти — алель Ppo-D1b. Для підтвердження результатів моле ку ляр- но-генетичних систем, за допомогою яких сор- ти пшениці були поділені на групи, враховую- чи алельний склад генів PPO, було проведено серію біохімічних дослідів для визначення ак- тивності поліфенолоксидаз, використовуючи як субстрат 1%-ий фенол. Для цього було обрано низку контрастних сортів та білозерних ліній із залученням ряду зарубіжних сортів. Вимі рю- вання інтенсивності забарвлення здійснюва- лося спектрофотометрично при довжині хвилі 405 нм (табл. 4). Отримані дані свідчать про високу ПФО ак- тивність сортів Куяльник, Ятрань 60 та Недра, які є носіями алеля Ppo-A1а. Проте достовір- но не можна відрізнити сорт Недра (Ppo-D1a) від сортів Куяльник та Ятрань 60 (Ppo-D1b). 48 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко та ін. Рис. 1. Електрофореграма продуктів мультиплексної ампліфікації для виявлення алелів Ppo-A1a та Ppo-A1b. Доріжки 1—16 — досліджувані сорти; 17 — позитивний контроль (Ppo-A1b); 18 — позитивний контроль (Ppo-A1a); К — нега- тивний контроль (ТЕ буфер); М — маркер молекулярної маси DNA Ladder Mix Рис. 2. Електрофореграма результатів мультиплексної ПЛР для виявлення алеля Ppo-D1b. Доріжки 1—16 — дослід- жувані сорти; 17 — позитивний контроль (Ppo-D1b); 18 — позитивний контроль (Ppo-D1а); К — негативний конт роль (ТЕ буфер); М — маркер молекулярної маси DNA Ladder Mix Таблиця 4 Розподіл контрастних сортів пшениці за ознакою активності ПФО методом фенольної проби Сорт Значення А405 Активність ПФО Генотип Білява 0,424 ± 0,100 Низька Ppo-A1b, Ppo-D1a Куяльник 2,237 ± 0,263 Висока Ppo-A1а, Ppo-D1b Фаворитка 0,848 ± 0,300 Середня Ppo-A1а/b, Ppo-D1b Гренні 0,588 ± 0,215 Низька Ppo-A1а/b, Ppo-Da Ятрань-60 2,105 ± 0,390 Висока Ppo-A1а, Ppo-D1b Недра 2,349 ± 0,286 Висока Ppo-A1а, Ppo-D1a Хуторянка 0,426 ± 0,105 Низька Ppo-A1а/b, Ppo-D1a Торчинська 1,196 ± 0,360 Середня Ppo-A1а/b, Ppo-D1b Лінія 3162 б.з. 0,462 ± 0,162 Низька Ppo-A1b, Ppo-D1a 49ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці Рис. 3. Електрофореграма продуктів мультиплексної ампліфікації гена Tamyb10-A1 з праймерами набору 1. Доріжки 1—9 — зразки пшениці, які несуть алель R-A1b; 10—15 — зразки пшениці, які несуть алель R-A1а; 16 — позитивний контроль; 17 — негативний контроль; 18 — негативний контроль, ТЕ буфер; М — маркер молекулярної маси GeneRuler™ DNA Ladder Mix Рис. 4. Електрофореграма продуктів мультиплексної ампліфікації гена Tamyb10-A1 з праймерами набору 2. Доріжки 1, 2, 6—8, 11—14 — зразки пшениці, які несуть алель R-A1а; 3—5, 9—11, 15, 16 — зразки пшениці, які несуть алель R-A1b; 17 — позитивний контроль; 18 — негативний контроль; 19 — негативний контроль, ТЕ буфер; М — маркер молекулярної маси GeneRuler™ DNA Ladder Mix Рис. 5. Електрофореграма продуктів ампліфікації локусу Xgwm111. Доріжки: 1—12 — досліджувані сорти пшениці; К — негативний контроль, ТЕ буфер; М — маркер молекулярної маси GeneRuler™ DNA Ladder Mix 50 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко та ін. Сорт Білява та лінія білозерної пшениці 3162 показали низький достовірно значимий рівень ПФО активності, що корелює з їх генотипом. Проміжний рівень активності ПФО займають сорти, які є гетерогенними за геном Ppo-A1. Отже, отримані дані показують ефективність молекулярно-генетичних підходів для харак- теристики сортів за ознакою активності полі- фенолоксидазних ферментів. 5. ВИЯВЛЕННЯ АЛЕЛЬНИХ ВАРІАНТІВ ГЕНА Tamyb10-A1 Для виявлення алелів гена Tamyb10-A1 про- водили розробку мультиплексних полімеразних ланцюгових реакцій для двох наборів прай ме- рів (рис. 3, 4). Для контролю адекватності пере- бігу реакції використовували праймери до ре- фе рентного гена TaTM20. За використання набору 1 спостерігали амп- лікон 665 п.н. для сортів, які несуть домінант- ний алель R-A1b, та для всіх зразків очікували амплікон 934 п.н., який свідчить про адекват- ність перебігу реакції. За використання набору 2 спостерігали амп- лікон 536 п.н. для сортів, які несуть рецесив- ний алель R-A1а, та для всіх зразків очікували амплі кон 934 п.н., який свідчить про адекват- ність перебігу реакції. За результатами проведених аналізів складе- но характеристику 100 сортів за геном Ta myb10- A1. Сорти з алелем R-A1b потенційно мають більшу стійкість до проростання в колосі. У результаті аналізу 100 сортів пшениці бу- ло виявлено 26 сортів, які несуть рецесивний алель R-A1а, що відповідає за білий колір зер- нівки та має негативний вплив на стійкість до проростання в колосі. У 74 сортах виявлено до- мінантний алель R-A1b, який потенційно по- зитивно впливає на стійкість до проростання. Частота по яви рецесивного алеля є досить ви- сокою, незважаючи на практичну відсутність білозерних сортів вітчизняного походження. Та- ким чином, запропоновані молекулярні підхо- ди оцін ки сортового матеріалу ефективні для впровад жен ня у селекційний процес створен- ня як білозерних сортів, так і сортів, стійких до проростання в колосі. 6. АНАЛІЗ СОРТІВ ПШЕНИЦІ ЗА ЛОКУСОМ Xgwm111 Для виявлення локусу Xgwm111, який лока- лізований на хромосомі 7D на відстані 0,7 cM від Stb4, проводилася ПЛР зі специфічною парою праймерів з наступним розділенням за допомо- гою горизонтального електрофорезу у 3%-ому агарозному гелі. Розмір ампліконів визначали використовуючи програмне забезпечення Gel- Ana lyzer, ver. 2010a. Було запропоновано виді- лити 3 амплікони з орієнтовним розміром 175, 190 та 210 п.н., причому розмір амплікону 210 п.н. за літературними даними спостеріга- ється у стійких до септоріозу сортів. Окрім то- го, ідентифікували другий блок ампліконів роз- міром 125 та 135 п.н., який не корелює зі стій- кістю, проте є цінним для генотипування сор- тів. Результати типової ампліфікації наведені на рис. 5. Отри мана якість розділення продуктів ампліфікації у агарозному гелі виявилася при- йнятною для чіткої ідентифікації результатів. У результаті аналізу було виявлено 18 із 100 сортів пшениці з ампліконом 210 п.н., що свід- чить про наявність у даних сортів гена Stb4, який обумовлює стійкість до септоріозу. Сорти Доброчин і Подяка є гетерогенними за локу- сом, тобто зерновий матеріал є як з генотипом Stb4, так і без нього. Отримані дані придатні для використання у селекції на стійкість пше- ниці до септоріозу, а також можуть бути залу- чені до генотипування нових сортів. 7. ВИЗНАЧЕННЯ АЛЕЛЬНОГО СКЛАДУ ГЕНІВ Wx ПШЕНИЦІ Визначення алельного стану генів Wx про- водили за допомогою попередньо оптимізова- них програм та зі специфічними праймерами. На рис. 6 наведено типові результати візуалі- зації фрагментів ампліфікації гена Wx-А1 піс- ля рестрикційного аналізу. Спостерігали амплікон розміром 652 п.н. у сортах, які несуть нуль-алель гена Wx-А1. Для 51ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці Рис. 6. Електрофореграма результатів ПЛР з рестрикційним аналізом на ген Wx-А1. Доріжки: 1—16 — дослідні зраз- ки пшениці; 17 — контрольний зразок, який несе нуль-алель Wx-A1b гена; 18 — контрольний зразок, який несе алель дикого типу (Wx-A1а); К — негативний контроль; М — маркер молекулярної маси GeneRuler™ DNA Ladder Mix Рис. 7. Електрофореграма результатів мультиплексної ампліфікації гена Wx-В1. Доріжки: 1—16 — дослідні зразки пшениці; 17 — контрольний зразок, який несе нуль-алель Wx-В1b гена; 18 — контрольний зразок, який несе алель дикого типу (Wx-В1а); К — негативний контроль; М — маркер молекулярної маси GeneRuler™ DNA Ladder Mix Рис. 8. Електрофореграма результатів ампліфікації гена Wx-D1. Доріжки 1—16 — дослідні зразки пшениці; 17 — контрольний зразок, який несе нуль-алель Wx-D1b гена; 18 — контрольний зразок, який несе алель дикого типу (Wx-D1а); К — негативний контроль; М — маркер молекулярної маси GeneRuler™ DNA Ladder Mix 52 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко та ін. сортів, які містять алель дикого типу ідентифі- кували амплікони 495 та 176 п.н. Негативний контроль підтвердив достовірність результатів. На рис. 7 наведені типові результати візуа- лізації ампліфікації гена Wx-В1. Амплікон розміром 668 п.н. спостерігали у сортів з нуль-алелем гена Wx-В1, а в ін ших зразках детектували амплікон 778 п.н., харак- терний для алеля дикого типу. В деяких сортах спостерігали наявність амплікону 804 п.н., ха- рактерного для функціонального алеля Wx-B1e. Амплікон розміром 934 п.н., що відповідає ге- ну TaTM20, виявлено в усіх зразках, що свід- чить по адекватний перебіг реакції. Амплікон розміром 342 п.н. є типовим для нуль-алеля гена Wx-D1, а 930 п.н. — для алеля дикого типу гена Wx-D1 (рис. 8). Серед досліджуваних сортів був виявлений один ваксі-сорт пшениці одеської селекції Со- фій ка, що підтверджено за допомогою моле ку- лярно-генетичних аналізів наявністю нуль-але- лей за всіма генами Wx. Усі зразки за генами Wx-A1 та Wx-D1 були представлені алелями ди- кого типу. Вперше серед українських сортів пше- ниці було виявленно функціональний алель e гена Wx-B1. Сорти Кірія і Красень при детекції гена Wx-B1 виявляли амплікон розміром 804 п.н., що відповідає функціональному алелю Wx-B1е. Сорт Селянка ніс одразу і алель дикого типу і функціональний алель. Отже, поліморфізм ге- нів Wx серед досліджуваної вибірки пшениці виявився незначним. Для підтвердження ефективності та досто- вірності молекулярно-генетичних аналізів бу- ло проведено фарбування зернівок пшениці розчином йоду. Для додаткового порівняння окрім досліджуваних сортів було використано ряд ліній з різним алельним складом генів Wx. Негативна реакція з йодом спостерігалась у вак сі-сортів, де відсутній крохмаль із звичною структурою і йод не прореагував з амілозою, а у ваксі-пшениці та в сорті Ятрань 60 частково пройшла реакція з утворенням клатрату си- нього кольору. Отже, дана реакція є доцільною для визначення ваксі-генотипів пшениці. Робота проводилася у рамках науково-тех- нічного проекту «Впровадження молекулярних систем визначення генетичного й епігенетич- ного поліморфізму озимої пшениці для отри- мання високопродуктивних спеціалізованих сор- тів», фінансованого НАН України. Реєст ра цій- ний номер 0114U002736. ЛІТЕРАТУРА 1. Lukaszewski A.J. Frequency of 1RS.1AL and 1RS.1BL translocations in United States wheat / A.J. Lukaszewski // Crop Sci. — 1990. — V. 30. — P. 1151—1153. 2. McIntosh R.A. Cataloge of gene symbols for wheat / R.A. McIntosh, G. Hart, M. Gale // Proc. of the 8th Intern. Wheat Genet. Symp. Eds Z.S. Li, Z.Y. Xin. Beijing, China. — 1993. — P. 1333—1500. 3. Rabinovich S.V. Importance of wheat-rye translocations for breeding modern cultivars of Triticum aestivum L. / S.V. Rabinovich // Euphytica. — 1998. — V. 100. — P. 323— 340. 4. Shlegel R. Current list of wheats with rye and alien int- rogression / R. Shlegel // — 2010. — V. 5-8. — P. 1—14. 5. Singh N.K. Linkage mapping of genes for resistance to leaf,steam and stripe rust and secalins on the short arm of rye chromosome 1R / N.K. Singh, K.W. Shepherd, R.A. McIntosh // Theor. Appl. Genet. — 1990. — V. 80. — P. 609—616. 6. Catalogue of gene symbols for wheat // Proc. of the 10th Intern. Wheat Genet. Symp/ R.A. McIntosh, Y. Ya ma- zaki, K.M. Devos [et al.] / Eds N.E.Pogna, M. Romano, G. Galterio. Paestum, Italy, 2003. — P. 1—6. 7. Meltz G., Schlegel R., Thiele V. Genetic linkage map of rye // Theor. Appl. Genet. — 1992. — V. 83. — P. 33—45. 8. Козуб Н.О., Созінов І.О., Колючий В.Т. та ін. Іден ти фі- кація 1АL/1RS транслокації у сортів м’якої пшениці української селекції // Цитология и генетика. — 2005. — 39, № 4. — С. 20—24. 9. Hoffmann B. Alteration of drought tolerance of winter wheat caused by translocation of rye chromosome seg- ment 1R // Cereal Res. Commun. — 2008. — V. 36. — P. 269—278. 10. Kim Y.-Y., Kim D.-Y., Donghwan S. et al. Expression of the novel wheat gene TM20 confers enhanced cadmium tolerance to bakers’ yeast // J. of Biologocal Chemistry. — 2008. — V. 283 (23). — P. 15893—15902. 11. Козуб Н.А., Созинов И.А., Созинов А.А. Сопряженность 1BL/1RS транслокации с качественными и коли чест- вен ными признаками у мягкой пшеницы T. aes tivum // Цитология и генетика. — 2001. — Т. 35, № 5. — С. 74—80. 12. Zhou Y., He Z.H., Sui X.X. et al.Genetic improvement of grain yield and associated traits in the Northern China 53ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці winter wheat region from 1960 to 2000 // Crop Sci. — 2007. — Vol. 47. — P. 245—253. 13. Рибалка О.І. Якість пшениці та її поліпшення — К.: Ло гос, 2011. — 495 с. 14. Сиволап Ю.М., Чеботар С.В., Сударчук Л.В. Детекція 1RS.1AL, 1RS.1BL та модифікованої транслокацій за 1RS хромосомою у селекційних форм м’якої пшени- ці. Методичні рекомендації. — Одеса. — 2011. — 13 с. 15. Gupta R.B., Shepherd K.W. Identification of rye chro- mosome 1R translocations and substitutions in hexaplo- id wheats using storage proteins as genetic markers // Plant Breeding. — 1992. — V. 109. — P. 130—140. 16. Berzonsky W.F., Francki G. Biochemical, molecular and cy- togenetic technologies for characterizing 1RS in wheat: a review // Euphytica. — 1999. — 108. — P. 1—15. 17. Dexter J.E., Preston K.R., Matsuo R.R. et al. Development of a high extraction flour for the GRL Pilot Mill to eva luate Canadian wheat potential for the Chinese mar ket // Can Inst Food Sci Technol. — 1984. — V. 14. — P. 253—259. 18. Feillet P., Autran J.C., Icard-Verniere C. Pasta brownness: an assessment // J Cereal Sci. — 2000. — Vol. 32. — P. 215—233. 19. Simeone R., Pasqualone A., Clodoveo M.L. et al. Genetic mapping of polyphenol oxidase in tetraploid wheat // Cell Mol Biol Lett. — 2002. — V. 7. — P. 763—769. 20. McCallum J.A., Walker J.R.L. O-diphenol oxidase activity, phenolic content and colour of New Zealand wheats, flours and milling streams // J Cereal Sci. — 1990. — Vol. 12. — P. 83—96. 21. McCallum J.A., Walker J.R.L. Proanthocyanidins in wheat bran // Cereal Chem. — 1990. — Vol. 67(3). — P. 282—285. 22. Fuerst E.P., Xu S.S., Beecher B. Genetic characterization of kernel polyphenol oxidase in wheat and related spe- cies // J Cereal Sci. — 2008. — V. 48. — P. 359—368. 23. Jukanti A.K., Bruckner P.L., Fischer A.M. Evaluation of wheat polyphenol oxidase genes // Cereal Chem. — 2004. — V. 81. — P. 481—485. 24. Massa A.N., Beecher B., Morris C.F. Polyphenol oxidase (PPO) in wheat and wild relatives: molecular evidence for a multigene family // Theor Appl Genet. — 2007. — V. 114. — P. 1239—1247. 25. Demeke T., Morris C.F., Campbelle K.J. et al. Wheat Po- lyphenol Oxidase // Crop Sci. — 2001. — V. 41 (6). — Р. 1750—1757. 26. Raman R., Raman H., Martin P. Functional gene markers for polyphenol oxidase locus in bread wheat (Triticum aestivum L.) // Molecular Breeding. — 2007. — V. 19 (4). — P. 315—328. 27. Sun Y., He Z., Ma W. et al. Alternative splicing in the coding region of Ppo-A1 directly influences the po ly- phenol oxidase activity in common wheat (Triticum aes- tivum L.) // Functional & Integrative Genomics. — 2011. — V. 11(1). — P. 85—93. 28. Vatanabe N., Takeuchi A., Nakayama A. Vatanabe N. In- heritance and chromosomal location of the ho moeo lo- gous genes affecting phenol colour reaction of kernels in durum wheat // Euphytica. — 2004. — V. 139. — P. 87—93. 29. Beecher B.S., Skinner D.Z. Molecular cloning and expres- sion analysis of multiple polyphenol oxidase genes in de- veloping wheat (Triticum aestivum) kernels // J Cereal Sci. — 2011. — V. 53. — P. 371-378. 30. Sun D.J., He Z.H., Xia X.C. et al. A novel STS marker for polyphenol oxidase activity in bread wheat // Mol Breed. — 2005. — V. 16. — P. 209—218. 31. He X.Y., He Z.H., Zhang L.P. et al. Allelic variation of po- ly phenol oxidase (PPO) genes located on chromosomes 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes in common wheat // Theor Appl Genet. — 2007. — V. 115. — P. 47—58. 32. Beecher B.S., Carter A.H., See D.R. Genetic mapping of new seed-expressed polyphenol oxidase genes in wheat (Triticum aestivum L.) // Theor Appl Genet. — 2012. — V. 124. — P. 1463—1473. 33. Flintham J.E. Different genetic components control coat- imposed and embryo-imposed dormancy in wheat // Se ed Sci Res. — 2000. — V. 10. — P. 43—50. 34. Warner R.L., Kudrna D.A., Spaeth S.C. et al. Dormancy in white-grain mutants of Chinese Spring wheat (Triticum aestivum L.) // Seed Sci Res. — 2000. — V. 10. — P. 51—60. 35. Himi E., Mares D.J., Yanagisawa A. et al. Effect of grain colour gene (R) on grain dormancy and sensitivity of the embryo to abscisic acid (ABA) in wheat // J Exp Bot. — 2002. — V. 53(374). — P. 1569—1574. 36. Himi E., Nisar A., Noda K. Colour genes (R and Rc) for grain and coleoptile upregulate flavonoid biosynthe- sis ge nes in wheat // Genome. — 2005. — V. 48(4). — P. 747—754. 37. Himi E., Noda K. Isolation and location of three ho moeo- logous dihydroflavonol-4-reductase (DFR) genes of wheat and their tissue-dependent expression // J Exp Bot. — 2004. — V. 55(396). — P. 365—375. 38. Shaner G., Finney R.E. Weather and epidemics of Septoria leaf blotch of wheat // Phytopathology. — 1976. — V. 66. — P. 781—785. 39. Adhikari T.B., Cavaletto J.R., Dubcovsky J. et al. Molecular mapping of the stb4 gene for resistance to Septoria tritici blotch in wheat // In: Phytopathology. — 2004. — V. 94. — P. 1198—1206. 40. Brading P.A., Verstappen E.C.P., Kema G.H.J. et al. A gene- for-gene relationship between wheat and My co sphae rella graminicola, the Septoria tritici blotch pa tho gen // Phy- topathology. — 2002. — V. 92. — P. 439—445. 41. McCartney C.A. Inheritance and chromosomal location of race-specific resistance to Mycosphaerella graminicola in wheat. Ph.D. thesis. University of Manitoba, Win ni- peg, Canada. — 2002. 42. Копусь М.М., Игнатьева Н.Г., Васюшкина Н.Е. и др. Генетический полиморфизм амилолитических фер- ментов зерна пшеницы и генетика ферментов био- 54 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко та ін. синтеза крахмала // Зерновое хозяйство России. — 2009. — № 4. — С. 23—27. 43. Chao S., Sharp P. Chao S. RELP-based genetic map of wheat homeologous group 7 chromosomes // Teor. Appl. Genet. — 1989. — V. 78. — P. 495—504. 44. Rodriguez-Quijano M., Nieto-Taladriz M.T., Carrillo J.M. Polymorphism of waxy proteins in Iberian hexa plo id whe- ats // Plant Breeding. — 1998. — V. 117. — P. 341—344. 45. Saito M., Vrinten P., Nakamura T. DNA markers for iden- tifying waxy mutations and improving noodle quality in wheat // JARQ. — 2010. — V. 44 (2). — P. 109—115. 46. Zhao X.C., Sharp P.J., Crosbie G. et al. A single genetic locus associated with starch granule properties in a cross between wheat cultivars of disparate noodle quality // J. Cereal Sci. — 1998. — V. 27. — P. 7—13. 47. Stewart C.N., Via L.E. Stewart C.N. A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications // Bio Techniques. — 1993. — V. 14(5). — P. 748—749. 48. Рибалка О.І., Червоніс М.В., Щербина З.В. Генетичний по ліморфізм клейковинних білків зерна, пов’язаних з якіс тю борошна пшениці: методи ідентифікації // Зб. наук. праць СГІ НЦНС. — 2007. — Т. 10, № 50. — С. 52—71. 49. Степаненко А.І. Розробка систем молекулярно-ге не- тичних маркерів для детекції якісних ознак у пшени- ці та ячменю: Автореф. дис. канд. біол. наук. — Київ, 2015. — 26 с. 50. Власенко В.А. Створення вихідного матеріалу для адап- тивної селекції і виведення високопродуктивних сор- тів пшениці в умовах Лісостепу України: Автореф. дис. докт. с.-г. наук. — Одесса, 2008. — 48 с. 51. Rogowsky P.M., Shepherd K.W., Langridge P. Polymerase chain reaction based mapping of rye involving repeated DNA sequences // Genome. — 1992. — V. 35. — P.621—626. 52. Saal D., Wricke G. Development of simple sequence re peat markers in rye (Secale cereale L.) // Genome. — 1999. — V. 42. — P. 964—972. 53. Vanzetti L.S., Pflüger L.A., Rodrίguez-Quijano M. et al. Genetic variability for waxy genes in Argentinean bread wheat germplasm// Electronic J. Biotechnol. — 2009. — V. 12. — P. 1—9. 54. Saito M., Vrinten P., Ishikawa G. et al. A novel codominant marker for selection of the null Wx-B1 allele in wheat breeding programs // Mol. Breeding. — 2009. — V. 23. — P. 209—217. 55. Дивашук М.Г., Климушина М.В., Карлов Г.И. Моле ку- ляр но-генетическая характеристика аллеля Wx-B1е мяг кой пшеницы и применимость ДНК маркеров для его идентификации // Генетика. — 2011. — Т. 47. — № 12. — С. 1611—1615. 56. Vrinten P., Nakamura T., Yamamori M. Molecular cha rac- terization of waxy mutations in wheat// Mol. General Genet. — 1999. — V. 261. — P. 463—471. REFERENCES 1. Lukaszewski A.J. Frequency of 1RS.1AL and 1RS.1BL translocations in United States wheat / A.J. Lukaszewski. Crop Sci. 1990. V.30: 1151—1153. 2. McIntosh R.A. Cataloge of gene symbols for wheat. R.A. McIntosh, G. Hart, M. Gale. Proc. of the 8th Intern. Wheat Genet. Symp. Eds Z.S. Li, Z.Y. Xin. Beijing, Chi- na. 1993: 1333—1500. 3. Rabinovich S.V. Importance of wheat-rye translocations for breeding modern cultivars of Triticum aestivum L. S.V. Rabinovich. Euphytica. 1998. V.100: 323—340. 4. Schlegel R. Current list of wheats with rye and alien introgression. Shlegel. 2010. V.5-8: 1—14. 5. Singh N.K. Linkage mapping of genes for resistance to leaf,steam and stripe rust and secalins on the short arm of rye chromosome 1R. N.K. Singh, K.W. Shepherd, R.A. McIntosh. Theor. Appl. Genet. 1990. V.80: 609—616. 6. Catalogue of gene symbols for wheat. Proc. of the 10th Intern. Wheat Genet. Symp. R.A. McIntosh, Y. Yamazaki, K.M. Devos [et al.] Eds N.E.Pogna, M. Romano, G. Gal- terio. Paestum, Italy, 2003: 1—6. 7. Meltz G., Schlegel R., Thiele V. Genetic linkage map of rye. Theor. Appl. Genet. 1992. V.83: 33—45. 8. Kozub N.O., Sozinov I.O., Koljuchyj V.T. ta in. Iden- tyfikacija 1AL/1RS translokacii’ u sortiv m’jakoi’ pshe- nyci ukrai’ns’koi’ selekcii’. Cytologyja y genetyka. 2005. 39(4): 20—24 [in Ukrainian]. 9. Hoffmann B. Alteration of drought tolerance of winter wheat caused by translocation of rye chromosome seg- ment 1R. Cereal Res. Commun. 2008. V.36: 269—278. 10. Kim Y.-Y., Kim D.-Y., Donghwan S. et al. Expression of the novel wheat gene TM20 confers enhanced cadmium tolerance to bakers’ yeast. J. of Biologocal Chemistry. 2008. 283(23): 15893—15902. 11. Kozub N.A., Sozynov Y.A., Sozynov A.A. Soprjazhen- nost’ 1BL/1RS translokacyy s kachestvennіmy y koly- chest vennыmy pryznakamy u mjagkoj pshenycі T. aes- tivum. Cytologyja y genetyka. 2001. 35(5): 74—80 [in Uk rainian]. 12. Zhou Y., He Z.H., Sui X.X. et al.Genetic improvement of grain yield and associated traits in the Northern China winter wheat region from 1960 to 2000. Crop Sci. 2007. V.47: 245—253. 13. Rybalka O.I. Jakist’ pshenyci ta i’i’ polipshennja. Kyiv: Logos, 2011 [in Ukrainian]. 14. Syvolap Ju.M., Chebotar S.V., Sudarchuk L.V. Detekcija 1RS.1AL, 1RS.1BL ta modyfikovanoi’ translokacij za 1RS hromosomoju u selekcijnyh form m’jakoi’ pshenyci. Me- todychni rekomendacii’. Odesa, 2011 [in Ukrainian]. 15. Gupta R.B., Shepherd K.W. Identification of rye chro- mo some 1R translocations and substitutions in hexa- ploid wheats using storage proteins as genetic markers. Plant Breeding. 1992. V.109: 130—140. 55ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці 16. Berzonsky W.F., Francki G. Biochemical, molecular and cytogenetic technologies for characterizing 1RS in wheat: a review. Euphytica. 1999. 108: 1—15. 17. Dexter J.E., Preston K.R., Matsuo R.R. et al. De ve lop- ment of a high extraction flour for the GRL Pilot Mill to evaluate Canadian wheat potential for the Chinese mar- ket. Can Inst Food Sci Technol. 1984. 14: 253—259. 18. Feillet P., Autran J.C., Icard-Verniere C. Pasta brownness: an assessment. J Cereal Sci. 2000. V. 32: 215—233. 19. Simeone R., Pasqualone A., Clodoveo M.L. et al. Genetic mapping of polyphenol oxidase in tetraploid wheat. Cell Mol Biol Lett. 2002. V.7: 763—769. 20. McCallum J.A., Walker J.R.L. O-diphenol oxidase ac ti vi ty, phenolic content and colour of New Zealand whe ats, flours and milling streams. J Cereal Sci. 1990. V.12: 83—96. 21. McCallum J.A., Walker J.R.L. Proanthocyanidins in wheat bran. Cereal Chem. 1990. 67(3): 282—285. 22. Fuerst E.P., Xu S.S., Beecher B. Genetic characterization of kernel polyphenol oxidase in wheat and related spe- cies. J Cereal Sci. 2008. V.48: 359—368. 23. Jukanti A.K., Bruckner P.L., Fischer A.M. Evaluation of wheat polyphenol oxidase genes. Cereal Chem. 2004. V.81: 481—485. 24. Massa A.N., Beecher B., Morris C.F. Polyphenol oxidase (PPO) in wheat and wild relatives: molecular evidence for a multigene family. Theor Appl Genet. 2007. V.114: 1239—1247. 25. Demeke T., Morris C.F., Campbelle K.J. et al. Wheat Po- lyphenol Oxidase. Crop Sci. 2001. 41(6): 1750—1757. 26. Raman R., Raman H., Martin P. Functional gene mar- kers for polyphenol oxidase locus in bread wheat (Tri- ticum aestivum L.). Molecular Breeding. 2007. 19(4): 315—328. 27. Sun Y., He Z., Ma W. et al. Alternative splicing in the coding region of Ppo-A1 directly influences the poly- phenol oxidase activity in common wheat (Triticum aes- tivum L.). Functional & Integrative Genomics. 2011. 11(1): 85—93. 28. Vatanabe N., Takeuchi A., Nakayama A. Vatanabe N. In- heritance and chromosomal location of the homoeolo- gous genes affecting phenol colour reaction of kernels in durum wheat. Euphytica. 2004. V.139: 87—93. 29. Beecher B.S., Skinner D.Z. Molecular cloning and ex- pression analysis of multiple polyphenol oxidase genes in developing wheat (Triticum aestivum) kernels. J Cereal Sci. 2011. V.53: 371-378. 30. Sun D.J., He Z.H., Xia X.C. et al. A novel STS marker for polyphenol oxidase activity in bread wheat. Mol Breed. 2005. V.16: 209—218. 31. He X.Y., He Z.H., Zhang L.P. et al. Allelic variation of polyphenol oxidase (PPO) genes located on chro mo so- mes 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes in common wheat. Theor Appl Genet. 2007. V.115: 47—58. 32. Beecher B.S., Carter A.H., See D.R. Genetic mapping of new seed-expressed polyphenol oxidase genes in wheat (Triticum aestivum L.). Theor Appl Genet. 2012. V.124: 1463—1473. 33. Flintham J.E. Different genetic components control coat-imposed and embryo-imposed dormancy in wheat. Seed Sci Res. 2000. V.10: 43—50. 34. Warner R.L., Kudrna D.A., Spaeth S.C. et al. Dormancy in white-grain mutants of Chinese Spring wheat (Tri ti- cum aestivum L.). Seed Sci Res. 2000. V.10: 51—60. 35. Himi E., Mares D.J., Yanagisawa A. et al. Effect of grain colour gene (R) on grain dormancy and sensitivity of the embryo to abscisic acid (ABA) in wheat. J Exp Bot. 2002. 53(374): 1569—1574. 36. Himi E., Nisar A., Noda K. Colour genes (R and Rc) for grain and coleoptile upregulate flavonoid biosynthesis genes in wheat. Genome. 2005. 48(4): 747—754. 37. Himi E., Noda K. Isolation and location of three ho moeo- logous dihydroflavonol-4-reductase (DFR) genes of wheat and their tissue-dependent expression. J Exp Bot. 2004. 55(396): 365—375. 38. Shaner G., Finney R.E. Weather and epidemics of Sep- toria leaf blotch of wheat. Phytopathology. 1976. V.66: 781—785. 39. Adhikari T.B., Cavaletto J.R., Dubcovsky J. et al. Mo le- cu lar mapping of the stb4 gene for resistance to Septo- ria tritici blotch in wheat. Phytopathology. 2004. V.94: 1198—1206. 40. Brading P.A., Verstappen E.C.P., Kema G.H.J. et al. A gene-for-gene relationship between wheat and Myco- spha erella graminicola, the Septoria tritici blotch patho- gen. Phytopathology. 2002. V.92: 439—445. 41. McCartney C.A. Inheritance and chromosomal location of race-specific resistance to Mycosphaerella graminicola in wheat. Ph.D. thesis. University of Manitoba, Win ni- peg, Canada. 2002. 42. Kopus’ M.M., Ignat’eva N.G., Vasjushkina N.E. i dr. Ge- ne ticheskij polimorfizm amiloliticheskih fermentov zer- na pshenicy i genetika fermentov biosinteza krahmala. Zer novoe hozjajstvo Rossii. 2009, no 4: 23—27 [in Rus- sian]. 43. Chao S., Sharp P. Chao S. RELP-based genetic map of wheat homeologous group 7 chromosomes. Teor. Appl. Genet. 1989. V.78: 495—504. 44. Rodriguez-Quijano M., Nieto-Taladriz M.T., Carrillo J.M. Polymorphism of waxy proteins in Iberian he xa plo- idwheats. Plant Breeding. 1998. V.117: 341—344. 45. Saito M., Vrinten P., Nakamura T. DNA markers for iden- tifying waxy mutations and improving noodle quality in wheat. JARQ. 2010. 44(2): 109—115. 46. Zhao X.C., Sharp P.J., Crosbie G. et al. A single genetic locus associated with starch granule properties in a cross between wheat cultivars of disparate noodle quality. J. Ce real Sci. 1998. V.27: 7—13. 56 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2016, 12(2) Б.В. Моргун, А.І. Степаненко, О.В. Степаненко та ін. 47. Stewart C.N., Via L.E. Stewart C.N. A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications. Bio Techniques. 1993. 14(5): 748—749. 48. Rybalka O.I., Chervonis M.V., Shherbyna Z.V. Ge ne tych- nyj polimorfizm klejkovynnyh bilkiv zerna, pov’ja za nyh z jakistju boroshna pshenyci: metody identyfikacii’. Zb. nauk. prac’ SGI NCNS. 2007. 10(50): 52—71 [in Ukrainian]. 49. Stepanenko A.I. Avtoreferat, 2015 [in Ukrainian]. 50. Vlasenko V.A. Stvorennja vyhidnogo materialu dlja adap- tyvnoi’ selekcii’ i vyvedennja vysokoproduktyvnyh sortiv pshenyci v umovah Lisostepu Ukrai’ny. Avtoref. dys. dokt. s.-g. nauk. Odessa, 2008 [in Ukrainian]. 51. Rogowsky P.M., Shepherd K.W., Langridge P. Poly me- ra se chain reaction based mapping of rye involving re- peated DNA sequences. Genome. 1992. V.35: 621—626. 52. Saal D., Wricke G. Development of simple sequence re- peat markers in rye (Secale cereale L.). Genome. 1999. V.42: 964—972. 53. Vanzetti L.S., Pflüger L.A., Rodrίguez-Quijano M. et al. Genetic variability for waxy genes in Argentinean bread wheat germplasm. Electronic J. Biotechnol. 2009. V.12: 1—9. 54. Saito M., Vrinten P., Ishikawa G. et al. A novel codo mi nant marker for selection of the null Wx-B1 allele in wheat breeding programs. Mol. Breeding. 2009. V.23: 209—217. 55. Divashuk M.G., Klimushina M.V., Karlov G.I. Mole ku ljar- no-geneticheskaja harakteristika allelja Wx-B1e mjag koj pshenicy i primenimost' DNK markerov dlja ego iden ti fi- ka cii. Genetika. 2011. 47(12): 1611—1615 [in Russian]. 56. Vrinten P., Nakamura T., Yamamori M. Molecular cha- rac terization of waxy mutations in wheat. Mol. General Genet. 1999. V.261: 463—471. Б.В. Моргун, А.И. Степаненко, Е.В. Степаненко, М.А. Банникова, А.В. Голубенко, И.А. Нитовская, П.Д. Майстров, Д.М. Гродзинский Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев ВНЕДРЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ СОРТОВ Внедрены молекулярные системы определения гене- тического полиморфизма для 100 сортов озимой пше- ницы: проведен скрининг наличия ценных аллелей, на основе полимеразных цепных реакций; установлен уро- вень распространения аллелей низкой и средней ак- тивности полифенолоксидазных ферментов и проведе- на валидация. Определены сорта пшеницы с ржаными транслокациями 1AL.1RS, 1BL.1RS, рецессивным ал- лелем гена Tamyb10, геном устойчивости к септориозу Stb4, сцепленным с полиморфным локусом Xgwm111. Выявлен сорт вакси-пшеницы и сорта-носители нети- пичного функционального аллеля Wx-B1е. Составлена характеристика 100 элитных и перспективных сортов пшеницы по наличию ценных аллелей генов, детерми- нирующих качественные признаки зерна (гены PPO, Tamyb10-A1, Wx) и устойчивость к биотическим и абио- тическим стрессовым факторам (ржаной транс ло ка ци- он ный материал, Tamyb10-A1, Stb4). Ключевые слова: пшеница, аллель, праймер, качест- венные характеристики зерна, полимеразная цепная ре- акция. B.V. Morgun, A.I. Stepanenko, O.V. Stepanenko, M.A. Bannikova, A.V. Holubenko, I.O. Nitovska, P.D. Maystrov, D.M. Grodzinsky Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, the NAS of Ukraine, Kyiv IMPLEMENTATION OF MOLECULAR SYSTEMS FOR IDENTIFICATION OF GENETIC POLYMORPHISM IN WINTER WHEAT TO OBTAIN HIGH-PERFORMANCE SPECIALIZED VARIETIES The molecular genetic polymorphism detection systems to screen the presence of alleles in winter wheat 100 variet- ies were developed. Polymerase chain reactions were de- ployed to identify relevant genes. The level of allele preva- lence of low and medium activity of polyphenol oxidase en- zymes was defined and the validation was carried out. Wheat varieties carrying rye 1AL.1RS, 1BL.1RS translocations were characterized and those containing recessive allele of Tamyb10 gene, with Stb4 gene resistance to Septoria linked to polymorphic locus Xgwm111. Waxy wheat variety was discovered and other varieties carrying atypical functional Wx-B1e allele. Characteristics of 100 elite and perspective varieties of wheat were compiled for the presence of alleles of genes determining grain quality (genes PPO, Tamyb10- A1, Wx), resistance to biotic and abiotic stress (rye trans- locative material, Tamyb10-A1, Stb4). Keywords: wheat, allele, primer, grain quality cha rac te- ristics, polymerase chain reactions. Стаття надійшла до редакції 27.07.15

Впровадження молекулярних систем визначення генетичного поліморфізму озимої пшениці для отримання високопродуктивних спеціалізованих сортів

Репозитарії

Схожі ресурси