Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака
Розроблено оригінальний метод виділення з клітин рослин малих регуляторних РНК (si/miRNA). За допомогою ПЛР проведено полімеразне копіювання фрагмента кДНК гена 8H07 нематоди Heterodera schachtii. Шляхом гібридизації si/miRNA рослин з фрагментом кДНК консервативної ділянки у гена 8H07 нематоди підтв...
Збережено в:
| Дата: | 2012 |
|---|---|
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
2012
|
| Назва видання: | Цитология и генетика |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126497 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака / В.А. Циганкова, Я.В. Андрусевич, С.П. Пономаренко, А.П. Галкін, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2012. — Т. 46, № 6. — С. 3-11. — Бібліогр.: 49 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-126497 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1264972017-11-26T03:01:58Z Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака Циганкова, В.А. Андрусевич, Я.В. Пономаренко, С.П. Галкін, А.П. Блюм, Я.Б. Оригинальные работы Розроблено оригінальний метод виділення з клітин рослин малих регуляторних РНК (si/miRNA). За допомогою ПЛР проведено полімеразне копіювання фрагмента кДНК гена 8H07 нематоди Heterodera schachtii. Шляхом гібридизації si/miRNA рослин з фрагментом кДНК консервативної ділянки у гена 8H07 нематоди підтверджено високий ступінь їхньої гомології. В подальшому ампліфікований кДНК фрагмент гена 8H07 нематоди буде використано для створення рекомбінантного гена з антисенсовою послідовністю dsRNA для підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди. Разработан оригинальный метод выделения из клеток растений малых регуляторных РНК (si/miRNA). С помощью ПЦР осуществлено полимеразное копирование фрагмента кДНК гена 8H07 Heterodera schachtii. Путем гибридизации si/miRNA растений с фрагментом кДНК консервативного участка гена 8H07 нематоды подтверждена их высокая степень гомологии. В дальнейшем амплифицированный кДНК фрагмент гена 8H07 нематоды будет использован для создания рекомбинантного гена с антисенсовой последовательностью dsRNA для повышения устойчивости растений рапса к паразитической нематоде. Original method of small regulatory si/miRNA isolation from plant cells was elaborated. PCR amplification of fragment cDNA 8H07 nematode Heterodera schachtii gene was carried out. Using Northernblot method hybridization of plant si/miRNA with cDNA fragment of conservative region 8H07 gene the presence of their high homology is found out. The amplified cDNA fragment of nematode 8H07 gene in future will be used for creation recombinant gene with complementary antisense dsRNA sequence for increasing resistance of rape plants to parasitic nematodes. 2012 Article Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака / В.А. Циганкова, Я.В. Андрусевич, С.П. Пономаренко, А.П. Галкін, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2012. — Т. 46, № 6. — С. 3-11. — Бібліогр.: 49 назв. — укр. 0564-3783 DOI: 10.3103/S0095452712060114 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126497 631. 811. 98 75. 117. 2. 577. 2. 08 uk Цитология и генетика Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Оригинальные работы Оригинальные работы |
| spellingShingle |
Оригинальные работы Оригинальные работы Циганкова, В.А. Андрусевич, Я.В. Пономаренко, С.П. Галкін, А.П. Блюм, Я.Б. Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака Цитология и генетика |
| description |
Розроблено оригінальний метод виділення з клітин рослин малих регуляторних РНК (si/miRNA). За допомогою ПЛР проведено полімеразне копіювання фрагмента кДНК гена 8H07 нематоди Heterodera schachtii. Шляхом гібридизації si/miRNA рослин з фрагментом кДНК консервативної ділянки у гена 8H07 нематоди підтверджено високий ступінь їхньої гомології. В подальшому ампліфікований кДНК фрагмент гена 8H07 нематоди буде використано для створення рекомбінантного гена з антисенсовою послідовністю dsRNA для підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди. |
| format |
Article |
| author |
Циганкова, В.А. Андрусевич, Я.В. Пономаренко, С.П. Галкін, А.П. Блюм, Я.Б. |
| author_facet |
Циганкова, В.А. Андрусевич, Я.В. Пономаренко, С.П. Галкін, А.П. Блюм, Я.Б. |
| author_sort |
Циганкова, В.А. |
| title |
Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака |
| title_short |
Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака |
| title_full |
Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака |
| title_fullStr |
Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака |
| title_full_unstemmed |
Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака |
| title_sort |
отримання та ампліфікація кднк консервативної ділянки гена 8h07 нематоди heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака |
| publisher |
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України |
| publishDate |
2012 |
| topic_facet |
Оригинальные работы |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126497 |
| citation_txt |
Отримання та ампліфікація кДНК консервативної ділянки гена 8H07 нематоди Heterodera shcachtii з високою спорідненістю до його гомолога у ріпака / В.А. Циганкова, Я.В. Андрусевич, С.П. Пономаренко, А.П. Галкін, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2012. — Т. 46, № 6. — С. 3-11. — Бібліогр.: 49 назв. — укр. |
| series |
Цитология и генетика |
| work_keys_str_mv |
AT cigankovava otrimannâtaamplífíkacíâkdnkkonservativnoídílânkigena8h07nematodiheteroderashcachtiizvisokoûsporídnenístûdojogogomologaurípaka AT andrusevičâv otrimannâtaamplífíkacíâkdnkkonservativnoídílânkigena8h07nematodiheteroderashcachtiizvisokoûsporídnenístûdojogogomologaurípaka AT ponomarenkosp otrimannâtaamplífíkacíâkdnkkonservativnoídílânkigena8h07nematodiheteroderashcachtiizvisokoûsporídnenístûdojogogomologaurípaka AT galkínap otrimannâtaamplífíkacíâkdnkkonservativnoídílânkigena8h07nematodiheteroderashcachtiizvisokoûsporídnenístûdojogogomologaurípaka AT blûmâb otrimannâtaamplífíkacíâkdnkkonservativnoídílânkigena8h07nematodiheteroderashcachtiizvisokoûsporídnenístûdojogogomologaurípaka |
| first_indexed |
2025-07-09T05:09:37Z |
| last_indexed |
2025-07-09T05:09:37Z |
| _version_ |
1837144770598666240 |
| fulltext |
3
Îðèãèíàëüíûå ðàáîòû
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 6
© Â.À. ÖÈÃÀÍÊÎÂÀ, ß.Â. ÀÍÄÐÓÑÅÂÈ×,
Ñ.Ï. ÏÎÍÎÌÀÐÅÍÊÎ, À.Ï. ÃÀËʲÍ, ß.Á. ÁËÞÌ, 2012
УДК 631. 811. 98 75. 117. 2. 577. 2. 08
В.А. ЦИГАНКОВА 1, Я.В. АНДРУСЕВИЧ 1,
С.П. ПОНОМАРЕНКО 2, А.П. ГАЛКІН 3, Я.Б. БЛЮМ 3
1 Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ
E-mail: vTsygankova@ukr.net
2 Міжвідомчий науково-технологічний центр «Агробіотех»
НАН і МОН України, Київ
3 Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Київ
E-mail: cellbio@cellbio.freenet.viaduk.net
ОТРИМАННЯ ТА АМПЛІФІКАЦІЯ
кДНК КОНСЕРВАТИВНОЇ
ДІЛЯНКИ ГЕНА 8H07 НЕМАТОДИ
HETERODERA SCHACHTII З ВИСОКОЮ
СПОРІДНЕНІСТЮ ДО ЙОГО
ГОМОЛОГА У РІПАКА
Ðîçðîáëåíî îðèã³íàëüíèé ìåòîä âèä³ëåííÿ ç êë³òèí
ðîñëèí ìàëèõ ðåãóëÿòîðíèõ ÐÍÊ (si/miRNA). Çà äî-
ïîìîãîþ ÏËÐ ïðîâåäåíî ïîë³ìåðàçíå êîï³þâàííÿ ôðàã-
ìåíòà êÄÍÊ ãåíà 8H07 íåìàòîäè Heterodera scha-
chtii. Øëÿõîì ã³áðèäèçàö³¿ si/miRNA ðîñëèí ç ôðàã-
ìåíòîì êÄÍÊ êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ó ãåíà 8H07
íåìàòîäè ï³äòâåðäæåíî âèñîêèé ñòóï³íü ¿õíüî¿ ãîìî-
ëî㳿.  ïîäàëüøîìó àìïë³ô³êîâàíèé êÄÍÊ ôðàã-
ìåíò ãåíà 8H07 íåìàòîäè áóäå âèêîðèñòàíî äëÿ
ñòâîðåííÿ ðåêîìá³íàíòíîãî ãåíà ç àíòèñåíñîâîþ ïî-
ñë³äîâí³ñòþ dsRNA äëÿ ï³äâèùåííÿ ñò³éêîñò³ ðîñëèí
ð³ïàêà äî ïàðàçèòè÷íî¿ íåìàòîäè.
Âñòóï. Ïàðàçèòè÷í³ íåìàòîäè äëÿ á³ëü-
øîñò³ ñ³ëüñüêîãîñïîäàðñüêèõ âèä³â ðîñëèí º
³íôåêö³éíèìè òà ðóéí³âíèìè øê³äíèêàìè,
ùî ñïðè÷èíÿþòü âåëèê³ âòðàòè âðîæàþ. Â
óñüîìó ñâ³ò³ ùîð³÷í³ âòðàòè âðîæà¿â âíàñë³äîê
óðàæåííÿ ðîñëèí íåìàòîäàìè ñòàíîâëÿòü ïî-
íàä 125 ìëðä äîëàð³â [1].
Ïàðàçèòè÷í³ íåìàòîäè íàëåæàòü äî îáë³-
ãàòíèõ åíäîïàðàçèò³â, ÿê³ ìàþòü ïîñò³éíó ëî-
êàë³çàö³þ â ì³ñöÿõ óðàæåííÿ ðîñëèí-ãîñïî-
äàð³â. Ñâ³é æèòòºâèé öèêë âîíè ïî÷èíàþòü
ÿê îðãàí³çìè, ùî íåñïðîìîæí³ õàð÷óâàòèñÿ,
ïåðåòâîðþþ÷èñü íà þâåí³ëüí³é ñòà䳿 ðîç-
âèòêó â ³íôåêö³éí³ ëè÷èíêè, ÿê³ ³ ïîòðàïëÿ-
þòü ³ç ãðóíòó â êîðåí³ ðîñëèí-ãîñïîäàð³â.
Äëÿ óñï³øíîãî ïàðàçèòóâàííÿ íåìàòîäè
âèêîðèñòîâóþòü ñåêðåòîðí³ á³ëêè, ÿê³ ÷åðåç
êðèõ³òíèé îòâ³ð âñìîêòóâàëüíî¿ òðóáî÷êè
(ñòèëåò) ââîäÿòüñÿ íèìè â ñïåö³àë³çîâàí³
ìåòàáîë³÷íî àêòèâí³ áàãàòîÿäåðí³ êë³òèíè
ðîñëèí, çàâäÿêè ÷îìó íåìàòîäè îòðèìóþòü
ïîæèâí³ ðå÷îâèíè [2]. Ö³ êë³òèíè – ñàéòè
õàð÷óâàííÿ (ñèíòèö³¿) – óòâîðþþòüñÿ â ïðî-
öåñ³ äèôåðåíö³àö³¿ ³ç çâè÷àéíèõ êë³òèí ðîñ-
ëèí ³ ìàþòü âèãëÿä àáî ã³ãàíòñüêèõ êë³òèí,
ùî º ñïåöèô³÷íèìè äëÿ íåìàòîä êîðåíåâèõ
âóçë³â, àáî ñõîæèõ íà öèñòè êë³òèí, ÿê³ º
õàðàêòåðíèìè äëÿ öèñòîóòâîðþþ÷èõ íåìà-
òîä. Ñåêðåòîðí³ á³ëêè íåìàòîä â ³íô³êîâàíèõ
íèìè êë³òèíàõ ðîñëèí âèêëèêàþòü çíà÷í³
ïîðóøåííÿ åêñïðåñ³¿ ãåí³â øëÿõîì ïðÿìîãî
ïðîíèêíåííÿ äî ÿäðà [2, 3] àáî æ ÷åðåç
á³ëêè-ïîñåðåäíèêè [4, 5], âíàñë³äîê ÷îãî
çì³íþºòüñÿ êë³òèííèé öèêë [6], â³äáóâàºòüñÿ
ðåîðãàí³çàö³ÿ öèòîñêåëåòó [7], ïîðóøóþòüñÿ
ïðîöåñè åíäîðåäóïë³êàö³¿ òà äåãðàäàö³¿ á³ëê³â-
ì³øåíåé [8], ðåãóëÿö³ÿ ñèãíàëüíèõ ³ ìåòàáî-
ë³÷íèõ ïðîöåñ³â [9], çì³íþºòüñÿ áàëàíñ ô³òî-
ãîðìîí³â [10], çíèæóþòüñÿ ³ìóíîçàõèñí³ ðåàê-
ö³¿ ðîñëèí òà ïðèïèíÿºòüñÿ ð³ñò ³ ðîçâèòîê ¿õ
â ö³ëîìó [11].
Íèí³ ³äåíòèô³êîâàíî ïîíàä 60 ô³òîïàðà-
çèòè÷íèõ ãåí³â, ùî êîíòðîëþþòü æèòòºâèé
öèêë ó íåìàòîä [12, 13]. Äåÿê³ ç öèõ ãåí³â
ìàþòü âèñîêèé ð³âåíü ãîìîëî㳿 ç áàãàòüìà
åóêàð³îòè÷íèìè ãåíàìè [2]. Ïðîäóêòàìè ¿õ-
íüî¿ åêñïðåñ³¿ º íàéá³ëüø ôóíêö³îíàëüíî
âàæëèâ³ äëÿ íåìàòîä á³ëêè, ùî áåðóòü
ó÷àñòü â ðåïë³êàö³¿ ÄÍÊ, òðàíñêðèïö³¿, ïðî-
öåñèíãó ÐÍÊ, ñèíòåç³ òÐÍÊ, òðàíñëÿö³¿, êîí-
òðîë³ ôóíêö³îíóâàííÿ ðèáîñîì ³ òÐÍÊ, ïðî-
öåñàõ ìîäèô³êàö³¿, ñåêðåö³¿, ïåðåíîñó á³ëê³â
4 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 6
Â.À. Öèãàíêîâà, ß.Â. Àíäðóñåâè÷, Ñ.Ï. Ïîíîìàðåíêî òà ³í.
òà êîíòðîë³ ¿õ ñòàá³ëüíîñò³ ³ äåãðàäàö³¿, êîí-
òðîë³ ôóíêö³é ì³òîõîíäð³é òà ìåòàáîë³çìó
á³ëê³â-ïîñåðåäíèê³â, êîíòðîë³ êë³òèííîãî öèê-
ëó, ñòðóêòóðè êë³òèí, ïåðåäà÷³ åíäî- òà ì³æ-
êë³òèííèõ ñèãíàë³â, ïðîöåñ³â åíäîöèòîçó, ³îí-
í³é ðåãóëÿö³¿, à òàêîæ á³ëêè, â³äïîâ³äàëüí³ çà
ðåïðîäóêòèâíèé öèêë íåìàòîä (íàïðèêëàä, ìà-
æîðíèé á³ëîê ñïåðìè àáî õ³òèíñèíòåòàçà) [14].
 ïðèðîäíèõ óìîâàõ öåíòðàëüíó ðîëü â
áîðîòüá³ ç ïàòîãåííèìè îðãàí³çìàìè ó êë³òè-
íàõ ðîñëèí â³ä³ãðàþòü ìàë³ ðåãóëÿòîðí³ ÐÍÊ
(si/miRNA), ñòðóêòóðà ÿêèõ º àíòèñåíñîâîþ
äî ïåâíèõ ä³ëÿíîê ìÐÍÊ ïàðàçèò³â. Øëÿõîì
êîìïëåìåíòàðíîãî ñïàðþâàííÿ ç öèìè ìÐÍÊ
â êë³òèíàõ si/miRNA ³íã³áóþòü òðàíñëÿö³þ
÷óæèííî¿ ìÐÍÊ. Ó á³ëüøîñò³ ðîñëèí ê³ëü-
êîñò³ si/miRNA, ùî ñèíòåçóºòüñÿ, íåäîñòàò-
íüî äëÿ ïðîòè䳿 ïàòîãåííèì îðãàí³çìàì [15–
23]. Àëå ç îñâîºííÿì òåõíîëî㳿 ³íòåðôå-
ðåíö³¿ ÐÍÊ (RNAi) ñòàëî ìîæëèâèì ðîç-
âèâàòè ãåííî-³íæåíåðí³ ñòðàòå㳿 êîíòðîëþ
ðîçïîâñþäæåííÿ íåìàòîä øëÿõîì ïîñòòðàíñ-
ëÿö³éíîãî ñàéëåíñ³íãó ãåí³â, ÿê³ º æèòòºâî
âàæëèâèìè äëÿ ïàðàçèòè÷íîãî öèêëó òà ïî-
òðàïëÿííÿ â îðãàí³çì ðîñëèíè-ãîñïîäàðÿ. ³ä-
êðèòòÿ ìàëèõ ðåãóëÿòîðíèõ ÐÍÊ (si/miRNA),
ùî âèêîíóþòü ãîëîâíó ðîëü â ðåãóëÿö³¿
ïîñòòðàíñëÿö³éíîãî ñàéëåíñ³íãó ãåí³â, íàäàº
ìîæëèâîñò³ çä³éñíþâàòè êîíòðîëü åêñïðåñ³¿
ãåí³â òà ïðîâîäèòè àíàë³ç ¿õí³õ ôóíêö³é [25].
Îñòàíí³ì ÷àñîì âåëèê³ óñï³õè äîñÿãíóòî
ó êëîíóâàíí³ öèõ ãåí³â, êîíñòðóþâàíí³ íà
¿õí³é îñíîâ³ àíòèñåíñîâèõ dsRNA âåêòîð³â òà
ñòâîðåíí³ òðàíñãåííèõ ðîñëèí ³ç ï³äâèùåíîþ
ñò³éê³ñòþ äî íåìàòîä-ïàðàçèò³â [25–28]. Ïàðà-
ëåëüíî òàêîæ ³äåíòèô³êîâàíî ãåíè ðîñëèí-
ãîñïîäàð³â, ã³ïåðåêñïðåñ³ÿ ÿêèõ ñïðèÿº ïðî-
íèêíåííþ òà ðîçìíîæåííþ ïàðàçèòè÷íèõ íå-
ìàòîä. Âñòàíîâëåíî, ùî áëîêóâàííÿ åêñïðå-
ñ³¿ öèõ ãåí³â çà äîïîìîãîþ òðàíñôîðìàö³¿
àíòèñåíñîâèìè (êîìïëåìåíòàðíèìè) äî ¿õ
íóêëåîòèäíèõ ïîñë³äîâíîñòåé si/miRNA ñïðè-
÷èíÿº ï³äâèùåííÿ ðåçèñòåíòíîñò³ ðîñëèí äî
ïàòîãåí³â, â ðåçóëüòàò³ ÷îãî çíèæóºòüñÿ ðóõ-
ëèâ³ñòü ëè÷èíîê íåìàòîä, çäàòí³ñòü ïðîíè-
êàòè ó êîðåí³ ³ ôîðìóâàòè ñàéòè õàð÷óâàííÿ,
ïîðóøóþòüñÿ ìåòàìîðôîç òà ðåïðîäóêòèâíèé
öèêë íåìàòîä [29–32].
Äî íàéá³ëüø âàæëèâèõ ô³òîïàðàçèòè÷íèõ
ãåí³â, ùî êîíòðîëþþòü æèòòºâèé öèêë öèñòî-
óòâîðþþ÷î¿ íåìàòîäè ñî¿ Heterodera glycines ³
öèñòîóòâîðþþ÷î¿ íåìàòîäè öóêðîâèõ áóðÿê³â
Heterodera schachtii (ÿêà ïàðàçèòóº òàêîæ íà
ðîñëèíàõ ð³ïàêà), íàëåæàòü ñ³ìåéñòâà ãåí³â
ñåêðåòîðíèõ á³ëê³â êë³òèí äîðçàëüíèõ åçî-
ôàãåàëüíèõ çàëîç íåìàòîä. Äî íèõ íàëåæàòü
ãåíè 3B05 (AF469058), 4G06 (AF469060), 8H07
(AF500024) òà 10A06 (AF502391), ùî õàðàêòå-
ðèçóþòüñÿ âèñîêèì ñòóïåíåì ãîìîëî㳿 (90 %)
ó öèõ âèä³â íåìàòîä (¿õí³ íóêëåîòèäí³ ïîñ-
ë³äîâíîñò³ ³äåíòè÷í³ íà 40 % ãåíàì ðîñëèí-
ãîñïîäàð³â) [8], à òàêîæ ãåí Hs4F01, ùî ìàº
íóêëåîòèäíó ïîñë³äîâí³ñòü, íà 33 % ³äåíòè÷-
íó ãîìîëîã³÷íîìó ãåíó ðîñëèí [33]. Êîíñòè-
òóö³éíà åêñïðåñ³ÿ öèõ ãåí³â â ðîñëèíàõ-
ãîñïîäàðÿõ ñïðèÿº ã³ïåð÷óòëèâîñò³ äî íåìà-
òîäíî¿ ³íôåêö³¿, òîáòî óðàæåííþ ðîñëèí íå-
ìàòîäàìè.  îðãàí³çìàõ íåìàòîä ï³ê åêñïðåñ³¿
ãåíà Hs4F01 ñïîñòåð³ãàºòüñÿ ïðè ôîðìóâàíí³
ñèíòèö³é ó ðîñëèí, à ³íø³ ÷îòèðè ãåíè – 3B05,
4G06, 8H07 òà 10A06 – ã³ïåðåêñïðåñóþòüñÿ â
ïåð³îä ï³ñëÿ õàð÷óâàííÿ íåìàòîä [8, 34].
Ç’ÿñîâàíî á³îëîã³÷í³ ôóíêö³¿ á³ëê³â, ùî
êîäóþòüñÿ öèìè ãåíàìè. Ãåí 3B05 êîäóº á³ëîê,
ÿêèé ìຠäîìåí, ùî çâ’ÿçóº öåëþëîçó [35].
Ãåí 4G06 êîäóº ³äåíòè÷íèé øèðîêî ðîçïîâ-
ñþäæåíîìó ó ðîñëèí á³ëêó óá³õ³òèíó ïåïòèä,
ùî ìຠ14 àì³íîêèñëîò, ç óí³êàëüíèì, ïðè-
ñóòí³ì ò³ëüêè ó íåìàòîä Ñ-ê³íöåâèì äîìå-
íîì, ÿêèé ìîæå áóòè ì³øåííþ äëÿ ñàé-
ëåíñ³íãó àíòèñåíñîâèìè si/miRNA, ùî ñèí-
òåçóþòüñÿ ó òðàíñãåííèõ ðîñëèíàõ [8, 12].
Ãåí 8H07 êîäóº á³ëîê, ³äåíòè÷íèé SKP1
á³ëêàì ðîñëèí, ùî º êîìïîíåíòàìè SCF-
êîìïëåêñó ïðîòåîë³òè÷íèõ ôåðìåíò³â (ïðî-
òåîñîìè), çà ó÷àñò³ ÿêîãî â³äáóâàºòüñÿ ïðîöåñ
ïîë³óá³õ³òèíóâàííÿ òà äåãðàäàö³¿ á³ëê³â [8,
12]. Âèÿâëåíî, ùî öåé íåìàòîäíèé ãåí 8H07
ìຠêîíñåðâàòèâíó ä³ëÿíêó (CR) 8H07CR, ãî-
ìîëîã³÷íó êîíñåðâàòèâí³é ä³ëÿíö³ ãåíà 8H07
ðîñëèí, ùî êîäóº SKP1 á³ëêè, à òàêîæ óí³-
êàëüíèé ðåã³îí (UR) 8H07UR, ñïåöèô³÷íèé
ò³ëüêè äëÿ íåìàòîä. Çàâäÿêè ïðèñóòíîñò³ ó
êîíñåðâàòèâí³é ä³ëÿíö³ ãåíà 8H07 íåìàòîä
çíà÷íî¿ ê³ëüêîñò³ íóêëåîòèäíèõ ïîñë³äîâ-
íîñòåé, ùî â³äð³çíÿþòüñÿ â³ä ïîñë³äîâíîñòåé
ðîñëèí, à òàêîæ ïðèñóòíîñò³ óí³êàëüíî¿ äëÿ
íåìàòîä ä³ëÿíêè UR ñòâîðþºòüñÿ ìîæëè-
â³ñòü óíèêíóòè íåñïåöèô³÷íîãî ñàéëåíñ³íãó
öüîãî ãåíà ó ðîñëèí, òîìó ùî ä³ëÿíêè ³ CR,
5ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 6
Îòðèìàííÿ òà àìïë³ô³êàö³ÿ êÄÍÊ êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8Í07 íåìàòîäè
³ UR ìîæíà âèêîðèñòîâóâàòè äëÿ êîíñòðó-
þâàííÿ âåêòîð³â åêñïðåñ³¿ ç àíòèñåíñîâèìè
äî íèõ dsRNA â òðàíñãåííèõ ðîñëèíàõ. Ãåí
10A06 êîäóº á³ëîê, ³äåíòè÷íèé RING-H2
Zinc-finger-á³ëêàì ðîñëèí – êîìïîíåíòàì
SCF-êîìïëåêñó, ùî â³äïîâ³äຠçà ïîë³óá³õè-
òèíóâàííÿ á³ëê³â [8, 12]. Äëÿ åêñïåðèìåíò³â
ç RNAi ì³øåííþ ìîæå áóòè îáðàíèé äîìåí
ãåíà 10A06, ùî êîäóº RING-H2 Zinc-finger-
á³ëîê, àëå çà íóêëåîòèäíîþ ïîñë³äîâí³ñòþ
³ñòîòíî â³äð³çíÿºòüñÿ â³ä àíàëîã³÷íîãî äîìå-
íó ãåíà 10A06 ðîñëèí, çàâäÿêè ÷îìó ìîæíà
óíèêíóòè íåñïåöèô³÷íîãî ñàéëåíñ³íãó öüîãî
ãåíà ó ðîñëèí.
Ãåí Hs4F01, ùî êîäóº á³ëîê àíåêñèí, ìàº
÷îòèðè êîíñåðâàòèâíèõ äîìåíè. Âîíè ñêëà-
äàþòüñÿ ç 60–70 íóêëåîòèäíèõ ïîñë³äîâíîñ-
òåé, ÿê³ ÷îòèðèêðàòíî ïîâòîðþþòüñÿ òà ìà-
þòü ñàéòè çâ’ÿçêó ç êàëüö³ºì [8, 36]. Ðîäèíà
á³ëê³â àíåêñèí³â áåðå ó÷àñòü â ïðîöåñàõ, ùî
ðåãóëþþòüñÿ êàëüö³ºì íà ïîâåðõí³ êë³òèí-
íèõ ìåìáðàí íåìàòîä. Â êë³òèíàõ ðîñëèí
á³ëêè àíåêñèíè âèêîíóþòü á³ëüø ð³çíîìàí³ò-
í³ ôóíêö³¿. Íàïðèêëàä, àíåêñèíè ãîðîõó òà
êóêóðóäçè êîíöåíòðóþòüñÿ â ñåêðåòîðíèõ êë³-
òèíàõ êîðåíåâèõ ÷îõëèê³â ó êñèëåì³ òà ôëî-
åì³ [37, 38]. Àíåêñèíè áàâîâíèêó ³íã³áóþòü
àêòèâí³ñòü ôåðìåíòó êàëîçîñèíòåòàçè [38], à
ó Arabidopsis ³ñíóº íå ìåíøå âîñüìè ãåí³â
àíåêñèí³â, äåÿê³ ç êîòðèõ åêñïðåñóþòüñÿ ó
â³äïîâ³äü íà àá³îòè÷í³ ñòðåñè òà âèêîíóþòü
çàõèñí³ ôóíêö³¿ [33, 39]. Áåçóìîâíî, âñ³
ïðåäñòàâëåí³ ãåíè ìîæóòü áóòè âèêîðèñòàí³
äëÿ êëîíóâàííÿ, êîíñòðóþâàííÿ àíòèñåíñî-
âèõ äî ¿õí³õ ïîñë³äîâíîñòåé dsRNA âåêòî-
ð³â ³ ñòâîðåííÿ ðåçèñòåíòíèõ äî íåìàòîä-ïàðà-
çèò³â òðàíñãåííèõ ðîñëèí. Òîìó ðîçðîáêà ìå-
òîä³â ³äåíòèô³êàö³¿ öèõ ãåí³â, êëîíóâàííÿ òà
êîíñòðóþâàííÿ íà ¿õí³é îñíîâ³ âåêòîð³â äëÿ
ãåíåòè÷íî¿ òðàíñôîðìàö³¿ ðîñëèí º àêòóàëüíèì
íàïðÿìêîì ðîçâèòêó ãåíåòè÷íî¿ ³íæåíåð³¿
ßê áóëî ðàí³øå âèÿâëåíî ó ïðîâåäåíèõ íà-
ìè ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷íèõ äîñë³äæåííÿõ,
ñò³éê³ñòü ðîñëèí äî ð³çíèõ ïàòîãåí³â ìîæíà
çíà÷íî ï³äâèùèòè çàâäÿêè ñòèìóëÿö³¿ ñèíòåçó
âëàñíèõ ìàëèõ ðåãóëÿòîðíèõ si/miRNA, ùî
áåðóòü ó÷àñòü â ïðîöåñàõ ³íòåðôåðåíö³¿ ÐÍÊ
çà äîïîìîãîþ îáðîáêè ¿õ ðåãóëÿòîðàìè ðîñ-
òó ïðèðîäíîãî ïîõîäæåííÿ ³ç á³îçàõèñíèìè
âëàñòèâîñòÿìè [40, 41]. Åôåêòèâí³ñòü óðà-
æåííÿ ðîñëèí íåìàòîäàìè çàëåæèòü â³ä ñåê-
ðåòîðíèõ á³ëê³â, ùî ñèíòåçóþòüñÿ â åçîôà-
ãåàëüíèõ çàëîçàõ ïàðàçèò³â ï³ä ÷àñ ïðîíèê-
íåííÿ âñìîêòóâàëüíî¿ òðóáî÷êè (ñòèëåò) â
êë³òèíè êîðåí³â ðîñëèí òà ôîðìóâàííÿ â öèõ
ì³ñöÿõ óòâîðåííÿ ñèíòèö³¿â [8]. Ãðóíòóþ-
÷èñü íà ïðîâ³äí³é ðîë³ ãåí³â, ùî êîäóþòü
ñèíòåç öèõ á³ëê³â ³ òèì ñàìèì ñïðèÿþòü âè-
æèâàííþ øê³äíèê³â, ìåòîþ íàøèõ åêñïå-
ðèìåíò³â áóëî ðîçðîáèòè ï³äõîäè äî ï³äâè-
ùåííÿ ÷èñëà êîï³é â ³íô³êîâàíèõ êë³òèíàõ
ð³ïàêà àíòèñåíñîâèõ dsRNA, ñïåöèô³÷íèõ
äî ñòðóêòóðè îäíîãî ç ãåí³â (8Í07) ñåêðå-
òîðíîãî á³ëêà íåìàòîäè, íà îñíîâ³ ñó÷àñ-
íèõ ìåòîä³â ãåíåòè÷íî¿ ³íæåíå𳿠â êîì-
á³íàö³¿ ç á³îñòèìóëÿö³ºþ åêñïðåñ³¿ ãåí³â
dsRNA.
Ìàòåð³àëè òà ìåòîäè. Íàñ³ííÿ ð³ïàêà ç âè-
ñîêîþ ñõîæ³ñòþ ïðîðîùóâàëè â ÷àøêàõ Ïåò-
ð³ íà áåçíåìàòîäíîìó âîäíîìó ñåðåäîâèù³
(êîíòðîëü) òà ³ç ñóñïåí糺þ öèñò êîðåíå-
ïàðàçèòóþ÷î¿ íåìàòîäè H. schachtii, ç ÿêèõ ó
ïðîöåñ³ ³íêóáàö³¿ ïðè 23 °Ñ ç’ÿâëÿëèñü ëè-
÷èíêè íåìàòîä (ïðèáëèçíî íà 5–7-é äåíü).
Äëÿ äîäàòêîâîãî ï³äâèùåííÿ ñò³éêîñò³ ð³-
ïàêà äî íåìàòîäíî¿ ³íâà糿 ðîñëèíè îáðîáëÿ-
ëè ðåãóëÿòîðîì ðîñòó Ðåãîïëàíò* ç á³îçàõèñ-
íèìè âëàñòèâîñòÿìè [41, 42]. Öåé ïîë³êîì-
ïîíåíòíèé ïðåïàðàò ì³ñòèòü â ñâîºìó ñêëàä³
ïðîäóêòè æèòòºä³ÿëüíîñò³ â êóëüòóð³ in vitro
ãðèáà-ì³êñîì³öåòà, âèëó÷åíîãî ç êîðåíåâî¿
ñèñòåìè æåíüøåíþ (ñóì³ø àì³íîêèñëîò, âóã-
ëåâîä³â, æèðíèõ êèñëîò, ïîë³ñàõàðèä³â, ô³òî-
ãîðìîí³â òà ì³êðîåëåìåíò³â), òà àâåðñåêòè-
í³â – êîìïëåêñíèõ àíòèïàðàçèòàðíèõ ìàêðî-
ë³äíèõ àíòèá³îòèê³â, ïðîäóêò³â ìåòàáîë³çìó
ãðóíòîâîãî ñòðåïòîì³öåòó Streptomyces aver-
mitilis [43]. Ñòðåïòîì³öåòè â³äîì³ ÿê ïðîäó-
öåíòè íå ëèøå àíòèá³îòèê³â, àëå é òàêèõ
á³îëîã³÷íî àêòèâíèõ ðå÷îâèí, ÿê³ âèÿâëÿþòü
ô³òîçàõèñíó òà ð³ñò-ñòèìóëþâàëüíó ä³þ íà
ðîñëèíè. Öå ð³çíîãî ðîäó ãîðìîíè, â³òàì³íè,
àì³íîêèñëîòè, êàðîòèíî¿äè, ôåðìåíòè, òîê-
ñèíè òà ³íø³ ðå÷îâèíè, ùî âïëèâàþòü íà
ðîñòîâ³ ïðîöåñè ðîñëèí, à ñàìå ñòèìóëþ-
* Ñòâîðåíèé â ²íñòèòóò³ á³îîðãàí³÷íî¿ õ³ì³¿ òà
íàôòîõ³ì³¿ ÍÀÍ Óêðà¿íè ñï³ëüíî ç Äåðæàâíèì
ï³äïðèºìñòâîì «Ì³æâ³äîì÷èé íàóêîâî-òåõíîëîã³÷-
íèé öåíòð «Àãðîá³îòåõ» ÍÀÍ ³ ÌÎÍ Óêðà¿íè».
6 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 6
Â.À. Öèãàíêîâà, ß.Â. Àíäðóñåâè÷, Ñ.Ï. Ïîíîìàðåíêî òà ³í.
þòü ïðîðîñòàííÿ íàñ³ííÿ ³ ï³äâèùóþòü âðîæàé-
í³ñòü [42].  äîñë³äàõ âèêîðèñòîâóâàëè Ðåãî-
ïëàíò ç êîíöåíòðàö³ºþ àâåðñåêòèí³â 10 ìêã/ìë.
Âèä³ëåííÿ si/miRNA ç êë³òèí äîñë³äíèõ
ðîñëèí ð³ïàêà çä³éñíþâàëè çà äîïîìîãîþ
óäîñêîíàëåíîãî ðîçðîáëåíîãî íàìè ðàí³øå
[40] îðèã³íàëüíîãî ìåòîäó, ÿêèé ñêëàäàâñÿ ç
íàñòóïíèõ åòàï³â:
1) âèä³ëåííÿ ñóìàðíîãî ïðåïàðàòó ÐÍÊ ç
êë³òèí ðîñëèí [43–45]; ïîë³ìåðí³ñòü âèä³ëå-
íèõ ñóìàðíèõ ïðåïàðàò³â ÐÍÊ àíàë³çóâàëè çà
äîïîìîãîþ åëåêòðîôîðåçó â 1,5%-íîìó ãå-
ë³ àãàðîçè ó ïðèñóòíîñò³ 7 Ì ñå÷îâèíè çà
ìåòîäîì Ëîêåðà [46] (ãåë³ ôàðáóâàëè ðîç÷è-
íîì åòèä³óì áðîì³äó ïåðåä ôîòîãðàôóâàí-
íÿì ôðàêö³é ÐÍÊ â óëüòðàô³îëåò³);
2) ðîçä³ëåííÿ ïîë³(A)+ìÐÍÊ (òîáòî ìÐÍÊ)
òà ïîë³(A)–ìÐÍÊ íà îë³ãî(dT)-öåëþëîçí³é êî-
ëîíö³ ç ìåòîþ ïîäàëüøîãî âèêîðèñòàííÿ ïî-
ë³(A)+ìÐÍÊ äëÿ òåñòóâàííÿ ôóíêö³îíàëüíî¿
àêòèâíîñò³ si/miRNA â áåçêë³òèííèõ ñèñòå-
ìàõ á³ëêîâîãî ñèíòåçó ç ïðîðîñòê³â ïøåíèö³
[44, 46];
3) îñàäæåííÿ âèñîêîìîëåêóëÿðíî¿ ïîë³(A)–
ìÐÍÊ ç åëþàòó ïðîâîäèëè çà äîïîìîãîþ
10%-íîãî ðîç÷èíó ïîë³åòèëåíãë³êîëþ (ìîë.
ìàñà 8000) ç 0,5 Ì NaCl, à si/miRNA – ð³â-
íèì îá’ºìîì 96%-íîãî åòàíîëó ïðè –22 °C
âïðîäîâæ äîáè; ïîë³(À)+ÐÍÊ ç êîëîíêè çí³-
ìàëè 2–3 îá’ºìàìè áóôåðà: 10 ìM Òðèñ-ÍÑ1
(pH 7,5), 1 ìM ÅÄÒÀ, 0,05 % ÄÄÑ-Na [47,
48], à ï³ñëÿ åëþö³¿ ç êîëîíêè ïîë³(A)+ìÐÍÊ
îñàäæóâàëè åòàíîëîì;
4) ìîëåêóëÿðíà ã³áðèäèçàö³ÿ â ðîç÷èí³
2×SSC íèçüêîìîëåêóëÿðíèõ si/miRNA ç ôðàê-
ö³ºþ ïîë³(A)+ìÐÍÊ;
5) íàíåñåííÿ ã³áðèäíèõ ìîëåêóë ïîë³(A)+
ìÐÍÊ ç si/miRNA íà îë³ãî(dT)-öåëþëîçíó
êîëîíêó ç íàñòóïíîþ åëþö³ºþ ç êîëîíêè áó-
ôåðîì, âêàçàíèì ó ï. 3;
6) òåìïåðàòóðíà (95 °C) äåíàòóðàö³ÿ î÷è-
ùåíèõ çà äîïîìîãîþ êîëîíêè ã³áðèäíèõ ìî-
ëåêóë ïîë³(A)+ìÐÍÊ ç si/miRNA;
7) â³äîêðåìëåííÿ ïîë³(A)+ìÐÍÊ â³ä si/
miRNA çà äîïîìîãîþ ìåòîäó ôðàêö³îíóâàííÿ
íà îë³ãî(dT)-öåëþëîçí³é êîëîíö³;
8) ïîâòîðíå îñàäæåííÿ si/miRNA 96%-
íèì åòàíîëîì òà ïåðåâ³ðêà ÷èñòîòè âèä³ëå-
íèõ si/miRNA çà äîïîìîãîþ åëåêòðîôîðåçó
ó 15%-íîìó ïîë³àêðèëàì³äíîìó ãåë³ (ÏÀÀÃ-
åëåêòðîôîðåç) (ðèñ. 1).
Äëÿ äîñë³ä³â ïî ã³áðèäèçàö³¿ si/miRNA ç
êîíñåðâàòèâíîþ ä³ëÿíêîþ êÄÍÊ íåìàòîä,
àìïë³ô³êîâàíîþ øëÿõîì ÏËÐ, ïåðåä îäåð-
æàííÿì si/miRNA ¿¿ ³íòåíñèâíî ì³òèëè in vivo
33P çà äîïîìîãîþ Na2HP33O4 [44].
Âèä³ëåííÿ ñóìàðíîãî ïðåïàðàòó ìÐÍÊ ç
êë³òèí íåìàòîä H. schachtii. ßéöÿ íåìàòîä
H. schachtii, ïðîìèò³ òà î÷èùåí³ â ãðà䳺íò³
ñàõàðîçè, ïîì³ùàëè íà ïðîñî÷åíèé ðîç÷è-
íîì 3,14 ìM ZnSO4 ô³ëüòðîâàëüíèé ïàï³ð
â ÷àøêè Ïåòð³ òà ³íêóáóâàëè â òåðìîñòàò³
ïðè òåìïåðàòóð³ 26 °C ïðîòÿãîì 5–7 äí³â äî
ïîÿâè ëè÷èíîê íåìàòîä. Ëè÷èíêè çáèðàëè òà
ñòåðèë³çîâàëè ñïî÷àòêó 1 ãîä â 0,001%-íîìó
ðîç÷èí³ õëîðãåêñèäèíó òà 7 õâ ó 0,001%-íîìó
ðîç÷èí³ õëîðèäó ðòóò³.
Âèä³ëåííÿ ñóìàðíîãî ïðåïàðàòó ÐÍÊ ç
ëè÷èíîê çä³éñíþâàëè çà äîïîìîãîþ òîãî æ
Ðèñ. 1. ÏÀÀÃ-åëåêòðîôîðåç si/miRNA ç ïðîðîñòê³â
ð³ïàêà. Ìàðêåðí³ ïîë³íóêëåîòèäè (ïî âåðòèêàë³ –
äîâæèíà â íóêëåîòèäàõ) òà ïðåïàðàò si/miRNA íà
äîð³æêàõ ãåëþ (â³äïîâ³äíî 1 òà 2) íàñè÷åí³ åòèä³óì
áðîì³äîì; ðàä³îàâòîãðàô 33P ì³÷åíèõ si/miRNA ç
ãåëþ (äîð³æêà 3)
7ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 6
Îòðèìàííÿ òà àìïë³ô³êàö³ÿ êÄÍÊ êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8Í07 íåìàòîäè
ñàìîãî ìåòîäó, ÿêèé âèêîðèñòîâóâàëè ³ äëÿ
âèä³ëåííÿ ñóìàðíîãî ïðåïàðàòó ÐÍÊ ç ðîñ-
ëèí. Ïîë³ìåðí³ñòü âèä³ëåíèõ ñóìàðíèõ ïðå-
ïàðàò³â ÐÍÊ àíàë³çóâàëè çà äîïîìîãîþ ìå-
òîäó Ëîêåðà [46].
Ðîçä³ëåííÿ ïîë³(À)+ÐÍÊ (òîáòî ìÐÍÊ)
òà ïîë³(À)–ÐÍÊ, îñàäæåííÿ âèñîêîìîëåêó-
ëÿðíî¿ ïîë³(A)–ìÐÍÊ ç åëþàòó ïðîâîäèëè íà
îë³ãî(dT)-öåëþëîçí³é êîëîíö³, à òàêîæ – ÿê
îïèñàíî ó ï. 2 òà 3.
Ñèíòåç êÄÍÊ íà ìàòðèöÿõ ïîë³(À)+ÐÍÊ
çä³éñíþâàëè çà äîïîìîãîþ çâîðîòíî¿ òðàíñ-
êðèïòàçè (ðåâåðòàçè) òà [ -33P] ì³÷åíîãî äå-
çîêñè-ÖÒÔ [40, 49].
Àìïë³ô³êàö³ÿ êÄÍÊ ïîñë³äîâíîñòåé ãåíà 8H07
íåìàòîä çà äîïîìîãîþ ÏËÐ. Äëÿ ïîäàëüøîãî
êëîíóâàííÿ ³ êîíñòðóþâàííÿ âåêòîðà åêñïðåñ³¿
dsRNA, ÿê³ º çà ñòðóêòóðîþ àíòèñåíñîâèìè
äî ìÐÍÊ íåìàòîä, íàìè îáðàíî ãåí 8H07 íå-
ìàòîäè, ùî ìຠâèñîêèé ñòóï³íü ãîìîëî㳿 ó
êîíñåðâàòèâí³é ä³ëÿíö³ (CR) ïî â³äíîøåííþ
äî òàêî¿ æ ä³ëÿíêè àíàëîã³÷íîãî ãåíà ðîñëèí.
Äëÿ ÏËÐ àìïë³ô³êàö³¿ êÄÍÊ ïîñë³äîâíîñòåé
ôðàãìåíòà êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07
íåìàòîäè H. shcachtii âèêîðèñòîâóâàëè ïðàé-
ìåðè, êîìïëåìåíòàðí³ êîíñåðâàòèâí³é ä³ëÿí-
ö³ öüîãî ãåíà (òàáëèöÿ).
Àìïë³ô³êàö³þ êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè êÄÍÊ
ãåíà 8H07 ïðîâîäèëè íà òåðìîöèêëåð³ ABI
(«Applied Biosciences», ͳìå÷÷èíà) ç âèêîðèñ-
òàííÿì 0,025 îä./ìêë Taq ïîë³ìåðàçè («New
England Biolabs», ÑØÀ) òà ðåàãåíò³â ô³ðìè
«Invitrogen» (ÑØÀ): 1,5 ìM MgCl2 ³ 200 ìêM
êîæíîãî ç íóêëåîòèä³â – dATP, dTTP, dGTP
òà dCTP. Òåìïåðàòóðí³ ðåæèìè ÏËÐ: ïî÷àò-
êîâà òåìïåðàòóðà äëÿ äåíàòóðàö³¿ ñòàíîâè-
ëà 94 °C ïðîòÿãîì 2 õâ, íàñòóïí³ 35 öèê-
ë³â àìïë³ô³êàö³¿ ïðîâîäèëè ïðè 94 °C ïðî-
òÿãîì 30 ñ, ïðè 55 °C – 45 ñ, ïðè 72 °C – 1 õâ;
ê³íöåâèé öèêë åëîíãàö³¿ â³äáóâàâñÿ ïðè 72 °C
ïðîòÿãîì 7 õâ.
Àìïë³ô³êîâàíó êîíñåðâàòèâíó ä³ëÿíêó êÄÍÊ
ãåíà 8H07 àíàë³çóâàëè çà äîïîìîãîþ åëåê-
òðîôîðåçó â 15%-íîìó ÏÀÀÃ, ïðîñî÷åíîìó
åòèä³óì áðîì³äîì (ðèñ. 2).
Äëÿ ïåðåâ³ðêè íàÿâíîñò³ ãîìîëî㳿 ì³æ âè-
ä³ëåíèìè ç îáðîáëåíèõ êîìïîçèö³éíèì ïîë³-
ôóíêö³îíàëüíèì ïðåïàðàòîì Ðåãîïëàíò ðîñ-
ëèí ð³ïàêà ìàëèìè ðåãóëÿòîðíèìè si/miRNA
òà àìïë³ô³êîâàíèì ôðàãìåíòîì êÄÍÊ êîí-
ñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07 íåìàòîäè,
åëþàò êÄÍÊ ç ãåëþ íàíîñèëè íà ìîäèô³êî-
âàí³ òà àêòèâîâàí³ í³òðîöåëþëîçí³ ìåìáðàíí³
ô³ëüòðè (Âàòìàí 50, 2-àì³íîôåí³ëò³îåô³ðíèé
ïàï³ð) òà ïðîâîäèëè Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçà-
ö³þ [47] ç íèçüêîìîëåêóëÿðíèìè 33P ì³÷å-
íèìè si/miRNA, âèä³ëåíèìè ç ðîñëèí ð³ïàêà,
ùî íå îáðîáëÿëèñü òà îáðîáëÿëèñü ðåãóëÿ-
òîðîì ðîñòó (ðèñ. 3).
Ðåçóëüòàòè äîñë³äæåíü òà ¿õ îáãîâîðåííÿ.
Ç ìåòîþ ñòâîðåííÿ âåêòîðà ç àíòèñåíñîâè-
ìè dsRNA îáðàíî ãåí 8H07 íåìàòîäè, ÿêèé
êîäóº îäèí ³ç ñåêðåòîðíèõ á³ëê³â åçîôàãå-
àëüíèõ çàëîç ³ ìຠâèñîêèé ñòóï³íü ãîìî-
ëî㳿 â êîíñåðâàòèâí³é ä³ëÿíö³ ç êîíñåðâàòèâ-
íîþ ä³ëÿíêîþ ãåíà 8H07 ðîñëèí. Òîìó áóëî
âèð³øåíî ïåðåâ³ðèòè ñòóï³íü ãîìîëî㳿 ì³æ
âèä³ëåíèìè íàìè (ç îáðîáëåíèõ òà íå îáðîá-
ëåíèõ êîìïîçèö³éíèì ïîë³ôóíêö³îíàëüíèì
ïðåïàðàòîì Ðåãîïëàíò ðîñëèí ð³ïàêà) ìàëè-
ìè ðåãóëÿòîðíèìè si/miRNA òà àìïë³ô³êîâà-
íèì ôðàãìåíòîì êÄÍÊ êîíñåðâàòèâíîãî ðå-
ã³îíó ãåíà 8H07 íåìàòîäè.
Ðåçóëüòàòè ³äåíòèô³êàö³¿ çà äîïîìîãîþ
ÏÀÀÃ-åëåêòðîôîðåçó âèä³ëåíèõ si/miRNA ñâ³ä-
÷àòü, ùî si/miRNA º ïðåïàðàòàìè âèñîêî¿
Ïåðåë³ê ïîñë³äîâíîñòåé ïðàéìåð³â, âèêîðèñòàíèõ äëÿ àìïë³ô³êàö³¿ ãåíà-ì³øåí³ 8H07 íåìàòîäè H. schachtii
Ïðèì³òêà. CR – êîíñåðâàòèâíèé ðåã³îí, S – ñåíñîâ³, AS – àíòèñåíñîâ³ ïîñë³äîâíîñò³ â³äïîâ³äíî.
Ïðàéìåð Ïîñë³äîâíîñò³
ʳëüê³ñòü ïàð íóêëåî-
òèä³â, îòðèìàíèõ
ìåòîäîì ÏËÐ
8H07-CR-S-Forward
8H07-CR-S-Reverse
8H07-CR-AS-Forward
8H07-CR-AS-Reverse
ATCTCGAGAACCATATTCCCCAAATG
ATGAATTCTATTTGGTTTGGCATTTGATTCGGCTG
ATTCTAGAAACCATATTCCCCAAATG
ATAAGCTTTATTTGGTTTGGCATTTGATTCGGCTG
338
8 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 6
Â.À. Öèãàíêîâà, ß.Â. Àíäðóñåâè÷, Ñ.Ï. Ïîíîìàðåíêî òà ³í.
÷èñòîòè ç êëàñè÷íèìè ïàðàìåòðàìè öèõ òèï³â
RNA – ðîçì³ðîì â³ä 21 äî 25 íóêëåîòèä³â.
Äëÿ ÏËÐ àìïë³ô³êàö³¿ êÄÍÊ ïîñë³äîâ-
íîñòåé ôðàãìåíòà ãåíà 8H07 íåìàòîäè H. shca-
chtii âèêîðèñòîâóâàëè ïðàéìåðè, êîìïëåìåí-
òàðí³ êîíñåðâàòèâí³é ä³ëÿíö³ öüîãî ãåíà, ùî
ñêëàäàþòüñÿ ç ñåíñîâèõ òà àíòèñåíñîâèõ äî
CR ðåã³îíó ïîñë³äîâíîñòåé ³ ì³ñòÿòü ñàéòè
ðåñòðèêö³¿ äëÿ ïðîâåäåííÿ êëîíóâàííÿ àìïë³-
ô³êîâàíî¿ êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè êÄÍÊ ãåíà
8H07 òà íàñòóïíîãî éîãî âíåñåííÿ ó âåêòîð
ðHannibal (XhoI, CTCGAG; EcoRI, GAATTC;
XbaI, TCTAGA, HindIII, AAGCTT; ClaI, ATC-
GAT) (òàáëèöÿ).
Çà äîïîìîãîþ åëåêòðîôîðåçó àìïë³ô³êîâà-
íîãî êîíñåðâàòèâíîãî ðåã³îíó êÄÍÊ ãåíà 8H07
ó 15%-íîìó ÏÀÀÃ, ïðîñî÷åíîìó åòèä³óì áðî-
ì³äîì, âñòàíîâëåíî íàÿâí³ñòü ÷³òêî âèðàæåíî¿
çàñâ³÷åíî¿ â óëüòðàô³îëåò³ ñìóãè â ãåë³, ùî
ÿâëÿº ñîáîþ êîíöåíòðîâàíèé ïðåïàðàò ìî-
ëåêóë â³äïîâ³äíî¿ ä³ëÿíêè âêàçàíîãî ãåíà,
ÿêà çà äàíèìè ë³òåðàòóðè ì³ñòèòü 338 ïàð
íóêëåîòèä³â (ðèñ. 2).
Ðåçóëüòàòè Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³¿ àì-
ïë³ô³êîâàíî¿ çà äîïîìîãîþ ÏËÐ êîíñåðâà-
òèâíî¿ ä³ëÿíêè êÄÍÊ ãåíà 8H07 ç íèçüêî-
ìîëåêóëÿðíèìè 33P ì³÷åíèìè si/miRNA
(ðèñ. 3) ï³äòâåðäæóþòü íàÿâí³ñòü âèñîêî¿
ãîìîëî㳿 ì³æ âèä³ëåíèìè íàìè ç îáðîá-
ëåíèõ òà íå îáðîáëåíèõ ðåãóëÿòîðîì ðîñòó
ðîñëèí ð³ïàêà ïðåïàðàòàìè si/miRNA òà àì-
ïë³ô³êîâàíî¿ êÄÍÊ, ãîìîëîã³÷íî¿ ôðàãìåí-
òó ãåíà 8H07 íåìàòîäè H. shcachtii.
Îòðèìàí³ ðåçóëüòàòè Íîçåðí-áëîò ã³áðè-
äèçàö³¿ çàñâ³ä÷óþòü, ùî çàñòîñóâàííÿ ðåãóëÿ-
òîðà ðîñòó Ðåãîïëàíò çíà÷íî ï³äâèùóº ð³-
âåíü ñèíòåçó àíòèíåìàòîäíèõ si/miRNA, ñïå-
öèô³÷íèõ äî êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà
8H07, ùî â³äïîâ³äຠçà ³íôåêö³éí³ âëàñòè-
âîñò³ ïàðàçèòè÷íî¿ íåìàòîäè. ßê çàçíà÷à-
ëîñü, äîñÿãòè äîäàòêîâîãî ï³äâèùåííÿ ñò³é-
êîñò³ ðîñëèí äî íåìàòîäíî¿ ³íâà糿 ìîæíà
íå ëèøå çà äîïîìîãîþ îáðîáêè ïðåïàðàòîì
Ðåãîïëàíò, à é ç âèêîðèñòàííÿì ñòâîðåíèìè
íàìè àíàëîã³÷íèìè êîìïîçèö³éíèìè ïðåïà-
ðàòàìè ç ð³ñò-ñòèìóëþâàëüíîþ òà àíòèïàðà-
çèòàðíîþ àêòèâí³ñòþ, òàêîæ ñòâîðåíèìè â
²íñòèòóò³ á³îîðãàí³÷íî¿ õ³ì³¿ òà íàôòîõ³ì³¿
ÍÀÍ Óêðà¿íè ³ íà Äåðæàâíîìó ï³äïðèºìñòâ³
«Ì³æâ³äîì÷èé íàóêîâî-òåõíîëîã³÷íèé öåíòð
«Àãðîá³îòåõ» (Ñò³ìïî, Á³îãåí òà ³í.) [40, 41].
Òàêèì ÷èíîì, çàâäÿêè âèêîðèñòàííþ ðîç-
ðîáëåíîãî ìåòîäó âèä³ëåííÿ âèñîêîî÷èùå-
íîãî ïðåïàðàòó ìàëèõ ðåãóëÿòîðíèõ si/miRNA
âäàëîñÿ âñòàíîâèòè, ùî ñò³éê³ñòü ðîñëèí ð³-
ïàêà äî óðàæåííÿ íåìàòîäîþ H. schachtii îáó-
ìîâëåíà ð³çêèì ï³äâèùåííÿì ñèíòåçó si/miRNA
ï³ä 䳺þ ïîë³ôóíêö³îíàëüíîãî ïðåïàðàòó Ðåãî-
ïëàíò. Çà äîïîìîãîþ Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³¿
âñòàíîâëåíî âèñîêó ñïîð³äíåí³ñòü âèä³ëåíèõ ç
êë³òèí ð³ïàêà ìàëèõ ðåãóëÿòîðíèõ si/miRNA
äî àìïë³ô³êîâàíîãî ôðàãìåíòó êÄÍÊ êîí-
ñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07 H. schachtii. Ö³
ðåçóëüòàòè ñâ³ä÷àòü íà êîðèñòü òîãî, ùî àí-
òèíåìàòîäí³ âëàñòèâîñò³ ïðåïàðàò³â si/miRNA
ïîâ’ÿçàí³ ç íàÿâí³ñòþ â íèõ àíòèñåíñîâèõ
(êîìïëåìåíòàðíèõ) äî ãåíà 8H07 íåìàòîäè
ïîñë³äîâíîñòåé, çàâäÿêè ÷îìó â³äáóâàºòüñÿ
áëîêóâàííÿ òðàíñëÿö³¿ (ñàéëåíñ³íã) ìÐÍÊ
Ðèñ. 2. 15%-íèé ÏÀÀÃ-åëåêò-
ðîôîðåç êîíñåðâàòèâíîãî ðå-
ã³îíó êÄÍÊ ãåíà 8H07, àìï-
ë³ô³êîâàíîãî çà äîïîìîãîþ
ÏËÐ
Ðèñ. 3. Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³ÿ àìïë³ô³êîâàíîãî
ìåòîäîì ÏËÐ ôðàãìåíòà êÄÍÊ êîíñåðâàòèâíîãî
ðåã³îíó ãåíà 8H07 ç íèçüêîìîëåêóëÿðíèìè 33P
ì³÷åíèìè si/miRNA: 1 – ã³áðèäè êÄÍÊ ç ïðå-
ïàðàòàìè si/miRNA, âèä³ëåíèìè ç ðîñëèí ð³ïàêà,
ùî îáðîáëåí³ ðåãóëÿòîðîì ðîñòó; 2 – ã³áðèäè
êÄÍÊ ç ïðåïàðàòàìè si/miRNA, âèä³ëåíèìè ç ðîñ-
ëèí ð³ïàêà, ùî íå îáðîáëåí³ ðåãóëÿòîðîì ðîñòó
9ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 6
Îòðèìàííÿ òà àìïë³ô³êàö³ÿ êÄÍÊ êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8Í07 íåìàòîäè
íåìàòîä, âíàñë³äîê ÷îãî âîíè ãèíóòü. ϳä-
òâåðäæåííÿì òîãî ôàêòó, ùî â ³íô³êîâàíèõ
íåìàòîäàìè êë³òèíàõ ðîñëèí ï³äâèùóºòüñÿ ñèí-
òåç ñïåöèô³÷íèõ àíòèíåìàòîäíèõ si/miRNA,
ÿêèé òàêîæ äîäàòêîâî ï³äñèëþºòüñÿ ï³ä
âïëèâîì Ðåãîïëàíòó, º îòðèìàí³ ðàí³øå íà-
ìè ðåçóëüòè ïî ³íã³áóâàííþ ñèíòåçó á³ëê³â
íà ìàòðèöÿõ ïîë³(À)+ìÐÍÊ â áåçêë³òèíí³é
ñèñòåì³ á³ëêîâîãî ñèíòåçó ç ïðîðîñòê³â ïøå-
íèö³ [40, 49].  öèõ äîñë³äàõ âñòàíîâëåíî, ùî
äîäàâàííÿ â áåçêë³òèííó ñèñòåìó á³ëêîâîãî
ñèíòåçó ïðåïàðàò³â si/miRNA, îäåðæàíèõ ç
³íô³êîâàíèõ ðîñëèí, ÿê³ îáðîáëÿëèñü òà íå
îáðîáëÿëèñü ïðåïàðàòîì Ðåãîïëàíò, ïðèçâî-
äèòü äî ïðàêòè÷íî ïîâíîãî ³íã³áóâàííÿ òðàíñ-
ëÿö³¿ ìÐÍÊ, îäåðæàíèõ ÿê ç ëè÷èíîê íå-
ìàòîä, òàê ³ ç ³íô³êîâàíèõ ðîñëèí.  ïðîòè-
ëåæí³ñòü öüîìó ïðåïàðàòè si/miRNA, âèä³ëåí³
ç íå³íô³êîâàíèõ íåìàòîäàìè êë³òèí ðîñ-
ëèí, âèÿâëÿëè äîñòàòíüî íèçüêó ³íã³áóþ÷ó
àêòèâí³ñòü (çà ðàõóíîê áëîêóâàííÿ òðàíñëÿö³¿
âëàñíî êë³òèííèõ ìÐÍÊ).
 ö³ëîìó íàâåäåí³ ðåçóëüòàòè âêàçóþòü íà
÷³òêó ïåðñïåêòèâó îäåðæàííÿ ðîñëèí, ñò³é-
êèõ äî óðàæåííÿ íåìàòîäàìè H. schachtii, ç
âèêîðèñòàííÿì ãåííî-³íæåíåðíèõ ï³äõîä³â,
êîíñòðóþâàííÿ âåêòîð³â åêñïðåñ³¿ àíòèñåí-
ñîâèõ dsRNA, êîìïëåìåíòàðíèõ êîíñåðâà-
òèâíîìó ðåã³îíó ãåíà 8H07, òà ãåíåòè÷íî¿
òðàíñôîðìàö³¿ íèìè ðîñëèí.
V.À. Tsygankova,
Ya.V. Andrusevich, S.P. Ponomarenko,
A.P. Galkin, Ya.B. Blume
ISOLATION AND AMPLIFICATION
ñDNA OF 8H07 GENE CONSERVATIVE
REGION OF NEMATODE HETERODERA
SCHACHTII WITH HIGH RELATIONSHIP
TO ITS RAPE HOMOLOG
Original method of small regulatory si/miRNA iso-
lation from plant cells was elaborated. PCR amp-
lification of fragment cDNA 8H07 nematode Heterodera
schachtii gene was carried out. Using Northern-
blot method hybridization of plant si/miRNA with
cDNA fragment of conservative region 8H07 gene
the presence of their high homology is found out.
The amplified cDNA fragment of nematode 8H07
gene in future will be used for creation recombinant
gene with complementary antisense dsRNA sequence
for increasing resistance of rape plants to parasitic
nematodes.
Â.À. Öûãàíêîâà,
ß.Â. Àíäðóñåâè÷, Ñ.Ï. Ïîíîìàðåíêî,
À.Ï. Ãàëêèí, ß.Á. Áëþì
ÏÎËÓ×ÅÍÈÅ È ÀÌÏËÈÔÈÊÀÖÈß êÄÍÊ
ÊÎÍÑÅÐÂÀÒÈÂÍÎÃÎ Ó×ÀÑÒÊÀ ÃÅÍÀ 8Í07
ÍÅÌÀÒÎÄÛ HETERODERA SCHACHTII
Ñ ÂÛÑÎÊÈÌ ÐÎÄÑÒÂÎÌ Ê ÅÃÎ ÃÎÌÎËÎÃÓ
Ó ÐÀÏÑÀ
Ðàçðàáîòàí îðèãèíàëüíûé ìåòîä âûäåëåíèÿ èç
êëåòîê ðàñòåíèé ìàëûõ ðåãóëÿòîðíûõ ÐÍÊ (si/
miRNA). Ñ ïîìîùüþ ÏÖÐ îñóùåñòâëåíî ïîëèìå-
ðàçíîå êîïèðîâàíèå ôðàãìåíòà êÄÍÊ ãåíà 8H07
Heterodera schachtii. Ïóòåì ãèáðèäèçàöèè si/miRNA
ðàñòåíèé ñ ôðàãìåíòîì êÄÍÊ êîíñåðâàòèâíîãî
ó÷àñòêà ãåíà 8H07 íåìàòîäû ïîäòâåðæäåíà èõ
âûñîêàÿ ñòåïåíü ãîìîëîãèè. Â äàëüíåéøåì àìï-
ëèôèöèðîâàííûé êÄÍÊ ôðàãìåíò ãåíà 8H07 íå-
ìàòîäû áóäåò èñïîëüçîâàí äëÿ ñîçäàíèÿ ðåêîì-
áèíàíòíîãî ãåíà ñ àíòèñåíñîâîé ïîñëåäîâàòåëü-
íîñòüþ dsRNA äëÿ ïîâûøåíèÿ óñòîé÷èâîñòè ðàñ-
òåíèé ðàïñà ê ïàðàçèòè÷åñêîé íåìàòîäå.
ÑÏÈÑÎÊ Ë²ÒÅÐÀÒÓÐÈ
1. Chitwood D.J. Research on plant-parasitic nematode
biology conducted by the United States Department
of Agriculture – Agricultural Research Service //
Pest Manag. Sci. – 2003. – 59. – P. 748–753.
2. Baum T.J., Hussey R.S., Davis E.L. Root-knot and
cyst nematode parasitism genes: the molecular ba-
sis of plant parasitism // Genet. Engineering. –
2007. – 28. – P. 17–43.
3. Elling A.A., Davis E.L., Hussey R.S., Baum T.J. Ac-
tive uptake of cyst nematode parasitism proteins
into the plant cell nucleus // Int. J. Parasitol. –
2007. – 37. – P. 1269–1279.
4. Jammes F., Lecomte P., Almeida-Engler J., Bitton F.,
Martin-Magniette M., Renou J.P., Abad P., Favery
B. Genome-wide expression profiling of the host
response to root-knot nematode infection in Arabi-
dopsis // Plant J. – 2005. – 44. – P. 447–458.
5. Ithal N., Recknor J., Nettleton D., Hearne L., Mai-
er T., Baum T.J., Mitchum M.G. Parallel genome-
wide expression profiling of host and pathogen
during soybean cyst nematode infection of soybe-
an // Mol. Plant-Microbe Interact. – 2007. – 20. –
P. 293–305.
6. Gheysen G., Fenoll C. Gene expression in nematode
feeding sites // Ann. Rev. Phytopathol. – 2002. –
40. – P. 191–219.
7. Caillaud M., Lecomte P., Jammes F. et al. MAP65-3
microtubule-associated protein is essential for
nematode-induced giant cell ontogenesis in Arabi-
dopsis // Plant Cell. – 2008. – 20. – P. 423–437.
8. Gao B., Allen R., Maier T., Davis E.L., Baum T.J.,
10 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 6
Â.À. Öèãàíêîâà, ß.Â. Àíäðóñåâè÷, Ñ.Ï. Ïîíîìàðåíêî òà ³í.
Hussey R.S. The parasitome of the phytonematode
Heterodera glycines // Mol. Plant-Microbe Inter-
act. – 2003. – 16. – P. 720–726.
9. Doyle E.A., Lambert K.N. Meloidogyne javanica cho-
rismate mutase 1 alters plant cell development //
Mol. Plant-Microbe Interact. – 2003. – 16. –
P. 123–131.
10. Karczmarek A., Overmars H., Helder J., Goverse A.
Feeding cell development by cyst and root-knot
nematodes involves a similar early, local and tran-
sient activation of a specific auxin inducible pro-
moter element // Mol. Plant Pathol. – 2004. – 5. –
P. 343–346.
11. Huang G., Allen R., Davis E.L., Baum T.J., Hus-
sey R.S. Engineering broad root-knot resistance in
transgenic plants by RNAi silencing of a conserved
and essential root-knot nematode parasitism gene //
Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2006. – 103. –
P. 14302–14306.
12. Gao B., Allen R., Maier T., Davis E.L., Baum T.J.,
Hussey R.S. Identification of putative parasitism
genes expressed in the esophageal gland cells of
the soybean cyst nematode Heterodera glycines //
Mol. Plant-Microbe Interact. – 2001. – 14. –
P. 1247–1254.
13. Wang X., Allen R., Ding X., Goellner M., Maier T.,
de Boer J.M., Baum T.J., Hussey R.S., Davis E.L.
Signal peptide-selection of cDNA cloned directly
from the esophageal gland cells of the soybean cyst
nematode Heterodera glycines // Mol. Plant-Mi-
crobe Interact. – 2001. – 14. – P. 536–544.
14. Bradley J. D., Chiapelli B., Gao B., McCarter J.P.,
Verbsky M.L., Williams D.J. Methods and compo-
sitions for root knot nematode control. – Patent
WO2009126896. – 2009.
15. Hamilton A., Voinnet O., Chappell L. et al. Two
classes of short interfering RNA in RNA silen-
cing // EMBO J. – 2002. – 21, ¹ 17. – P. 4671–
4679.
16. Leung R.K.M., Whittaker P.A. RNA interference:
from gene silencing to gene-specific therapeutics //
Pharmacol. Therap. – 2005. – 107. – P. 222–239.
17. Bakhetia M., Charlton W.L., Urwin P.E. et al.
RNA interference and plant parasitic nematodes //
Trends Plant Sci. – 2005. – 10, ¹ 8. – P. 362–
367.
18. Gheysen G., Vanholme B. RNAi from plants to
nematodes // Trends Biotechnol. – 2006. – 25,
¹ 3. – P. 89–92.
19. Knox D.P., Geldhof P., Visser A., Britton C. RNA
interference in parasitic nematodes of animals:
a reality check? // Trends Parasitol. – 2007. –
23, ¹ 3. – P. 105–107.
20. Auer C., Frederick R. Crop improvement using
small RNAs: applications and predictive ecological
risk assessments // Trends Biotechnol. – 2009. –
27, ¹ 11. – P. 644–650.
21. Padmanabhan Ch., Zhang X., Jin H. Host small
RNAs are big contributors to plant innate im-
munity // Curr. Opin. Plant Biol. – 2009. – 12,
¹ 4. – P. 465–472.
22. Chen R., Hu Z., Zhang H. Identification of micro
RNAs in wild soybean (Glycine soja) // J. Integr.
Plant Biol. – 2009. – 51, ¹ 12. – P. 1071–1079.
23. Jian X., Zhang L., Li G. et al. Identification of
novel stress-regulated microRNAs from Oryza sa-
tiva L. // Genomics. – 2010. – 95. – P. 47–55.
24. Baulcombe D. RNA silencing // Trends Biochem.
Sci. – 2005. – 30. – P. 290–293.
25. Tytgat T., Vanholme B., De Meutter J., Claeys M.,
Couvreur M., Vanhoutte I., Gheysen G., Van
Criekinge W., Borgonie G., Coomans A., Gheysen G.
A new class of ubiquitin extension proteins secreted
by the dorsal pharyngeal gland in plant parasitic
cyst nematodes // Mol. Plant-Microbe Interact. –
2004. – 17. – P. 846–852.
26. Chen Q., Rehman S., Smant G., Jones J.T. Func-
tional analysis of pathogenicity proteins of the po-
tato cyst nematode Globodera rostochiensis using
RNAi // Mol. Plant-Microbe Interact. – 2005. –
18. – P. 621–625.
27. Rosso M.N., Dubrana M.P., Cimbolini N., Jaubert S.,
Abad P. Application of RNA interference to root-
knot nematode genes encoding esophageal gland
proteins // Mol. Plant-Microbe Interact. – 2005. –
18. – P. 615–620.
28. Shingles J., Lilley C.J., Atkinson H.J., Urwin P.E.
Meloidogyne incognita: molecular and biochemical
characterisation of a cathepsin L cysteine protein-
ase and the effect on parasitism following RNAi //
Exp. Parasitol. – 2007. – 115. – P. 114–120.
29. Wiig A. Compositions and methods using RNA in-
terference of OPR3-like gene for control of nema-
todes. – Patent US2010115660. – 2010.
30. Wiig A. Compositions and methods using RNA in-
terference targeting MTHFR-like genes for control
of nematodes. – Patent US2010107276. – 2010.
31. Favery B., Abad P., Caillaud M.C. Method for in-
creasing the resistance of a plant to endoparasitic
nematodes. – Patent WO2008139334. – 2008.
32. Ascenzi R. Compositions and methods using RNA
interference of CDPK-like for control of nema-
todes. – Patent US2010017910. – 2010.
33. Clark G.B., Sessions A., Eastburn D.J., Roux S.J.
Differential expression of members of the annexin
multigene family in Arabidopsis // Plant Physiol. –
2001. – 126. – P. 1072–1084.
34. Elling A.A., Mitreva M., Recknor J. et al. Diver-
gent evolution of arrested development in the dauer
stage of Caenorhabditis elegans and the infective
11ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 6
Îòðèìàííÿ òà àìïë³ô³êàö³ÿ êÄÍÊ êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8Í07 íåìàòîäè
stage of Heterodera glycines // Genome Biol. –
2007. – 8, ¹ 10. – R211.
35. Gao B.L., Allen R., Davis E.L., Baum T.J., Hussey R.S.
Developmental expression and biochemical prop-
erties of a beta-1,4-endoglucanase family in the
soybean cyst nematode, Heterodera glycines // Mol.
Plant Pathol. – 2004. – 5. – P. 93–104.
36. Creutz C.E. The annexins and exocytosis // Sci-
ence. – 1992. – 258. – P. 924–931.
37. Clark G.N., Dauwalder M., Roux S.J. Immuno-
localization of an annexin-like protein in corn //
Adv. Space Res. – 1994. – 14. – P. 341–346.
38. Delmer D.P, Potikha T.S. Structures and function
of annexins in plants // Cell. Mol. Life Sci. –
1997. – 53. – P. 546–553.
39. Cantero A., Barthkur S., Bushart T.J., Chou S.,
Morgan R.O., Fernandez M.P., Clark G.B., Roux
S.J. Expression profiling of the Arabidopsis annexin
gene family during germination, de-etiolation, and
abiotic stress // Plant Physiol. Biochem. – 2006. –
44. – P. 13–24.
40. Öèãàíêîâà Â.À., Àíäðóñåâè÷ ß.Â., Áëþì ß.Á.
Âèä³ëåííÿ ç êë³òèí ðîñëèí ìàëèõ ðåãóëÿòîðíèõ
si/miRNA ç àíòèíåìàòîäíîþ àêòèâí³ñòþ //
Äîï. ÍÀÍ Óêðà¿íè. – 2011. – ¹ 9. – Ñ. 159–
164.
41. Tsygankova V.A., Galkin A.P., Galkina L.A.,
Musatenko L.I., Ponomarenko S.P., Iutynska H.O.
Gene expression under regulators’ stimulation of
plant growth and development // New plant growth
regulators: basic research and technologies of appli-
cation / Eds S.P. Ponomarenko, H.O. Iutynska. –
Kyiv : Nichlava, 2011. – 211 p.
42. Ïîíîìàðåíêî Ñ.Ï., Òåðåê Î.È., Ãðèöàåíêî Ç.Ì.,
Áàáàÿíö Î.Â., Ìîèñååâà Ò.Â., Õó Âåíü Êñþ, Èêèí Ä.
Áèîðåãóëÿöèÿ ðîñòà è ðàçâèòèÿ ðàñòåíèé //
Áèîðåãóëÿöèÿ ìèêðîáíî-ðàñòèòåëüíûõ ñèñòåì/
Ïîä. ðåä. Ã.À. Èóòèíñêîé, Ñ.Ï. Ïîíîìàðåíêî. –
Êèåâ : Íè÷ëàâà, 2010. – 464 ñ.
43. Tsygankova V.A., Zayets V.N., Galkina L.A., Pri-
kazchikova L.P., Blume Ya.B. An unusual minor
protein appearing in embryonic axis cells of haricot
bean seeds following germination process stimu-
lated by 6-methylthiouracyl // Biopolym. Ñell. –
1998. – 14, ¹ 5. – P. 438–448.
44. Tsygankova V. A. Concerning the peculiarities of
gene expression changes in plant leaf cells dur-
ing twenty-four-hour period // Á³îòåõíîëîã³ÿ. –
2010. – 3, ¹ 4. – Ð. 86–95.
45. Tsygankova V.A., Musatenko L.I., Ponomarenko S.P.,
Galkina L.A., Andrusevich Ja.V., Galkin A.P. Chan-
ge of functionally active cytoplasmic mRNA popu-
lations in plant cells under growth regulators action
and biological perspectives of cell-free systems of
protein synthesis // Á³îòåõíîëîã³ÿ. – 2010. – 3,
¹ 2. – P. 19–32.
46. Locker J. Analytical and preparative electrophoresis
of RNA in agarose-urea // Anal. Biochem. – 1979. –
98, ¹ 2. – P. 358–367.
47. Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular
cloning : A laboratory manual. – New York : Cold
Spring Harbor Lab., 1982. – 480 p.
48. Promega protocols and applications guide. Second
edition. – USA : Promega Corporation, 1991. –
422 p.
49. Öèãàíêîâà Â.À., Ãàëê³í À.Ï., Ãàëê³íà Ë.Î.,
Ñàáëóê Â.Ò., Êàëàòóð Ê.À., Ñòåôàíîâñüêà Ò.Ð.,
Ïîíîìàðåíêî Ñ.Ï. Çá³ëüøåííÿ ñèíòåçó ìàëèõ
ðåãóëÿòîðíèõ ÐÍÊ ç ³ìóíîìîäóëþþ÷èìè âëàñ-
òèâîñòÿìè â êë³òèíàõ ðîñëèí ï³ä âïëèâîì ðå-
ãóëÿòîð³â ðîñòó // Öóêð. áóðÿêè. – 2011. – 82,
¹ 4. – Ñ. 10–12.
Íàä³éøëà 06.02.12
<<
/ASCII85EncodePages false
/AllowTransparency false
/AutoPositionEPSFiles true
/AutoRotatePages /None
/Binding /Left
/CalGrayProfile (Dot Gain 20%)
/CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
/CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2)
/sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
/CannotEmbedFontPolicy /Error
/CompatibilityLevel 1.4
/CompressObjects /Tags
/CompressPages true
/ConvertImagesToIndexed true
/PassThroughJPEGImages true
/CreateJobTicket false
/DefaultRenderingIntent /Default
/DetectBlends true
/DetectCurves 0.0000
/ColorConversionStrategy /CMYK
/DoThumbnails false
/EmbedAllFonts true
/EmbedOpenType false
/ParseICCProfilesInComments true
/EmbedJobOptions true
/DSCReportingLevel 0
/EmitDSCWarnings false
/EndPage -1
/ImageMemory 1048576
/LockDistillerParams false
/MaxSubsetPct 100
/Optimize true
/OPM 1
/ParseDSCComments true
/ParseDSCCommentsForDocInfo true
/PreserveCopyPage true
/PreserveDICMYKValues true
/PreserveEPSInfo true
/PreserveFlatness true
/PreserveHalftoneInfo false
/PreserveOPIComments false
/PreserveOverprintSettings true
/StartPage 1
/SubsetFonts true
/TransferFunctionInfo /Apply
/UCRandBGInfo /Preserve
/UsePrologue false
/ColorSettingsFile ()
/AlwaysEmbed [ true
]
/NeverEmbed [ true
]
/AntiAliasColorImages false
/CropColorImages true
/ColorImageMinResolution 300
/ColorImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleColorImages true
/ColorImageDownsampleType /Bicubic
/ColorImageResolution 1200
/ColorImageDepth -1
/ColorImageMinDownsampleDepth 1
/ColorImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeColorImages false
/ColorImageFilter /DCTEncode
/AutoFilterColorImages true
/ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG
/ColorACSImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/ColorImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/JPEG2000ColorACSImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/JPEG2000ColorImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/AntiAliasGrayImages false
/CropGrayImages true
/GrayImageMinResolution 300
/GrayImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleGrayImages true
/GrayImageDownsampleType /Bicubic
/GrayImageResolution 1200
/GrayImageDepth -1
/GrayImageMinDownsampleDepth 2
/GrayImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeGrayImages false
/GrayImageFilter /DCTEncode
/AutoFilterGrayImages true
/GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG
/GrayACSImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/GrayImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/JPEG2000GrayACSImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/JPEG2000GrayImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/AntiAliasMonoImages false
/CropMonoImages true
/MonoImageMinResolution 1200
/MonoImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleMonoImages true
/MonoImageDownsampleType /Bicubic
/MonoImageResolution 1200
/MonoImageDepth -1
/MonoImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeMonoImages false
/MonoImageFilter /CCITTFaxEncode
/MonoImageDict <<
/K -1
>>
/AllowPSXObjects false
/CheckCompliance [
/None
]
/PDFX1aCheck false
/PDFX3Check false
/PDFXCompliantPDFOnly false
/PDFXNoTrimBoxError true
/PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
]
/PDFXSetBleedBoxToMediaBox true
/PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
]
/PDFXOutputIntentProfile (None)
/PDFXOutputConditionIdentifier ()
/PDFXOutputCondition ()
/PDFXRegistryName ()
/PDFXTrapped /False
/CreateJDFFile false
/Description <<
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
/BGR <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>
/CHS <FEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000410064006f006200650020005000440046002065876863900275284e8e9ad88d2891cf76845370524d53705237300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002>
/CHT <FEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef69069752865bc9ad854c18cea76845370524d5370523786557406300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002>
/CZE <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>
/DAN <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>
/DEU <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>
/ESP <FEFF005500740069006c0069006300650020006500730074006100200063006f006e0066006900670075007200610063006900f3006e0020007000610072006100200063007200650061007200200064006f00630075006d0065006e0074006f00730020005000440046002000640065002000410064006f0062006500200061006400650063007500610064006f00730020007000610072006100200069006d0070007200650073006900f3006e0020007000720065002d0065006400690074006f007200690061006c00200064006500200061006c00740061002000630061006c0069006400610064002e002000530065002000700075006500640065006e00200061006200720069007200200064006f00630075006d0065006e0074006f00730020005000440046002000630072006500610064006f007300200063006f006e0020004100630072006f006200610074002c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000200079002000760065007200730069006f006e0065007300200070006f00730074006500720069006f007200650073002e>
/ETI <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>
/FRA <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>
/GRE <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>
/HEB <FEFF05D405E905EA05DE05E905D5002005D105D405D205D305E805D505EA002005D005DC05D4002005DB05D305D9002005DC05D905E605D505E8002005DE05E105DE05DB05D9002000410064006F006200650020005000440046002005D405DE05D505EA05D005DE05D905DD002005DC05D405D305E405E105EA002005E705D305DD002D05D305E405D505E1002005D005D905DB05D505EA05D905EA002E002005DE05E105DE05DB05D90020005000440046002005E905E005D505E605E805D5002005E005D905EA05E005D905DD002005DC05E405EA05D905D705D4002005D105D005DE05E605E205D505EA0020004100630072006F006200610074002005D5002D00410064006F00620065002000520065006100640065007200200035002E0030002005D505D205E805E105D005D505EA002005DE05EA05E705D305DE05D505EA002005D905D505EA05E8002E05D005DE05D905DD002005DC002D005000440046002F0058002D0033002C002005E205D905D905E005D5002005D105DE05D305E805D905DA002005DC05DE05E905EA05DE05E9002005E905DC0020004100630072006F006200610074002E002005DE05E105DE05DB05D90020005000440046002005E905E005D505E605E805D5002005E005D905EA05E005D905DD002005DC05E405EA05D905D705D4002005D105D005DE05E605E205D505EA0020004100630072006F006200610074002005D5002D00410064006F00620065002000520065006100640065007200200035002E0030002005D505D205E805E105D005D505EA002005DE05EA05E705D305DE05D505EA002005D905D505EA05E8002E>
/HRV (Za stvaranje Adobe PDF dokumenata najpogodnijih za visokokvalitetni ispis prije tiskanja koristite ove postavke. Stvoreni PDF dokumenti mogu se otvoriti Acrobat i Adobe Reader 5.0 i kasnijim verzijama.)
/HUN <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>
/ITA <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>
/JPN <FEFF9ad854c18cea306a30d730ea30d730ec30b951fa529b7528002000410064006f0062006500200050004400460020658766f8306e4f5c6210306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103055308c305f0020005000440046002030d530a130a430eb306f3001004100630072006f0062006100740020304a30883073002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d3067958b304f30533068304c3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002>
/KOR <FEFFc7740020c124c815c7440020c0acc6a9d558c5ec0020ace0d488c9c80020c2dcd5d80020c778c1c4c5d00020ac00c7a50020c801d569d55c002000410064006f0062006500200050004400460020bb38c11cb97c0020c791c131d569b2c8b2e4002e0020c774b807ac8c0020c791c131b41c00200050004400460020bb38c11cb2940020004100630072006f0062006100740020bc0f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020c774c0c1c5d0c11c0020c5f40020c2180020c788c2b5b2c8b2e4002e>
/LTH <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>
/LVI <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>
/NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken die zijn geoptimaliseerd voor prepress-afdrukken van hoge kwaliteit. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.)
/NOR <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>
/POL <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>
/PTB <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>
/RUM <FEFF005500740069006c0069007a00610163006900200061006300650073007400650020007300650074010300720069002000700065006e007400720075002000610020006300720065006100200064006f00630075006d0065006e00740065002000410064006f006200650020005000440046002000610064006500630076006100740065002000700065006e0074007200750020007400690070010300720069007200650061002000700072006500700072006500730073002000640065002000630061006c006900740061007400650020007300750070006500720069006f006100720103002e002000200044006f00630075006d0065006e00740065006c00650020005000440046002000630072006500610074006500200070006f00740020006600690020006400650073006300680069007300650020006300750020004100630072006f006200610074002c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020015f00690020007600650072007300690075006e0069006c006500200075006c0074006500720069006f006100720065002e>
/RUS <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>
/SKY <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>
/SLV <FEFF005400650020006e006100730074006100760069007400760065002000750070006f0072006100620069007400650020007a00610020007500730074007600610072006a0061006e006a006500200064006f006b0075006d0065006e0074006f0076002000410064006f006200650020005000440046002c0020006b006900200073006f0020006e0061006a007000720069006d00650072006e0065006a016100690020007a00610020006b0061006b006f0076006f00730074006e006f0020007400690073006b0061006e006a00650020007300200070007200690070007200610076006f0020006e00610020007400690073006b002e00200020005500730074007600610072006a0065006e006500200064006f006b0075006d0065006e0074006500200050004400460020006a00650020006d006f0067006f010d00650020006f0064007000720065007400690020007a0020004100630072006f00620061007400200069006e002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000200069006e0020006e006f00760065006a01610069006d002e>
/SUO <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>
/SVE <FEFF0041006e007600e4006e00640020006400650020006800e4007200200069006e0073007400e4006c006c006e0069006e006700610072006e00610020006f006d002000640075002000760069006c006c00200073006b006100700061002000410064006f006200650020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e007400200073006f006d002000e400720020006c00e4006d0070006c0069006700610020006600f60072002000700072006500700072006500730073002d007500740073006b00720069006600740020006d006500640020006800f600670020006b00760061006c0069007400650074002e002000200053006b006100700061006400650020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e00740020006b0061006e002000f600700070006e00610073002000690020004100630072006f0062006100740020006f00630068002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020006f00630068002000730065006e006100720065002e>
/TUR <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>
/UKR <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>
/ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents best suited for high-quality prepress printing. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.)
>>
/Namespace [
(Adobe)
(Common)
(1.0)
]
/OtherNamespaces [
<<
/AsReaderSpreads false
/CropImagesToFrames true
/ErrorControl /WarnAndContinue
/FlattenerIgnoreSpreadOverrides false
/IncludeGuidesGrids false
/IncludeNonPrinting false
/IncludeSlug false
/Namespace [
(Adobe)
(InDesign)
(4.0)
]
/OmitPlacedBitmaps false
/OmitPlacedEPS false
/OmitPlacedPDF false
/SimulateOverprint /Legacy
>>
<<
/AddBleedMarks false
/AddColorBars false
/AddCropMarks false
/AddPageInfo false
/AddRegMarks false
/ConvertColors /ConvertToCMYK
/DestinationProfileName ()
/DestinationProfileSelector /DocumentCMYK
/Downsample16BitImages true
/FlattenerPreset <<
/PresetSelector /MediumResolution
>>
/FormElements false
/GenerateStructure false
/IncludeBookmarks false
/IncludeHyperlinks false
/IncludeInteractive false
/IncludeLayers false
/IncludeProfiles false
/MultimediaHandling /UseObjectSettings
/Namespace [
(Adobe)
(CreativeSuite)
(2.0)
]
/PDFXOutputIntentProfileSelector /DocumentCMYK
/PreserveEditing true
/UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged
/UntaggedRGBHandling /UseDocumentProfile
/UseDocumentBleed false
>>
]
>> setdistillerparams
<<
/HWResolution [2400 2400]
/PageSize [612.000 792.000]
>> setpagedevice
|