Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів

Показано здатність ізольованого чинника спряження CF₁ — каталітичної частини ATФ-синтазного комплексу хлоропластів — каталізувати гідроліз п-нітрофенілового естеру оцтової кислоти. Специфічні інгібітори карбоангідрази — ацетазоламід (АА) і етоксизоламід (ЕА) — в концентрації 1—100 мкМ модифікували...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2017
Hauptverfasser:	Михайленко, Н.Ф., Семеніхін, А.В., Хомочкін, А.П., Золотарьова, О.К.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України 2017
Schriftenreihe:	Доповіді НАН України
Schlagworte:	Біохімія
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126549
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів / Н.Ф. Михайленко, А.В. Семеніхін, А.П. Хомочкін, О.К. Золотарьова // Доповіді Національної академії наук України. — 2017. — № 3. — С. 92-98. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-126549
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1265492017-11-27T03:02:45Z Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів Михайленко, Н.Ф. Семеніхін, А.В. Хомочкін, А.П. Золотарьова, О.К. Біохімія Показано здатність ізольованого чинника спряження CF₁ — каталітичної частини ATФ-синтазного комплексу хлоропластів — каталізувати гідроліз п-нітрофенілового естеру оцтової кислоти. Специфічні інгібітори карбоангідрази — ацетазоламід (АА) і етоксизоламід (ЕА) — в концентрації 1—100 мкМ модифікували естеразну активність ензиму. АА в низькій концентрації (менше 5 мкМ) стимулював, а в діапазоні 25— 75 мкМ інгібував естеразну активність CF₁. ЕА в концентраціях 1—75 мкМ спричиняв значні зміни естеразної активності CF₁. АА і ЕА також впливали на латентну ATФазну активність ензиму: в концентраціях 1—25 мкМ активували, а 30—100 мкМ пригнічували гідроліз ATФ. Отримані результати дають підставу припустити, що виявлена естеразна активність CF₁ пов'язана з карбоангідразною функ цією чинника спряження і, можливо, є необхідною для перенесення протонів, спряженого з реакціями синтезу або гідролізу ATФ. Показана способность изолированного сопрягающего фактора CF₁ — каталитической части ATФ-синтазного комплекса хлоропластов — катализировать гидролиз п-нитрофенилового эфира уксусной кислоты. Специфические ингибиторы карбоангидразы — ацетазоламид (АА) и этоксизоламид (ЭА) — в концентрациях 1—100 мкМ модифицировали эстеразную активность фермента. АА в низкой концентрации (менее 5 мкМ) стимулировал, а в диапазоне 25—75 мкМ ингибировал эстеразную активность CF₁. ЭА в концентрациях 1—75 мкМ вызывал значительные изменения эстеразной активности CF₁. АА и ЭА также влияли на латентную ATФазную активность фермента: в концентрациях 1—25 мкМ активировали, а 30—100 мкМ подавляли гидролиз ATФ. Полученные результаты позволяют предположить, что обнаруженная эстеразная активность CF₁ связана с карбоангидразной функцией сопрягающего фактора и, возможно, необходима для переноса протонов, сопряженного с реакциями синтеза либо гидролиза ATФ. It is shown that the isolated coupling factor CF₁ (a catalytic part of the ATP synthase complex of chloroplasts) is able to catalyze the hydrolysis of p-nitrophenyl ester of acetic acid. Specific inhibitors of carbonic anhydrase, acetazolamide (AA), and ethoxyzolamide (EA) in the concentration range of 1 to 100 μM modified the esterase activity of the enzyme. AA at low concentrations (less than 5 μM) stimulated and in the range of 25-75 μM inhibited the esterase activity of CF₁. 1-75 μM EA caused the considerable changes in the esterase activity of CF₁. AA or EA affected also the latent ATPase activity of the enzyme: in the concentration 1-25 μM activated and 30-100 μM inhibited ATP hydrolysis. These results suggest that the observed esterase activity of CF₁ is related to the carbonic anhydrase function of the coupling factor and is probably necessary for the proton transfer coupled with the reactions of ATP synthesis or hydrolysis. 2017 Article Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів / Н.Ф. Михайленко, А.В. Семеніхін, А.П. Хомочкін, О.К. Золотарьова // Доповіді Національної академії наук України. — 2017. — № 3. — С. 92-98. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. 1025-6415 DOI: doi.org/10.15407/dopovidi2017.03.092 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126549 577.23 uk Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Біохімія Біохімія
spellingShingle	Біохімія Біохімія Михайленко, Н.Ф. Семеніхін, А.В. Хомочкін, А.П. Золотарьова, О.К. Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів Доповіді НАН України
description	Показано здатність ізольованого чинника спряження CF₁ — каталітичної частини ATФ-синтазного комплексу хлоропластів — каталізувати гідроліз п-нітрофенілового естеру оцтової кислоти. Специфічні інгібітори карбоангідрази — ацетазоламід (АА) і етоксизоламід (ЕА) — в концентрації 1—100 мкМ модифікували естеразну активність ензиму. АА в низькій концентрації (менше 5 мкМ) стимулював, а в діапазоні 25— 75 мкМ інгібував естеразну активність CF₁. ЕА в концентраціях 1—75 мкМ спричиняв значні зміни естеразної активності CF₁. АА і ЕА також впливали на латентну ATФазну активність ензиму: в концентраціях 1—25 мкМ активували, а 30—100 мкМ пригнічували гідроліз ATФ. Отримані результати дають підставу припустити, що виявлена естеразна активність CF₁ пов'язана з карбоангідразною функ цією чинника спряження і, можливо, є необхідною для перенесення протонів, спряженого з реакціями синтезу або гідролізу ATФ.
format	Article
author	Михайленко, Н.Ф. Семеніхін, А.В. Хомочкін, А.П. Золотарьова, О.К.
author_facet	Михайленко, Н.Ф. Семеніхін, А.В. Хомочкін, А.П. Золотарьова, О.К.
author_sort	Михайленко, Н.Ф.
title	Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів
title_short	Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів
title_full	Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів
title_fullStr	Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів
title_full_unstemmed	Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів
title_sort	естеразна активність чинника спряження cf₁, ізольованого з хлоропластів
publisher	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
publishDate	2017
topic_facet	Біохімія
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126549
citation_txt	Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів / Н.Ф. Михайленко, А.В. Семеніхін, А.П. Хомочкін, О.К. Золотарьова // Доповіді Національної академії наук України. — 2017. — № 3. — С. 92-98. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.
series	Доповіді НАН України
work_keys_str_mv	AT mihajlenkonf esteraznaaktivnístʹčinnikasprâžennâcf1ízolʹovanogozhloroplastív AT semeníhínav esteraznaaktivnístʹčinnikasprâžennâcf1ízolʹovanogozhloroplastív AT homočkínap esteraznaaktivnístʹčinnikasprâžennâcf1ízolʹovanogozhloroplastív AT zolotarʹovaok esteraznaaktivnístʹčinnikasprâžennâcf1ízolʹovanogozhloroplastív
first_indexed	2025-07-09T05:14:46Z
last_indexed	2025-07-09T05:14:46Z
_version_	1837145088890765312
fulltext	92 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 3 ОПОВІДІ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ doi: https://doi.org/10.15407/dopovidi2017.03.092 УДК 577.23 Н.Ф. Михайленко, А.В. Семеніхін, А.П. Хомочкін, О.К. Золотарьова Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, Київ E-mail: membrana@ukr.net Естеразна активність чинника спряження CF1, ізольованого з хлоропластів шпинату Представлено академіком НАН України К.М. Ситником Показано здатність ізольованого чинника спряження CF1 — каталітичної частини ATФ-синтазного комп- лексу хлоропластів — каталізувати гідроліз п-нітрофенілового естеру оцтової кислоти. Специфічні інгібі- тори карбоангідрази — ацетазоламід (АА) і етоксизоламід (ЕА) — в концентрації 1—100 мкМ модифікували естеразну активність ензиму. АА в низькій концентрації (менше 5 мкМ) стимулював, а в діапазоні 25— 75 мкМ інгібував естеразну активність CF1. ЕА в концентраціях 1—75 мкМ спричиняв значні зміни есте- разної активності CF1. АА і ЕА також впливали на латентну ATФазну активність ензиму: в концентраціях 1—25 мкМ активували, а 30—100 мкМ пригнічували гідроліз ATФ. Отримані результати дають підставу при- пустити, що виявлена естеразна активність CF1 пов'язана з карбоангідразною функ цією чинника спряження і, можливо, є необхідною для перенесення протонів, спряженого з реакціями синтезу або гідролізу ATФ. Ключовi слова: хлоропласти, CF1-ATФаза, карбоангідраза, естераза, сульфаніламідні інгібітори Чинник спряження CF1 є водорозчинною частиною ATФ-синтазного комплексу фотосин- те тичних (тилакоїдних) мембран хлоропластів, який складається з п'яти типів субоди- ниць у стехіометричному співвідношенні α :β :γ :δ :ε ~ 3:3 :1 :1 :1 [1] і містить каталітичні і регуляторні центри, що беруть участь у світлозалежному синтезі і гідролізі ATФ [2]. Піс- ля відокремлення від мембрани чинник CF1 втрачає здатність каталізувати синтез ATФ, але зберігає ATФазну активність. При цьому ізольований CF1 є латентною (прихованою) ATФазою і каталізує гідроліз ATФ лише після активації теплом або в результаті обробок редокс-реагентами, оксіаніонами, спиртами і деякими детергентами [2, 3]. Нещодавно ми показали, що ізольована CF1-ATФаза виявляє також карбоангідраз- ну активність, значно прискорюючи взаємоперетворення форм вугільної кислоти СО2 + + Н2О ↔ НСО3 – + Н+ [4, 5]. Хоча функціональне значення цієї активності для роботи комп- лексу ATФ-синтази лишається невизначеним, було висунуто припущення про її участь у протонному перенесенні крізь CF1-ATФазу, спряженому з процесами світлозалежного син- тезу або гідролізу ATФ [4, 6]. © Н.Ф. Михайленко, А.В. Семеніхін, А.П. Хомочкін, О.К. Золотарьова, 2017 БІОХІМІЯ 93ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 3 Естеразна активність чинника спряження CF1, ізольованого з хлоропластів шпинату Карбоангідрази (КА) відіграють головну роль у багатьох біологічних процесах. Існує принаймні шість різних ортологів цього ензиму (позначених як α, β, γ, δ, ε, ζ), що свідчить про їх незалежне еволюційне походження. Хоча чотири з цих протеїнів пов'язані з конкрет- ною групою організмів (α — з хребетними, β — з прокаріотами, γ — з археями, ε — з хе- молітотрофами), геномний аналіз показує, що в межах одного організму наявні ізоформи більше ніж одного ортологу. У C3-рослин ідентифіковані принаймні 15 генів, які кодують ізоформи КА з α-, β- і γ-родин [7]. Локалізація деяких ізоформ КА лишається невідомою. У хлоропластах, крім великої кількості β-карбоангідрази 1 (β-КА1), виявлені β-КА5 і α-КА4 у тилакоїдних мембранах, а в стромі — α-КА1 [8]. Показана також наявність КА в пігмент- білковому комплексі фотосистеми ІІ (ФСІІ), поблизу комплексу фотосистеми І і в люме- нальному просторі тилакоїдів [9]. Відомо, що, на відміну від β-КА, α-форми ензиму здатні каталізувати гідроліз низки естерів, тобто мають естеразну активність [10]. Наявність естеразної активності у складі мітохондріальної F1-ATФази була встановлена понад 35 років тому [11]. З метою повнішої характеристики КА, пов’язаної з ATФ-синтазним комплексом хлоропластів, нами була ви- значена естеразна активність ізольованої CF1-AТФази та вивчена дія специфічних інгібіто- рів карбоангідраз — ацетазоламіду і етоксизоламіду. Хлоропласти виділяли із свіжого листя шпинату як описано раніше [6] і руйнували протягом 10 хв у гіпотонічному розчині, що містив 5 мМ трис-НСl (pH 7,8) і 10 мМ NaCl. Тилакоїди двічі промивали гіпотонічним середовищем, переосаджували протягом 10 хв при 15 000 g і використовували для виділення препарату чинника спряження за методом Заха- рова із співавт. [12] з деякими модифікаціями. Осад тилакоїдів суспендували в середовищі 1 мМ ЕДТА, 5 мМ трис-SO4 (pH 7,5) до концентрації хлорофілу 1—1,5 мг/мл і змішували з хлороформом у співвідношенні об’ємів суспензії хлоропластів та розчинника 2:1. Суміш інтенсивно перемішували протягом 15 с і центрифугували 5 хв при 5 000 g. Верхню водну фазу відокремлювали, центрифугували протягом 30 хв при 20 000 g, і чинник спряження осаджували 2 М сульфатом амонію. Усі операції з ізоляції тилакоїдів і CF1 виконували при 4 °C. Концентрацію протеїну і чистоту отриманого препарату CF1 за результатами електро- форезу зі зміщенням заряду оцінювали як описано раніше [4]. Субодиничний склад CF1 ана- лізували після візуалізації поліпептидних зон ПААГ ДДС-денатуруючого електрофорезу в модифікованій системі Леммлі як описано в [4]. Поліпептидні зони виявляли за допомогою барвника кумассі R-250. Препарат містив практично один поліпептидній комплекс з моле- кулярною масою близько 440 кДа, що, за даними робіт [1, 3, 4], відповідає чиннику спря- ження CF1. Аналіз субодиничного складу згідно з даними електрофоретичного розділення денатурованого комплексу за наявності ДДС натрію показав п’ять типів поліпептидів з мо- лекулярною масою 60 кДа (α-субодиниця), 56 кДа (β-субодиниця), 39 кДа (γ-субодиниця), 20,5 кДа (δ-субодиниця), 14,7 кДа (ε-субодиниця). Це також відповідає даним [1, 3] і під- тверджує, що отриманий препарат є чинником спряження CF1. ATФазну активність ізольованого ензиму стимулювали прогріванням, для чого препа- рат (1,5—2,0 мг) вносили в розчин, що містив 10 мМ ATФ, 2 мМ CaCl2 і 20 мМ трис-HCl (рН ~ 7,8), і суміш на 30 хв вміщували в термостат з температурою 37 °С. Са2+-ATФазну ак- тивність визначали при 25 °С за кількістю утвореного неорганічного фосфату в реакційно- му середовищі, що містило 15 мМ трис-HCl (рН 7,8), 5 мМ ATФ та 2 мМ СаСl2 і виражали в 94 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 3 Н.Ф. Михайленко, А.В. Семеніхін, А.П. Хомочкін, О.К. Золотарьова мкмоль Фн /(мг протеїну · год) [5]. Кількість Фн у пробі визначали методом Лоурі та Лопеса в модифікації Скулачова [13]. Естеразну активність ізольованого ензиму CF1 визначали при 25 °С у розчині за швид- кістю гідролізу п-нітрофенілового естеру (п-НФЕ) оцтової кислоти [14]. Реакційне сере- довище (2 мл) містило 5 мМ трис-HCl (рН 7,8), 0,5 мМ п-НФЕ оцтової кислоти і 80— 150 мкг CF1. Усі дослідження проводили не менше ніж у трьох біологічних повторностях, кількість аналітичних повторностей у межах однієї біологічної дорівнювала 3. Визначали середні зна- чення і їх стандартні помилки. Порівнюючи вибірки, використовували t-критерій Стьюден- та, розбіжності вважали достовірними при p ≤ 0,05. Для визначення швидкості естеразної реакції як субстрат використовували п-НФЕ оцтової кислоти, при гідролізі якого утворюються п-нітрофенол і оцтова кислота: . (1) Ця реакція пришвидшується не тільки за наявності α-КА, але й α-хімотрипсину або аце- тилхолінестерази [15]. За експериментальних умов гідроліз нітрофенілових естерів виявився зручною модел- лю, яку широко використовують при дослідженні α-КА. Кінетика реакції при цьому є дво- фазною [15]: спочатку швидко утворюється п-нітрофенол у концентрації, що приблизно дорівнює кількості ензиму, після чого вивільнення продукту значно сповільнюється. Така кінетика була інтерпретована як результат початкового швидкого утворення інтермедіат- ного комплексу ацилгідразину з ензимом і одночасного вивільнення стехіометричних кіль- костей п-нітрофенолу. На рисунку, а наведено експериментальні дані по впливу гідрофільного інгібітора КА — ацетазоламіду (АА) на швидкість гідролізу п-НФЕ за наявності ізольованого чинника CF1. Швидкість реакції в контролі при відсутності інгібітора становила 150—550 мкмоль/(мг протеїну · год) і знижувалася при додаванні 25—75 мкМ АА. Під впливом АА в концентра- ціях 1—5 мкМ швидкість гідролізу п-НФЕ була вищою порівняно з контролем. Залежність естеразної активності CF1 від концентрації ліпофільного інгібітора КА — етоксизоламіду (ЕА) не є монотонною. У діапазоні протестованих концентрацій ЕА на кри- Вплив АА (а) і ЕА (б) на естеразну активність ізольованого чинника спряження CF1 95ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 3 Естеразна активність чинника спряження CF1, ізольованого з хлоропластів шпинату вій залежності швидкості реакції гідролізу п-НФЕ від концентрації інгібітора спостерігалося принаймні дві ділянки, де зростання ензиматичної активності чергувалося з її зменшенням (див. рисунок, б). Естеразна активність CF1 також немонотонно змінювалася залежно від концентрації АА (див. рисунок, а). Така кінетична поведінка свідчить про наявність у складі ензиму декількох центрів, при зв’язуванні з якими АА або ЕА стимулюють або пригнічують естеразну активність. CF1, який складається з багатьох субодиниць, містить декілька каталі- тичних [1, 3] і некаталітичних [2] центрів. Останні виконують регуляторну роль і, можливо, беруть участь у зв’язуванні інгібіторів КА. Таким чином, визначення естеразної активності ізольованого чинника спряження CF1 у розчині показало, що поряд зі здатністю прискорювати гідроліз ATФ і каталізувати пере- творення форм вугільної кислоти [4, 5] цей комплекс також пришвидшує розклад нітрофе- нілових естерів. Усі ці функції CF1 залежать від наявності специфічних сульфаніламідних інгібіторів КА — АА або ЕА в мікромолярних концентраціях. Залежність естеразної активності ізольованого CF1 від концентрації інгібіторів КА порівнювали з їх ефектом на ATФазну активність ізольованого препарату CF1. Як відо- мо, ATФазна активність CF1 є латентною, і в наших експериментах за наявності іонів Са2+ вона не перевищувала 45—48 мкмоль/(мг протеїну · год). Після теплової активації Са2+- ATФазна активність зростала і становила 175—195 мкмоль/(мг протеїну · год) (таблиця). Під впливом інгібіторів КА в діапазоні зростаючих концентрацій від 1 до 25 мкМ швидкість реакції Са2+-залежного гідролізу ATФ за наявності неактивованого ензиму зростала до рів- ня, який забезпечувався чинником спряження, активованим теплом (див. таблицю). З по- дальшим зростанням концентрації АА чи ЕА від 30 до 100 мкМ швидкість гідролізу ATФ знижувалася до значень, менших за рівень латентної активності ензиму. Отже, ATФазна активність ізольованого CF1 також змінюється при варіюванні концентрації інгібіторів КА за немонотонною кінетикою: спочатку активність зростає, а потім знижується, що свідчить про існування в ензимі декількох центрів зв’язування сульфаніламідних інгібіторів з різною афінністю, які регулюють швидкість ATФазної і естеразної реакцій CF1. Чутливість цих реакцій ізольованого CF1 до дії сульфаніламідів виявилася значно ви- щою порівняно з відповіддю мембранозв’язаного ATФ-синтазного комплексу тилакоїдів, функціональна активність якого змінювалася за наявності 0,5—1 мМ АА або ЕА [6]. На підставі отриманих результатів можна зробити припущення про те, що карбоангі- дразна активність каталітичної частини ATФ-синтазного комплексу, наявність якої була встановлена нами раніше [4, 5], може бути пов’язана з карбоангідразою α-типу, оскільки цей тип КА виявляє естеразну активність. Цей ензим може бути задіяним у перенесенні прото- нів, які поглинаються або вивільняються в реакції синтезу або гідролізу ATФ відповідно. Вплив інгібіторів КА на Са2+-ATФазну активність ізольованого чинника спряження CF1, мкмоль/(мг протеїну · год) Інгібітор Концентрація інгібітора 0 10 мкМ 20 мкМ 50 мкМ 100 мкМ АА 46 ± 2,2 147,8 ± 3,1 181,3 ± 9,1 45 ± 1,4 39 ± 1,2 ЕА 46 ± 2,2 110,5 ± 2,5 163 ± 7,3 44 ± 1,3 38 ± 1,2 96 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 3 Н.Ф. Михайленко, А.В. Семеніхін, А.П. Хомочкін, О.К. Золотарьова ЦИТОВАНА ЛIТЕРАТУРА 1. Tiedge H., Lünsdorf H., Schäfer G., Schairer H.U. Subunit stoichiometry and juxtaposition of the photosyn- thetic coupling factor 1: Immunoelectron microscopy using monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. 82, № 23. P. 7874—7878. 2. Malyan A.N. Noncatalytic nucleotide binding sites: Properties and mechanism of involvement in ATP synthase activity regulation. Biochemistry (Moscow). 2013. 78, № 13. P. 1512—1523. doi: https://doi.org/ 10.1134/S0006297913130099 3. Groth G., Strotmann H. New results about structure, function and regulation of the chloroplast ATP syn- thase (CF0CF1). Physiol. Plant. 1999. 106, № 1. P. 142—148. doi: https://doi.org/10.1034/j.1399-3054.1999. 106120.x 4. Semenihin A.V., Zolotareva O.K. Carbonic anhydrase activity of integral-functional complexes of thylakoid membranes of spinach chloroplasts. Ukr. Biochem. J. 2015. 87, № 3. P. 47—56. doi: https://doi.org/10.15407/ ubj87.03.047 5. Хомочкiн А.П., Семеніхін А.В., Золотарьова О.К. Дія інгібіторів карбоангідрази на ензиматичну актив- ність ізольованої тилакоїдної CF1 ATФази. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2016. № 1. С. 92—98. doi: https:// doi.org/10.15407/dopovidi2016.01.092 6. Онойко Е.Б., Полищук А.В., Золотарева Е.К. Стимулирование фотофосфорилирования в изолирован- ных хлоропластах шпината экзогенным бикарбонатом: роль карбоангидразы. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2010. № 10. С. 160—165. 7. Moroney J.V., Bartlett S.G., Samuelsson G. Carbonic anhydrases in plants and algae. Plant Cell Environ. 2001. 24, № 2. P. 141—153. doi: https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2001.00669.x 8. Fabre N., Reiter I.M., Becuwe-Linka N., Genty B., Rumeau D. Characterization and expression analysis of genes encoding α and β carbonic anhydrases in Arabidopsis. Plant Cell Environ. 2007. 30, № 5. P. 617—629. doi: https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2007.01651.x 9. Rudenko N.N., Ignatova L.K., Fedorchuk T.P., Ivanov B.N. Carbonic anhydrases in photosynthetic cells of higher plants. Biochemistry (Moscоw). 2015. 80, № 6. P. 674-687. doi: https://doi.org/10.1134/ S0006297915060048 10. Winum J.-Y., Colinas P. Carbonic anhydrases as esterases and their biotechnological applications. Carbonic An hydrases as Biocatalysts: From Theory to Medical and Industrial Applications. C.T. Supuran, G. De Simone (Eds.). Amsterdam: Elsevier, 2015. P. 361—371. doi: https://doi.org/10.1016/B978-0-444-63258-6.00021-4 11. Ягужинский Л.С., Гудзь Т.И., Верховский А.Б. Эстеразная активность олигомицинчувствительной ATФазы митохондрий. Биохимия. 1978. 43, № 11. С. 2058—2063. 12. Захаров С.Д., Сытник С.К., Мальян А.Н., Макаров А.Д. Выделение и свойства CF1-АТРазы с изменен- ной субмолекулярной структурой. Биохимия. 1978. 43, № 5. С. 887—891. 13. Никулина Г.И. Обзор методов колориметрического определения фосфора по образованию молибдено- вой сини. Москва-Ленинград: Наука, 1965. 45 с. 14. Ефимцева Э.А., Челпанова Т.И. Активность эстераз в тканях различных отделов желудочно-кишечного тракта северного оленя. Сельскохозяйственная биология. 2007. № 6. С. 77—80. 15. Bender M.L., Kézdy F.J., Wedler F.C. Alpha-Chymotrypsin: enzyme concentration and kinetics. J. Chem. Educ. 1967. 44, № 2. P. 84—88. doi: https://doi.org/10.1021/ed044p84 Надійшло до редакції 04.10.2016 REFERENCES 1. Tiedge, H., Lünsdorf, H., Schäfer, G. & Schairer, H. U. (1985). Subunit stoichiometry and juxtaposition of the photosynthetic coupling factor 1: Immunoelectron microscopy using monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, No. 23, pp. 7874-7878. 2. Malyan, A. N. (2013). Noncatalytic nucleotide binding sites: Properties and mechanism of involvement in ATP synthase activity regulation. Biochemistry (Moscow), 78, No. 13, pp. 1512-1523. doi: https://doi. org/10.1134/S0006297913130099 3. Groth, G. & Strotmann, H. (1999). New results about structure, function and regulation of the chloroplast ATP synthase (CF0CF1). Phyiol. Plant., 106, No. 1, pp. 142-148. doi: https://doi.org/10.1034/j.1399-3054. 1999.106120.x 97ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 3 Естеразна активність чинника спряження CF1, ізольованого з хлоропластів шпинату 4. Semenihin, A. V. & Zolotareva, O. K. (2015). Carbonic anhydrase activity of integral-functional complexes of thylakoid membranes of spinach chloroplasts. Ukr. Biochem. J., 87, Iss. 3, pp. 47-56. doi: https://doi. org/10.15407/ubj87.03.047 5. Khomochkin, A. P., Semenikhin, A. V. & Zolotareva, E. K. (2016). Effect of carbonic anhydrase inhibitors on enzymatic activity of isolated thylakoid CF1 ATPase. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr., No. 1, pp. 92-98 (in Ukrainian). doi: https://doi.org/10.15407/dopovidi2016.01.092 6. Onoiko, E. V., Polishchuck, A. V. & Zolotareva, E. K. (2010). The stimulation of photophosphorylation in isolated spinach chloroplasts by exogenous bicarbonate: the role of carbonic anhydrase. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr., No. 10, pp. 160-165 (in Russian). 7. Moroney, J. V., Bartlett, S. G. & Samuelsson, G. (2001). Carbonic anhydrases in plants and algae. Plant Cell Environ., 24, No. 2, pp. 141-153. doi: https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2001.00669.x 8. Fabre, N., Reiter, I. M., Becuwe-Linka, N., Genty, B. & Rumeau, D. (2007). Characterization and expression analysis of genes encoding α and β carbonic anhydrases in Arabidopsis. Plant Cell Environ., 30, No. 5, pp. 617- 629. doi: https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2007.01651.x 9. Rudenko, N.N., Ignatova, L.K., Fedorchuk, T.P. & Ivanov, B. N. (2015). Carbonic anhydrases in photosynthetic cells of higher plants. Biochemistry (Moscow), 80, No. 6, pp. 674-687. doi: https://doi.org/10.1134/ S0006297915060048 10. Winum, J.-Y., Colinas, P. (2015). Carbonic Anhydrases as Esterases and Their Biotechnological Applications. In Supuran, C. T., De Simone, G (Eds.) From Theory to Medical and Industrial Applications (pp. 361-371), Amsterdam: Elsevier. doi: https://doi.org/10.1016/B978-0-444-63258-6.00021-4 11. Yaguzhinskiy, L. S., Gudz, T. I. & Verkhovskiy, A. B (1978). Esterase activity of oligomycin sensitive ATPase of mitochondria. Biokhimiia, 43 (No. 11), pp. 2058-2063 (in Russian). 12. Zakharov, S. D., Sytnik, S. K., Malian, A. N. & Makarov, A. D. (1978). solation and svoysva СF1-ATPase with a modified structure submolecular. Biokhimiia, 43, No. 5, pp. 887-891 (in Russian). 13. Nikulina, G. I. (1965). Review of methods for the colorimetric determination of phosphorus on the formation of molybdenum blue. Moscow, Leningrad: Nauka, 1965 (in Russian). 14. Efimtseva, E. A. & Chelpanova, T. I. (2007). Esterase activity in the tissues of various parts of the gastrointestinal tract of the reindeer. Selskokhozyaistvennaya biologiya, No. 6, pp. 77-80 (in Russian). 15. Bender, M. L., Kezdy, F. J. & Wedler, F. C. (1967). Alpha-Chymotrypsin: Enzyme concentration and kinetics. J. Chem. Educ., 44, No. 2, pp. 84-88. doi: https://doi.org/10.1021/ed044p84 Received 04.10.2016 Н.Ф. Михайленко, А.В. Семенихин, А.П. Хомочкин, Е.К. Золотарёва Институт ботаники им. Н. Г. Холодного НАН Украины, Киев E-mail: membrana@ukr.net ЭСТЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ СОПРЯГАЮЩЕГО ФАКТОРА CF1, ИЗОЛИРОВАННОГО ИЗ ХЛОРОПЛАСТОВ ШПИНАТА Показана способность изолированного сопрягающего фактора CF1 — каталитической части ATФ-син таз- ного комплекса хлоропластов — катализировать гидролиз п-нитрофенилового эфира уксусной кислоты. Специфические ингибиторы карбоангидразы — ацетазоламид (АА) и этоксизоламид (ЭА) — в концентра- циях 1—100 мкМ модифицировали эстеразную активность фермента. АА в низкой концентрации (менее 5 мкМ) стимулировал, а в диапазоне 25—75 мкМ ингибировал эстеразную активность CF1. ЭА в концен- трациях 1—75 мкМ вызывал значительные изменения эстеразной активности CF1. АА и ЭА также влияли на латентную ATФазную активность фермента: в концентрациях 1—25 мкМ активировали, а 30—100 мкМ подавляли гидролиз ATФ. Полученные результаты позволяют предположить, что обнаруженная эстераз- ная активность CF1 связана с карбоангидразной функцией сопрягающего фактора и, возможно, необходи- ма для переноса протонов, сопряженного с реакциями синтеза либо гидролиза ATФ. Ключевые слова: хлоропласты, CF1-ATФаза, карбоангидраза, эстераза, сульфаниламидные ингибиторы. Н.Ф. Михайленко, А.В. Семеніхін, А.П. Хомочкін, О.К. Золотарьова N.F. Mykhailenko, A.V. Semenikhin, A.P. Khomochkin, E.K. Zolotareva M.G. Kholodhy Institute of Botany of the NAS of Ukraine, Kiev E-mail: membrana@ukr.net ESTERASE ACTIVITY OF CF1 COUPLING FACTOR ISOLATED FROM SPINACH CHLOROPLASTS It is shown that the isolated coupling factor CF1 (a catalytic part of the ATP synthase complex of chloroplasts) is able to catalyze the hydrolysis of p-nitrophenyl ester of acetic acid. Specific inhibitors of carbonic anhydrase, acetazolamide (AA), and ethoxyzolamide (EA) in the concentration range of 1 to 100 μM modified the esterase activity of the enzyme. AA at low concentrations (less than 5 μM) stimulated and in the range of 25-75 μM in- hibited the esterase activity of CF1. 1-75 μM EA caused the considerable changes in the esterase activity of CF1. AA or EA affected also the latent ATPase activity of the enzyme: in the concentration 1-25 μM activated and 30-100 μM inhibited ATP hydrolysis. These results suggest that the observed esterase activity of CF1 is related to the carbonic anhydrase function of the coupling factor and is probably necessary for the proton transfer cou- pled with the reactions of ATP synthesis or hydrolysis. Keywords: chloroplasts, CF1-ATPase, carbonic anhydrase, esterase, sulfanilamide inhibitors.

Естеразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів

Institution

Ähnliche Einträge