Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції
Сконструйовано вектор для конститутивної експресії антисенсових до консервативної ділянки гена 8Н07 нематоди Heterodera schachtii dsРНК та проведено генетичну трансформацію рослин ріпака за допомогою A. tumefaciens. Молекулярно-генетичними методами у геномі трансгенних рослин ріпака встановлено наяв...
Gespeichert in:
| Datum: | 2013 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
2013
|
| Schriftenreihe: | Цитология и генетика |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126583 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції / В.А. Циганкова, А.І. Ємець, Г.О. Іутинська, Л.О. Білявська, А.П. Галкін, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 4. — С. 35-45. — Бібліогр.: 40 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-126583 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1265832017-11-27T03:03:04Z Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції Циганкова, В.А. Ємець, А.І. Іутинська, Г.О. Білявська, Л.О. Галкін, А.П. Блюм, Я.Б. Оригинальные работы Сконструйовано вектор для конститутивної експресії антисенсових до консервативної ділянки гена 8Н07 нематоди Heterodera schachtii dsРНК та проведено генетичну трансформацію рослин ріпака за допомогою A. tumefaciens. Молекулярно-генетичними методами у геномі трансгенних рослин ріпака встановлено наявність вектора експресії антинематодних dsРНК, а також підтверджено високий рівень їхньої сайленсингової активності як в організмі нематод, так і в інфікованих ними рослин. В лабораторних дослідах за фізіологічними показниками підтверджено значне підвищення стійкості трансгенних рослин ріпака до коренепаразитуючої нематоди H. schachtii. Сконструирован вектор для конститутивной экспрессии антисмысловых к консервативной области гена 8Н07 нематоды H. schachtii dsРНК и проведена генетическая трансформация растений рапса с использованием A. tumefaciens. С помощью молекулярно-генетических методов показано присутствие в геноме трансгенных растений рапса вектора экспрессии антинематодных dsРНК, а также подтвержден высокий уровень их сайленсинговой активности как в организме нематод, так и у инфицированных ими растений. В лабораторных опытах по физиологическим показателям показано значительное повышение устойчивости трансгенных растений рапса к корнепаразитирующей нематоде H. schachtii. A vector for the constitutive expression of antisense to the conservative region of the 8H07 gene of the nematode H.schachtii dsRNA is constructed and a genetic transformation of rape plants is conducted by means of A. tumefaciens. Using molecular genetic methods, the presence of the vector expression of antinematode dsRNA in the genome of transgenic rape plants is shown, as well as the high level of their silencing activity is confirmed both in nematodes and in infected plants. In laboratory studies, a considerable increase in the tolerance of transgenic rape plants to the root parasitic nematode H. schachtii was shown for physiological signs. 2013 Article Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції / В.А. Циганкова, А.І. Ємець, Г.О. Іутинська, Л.О. Білявська, А.П. Галкін, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 4. — С. 35-45. — Бібліогр.: 40 назв. — укр. 0564-3783 DOI: 10.3103/S0095452713040105 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126583 631. 811. 98 uk Цитология и генетика Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Оригинальные работы Оригинальные работы |
| spellingShingle |
Оригинальные работы Оригинальные работы Циганкова, В.А. Ємець, А.І. Іутинська, Г.О. Білявська, Л.О. Галкін, А.П. Блюм, Я.Б. Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції Цитология и генетика |
| description |
Сконструйовано вектор для конститутивної експресії антисенсових до консервативної ділянки гена 8Н07 нематоди Heterodera schachtii dsРНК та проведено генетичну трансформацію рослин ріпака за допомогою A. tumefaciens. Молекулярно-генетичними методами у геномі трансгенних рослин ріпака встановлено наявність вектора експресії антинематодних dsРНК, а також підтверджено високий рівень їхньої сайленсингової активності як в організмі нематод, так і в інфікованих ними рослин. В лабораторних дослідах за фізіологічними показниками підтверджено значне підвищення стійкості трансгенних рослин ріпака до коренепаразитуючої нематоди H. schachtii. |
| format |
Article |
| author |
Циганкова, В.А. Ємець, А.І. Іутинська, Г.О. Білявська, Л.О. Галкін, А.П. Блюм, Я.Б. |
| author_facet |
Циганкова, В.А. Ємець, А.І. Іутинська, Г.О. Білявська, Л.О. Галкін, А.П. Блюм, Я.Б. |
| author_sort |
Циганкова, В.А. |
| title |
Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції |
| title_short |
Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції |
| title_full |
Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції |
| title_fullStr |
Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції |
| title_full_unstemmed |
Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції |
| title_sort |
підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди heterodera schachtii з використанням технологій рнк-інтерференції |
| publisher |
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України |
| publishDate |
2013 |
| topic_facet |
Оригинальные работы |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126583 |
| citation_txt |
Підвищення стійкості рослин ріпака до паразитичної нематоди Heterodera schachtii з використанням технологій РНК-інтерференції / В.А. Циганкова, А.І. Ємець, Г.О. Іутинська, Л.О. Білявська, А.П. Галкін, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 4. — С. 35-45. — Бібліогр.: 40 назв. — укр. |
| series |
Цитология и генетика |
| work_keys_str_mv |
AT cigankovava pídviŝennâstíjkostíroslinrípakadoparazitičnoínematodiheteroderaschachtiizvikoristannâmtehnologíjrnkínterferencíí AT êmecʹaí pídviŝennâstíjkostíroslinrípakadoparazitičnoínematodiheteroderaschachtiizvikoristannâmtehnologíjrnkínterferencíí AT íutinsʹkago pídviŝennâstíjkostíroslinrípakadoparazitičnoínematodiheteroderaschachtiizvikoristannâmtehnologíjrnkínterferencíí AT bílâvsʹkalo pídviŝennâstíjkostíroslinrípakadoparazitičnoínematodiheteroderaschachtiizvikoristannâmtehnologíjrnkínterferencíí AT galkínap pídviŝennâstíjkostíroslinrípakadoparazitičnoínematodiheteroderaschachtiizvikoristannâmtehnologíjrnkínterferencíí AT blûmâb pídviŝennâstíjkostíroslinrípakadoparazitičnoínematodiheteroderaschachtiizvikoristannâmtehnologíjrnkínterferencíí |
| first_indexed |
2025-07-09T05:18:35Z |
| last_indexed |
2025-07-09T05:18:35Z |
| _version_ |
1837145331983187968 |
| fulltext |
35ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
© Â.À. ÖÈÃÀÍÊÎÂÀ, À.². ªÌÅÖÜ, Ã.Î. ²ÓÒÈÍÑÜÊÀ,
Ë.Î. Á²ËßÂÑÜÊÀ, À.Ï. ÃÀËʲÍ, ß.Á. ÁËÞÌ, 2013
Ñêîíñòðóéîâàíî âåêòîð äëÿ êîíñòèòóòèâíî¿ åêñ-
ïðåñ³¿ àíòèñåíñîâèõ äî êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà
8Í07 íåìàòîäè Heterodera schachtii dsÐÍÊ òà ïðî-
âåäåíî ãåíåòè÷íó òðàíñôîðìàö³þ ðîñëèí ð³ïàêà çà
äîïîìîãîþ A. tumefaciens. Ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷íèìè ìå-
òîäàìè ó ãåíîì³ òðàíñãåííèõ ðîñëèí ð³ïàêà âñòàíîâ-
ëåíî íàÿâí³ñòü âåêòîðà åêñïðåñ³¿ àíòèíåìàòîäíèõ
dsÐÍÊ, à òàêîæ ï³äòâåðäæåíî âèñîêèé ð³âåíü ¿õíüî¿
ñàéëåíñèíãîâî¿ àêòèâíîñò³ ÿê â îðãàí³çì³ íåìàòîä, òàê
³ â ³íô³êîâàíèõ íèìè ðîñëèí.  ëàáîðàòîðíèõ äîñë³äàõ
çà ô³ç³îëîã³÷íèìè ïîêàçíèêàìè ï³äòâåðäæåíî çíà÷íå
ï³äâèùåííÿ ñò³éêîñò³ òðàíñãåííèõ ðîñëèí ð³ïàêà äî
êîðåíåïàðàçèòóþ÷î¿ íåìàòîäè H. schachtii.
Êëþ÷îâ³ ñëîâà: ÐÍÊ-³íòåðôåðåíö³ÿ, ìàë³ ðåãóëÿòîðí³
si/miÐÍÊ, êîðåíåïàðàçèòóþ÷à íåìàòîäà H. schachtii,
âåêòîðè åêñïðåñ³¿ àíòèíåìàòîäíèõ dsÐÍÊ, A. tume-
faciens-îïîñåðåäêîâàíà ãåíåòè÷íà òðàíñôîðìàö³ÿ, ñò³é-
ê³ äî íåìàòîä òðàíñãåíí³ ðîñëèíè ð³ïàêà.
Âñòóï. Äî íàéïîøèðåí³øèõ ïàòîãåííèõ îðãàí³ç-
ì³â, ùî ñïðè÷èíÿþòü õâîðîáè êóëüòóðíèõ ðîñ-
ëèí ³ çàâàæàþòü óñï³øíîìó ðîçâèòêó ñó÷àñíîãî
ðîñëèííèöòâà ó ð³çíèõ êðà¿íàõ ñâ³òó, íàëåæàòü
ïàðàçèòè÷í³ íåìàòîäè. Ùîð³÷í³ âòðàòè âðî-
æà¿â â³ä öèõ øê³äíèê³â ó ñâ³ò³ ñòàíîâëÿòü
ïîíàä 20 %, ùî â ãðîøîâîìó åêâ³âàëåíò³ ïðè-
ð³âíþºòüñÿ äî 125 ìëðä äîëàð³â ÑØÀ [1]. Íà
äàíèé ÷àñ ³äåíòèô³êîâàíî ïîíàä 4100 ð³çíèõ
âèä³â ïàðàçèòè÷íèõ íåìàòîä. Äëÿ ñ³ëüñüêîãî
ãîñïîäàðñòâà Óêðà¿íè íàéá³ëüø³ çáèòêè çàâäÿ-
êè ãëîáàëüíîìó ðîçïîâñþäæåííþ òà ñïðîìîæ-
íîñò³ âðàæàòè øèðîêå êîëî êóëüòóðíèõ ðîñëèí,
çîêðåìà òàê³ âàæëèâ³ êóëüòóðè, ÿê öóêðîâèé
áóðÿê òà ð³ïàê, ñïðè÷èíÿþòü åíäîïàðàçèòè÷í³
íåìàòîäè íàäðîäèíè Tylenchoidea, äî ÿêî¿ íà-
ëåæàòü ðîäèíè êîðåíåâèõ öèñòîóòâîðþþ÷èõ
íåìàòîä Heteroderidae òà Globoderidae, à òàêîæ
ðîäèíè ãàëîâèõ íåìàòîä Meloidogynidae [2]. Ô³ç³î-
ëîã³÷íèìè ïðîÿâàìè íåìàòîäíî¿ ³íâà糿 ó ðîñëèí
ìîæóòü áóòè ÷àõëèé ð³ñò, õëîðîç, ç³â’ÿíåííÿ,
ïîòîíøåííÿ òà ñêðó÷óâàííÿ ëèñòê³â àáî çì³íà
¿õíüîãî êîëüîðó (ïî÷åðâîí³ííÿ ÷è ïîáóð³ííÿ),
íåäîçð³âàííÿ òà ïåðåä÷àñíå îáïàäàííÿ ïëîä³â,
ï³äâèùåíà ÷óòëèâ³ñòü äî ³íøèõ õâîðîá, ñïðè-
÷èíåíèõ ³íòåíñèâíèì ñïîæèâàííÿì íåìàòîäà-
ìè âîäè òà ïîæèâíèõ ðå÷îâèí ³ç ñóäèí ðîñëèí,
çà â³äñóòíîñò³ êîòðèõ ãàëüìóºòüñÿ ð³ñò òà ðîç-
âèòîê îñòàíí³õ [3].
Äî ³ñíóþ÷èõ íà òåïåð³øí³é ÷àñ çàñîá³â êîíò-
ðîëþ ðîçïîâñþäæåííÿ íåìàòîä òà çìåíøåííÿ
óðàæåííÿ íèìè âàæëèâèõ ñ³ëüñüêîãîñïîäàðñüêèõ
êóëüòóð íàëåæàòü õ³ì³÷íî ñèíòåçîâàí³ ãðóíòîâ³
ôóì³ãàíòè, íåìàòèöèäè (êëàñó îðãàíîôîñôàò³â
òà êàðáàìàò³â) òà ð³çí³ âèäè ³íñåêòèöèä³â ïðè-
ðîäíîãî ïîõîäæåííÿ, íàïðèêëàä, ô³òî³íñåêòè-
öèä ïèðåòðèí òà éîãî ñèíòåòè÷í³ àíàëîãè –
ïèðåòðî¿äè [4]. Îäíàê ó á³ëüøîñò³ êðà¿í ñâ³òó
ñïîñòåð³ãàºòüñÿ òåíäåíö³ÿ îáìåæåííÿ ¿õíüîãî
ïðàêòè÷íîãî çàñòîñóâàííÿ ÷åðåç ¿õ âèñîêó òîê-
ñè÷í³ñòü äëÿ îðãàí³çìó ëþäèíè òà çàáðóäíåííÿ
íèìè íàâêîëèøíüîãî ñåðåäîâèùà. Äî òðàäèö³é-
íèõ çàñîá³â ðåãóëþâàííÿ ÷èñåëüíîñò³ ïàðàçè-
òè÷íèõ íåìàòîä íàëåæàòü òàêîæ ð³çí³ òåõíîëî㳿
á³îêîíòðîëþ [4], ùî âêëþ÷àþòü çàñòîñóâàííÿ
ð³çíîìàí³òíèõ îðãàí³÷íèõ ãðóíòîâèõ äîáðèâ òà
ïðîìèñëîâèõ â³äõîä³â ðîñëèííîãî òà òâàðèííîãî
ïîõîäæåííÿ, êîìïîñòó, à òàêîæ çì³íó ðÍ ãðóí-
ò³â (ï³äêèñëåííÿ äî pH 4 àáî ï³äëóæåííÿ äî
pH 8), ³íòðîäóêö³þ ó ãðóíò àíòàãîí³ñòè÷íèõ òà
êîíêóðåíòíèõ ì³êðîîðãàí³çì³â (áàêòåð³é øòàì³â
Burkholderia cepacia òà Bacillus chitinosporus, ãðè-
á³â-ì³êðîì³öåò³â Myrothecium verrucaria òà Paeci-
lomyces lilacinus), ñ³âîçì³íè ç âêëþ÷åííÿì êóëü-
òóð, ðåçèñòåíòíèõ äî íåìàòîä, âèêîðèñòàííÿ á³î-
ïðåïàðàò³â, ÿê³ ì³ñòÿòü åô³ðí³ î볿 ð³çíèõ ë³êàð-
ñüêèõ ðîñëèí ç íåìàòîöèäíèì åôåêòîì (íàïðèê-
ëàä, î볿 ñåçàìó, ÷àñíèêó, ðîçìàðèíó ³ á³ëîãî
УДК 631. 811. 98
В.А. ЦИГАНКОВА 1, А.І. ЄМЕЦЬ 2, Г.О. ІУТИНСЬКА 3,
Л.О. БІЛЯВСЬКА 3, А.П. ГАЛКІН 2, Я.Б. БЛЮМ 2
1 Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії HAH України, Київ
E-mail: vTsygankova@ukr.net
2 Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Київ
3 Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ
ПІДВИЩЕННЯ СТІЙКОСТІ РОСЛИН РІПАКА ДО ПАРАЗИТИЧНОЇ НЕМАТОДИ
HETERODERA SCHACHTII З ВИКОРИСТАННЯМ ТЕХНОЛОГІЙ РНК-ІНТЕРФЕРЕНЦІЇ
36
Â.À. Öèãàíêîâà, À.². ªìåöü, Ã.Î. ²óòèíñüêà òà ³í.
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
ïåðöþ) òà ³í. Íà æàëü, êîìá³íàö³¿ ïåðåë³÷åíèõ
çàñîá³â çäàòí³ ëèøå ïðèãí³÷óâàòè âèñîêó æèòòº-
ñïðîìîæí³ñòü öüîãî êëàñó øê³äíèê³â.
Àëüòåðíàòèâíèìè, íå øê³äëèâèìè äëÿ çäî-
ðîâ’ÿ ëþäèíè òà íàâêîëèøíüîãî ñåðåäîâèùà
àíòèïàðàçèòàðíèìè çàñîáàìè, º á³îïðåïàðàòè
â³ò÷èçíÿíîãî âèðîáíèöòâà: 1) á³îïðåïàðàò Àâåð-
êîì, ðîçðîáëåíèé â ²íñòèòóò³ ì³êðîá³îëî㳿 òà
â³ðóñîëî㳿 ³ì. Ä.Ê. Çàáîëîòíîãî ÍÀÍ Óêðà¿íè
íà îñíîâ³ ìåòàáîë³ò³â ´ðóíòîâîãî ñòðåïòîì³öåòó
Streptomyces avermitilis ÓÊÌ ÀÑ 2179, ÿêèé ì³ñ-
òèòü àíòèïàðàçèòàðíèé àíòèá³îòèê àâåðìåêòèí
³ êîìïëåêñ á³îëîã³÷íî àêòèâíèõ ñïîëóê – àì³íî-
êèñëîò, ë³ï³ä³â (ó òîìó ÷èñë³ â³ëüíèõ æèðíèõ
êèñëîò), â³òàì³í³â ãðóïè Â, ô³òîãîðìîí³â [5];
2) ðåãóëÿòîðè Á³îãåí, Ñò³ìïî ³ Ðåãîïëàíò,
ñòâîðåí³ â ²íñòèòóò³ á³îîðãàí³÷íî¿ õ³ì³¿ òà
íàôòîõ³ì³¿ ÍÀÍ Óêðà¿íè ñï³ëüíî ç ̳æâ³äîì-
÷èì íàóêîâî-òåõíîëîã³÷íèì öåíòðîì «Àãðîá³î-
òåõ» ÍÀÍ òà ÌÎÍ Óêðà¿íè; ö³ ðåãóëÿòîðè
ì³ñòÿòü àíòèïàðàçèòàðí³ àíòèá³îòèêè àâåðñåê-
òèíè (ïðîäóêòè ìåòàáîë³çìó ´ðóíòîâîãî ñòðåïòî-
ì³öåòó S. avermitilis) ³ ïðîäóêòè æèòòºä³ÿëüíîñò³
(àì³íîêèñëîòè, æèðí³ êèñëîòè, ïîë³ñàõàðèäè,
ô³òîãîðìîíè òà ì³êðîåëåìåíòè) â êóëüòóð³ in
vitro ãðèáà-ì³êñîì³öåòà, âèëó÷åíîãî ç êîðåíå-
âî¿ ñèñòåìè æåíüøåíþ [6].
 òîé æå ÷àñ íîâèì ïåðñïåêòèâíèì íàï-
ðÿìêîì áîðîòüáè ç³ øê³äíèêàìè ñ³ëüñüêîãî
ãîñïîäàðñòâà º ï³äâèùåííÿ ñò³éêîñò³ ðîñëèí
çà äîïîìîãîþ ìåòîä³â ãåííî¿ ³íæåíåð³¿, ñåðåä
ÿêèõ îñîáëèâèé ³íòåðåñ âèêëèêàþòü òåõíîëî-
㳿 ÐÍÊ-³íòåðôåðåíö³¿ (RNAi) àáî ïîñòòðàíñ-
êðèïö³éíîãî ñàéëåíñèíãó ãåí³â. Ãîëîâíà ðîëü
â îñòàííüîìó íàëåæèòü ìàëèì ðåãóëÿòîðíèì
si/miÐÍÊ (ðîçì³ðîì ~21–25 íò), çà ó÷àñò³ ÿêèõ
ñï³ëüíî ç åêçî- òà åíäîíóêëåàçàìè êîìïëåêñó
RISC (RNA-induced silencing complex) òà á³ë-
êàìè AGO (Argonaute) â³äáóâàºòüñÿ àáî áëî-
êóâàííÿ òðàíñëÿö³¿ ìÐÍÊ ïàòîãåííèõ òà ïàðà-
çèòè÷íèõ îðãàí³çì³â, àáî ¿õíº åíçèìàòè÷íå ðîç-
ùåïëåííÿ òà äåãðàäàö³ÿ [7, 8].
Íà äàíèé ÷àñ ðîçðîáëåíî ìåòîäè òà ïðî-
âåäåíî êîíñòðóþâàííÿ âåêòîð³â åêñïðåñ³¿ àíòè-
íåìàòîäíèõ si/miÐÍÊ. Ç ö³ºþ ìåòîþ ÿê ãåíè-
ì³øåí³ äëÿ ñàéëåíñèíãó îáèðàþòüñÿ íàéâàæ-
ëèâ³ø³ äëÿ æèòòºâîãî öèêëó íåìàòîä ãåíè,
çîêðåìà ãåíè êîíòðîëþ ðåïë³êàö³¿ ÄÍÊ, òðàíñ-
êðèïö³¿, ïðîöåñèíãó ÐÍÊ, ñèíòåçó òÐÍÊ, òðàíñ-
ëÿö³¿, êîíòðîëþ ôóíêö³îíóâàííÿ ðèáîñîì òà
òÐÍÊ, ïðîöåñ³â ìîäèô³êàö³¿, ñåêðåö³¿ òà ïåðå-
íîñó á³ëê³â, êîíòðîëþ ¿õíüî¿ ñòàá³ëüíîñò³ ³
äåãðàäàö³¿, êîíòðîëþ ôóíêö³é ì³òîõîíäð³é òà
ìåòàáîë³çìó á³ëê³â-ïîñåðåäíèê³â, ãåíè êîíòðî-
ëþ êë³òèííîãî öèêëó (á³ëê³â öèòîñêåëåòó –
òóáóë³í³â), êîíòðîëþ ñòðóêòóðè êë³òèí, ïåðå-
äà÷³ åíäî- òà ì³æêë³òèííèõ ñèãíàë³â, ïðîöå-
ñ³â åíäîöèòîçó, ³îííî¿ ðåãóëÿö³¿, ãåíè ôåð-
ìåíò³â íåìàòîä, ÿê³ ðîçùåïëþþòü êë³òèííó
ñò³íêó êîðåí³â ðîñëèí, ãåíè ñåêðåòîðíèõ á³ë-
ê³â åçîôàãåàëüíèõ çàëîç (åêñïðåñ³ÿ ÿêèõ íåîá-
õ³äíà äëÿ ïðîíèêíåííÿ ñòèëåòó íåìàòîä ó
ñïåö³àë³çîâàí³ êë³òèíè êîðåí³â – ñàéòè õàð-
÷óâàííÿ); ãåíè ðåïðîäóêòèâíîãî öèêëó (ìà-
æîðíèõ á³ëê³â ñïåðìè), ãåíè õ³òèíñèíòåòàçè
(çà ó÷àñò³ ÿêî¿ óòâîðþºòüñÿ ì³öíèé õ³òèíîâèé
ïîêðèâ íà îáîëîíö³ ÿºöü íåìàòîä) [9–15].
Ñòâîðþþòüñÿ òàêîæ ãåíåòè÷í³ êîíñòðóêö³¿
ç âåêòîðàìè åêñïðåñ³¿ si/miÐÍÊ äëÿ ñàéëåí-
ñèíãó ãåí³â ðîñëèí-ãîñïîäàð³â, ÿê³ ã³ïåðåêñ-
ïðåñóþòüñÿ ó ïåð³îä ³íô³êóâàííÿ ðîñëèí ³
òèì ñàìèì ñïðèÿþòü ïðîíèêíåííþ ó êîðåí³
òà ðîçìíîæåííþ ïàðàçèòè÷íèõ íåìàòîä. Äî
íàéá³ëüø âàæëèâèõ íàëåæàòü ðîäèíè ãåí³â:
PRP á³ëê³â (Pathogenesis-related protein), á³ë-
êà – òðàíñïîðòåðà àóêñèíó PIN2 (EIR), á³ëê³â
åòèëåíðåñïîíñèâíèõ (ERF) ôàêòîð³â, ðÿäó
òðàíñêðèïö³éíèõ ôàêòîð³â (AP2, MADS-
box, bZIP, bHLH òà NAC ãåíè), ã³áåðåë³í-
ðåãóëÿòîðíèõ á³ëê³â, çáàãà÷åíèõ ïðîë³íîì åêñ-
òåíñèíïîä³áíèõ á³ëê³â, á³ëê³â – òðàíñïîðòåð³â
í³òðàò³â NTP2, à òàêîæ ãåí³â ïåêòèíåñòåðàçè,
ôåðèòèíó, öèòîõðîìó P450, õàëêîíñèíòåòàçè,
ãåí³â á³ëê³â ìåòàáîë³çìó êë³òèííî¿ ñò³íêè òà ³í.
[16, 17].
Ðàí³øå íàìè êëîíîâàíî ãåí 8H07, ùî êî-
äóº îäèí ç âàæëèâèõ ñåêðåòîðíèõ á³ëê³â åçîôà-
ãåàëüíèõ çàëîç ïàðàçèòè÷íî¿ íåìàòîäè H. scha-
chtii, à òàêîæ ïðîâåäåíî ÏËÐ àìïë³ô³êàö³þ
êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè öüîãî ãåíà. Çà äîïî-
ìîãîþ Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³¿ ï³äòâåðäæå-
íî âèñîêèé ð³âåíü ãîìîëî㳿 ì³æ éîãî ïîñë³-
äîâíîñòÿìè òà ïîñë³äîâíîñòÿìè àíòèíåìàòîä-
íèõ (àíòèñåíñîâèõ äî CR-ä³ëÿíêè ãåíà) ìàëèõ
ðåãóëÿòîðíèõ si/miÐÍÊ, âèä³ëåíèõ ç ðîñëèí ð³-
ïàêà (Brassica rapa ssp. oleifera), êîòð³ âèðîùó-
âàëè íà ³íôåêö³éíîìó ôîí³ òà îáðîáëÿëè ðå-
ãóëÿòîðîì ðîñòó Ðåãîïëàíò [18]. Òîìó ìåòîþ
ö³º¿ ðîáîòè áóëî ñòâîðåííÿ âåêòîðíèõ êîíñò-
ðóêö³é ç êîíñòèòóòèâíîþ åêñïðåñ³ºþ si/miÐÍÊ,
37
ϳäâèùåííÿ ñò³éêîñò³ ðîñëèí ð³ïàêà äî ïàðàçèòè÷íî¿ íåìàòîäè Heterodera schachtii
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
ñïåöèô³÷íèõ äî êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà
8H07 ïàðàçèòè÷íî¿ íåìàòîäè H. schachtii, òà
îäåðæàííÿ òðàíñãåííèõ ðîñëèí ð³ïàêà ç ï³ä-
âèùåíîþ ñò³éê³ñòþ äî øê³äíèêà.
Ìàòåð³àëè òà ìåòîäè. Âåêòîðí³ êîíñòðóêö³¿
äëÿ ÐÍÊ-³íòåðôåðåíö³¿. Äëÿ äîñÿãíåííÿ åôåêòó
ÐÍÊ-³íòåðôåðåíö³¿ ïî â³äíîøåííþ äî êîíñåð-
âàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07 íåìàòîäè H. scha-
chtii ñòâîðèëè êîíñòðóêö³¿ ç âèêîðèñòàííÿì âåê-
òîðà pHannibal [10, 19], ÿêèé ïîò³ì ïåðåêëî-
íóâàëè ó NotI ñàéò á³íàðíîãî âåêòîðà pArt27 [20]
(ðèñ. 1). Ðåñòðèêö³þ, ë³ãóâàííÿ ÄÍÊ, ïðèãîòó-
âàííÿ ïëàçì³äíî¿ ÄÍÊ âèêîíóâàëè çã³äíî ç ðå-
êîìåíäàö³ÿìè [21, 22].
Á³íàðíèé âåêòîð çà äîïîìîãîþ ñòàíäàðòíîãî
òåïëîâîãî øîêó âíîñèëè ó øòàì Agrobacte-
rium tumefaciens C58, ÿêèé ó ïîäàëüøîìó êóëü-
òèâóâàëè íà ïîæèâíîìó ñåðåäîâèù³ LB, ùî
ì³ñòèëî 25 ìã/ìë êàíàì³öèíó [22]. Ïåðåâ³ðêó
øòàìó A. tumefaciens C58 íà ïðèñóòí³ñòü ïëàçì³äè
pArt27 çä³éñíþâàëè ëóæíèì âèä³ëåííÿì ïëàç-
ì³äè ç íàñòóïíèì ôðàêö³îíóâàííÿì çà äîïîìî-
ãîþ åëåêòðîôîðåçó â 0,8%-íîìó àãàðîçíîìó
ãåë³ (ðèñ. 2) [22].
Îäåðæàííÿ òðàíñãåííèõ ÐÍÊ-³íòåðôåðîâà-
íèõ ðîñëèí ð³ïàêà òà ïåðåâ³ðêà ¿õíüî¿ ñò³éêîñò³
äî íåìàòîäè H. schachtii. Ðîñëèíè ð³ïàêà âè-
ðîùóâàëè äî ñòà䳿 öâ³ò³ííÿ â óìîâàõ òåïëèö³
íà ñòåðèëüíîìó ´ðóíò³ ïðè 24/20 ºC (äåíü–í³÷).
Ïåðøîïî÷àòêîâ³ áðóíüêè çð³çàëè äëÿ çíÿòòÿ
àï³êàëüíîãî äîì³íóâàííÿ òà ñèíõðîí³çîâàíî¿
ïîÿâè áàãàòîðàçîâèõ âòîðèííèõ áðóíüîê. Òðàíñ-
ôîðìàö³þ çä³éñíþâàëè çà äîïîìîãîþ ãëèáèí-
íîãî ôëîðàëüíîãî ìåòîäó (íà ñòà䳿 öâ³ò³ííÿ ðîñ-
ëèíè íàéá³ëüø ñïðèéíÿòëèâ³ äî
òðàíñôîðìàö³¿) øëÿõîì çàíóðåí-
íÿ ðîçâèíóòèõ ôëîðàëüíèõ òêà-
íèí ó ðîç÷èí, ÿêèé ì³ñòèâ A. tu-
mefaciens, 5 % öóêðîçè òà 0,05%-
íèé ðîç÷èí (500 ìêë/ë) ñóð-
ôàêòàíòà Silwet L-77 (äëÿ ï³äâè-
ùåííÿ åôåêòèâíîñò³ òðàíñôîð-
ìàö³¿) [23]. Îáðîáêó êâ³òîê ð³-
ïàêà A. tumefaciens ïðîâîäèëè
Ðèñ. 1. Ñõåìà ðîçì³ùåííÿ àìïë³ô³êîâàíèõ
çà äîïîìîãîþ ÏËÐ êÄÍÊ ³íâåðòîâàíèõ
ïîñë³äîâíîñòåé ôðàãìåíòà êîíñåðâàòèâíî¿
ä³ëÿíêè ãåíà 8H07 íåìàòîäè H. schachtii ï³ä
êîíòðîëåì 35S ïðîìîòîðà ó âåêòîð pHan-
nibal ç íàñòóïíèì ïåðåêëîíóâàííÿì ó ñàéò
NotI á³íàðíîãî âåêòîðà pArt27: S – ñåíñîâ³
ïîñë³äîâíîñò³, ùî ì³ñòÿòü ñàéòè ðåñòðèêö³¿
XhoI–EcoRI; AS – àíòèñåíñîâ³ ôðàãìåíòè,
ùî ì³ñòÿòü ñàéòè ðåñòðèêö³¿ HindIII–XbaI
Ðèñ. 2. Ôðàãìåíòè ïëàçì³äè pArt27,
ôðàêö³îíîâàí³ çà äîïîìîãîþ åëåêòðî-
ôîðåçó â 0,8%-íîìó àãàðîçíîìó ãåë³
38
Â.À. Öèãàíêîâà, À.². ªìåöü, Ã.Î. ²óòèíñüêà òà ³í.
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
äåê³ëüêà ðàç³â òà íàêðèâàëè ¿õ ïîë³åòèëåíîâèì
÷îõëèêîì, ùîá çáåð³ãòè âîëîã³ñòü. ϳñëÿ
òðàíñôîðìàö³¿ ðîñëèíè ïåðåíîñèëè ó òåìíèé
áîêñ íà 24 ãîä, ïîò³ì âèíîñèëè íà ðîçñ³ÿíå
ñâ³òëî òà âèðîùóâàëè ïðîòÿãîì âåãåòàö³éíîãî
ïåð³îäó.
Íàñ³ííÿ, îòðèìàíå ç òðàíñãåííèõ ðîñëèí,
1 õâ ñòåðèë³çóâàëè 96%-íèì åòàíîëîì òà 20 õâ
ó 30%-íîìó âîäíîìó ðîç÷èí³ êîìåðö³éíîãî ïðå-
ïàðàòó «Á³ëèçíà» ç äîäàâàííÿì 0,02 % Tween,
ï³ñëÿ ÷îãî ïðîìèâàëè ñòåðèëüíîþ äèñòèëüî-
âàíîþ âîäîþ. Íàñ³ííÿ ïðîðîùóâàëè âïðî-
äîâæ 7–10 ä³á â ÷àøêàõ Ïåòð³ ó âîäíîìó
ðîç÷èí³ êàíàì³öèíó (20 ìã/ë) íà ³íôåêö³éíîìó
ôîí³ (³ç ñóñïåí糺þ öèñò íåìàòîäè H. sñha-
chtii, ç ÿêèõ ó ïðîöåñ³ ³íêóáàö³¿ ïðè 23 ºÑ ïðèáëèç-
íî íà 5–7-ìó äîáó ç’ÿâëÿëèñü ëè÷èíêè íåìàòîä)
[24]. ²äåíòèô³êàö³þ òðàíñôîðìîâàíèõ ðîñëèí
çä³éñíþâàëè çà íàÿâíîñò³ ó íèõ 3–5 ñôîðìîâàíèõ
çåëåíèõ ëèñòê³â òà äîáðå ðîçâèíóòèõ êîðåí³â.
Ñò³éê³ñòü 7-äîáîâèõ ïðîðîñòê³â òðàíñãåííèõ
ðîñëèí ð³ïàêà äî ïàðàçèòè÷íèõ íåìàòîä âè-
çíà÷àëè çà ìîðôîëîã³÷íèìè îçíàêàìè ó ïî-
ð³âíÿíí³ ç êîíòðîëüíèìè ³íô³êîâàíèìè ðîñ-
ëèíàìè (ðèñ. 3).
Êîðåí³ ð³ïàêà äëÿ ï³äðàõóíêó ê³ëüêîñò³ ïà-
ðàçèòóþ÷èõ íà íèõ ëè÷èíîê ñïî÷àòêó àêóðàò-
íî ïðîìèâàëè ó ïðîòî÷í³é âîä³, ïîò³ì çàíó-
ðþâàëè ó ðîç÷èí ìîëî÷íî¿ êèñëîòè, ãë³öåðèíó,
àí³ë³íó òà äèñòèëüîâàíî¿ âîäè íà äåê³ëüêà
õâèëèí, ï³ä³ãð³âàëè 2 õâ ó ì³êðîõâèëüîâ³é
ïå÷³ òà âèñóøóâàëè íà ïîâ³òð³. Øìàòî÷êè êî-
ðåí³â äîâæèíîþ 1,5 ñì ïîì³ùàëè ó ãîìî-
ãåí³çàòîð. ϳñëÿ öüîãî ãîìîãåí³çîâàí³ êîðå-
í³ ïåðåíîñèëè ó öèë³íäðè îá’ºìîì 150 ìë ç
100 ìë âîäè, ðåòåëüíî ñòðóøóâàëè òà ï³ä-
ðàõîâóâàëè ê³ëüê³ñòü íåìàòîä, ùî ïðîíèêëè
ó êîðåí³ [24]. Äîðîñë³ âåãåòóþ÷³ ðîñëèíè ïå-
ðåñàäæóâàëè ó ñòåðèëüíèé ãðóíò â ãîðùèêè
(ðèñ. 4).
Ìîëåêóëÿðíî-á³îëîã³÷íèé àíàë³ç ãåíåòè÷íî ìî-
äèô³êîâàíèõ ðîñëèí. Âèä³ëåííÿ ñóìàðíèõ ïðåïà-
ðàò³â ÐÍÊ ç êë³òèí òðàíñãåííèõ ðîñëèí òà
ïàðàçèòóþ÷èõ íà íèõ ëè÷èíîê íåìàòîä H. sñha-
chtii ïðîâîäèëè çã³äíî ç ìåòîäîì [18]. Ïîë³-
ìåðí³ñòü âèä³ëåíèõ ñóìàðíèõ ïðåïàðàò³â ÐÍÊ
àíàë³çóâàëè çà äîïîìîãîþ åëåêòðîôîðåçó â
1,5%-íîìó àãàðîçíîìó ãåë³ ó ïðèñóòíîñò³ 7 Ì
ñå÷îâèíè (ãåë³ çàáàðâëþâàëè ðîç÷èíîì áðî-
ìèñòîãî åòèä³þ).
Íàÿâí³ñòü ó ãåíîì³ òðàíñãåííèõ ðîñëèí âåê-
òîðà åêñïðåñ³¿ pArt27 çà ïðèñóòíîñò³ ³íòðîíó
ï³ðóâàòîðòîôîñôàòäèê³íàçà (ðdk) [19] ïåðåâ³-
ðÿëè ìåòîäîì ÇT-ÏËÐ àìïë³ô³êàö³¿ êÄÍÊ ïî-
ñë³äîâíîñòåé ³íòðîíó ðdk ç âèêîðèñòàííÿì
ñïåöèô³÷íèõ äî öèõ ïîñë³äîâíîñòåé ïðàéìåð³â
Ðèñ. 3. Âèðîùåí³ ó ëàáîðàòîðíèõ óìîâàõ íà ôîí³
³íôåêö³¿ H. schachtii 7-äîáîâ³ ïðîðîñòêè ð³ïàêà, ùî
îäåðæàí³ ç íàñ³ííÿ êîíòðîëüíèõ (á) òà òðàíñãåííèõ
(à) ðîñëèí
Ðèñ. 4. Çàãàëüíèé âèãëÿä êîíòðîëüíèõ ³ òðàíñãåííèõ
ðîñëèí ð³ïàêà, âèðîùåíèõ íà øòó÷íîìó ³íôåêö³é-
íîìó ôîí³ (ó ïðèñóòíîñò³ ëè÷èíîê íåìàòîäè H.
schachtii), òà ¿õíüîãî íàñ³ííÿ: à – êîíòðîëüí³ ðîñëèíè;
á – äîñë³äí³ ðîñëèíè, òðàíñôîðìîâàí³ A. tumefaciens,
ç âåêòîðîì åêñïðåñ³¿ dsÐÍÊ, ùî º ñïåöèô³÷íèìè äî
êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07 ïàðàçèòè÷íî¿ íå-
ìàòîäè H. schachtii; â – íàñ³ííÿ êîíòðîëüíèõ ðîñëèí;
ã – íàñ³ííÿ òðàíñãåííèõ ðîñëèí
39
ϳäâèùåííÿ ñò³éêîñò³ ðîñëèí ð³ïàêà äî ïàðàçèòè÷íî¿ íåìàòîäè Heterodera schachtii
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
(òàáëèöÿ) íà ìàòðèö³ ñóìàðíî¿ ìÐÍÊ, âèä³ëå-
íî¿ ç òðàíñãåííèõ ðîñëèí ð³ïàêà [18]. Àìïë³ô³êî-
âàíèé ôðàãìåíò ôðàêö³îíóâàëè çà äîïîìîãîþ
åëåêòðîôîðåçó â 15%-íîìó ÏÀÀÃ, ïðîñî÷åíî-
ìó áðîìèñòèì åòè䳺ì (ðèñ. 5).
Àíàë³ç åêñïðåñ³¿ àíòèíåìàòîäíèõ si/miRNA
â òðàíñôîðìîâàíèõ ðîñëèíàõ ð³ïàêà çä³éñíþ-
âàëè ìåòîäîì Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³¿ ñåí-
ñîâèõ òà àíòèñåíñîâèõ si/miÐÍÊ ïîñë³äîâ-
íîñòåé, îòðèìàíèõ ³ç ñóìàðíî¿ ìÐÍÊ ðîñëèí,
ç ðàä³îàêòèâíî ì³÷åíèìè íèçüêîìîëåêóëÿðíè-
ìè àíòèñåíñîâèìè òà ñåíñîâèìè [ -32P]-ì³-
÷åíèìè ÐÍÊ-çîíäàìè [21] (ðèñ. 6).
Ñïî÷àòêó âèä³ëÿëè si/miÐÍÊ çà ðåêîìåí-
äàö³ÿìè Hamilton et al. [25], çã³äíî ç ÿêèìè
îõîëîäæåíèé ó ð³äêîìó àçîò³ òà ïîäð³áíåíèé
ðîñëèííèé ìàòåð³àë äëÿ åêñòðàêö³¿ âíîñèëè ó
áóôåð: 50 ìÌ Òðèñ-HCl (pH 9), 10 ìÌ ÅÄÒA,
100 ìÌ õëîðèäó íàòð³þ, 2 % ÄÄÑ (5 ìë/1 ã
ðîñëèííîãî ìàòåð³àëó). ϳñëÿ åêñòðàêö³¿ ç
ìåòîþ âèäàëåííÿ á³ëê³â òà ïîë³ñàõàðèä³â ãî-
ìîãåíàò îáðîáëÿëè ð³âíèìè îá’ºìàìè áóôå-
ðà, íàñè÷åíîãî ôåíîëîì-õëîðîôîðìîì; íó-
êëå¿íîâ³ êèñëîòè îñàäæóâàëè çà äîïîìîãîþ
ðîç÷èíó, ÿêèé ì³ñòèâ 1/10 îá’ºìó 3 Ì àöå-
òàòó íàòð³þ (pH 5,0) òà òðè îá’ºìè àáñîëþò-
íîãî åòàíîëó.
ϳñëÿ ³íêóáàö³¿ âïðîäîâæ 2 ãîä ïðè –20 ºÑ
ïðåöèï³òàò öåíòðèôóãóâàëè, ïðîìèâàëè 70%-
íèì åòàíîëîì, âèñóøóâàëè òà ïîâòîðíî ðîç-
÷èíÿëè ó á³äèñòèëüîâàí³é âîä³. Âèñîêîìî-
ëåêóëÿðí³ íóêëå¿íîâ³ êèñëîòè îñàäæóâàëè ç
öüîãî ðîç÷èíó äîäàâàííÿì ïîë³åòèëåíãë³êîëþ
(ìîëåêóëÿðíà ìàñà 8000) òà õëîðèäó íàòð³þ
äî ê³íöåâèõ êîíöåíòðàö³é 5 % ³ 500 ìÌ â³äïî-
â³äíî ç íàñòóïíîþ ³íêóáàö³ºþ íà ëüîäó âïðî-
äîâæ 30 õâ. ϳñëÿ âèäàëåííÿ îñàäó öåíòðè-
ôóãóâàííÿì íèçüêîìîëåêóëÿðí³ si/miÐÍÊ, ùî
çàëèøèëèñü ó ñóïåðíàòàíò³, ïðåöèï³òóâàëè çà
äîïîìîãîþ àöåòàòó íàòð³þ òà åòàíîëó, ÿê
îïèñàíî âèùå; 50 ìêã ö³º¿ ôðàêö³¿, ùî ì³ñòè-
ëà si/miÐÍÊ, ôðàêö³îíóâàëè åëåêòðîôîðåçîì
â 15%-íîìó ÏÀÀà ó ïðèñóòíîñò³ 7 Ì ñå÷îâèíè.
Ñåíñîâ³ òà àíòèñåíñîâ³ ÐÍÊ-çîíäè ñèíòå-
çîâàí³ çà äîïîìîãîþ Riboprobe in vitro Trans-
cription System (Promega) [21] ³ç âèêîðèñòàííÿì
ðèáîíóêëåîòèä³â ÀÒÔ, ÃÒÔ, ÖÒÔ òà ðàä³î-
àêòèâíî ì³÷åíîãî [ -32P] ÓÒÔ (125 ìêʳ íà
20 ìêë ðåàêö³éíî¿ ñóì³ø³, ñïåöèô³÷íîþ àêòèâ-
í³ñòþ 3000 ʳ/ììîëü), à òàêîæ Ò7 ÐÍÊ-ïîë³-
ìåðàçè íà ÄÍÊ-ìàòðèö³ ë³àíåðèçîâàíî¿ ïëàç-
ì³äè pArt27, äåíàòóðîâàíî¿ ïðè +80 ºÑ [26].
ϳñëÿ ïðîâåäåííÿ ðåàêö³¿ òðàíñêðèïö³¿ çîíäè
îáðîáëÿëè 20 õâ ÄÍÊàçîþ I ïðè 37 ºÑ äëÿ âè-
äàëåííÿ ÄÍÊ. Ùîá îòðèìàòè íèçüêîìîëåêó-
ëÿðí³ çîíäè (ðîçì³ðîì 25–50 í.ï.), ùî º ñïå-
öèô³÷íèìè äî âèä³ëåíèõ si/miÐÍÊ [27], ïðî-
âîäèëè ïîñë³äóþ÷èé ëóæíèé ã³äðîë³ç ïîâíîðîç-
ì³ðíèõ [ -32P]-ì³÷åíèõ ÐÍÊ çîíä³â ïðè 60 ºÑ
ïðîòÿãîì 2,5 ãîä ç âèêîðèñòàííÿì 300 ìêë
êàðáîíàòíîãî áóôåðà, êîòðèé ì³ñòèâ 120 ìM
Na2CO3/80 ìM NaHCO3 íà 20 ìêë ðåàêö³éíî¿
ñóì³ø³ [25, 27]. ϳñëÿ ã³äðîë³çó ïîñë³äîâíî
ïðîâîäèëè íåéòðàë³çàö³þ ðîç÷èíó äî pH 5,0,
âèêîðèñòîâóþ÷è 20 ìêë 3 Ì àöåòàòó íàòð³þ.
Íèçüêîìîëåêóëÿðí³ ÐÍÊ ó ïîäàëüøîìó ïðå-
öèï³òóâàëè çà äîïîìîãîþ 0,1 îá’ºìó 3 Ì àöå-
òàòó íàòð³þ, pH 5,2, 2 ìêë ðîç÷èíó (10 ìã/ìë)
Ðèñ. 5. Ðåçóëüòàòè ³äåíòèô³êàö³¿ ïîñë³äîâíîñò³ ³íòðî-
íó pdk, àìïë³ô³êîâàíîãî çà äîïîìîãîþ ÇT-ÏËÐ, ó
15%-íîìó ÏÀÀÃ
Ðèñ. 6. Ðåçóëüòàòè àíàë³çó åêñïðåñ³¿ si/miÐÍÊ,
ñïåöèô³÷íèõ äî êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07
íåìàòîäè H. schachtii, ó òðàíñôîðìîâàíèõ ðîñëèíàõ
ð³ïàêà ìåòîäîì Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³¿ ñåíñîâèõ
òà àíòèñåíñîâèõ si/miÐÍÊ ïîñë³äîâíîñòåé, îòðèìà-
íèõ ³ç ñóìàðíî¿ ìÐÍÊ ðîñëèí, ç [ -32P]-ì³÷åíèìè
àíòèñåíñîâèìè (à) òà ñåíñîâèìè (á) ÐÍÊ-çîíäàìè
40
Â.À. Öèãàíêîâà, À.². ªìåöü, Ã.Î. ²óòèíñüêà òà ³í.
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
ãë³êîãåíó òà äâîõ îá’ºì³â 96%-íîãî åòàíîëó
ïðè –20 ºÑ ïðîòÿãîì 30 õâ. Ïîò³ì çä³éñíþâàëè
ïðîìèâàííÿ 80%-íèì åòàíîëîì, âèñóøóâàííÿ
òà ðîç÷èíåííÿ ó 30 ìêë â³ëüíî¿ â³ä íóêëåàç
äèñòèëüîâàí³é âîä³ ç íàñòóïíîþ äåíàòóðàö³ºþ
¿õ ïðè +80 ºÑ âïðîäîâæ 5 õâ.
Ç ãåëþ si/miÐÍÊ ïåðåíîñèëè íà íåéëîíî-
âó ìåìáðàíó Zeta-Probe çà äîïîìîãîþ åëåêòðî-
áëîòèíãó (ïðè 300 ìÀ ïðîòÿãîì 1 ãîä) ³ ïðî-
âîäèëè Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³þ ñåíñîâèõ òà
àíòèñåíñîâèõ ïîñë³äîâíîñòåé si/miÐÍÊ ç â³ä-
ïîâ³äíî àíòèñåíñîâèìè òà ñåíñîâèìè [ -32P]-
ì³÷åíèìè íèçüêîìîëåêóëÿðíèìè ÐÍÊ-çîíäà-
ìè (âïðîäîâæ 24 ãîä ïðè 42 ºÑ) ó áóôåð³,
ùî ì³ñòèâ 125 ìÌ ôîñôàòó íàòð³þ, ðÍ 7,2,
250 ìÌ õëîðèäó íàòð³þ, 7 % ÄÄÑ, 50 %
äå³îí³çîâàíîãî ôîðìàì³äó ç íàñòóïíîþ äâîðà-
çîâîþ ïðîìèâêîþ ðîç÷èíîì 2×SSC (1×SSC =
= 150 ìM õëîðèäó íàòð³þ òà 15 ìM öèòðàòó
íàòð³þ, pH 7,0) ³ 0,2 % ÄÄÑ ïðîòÿãîì 30 õâ
ïðè 42 ºÑ. Íåã³áðèäèçîâàí³ (íåñïåöèô³÷í³)
ä³ëÿíêè âèäàëÿëè øëÿõîì ³íêóáàö³¿ ìåìáðàí
âïðîäîâæ 1 ãîä ïðè 37 ºÑ ó áóôåð³, ùî ì³ñòèâ
20 ìÌ Tðèñ-HCl, pH 7,5, 5 ìM EÄTA, 60 ìM
õëîðèäó íàòð³þ, 10 ìêã/ìë ÐÍÊàçè À. ϳñëÿ
öüîãî ìåìáðàíè ïðîìèâàëè 1 ãîä ðîç÷èíîì
2×SSC ³ 96 º åòèëîâèì ñïèðòîì òà åêñïîíóâàëè
ç ðåíòãåí³âñüêîþ ïë³âêîþ ïðîòÿãîì 72 ãîä [21,
22, 25, 27].
Âèçíà÷åííÿ çì³í ð³âíÿ åêñïðåñ³¿ êîíñåð-
âàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07 íåìàòîäè H. schach-
tii (åôåêòèâíîñò³ ñàéëåíñèíãó) ó êë³òèíàõ êîíò-
ðîëüíèõ ëè÷èíîê íåìàòîä òà ïàðàçèòóþ÷èõ íà
êîðåíÿõ òðàíñãåííèõ ðîñëèí ð³ïàêà íåìàòîä
ïåðåâ³ðÿëè çà äîïîìîãîþ Íîçåðí-áëîò ã³-
áðèäèçàö³¿ ñóìàðíî¿ ìÐÍÊ íåìàòîä, ïîïåðåä-
íüî ôðàêö³îíîâàíî¿ åëåêòðîôîðåçîì â 15%-
íîìó ÏÀÀà ó ïðèñóòíîñò³ 7 Ì ñå÷îâèíè [18],
ç àíòèñåíñîâèìè äî êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè
ãåíà 8H07 [ -32P]-äÖÒÔ êÄÍÊ-çîíäàìè (ðèñ. 7)
[21, 22, 28]. Ç ö³ºþ ìåòîþ ñóìàðíèé ïðåïà-
ðàò ÐÍÊ ç êë³òèí íåìàòîä ðîçä³ëÿëè íà
ïîë³(A)+ìÐÍÊ (òîáòî ìÐÍÊ) òà ïîë³(A)–ìÐÍÊ
íà îë³ãî(dT)-öåëþëîçí³é êîëîíö³, ñèíòåçóâàëè
êÄÍÊ íà ìàòðèöÿõ ïîë³(À)+ÐÍÊ çà äîïîìî-
ãîþ çâîðîòíî¿ òðàíñêðèïòàçè ³ [ -32P]-ì³÷å-
íîãî äÖÒÔ òà ïðîâîäèëè ÏËÐ àìïë³ô³êàö³þ
êÄÍÊ ïîñë³äîâíîñòåé êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè
ãåíà 8H07 ç âèêîðèñòàííÿì ïðàéìåð³â (F5 -
ACAACTGCAGCAACAACAGAATCAGG-3 ;
R 5 - C T T C C T C G C C A T T C A T C A T C T -
TGCTC-3 ), ñïåöèô³÷íèõ äî ïîñë³äîâíîñòåé
ãåíà, ðîçòàøîâàíèõ çà ìåæàìè ä³ëÿíîê, ÿê³
º ì³øåíÿìè äëÿ RNAi-³íòåðôåðåíö³¿, äåçîêñè-
îë³ãîíóêëåîòèä³â äÀÒÔ, äÃÒÔ, äÒÒÔ, äÖÒÔ
òà ðàä³îàêòèâíî ì³÷åíîãî [ -32P] äÖÒÔ
(~10 ìêʳ/ìêë) ç íàñòóïíèì ôðàêö³îíóâàííÿì
àìïë³ô³êîâàíî¿ êÄÍÊ ó 15%-íîìó ÏÀÀà ç
7 Ì ñå÷îâèíîþ. óáðèäèçàö³þ ñóìàðíî¿ ìÐÍÊ
íåìàòîä ç àíòèñåíñîâèìè [ -32P]-ì³÷åíèìè
êÄÍÊ çîíäàìè çä³éñíþâàëè íà íåéëîíîâèõ
ìåìáðàíàõ Zeta-Probe ïðîòÿãîì 24 ãîä ïðè
42 ºÑ (óìîâè ã³áðèäèçàö³¿ òà ñêëàä ã³áðèäè-
çàö³éíîãî áóôåðà àíàëîã³÷í³ çàçíà÷åíèì âèùå).
Âèçíà÷åííÿ çì³í ð³âíÿ åêñïðåñ³¿ êîíñåðâà-
òèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07 òðàíñãåííèõ ðîñëèí
ð³ïàêà (åôåêòèâíîñò³ ñàìîñàéëåíñèíãó) ïðî-
âîäèëè çà äîïîìîãîþ Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³¿
ñåíñîâèõ ïîñë³äîâíîñòåé ñóìàðíî¿ ìÐÍÊ ðîñ-
ëèí ç àíòèñåíñîâèìè [ -32P]-ì³÷åíèìè êÄÍÊ-
çîíäàìè, îòðèìàíèìè àìïë³ô³êàö³ºþ êÄÍÊ
ïîñë³äîâíîñòåé CR ä³ëÿíêè ãåíà 8H07 ðîñ-
ëèí ³ç âèêîðèñòàííÿì äåçîêñèîë³ãîíóêëåî-
òèä³â äÀÒÔ, äÃÒÔ, äÒÒÔ, äÖÒÔ òà ðàä³îàê-
òèâíî ì³÷åíîãî [ -32P]-äÖÒÔ (~10 ìêʳ/ìêë),
à òàêîæ ñïåöèô³÷íèõ äî öüîãî ãåíà ïðàéìåð³â
(F5 -TTATATCGATATGTCCGAGTCAAACA-
AG-3 , R5 -TTATATCGATCTAGAAAAAATTA-
GGGTTG-3 ) ç íàñòóïíèì ôðàêö³îíóâàííÿì
àìïë³ô³êîâàíî¿ êÄÍÊ ó 15%-íîìó ÏÀÀà ç 7 Ì
ñå÷îâèíîþ (óìîâè ã³áðèäèçàö³¿ òà ñêëàä ã³áðè-
Ðèñ. 7. Ðåçóëüòàòè Íîçåðí-áëîò àíàë³çó ð³âí³â åêñ-
ïðåñ³¿ êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07: à – â
êë³òèíàõ ëè÷èíîê íåìàòîäè H. schachtii ç êîðåí³â
êîíòðîëüíèõ ðîñëèí; á – â êë³òèíàõ ëè÷èíîê íåìà-
òîä H. schachtii ç êîðåí³â òðàíñãåííèõ ðîñëèí ð³ïà-
êà; â êë³òèíàõ êîíòðîëüíèõ (â) òà òðàíñãåííèõ ðîñ-
ëèí ð³ïàêà (ã), âèðîùåíèõ âïðîäîâæ âåãåòàö³éíîãî
ïåð³îäó íà ³íôåêö³éíîìó ôîí³
41
ϳäâèùåííÿ ñò³éêîñò³ ðîñëèí ð³ïàêà äî ïàðàçèòè÷íî¿ íåìàòîäè Heterodera schachtii
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
äèçàö³éíîãî áóôåðà àíàëîã³÷í³ çàçíà÷åíèì âè-
ùå) [21, 22, 28].
Ðåçóëüòàòè äîñë³äæåíü òà ¿õ îáãîâîðåííÿ.
³äîìî, ùî íåîáõ³äíîþ óìîâîþ äëÿ äîñÿãíåííÿ
åôåêòèâíîãî ïîñòòðàíñêðèïö³éíîãî ñàéëåíñèí-
ãó ãåí³â º çàáåçïå÷åííÿ âèñîêîãî òà ñòàá³ëüíîãî
ð³âíÿ åêñïðåñ³¿ ãåòåðîëîã³÷íèõ ãåí³â ó òðàíñ-
ãåííèõ ðîñëèíàõ [29–32]. Ç ö³ºþ ìåòîþ íàìè
îáðàíî âåêòîð pHannibal [19] (ðèñ. 1). Àìïë³-
ô³êîâàí³ çà äîïîìîãîþ ÏËÐ êÄÍÊ ïîñë³äîâ-
íîñò³ ôðàãìåíòà êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà
8H07 íåìàòîäè H. schachtii ðîçì³ùóâàëè ï³ä
êîíòðîëåì êîíñòèòóòèâíîãî 35S ïðîìîòîðà ³
òåðì³íàòîðà OCS (ä³ëÿíêà òåðì³íàö³¿ òðàíñ-
êðèïö³¿ ãåíà îêòîï³íñèíòåòàçè) ÿê ñåíñîâ³ (S)
(ÿê³ ì³ñòÿòü ñàéòè ðåñòðèêö³¿ XhoI–EcoRI) òà
³íâåðòîâàí³ àíòèñåíñîâ³ (AS) ôðàãìåíòè (ùî
ì³ñòÿòü ñàéòè ðåñòðèêö³¿ HindIII–XbaI) ó âåê-
òîð pHannibal. Âàæëèâà îñîáëèâ³ñòü öüîãî
âåêòîðà – ïðèñóòí³ñòü â íüîìó ñåíñîâèõ òà
³íâåðòîâàíèõ àíòèñåíñîâèõ ïîñë³äîâíîñòåé,
ùî º ìàòðèöÿìè äëÿ ñèíòåçó dsÐÍÊ ìîëåêóë
çà ó÷àñò³ RdRP-ïîë³ìåðàçè (ÐÍÊ-çàëåæíî¿
ÐÍÊ-ïîë³ìåðàçè). Öå äຠìîæëèâ³ñòü óíèêíóòè
íåáàæàíî¿ àíòèñåíñîâî¿ ñóïðåñ³¿ àáî êîñóïðåñ³¿,
ÿêà òðàïëÿºòüñÿ ó âèïàäêó òðàíñôîðìàö³¿ âåê-
òîðàìè, ùî ì³ñòÿòü ò³ëüêè îäíó ñåíñîâó ÷è
àíòèñåíñîâó ïîñë³äîâí³ñòü [19]. Êð³ì òîãî, ïðè-
ñóòí³ñòü ó âåêòîðà pHannibal ì³æ ñåíñîâèìè
òà àíòèñåíñîâèìè ïîñë³äîâíîñòÿìè ³íòðîíó
pdk ÿê ñïåéñåðà äîçâîëÿº ïîñèëèòè ð³âåíü
åêñïðåñ³¿ ãåòåðîëîã³÷íîãî ãåíà òà ïîêðàùèòè
åôåêòèâí³ñòü ñàéëåíñèíãó äî 100 % ïîð³âíÿíî ç
âåêòîðàìè áåç ³íòðîí³â (48–58 %) òà âåêòîðàìè,
ùî ì³ñòÿòü ò³ëüêè àíòèñåíñîâ³ ïîñë³äîâíîñò³
(12 %) [29–31]. Öåé ôåíîìåí ìîæíà ïîÿñíèòè
çðîñòàííÿì ð³âíÿ òðàíñêðèïö³¿ àíòèñåíñîâèõ
dsÐÍÊ íà ìàòðèö³ ³íñåðö³éíèõ ïîñë³äîâíîñòåé
si/miÐÍÊ, ñòàá³ëüíîñò³ si/miÐÍÊ ó ïðîöåñàõ
ñïëàéñèíãó òà åêñïîðòó ç ÿäðà â öèòîïëàçìó.
Íàäàë³ âåêòîð pHannibal ïåðåêëîíóâàëè ó ñàéò
NotI á³íàðíîãî âåêòîðà pArt27 (ðèñ. 1).
Îáðàíèé íàìè á³íàðíèé âåêòîð pArt27 [20]
òåæ ìຠðÿä ïåðåâàã: â³í ì³ñòèòü Ri- òà Ti-
ðåïë³êîíè (ïîð³âíÿíî ç ³íøèìè á³íàðíèìè
âåêòîðàìè, ÿê³ ìàþòü ëèøå îäèí Ri-ïëàçì³äíèé
ì³í³ðåïë³êîí, ùî äîçâîëÿº ³íñåðö³þâàòè éîãî
ÿê ó øòàìè A. rhizogenes, òàê ³ A. tumefaciens),
ì³í³ìàëüíèé ðåïë³êîí RK2 äëÿ ðåïë³êàö³¿ â
Escherichia coli òà Agrobacterium [33], à òàêîæ
ä³ëÿíêó ColE1 äëÿ âèñîêîêîï³éíî¿ ðåïë³êàö³¿
â E. coli. Çàâäÿêè ïðèñóòíîñò³ áàêòåð³àëüíèõ
ñåëåêòèâíèõ ìàðêåð³â – ãåí³â ñò³éêîñò³ äî
ñïåêòèíîì³öèíó/ñòðåïòîì³öèíó Tn7 (îòðèìà-
íèõ ç á³íàðíîãî âåêòîðà pMON530) [34] òà
õèìåðíîãî ãåíà ñò³éêîñò³ äî êàíàì³öèíó (îòðè-
ìàíîãî ç âåêòîðà pGA643) [35, 36] äëÿ ñåëåê-
ö³¿ òðàíñãåííèõ ðîñëèí ìîæóòü âèêîðèñòîâó-
âàòèñü ñåðåäîâèùà ç äîäàâàííÿì àáî 100 ìã/ìë
ñïåêòèíîì³öèíó, àáî 25 ìã/ìë ñòðåïòîì³öèíó,
àáî 20 ìã/ìë àëüòåðíàòèâíîãî ñåëåêòèâíîãî
ìàðêåðà – êàíàì³öèíó.
Óí³êàëüíà îðãàí³çàö³éíà ñòðóêòóðà âåêòîðà
pArt27, ùî ì³ñòèòü ïðàâîðó÷ â³ä 3 -ê³íöÿ Ò-ÄÍÊ
ä³ëÿíêó lacZ' ç åíõàíñåðíèì åëåìåíòîì [37], çà
ÿêèì ñë³äêóº õèìåðíèé ñåëåêòèâíèé ìàðêåð
ñò³éêîñò³ äî êàíàì³öèíó (ðîçòàøîâàíèé ì³æ
ïðîìîòîðîì ãåíà íîïàë³íñèíòåòàçè òà òåðì³íà-
òîðîì ôîñôîòðàíñôåðàçî-íîïàë³íñèíòåòàçè), à
ë³âîðó÷ â³ä 3 -ê³íöÿ Ò-ÄÍÊ – ãðàíè÷íèé ôðàã-
ìåíò, ÿêèé äîçâîëÿº óíèêíóòè çíèæåííÿ ÷àñ-
òîòè âèïàäêîâî¿ òåðì³íàö³¿ òðàíñôîðìàö³¿, ùî
÷àñòî ñïîñòåð³ãàºòüñÿ ïðè âèêîðèñòàíí³ âåêòîð³â
ç ³íøèìè êîíñòðóêö³ÿìè [20, 35].
³ä ë³âîãðàíè÷íî¿ ä³ëÿíêè Ò-ÄÍÊ ïðàâî-
ðó÷ ðîçòàøîâàíî îòðèìàíèé ç á³íàðíîãî âåê-
òîðà pGEM5Zf ìîäèô³êîâàíèé (ç äåëåö³ºþ
ñàéò³â SalI–NdeI) ôðàãìåíò lacZ' [20], ÿêèé
ì³ñòèòü ìàðêåðíèé ãåí -ãàëîêòîçèäàçè, ùî
äîçâîëÿº ïðîâîäèòè ã³ñòîõ³ì³÷íèé ñêðèí³íã ó
ðåêîìá³íàíò³â pArt27 íà ñåðåäîâèùàõ ç 5-áðîì-
4-õëîð-3-³íäîë³ë- -D-ãàëàêòîçèäàçîþ. Ç ìåòîþ
ïîëåãøåííÿ êëîíóâàííÿ ïîñë³äîâíîñòåé åêñ-
ïðåñ³¿ âåêòîðà pHannibal â ä³ëÿíö³ lacZ' áóëî
ðîçì³ùåíî óí³êàëüíèé ñàéò NotI [20].
Îòðèìàíèé àãðîáàêòåð³àëüíèé øòàì A. tu-
mefaciens C58 ïåðåâ³ðÿëè íà ïðèñóòí³ñòü ïëàç-
ì³äè pArt27 ëóæíèì âèä³ëåííÿì ïëàçì³äè ç
íàñòóïíèì ôðàêö³îíóâàííÿì íà ë³í³éí³ òà
ê³ëüöåâ³ ìîëåêóëè çà äîïîìîãîþ åëåêòðîôî-
ðåçó â 0,8%-íîìó àãàðîçíîìó ãåë³ [22] (ðèñ. 2).
Òðàíñôîðìàö³þ ðîñëèí ð³ïàêà âåêòîðîì åêñ-
ïðåñ³¿ àíòèíåìàòîäíèõ dsÐÍÊ, ñïåöèô³÷íèõ
äî êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07 íåìàòî-
äè H. schachtii, ïðîâîäèëè ôëîðàëüíèì ãëè-
áèííèì ìåòîäîì íà ñòà䳿 öâ³ò³ííÿ. Êð³ì òîãî,
ùî çàñòîñóâàííÿ öüîãî ìåòîäó íå ïîòðåáóº
âèêîðèñòàííÿ êóëüòóðè êë³òèí òà òêàíèí in
vitro äëÿ ðåãåíåðàö³¿ òðàíñôîðìàíò³â, ùå îäíà
ïåðåâàãà éîãî ïîëÿãຠó òîìó, ùî ïîòîìñòâî
42
Â.À. Öèãàíêîâà, À.². ªìåöü, Ã.Î. ²óòèíñüêà òà ³í.
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
îòðèìàíèõ ðîñëèí º ãåíåòè÷íî îäíîð³äíèì
(òîáòî ãîìîçèãîòíèì çà òðàíñãåííèì ëîêóñîì)
³ ïîçáàâëåíå ñîìàêëîíàëüíèõ âàð³àö³é, ÿê³ âè-
íèêàþòü ó êóëüòóð³ òêàíèí in vitro [23].
Íà ðèñ. 3 ïðåäñòàâëåíî 7-äîáîâ³ ïðîðîñòêè
ð³ïàêà, âèðîùåí³ íà ³íôåêö³éíîìó ôîí³ (ó
ïðèñóòíîñò³ ëè÷èíîê íåìàòîäè H. schachtii)
ç íàñ³ííÿ êîíòðîëüíèõ òà òðàíñôîðìîâàíèõ
ðîñëèí. Î÷åâèäíî, ùî âèðàæåíà ð³çíèöÿ ó
ìîðôîëîã³÷íèõ îçíàêàõ ì³æ êîíòðîëüíèìè (á)
òà äîñë³äíèìè (à) òðàíñãåííèìè ðîñëèíàìè ïî-
ÿñíþºòüñÿ ï³äâèùåíîþ ñò³éê³ñòþ îäåðæàíèõ
íàìè òðàíñãåííèõ ðîñëèí ð³ïàêà äî íåìàòîäè
H. schachtii. Âñòàíîâëåíî, ùî ê³ëüê³ñòü ëè÷èíîê
ö³º¿ íåìàòîäè, ùî ïàðàçèòóþòü íà êîðåíÿõ
òðàíñãåííèõ ðîñëèí ð³ïàêà, çíà÷íî çìåíøóº-
òüñÿ (äî 80 %) â³äíîñíî êîíòðîëüíèõ ðîñëèí.
Íà ðèñ. 4 ïðîäåìîíñòðîâàíî ð³çíèöþ ìîðôî-
ëîã³÷íèõ îçíàê êîíòðîëüíèõ (à) òà òðàíñãåííèõ
(á) ðîñëèí ð³ïàêà, âèðîùåíèõ ó ëàáîðàòîðíèõ
óìîâàõ íà ³íôåêö³éíîìó ôîí³, òà íàñ³ííÿ (â ³
ã), îòðèìàíîãî ç öèõ ðîñëèí.
Çà äîïîìîãîþ ÇT-ÏËÐ àìïë³ô³êàö³¿ ïîñë³-
äîâíîñòåé ³íòðîíó pdk ç âèêîðèñòàííÿ ñïåöè-
ô³÷íèõ äî öèõ ïîñë³äîâíîñòåé ïðàéìåð³â
(òàáëèöÿ) íà ìàòðèö³ ñóìàðíî¿ ìÐÍÊ (÷åðåç
êÄÍÊ), âèä³ëåíî¿ ç òðàíñãåííèõ ðîñëèí ð³ïà-
êà, ³ç íàñòóïíèì ôðàêö³îíóâàííÿì àìïë³ô³êî-
âàíî¿ ä³ëÿíêè åëåêòðîôîðåçîì ó 15%-íîìó
ÏÀÀÃ, ïðîñî÷åíîìó áðîìèñòèì åòè䳺ì, ïåðå-
â³ðèëè íàÿâí³ñòü ó ãåíîì³ òðàíñãåííèõ ðîñ-
ëèí âåêòîðà åêñïðåñ³¿ pArt27 (ðèñ. 5). Ðîçì³ð
àìïë³ô³êîâàíèõ íàìè ïîñë³äîâíîñòåé ³íòðîíó
pdk ñòàíîâèâ 300 ï.í., ùî óçãîäæóºòüñÿ ç äàíè-
ìè ë³òåðàòóðè [19].
Ìåòîäîì Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³¿ ñåíñî-
âèõ òà àíòèñåíñîâèõ ïîñë³äîâíîñòåé si/miÐÍÊ,
îòðèìàíèõ ³ç ñóìàðíî¿ ìÐÍÊ òðàíñôîðìîâà-
íèõ ðîñëèí ð³ïàêà, ç [ -32P]-ì³÷åíèìè àíòè-
ñåíñîâèìè (ðèñ. 6, à) òà ñåíñîâèìè (ðèñ. 6, á)
íèçüêîìîëåêóëÿðíèìè ÐÍÊ-çîíäàìè, îòðèìà-
íèìè in vitro çà äîïîìîãîþ òðàíñêðèïö³¿ íà
ÄÍÊ-ìàòðèö³ ë³àíåðèçîâàíî¿ pArt27 ïëàçì³äè
[21, 22, 25, 27], ï³äòâåðäèëè íàÿâí³ñòü âèñîêîãî
ð³âíÿ åêñïðåñ³¿ àíòèíåìàòîäíèõ si/miÐÍÊ â
òðàíñôîðìîâàíèõ ðîñëèíàõ ð³ïàêà.
Ïðè ïåðåâ³ðö³ åôåêòèâíîñò³ ñàéëåíñèíãó
àíòèíåìàòîäíèìè si/miÐÍÊ, ñïåöèô³÷íèìè äî
êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07, ó êë³òèíàõ
ëè÷èíîê íåìàòîäè H. schachtii, ùî ïàðàçèòó-
þòü íà êîðåíÿõ òðàíñãåííèõ ðîñëèí ð³ïàêà,
ìåòîäîì Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³¿ ñóìàðíî¿
ìÐÍÊ íåìàòîä (ïîïåðåäíüî ôðàêö³îíîâàíî¿ ó
15%-íîìó ÏÀÀà ç 7 Ì ñå÷îâèíîþ) ³ç àíòè-
ñåíñîâèìè [ -32P]-ì³÷åíèìè êÄÍÊ çîíäàìè [11,
21, 28] âñòàíîâëåíî ð³çêå çíèæåííÿ ð³âíÿ åêñ-
ïðåñ³¿ (~90 %) êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà
8H07 (ðèñ. 7, á) ïîð³âíÿíî ç âèñîêèì ð³âíåì
åêñïðåñ³¿ öüîãî ãåíà ó êë³òèíàõ ëè÷èíîê íå-
ìàòîä, âèëó÷åíèõ ç êîðåí³â êîíòðîëüíèõ ðîñ-
ëèí (ðèñ. 7, à).
Ìåíø âèðàæåíå çíèæåííÿ ð³âíÿ åêñïðåñ³¿
(~60 %) êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8H07
ñïîñòåð³ãàëîñü òàêîæ â êë³òèíàõ òðàíñãåííèõ
ðîñëèí ð³ïàêà, âèðîùåíèõ âïðîäîâæ âåãåòà-
ö³éíîãî ïåð³îäó íà ³íôåêö³éíîìó ôîí³ ó ïðè-
ñóòíîñò³ ëè÷èíîê íåìàòîäè H. schachtii (ðèñ.
7, ã), ïîð³âíÿíî ç êîíòðîëüíèìè ðîñëèíàìè
(ðèñ. 7, â). гçíèöþ ì³æ ð³âíÿìè åêñïðåñ³¿
ãåí³â 8H07 ó íåìàòîä òà ðîñëèí ìîæëèâî ïî-
ÿñíèòè íàÿâí³ñòþ ó êîíñåðâàòèâí³é ä³ëÿíö³
öüîãî ãåíà çíà÷íî¿ ê³ëüêîñò³ íóêëåîòèäíèõ
ïîñë³äîâíîñòåé, ùî â³äð³çíÿþòüñÿ [15, 18].
Çã³äíî ç äàíèìè ë³òåðàòóðè [11, 15] ñòóï³íü
ãîìîëî㳿 ì³æ CR-ä³ëÿíêàìè ãåíà 8H07 ó ðîñëèí
òà íåìàòîä ñòàíîâèòü ~40 %, õî÷à ïðîäóêòàìè
åêñïðåñ³¿ ãåíà 8H07 ó íåìàòîä ³ ðîñëèí º
³äåíòè÷í³ á³ëêè SKP1 [15, 38–40] – êîìïîíåíòè
SCF-êîìïëåêñó ïðîòåîë³òè÷íèõ ôåðìåíò³â (ïðî-
òåàñîìè). Çà ó÷àñò³ öüîãî êîìïëåêñó â³äáóâàºòüñÿ
ïðîöåñ ïîë³óá³êâ³òèíóâàííÿ òà äåãðàäàö³¿ á³ëê³â.
Ïåðåë³ê ïîñë³äîâíîñòåé ïðàéìåð³â, âèêîðèñòàíèõ
äëÿ àìïë³ô³êàö³¿ ïîñë³äîâíîñòåé ³íòðîíó pdk
Ïðèì³òêà. R – çâîðîòí³, F – ïðÿì³ ïîñë³äîâíîñò³;
RT-R – çâîðîòí³ ïîñë³äîâíîñò³ äëÿ ñèíòåçó îäíî-
ëàíöþãîâî¿ êÄÍÊ ìàòðèö³.
Ïðàéìåð Ïîñë³äîâíîñò³
ʳëüê³ñòü
ïàð
íóêëåîòèä³â,
îòðèìàíèõ
â ðåçóëüòàò³
ÏËÐ
PDK-
RT-R
pIntronF
pIntronR
5 -ATCAATGATAACA-
CAATGACATGATCT-3
5 -GACGAAGAAGAT-
AAAAGTTGAGAG-3
5 -TTGATAAATTACA-
AGCAGATTGGA-3
300
43
ϳäâèùåííÿ ñò³éêîñò³ ðîñëèí ð³ïàêà äî ïàðàçèòè÷íî¿ íåìàòîäè Heterodera schachtii
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
Âñòàíîâëåíî, ùî íåìàòîäíèé ãåí 8H07, êð³ì
ä³ëÿíêè CR, ìຠóí³êàëüíó ä³ëÿíêó UR, ñïå-
öèô³÷íó ò³ëüêè äëÿ íåìàòîä. Îòðèìàíî òà-
êîæ äàí³, ÿê³ ñâ³ä÷àòü, ùî êîíñòèòóö³éíà åêñ-
ïðåñ³ÿ ãåíà 8H07 ó ðîñëèíàõ-ãîñïîäàðÿõ ñïðèÿº
¿õí³é ã³ïåð÷óòëèâîñò³ äî íåìàòîäíî¿ ³íôåêö³¿
(òîáòî óðàæåííþ ðîñëèí íåìàòîäàìè). Â îðãà-
í³çìàõ íåìàòîä ï³ê åêñïðåñ³¿ ãåíà 8H07 ñïîñ-
òåð³ãàºòüñÿ â ïåð³îä ïðîíèêíåííÿ ¿õ äî ñïå-
ö³àë³çîâàíèõ êë³òèí êîðåí³â ðîñëèí – ñàéò³â
õàð÷óâàííÿ [11, 15, 18]. Òîìó ñòâîðåííÿ âåêòîð-
íèõ êîíñòðóêö³é ç êîíñòèòóòèâíîþ åêñïðåñ³ºþ
àíòèñåíñîâèõ dsÐÍÊ äëÿ ñàéëåíñèíãóâàííÿ ãå-
íà 8H07 ÿê ó ðîñëèí, òàê ³ ó ô³òîíåìàòîä º
åôåêòèâíîþ ñòðàòå㳺þ äëÿ ï³äâèùåííÿ ó ðîñëèí
ñò³éêîñò³ äî íåìàòîäíî¿ ³íâà糿.
Âèñíîâêè.  õîä³ ïðîâåäåíèõ äîñë³äæåíü íàìè
âïåðøå êëîíîâàíî òà ñêîíñòðóéîâàíî âåêòîð ç
êîíñòèòóòèâíîþ åêñïðåñ³ºþ dsÐÍÊ, êîìïëåìåí-
òàðíèõ àìïë³ô³êîâàíîìó ôðàãìåíòó êÄÍÊ êîí-
ñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà 8Í07 íåìàòîäè H. scha-
chtii, òà ïðîâåäåíî ãåíåòè÷íó òðàíñôîðìàö³þ ð³-
ïàêà çà äîïîìîãîþ àãðîáàêòå𳿠A. tumefaciens.
Ìåòîäîì ÇÒ-ÏËÐ ïðîàíàë³çîâàíî ñóìàðíó
ìÐÍÊ, âèä³ëåíó ç ãåíåòè÷íî ìîäèô³êîâàíèõ ðîñ-
ëèí ð³ïàêà, íà íàÿâí³ñòü ó ãåíîì³ òðàíñãåí-
íèõ ðîñëèí âåêòîðà åêñïðåñ³¿ pArt27 çà ïðè-
ñòóòíîñò³ ³íòðîíó ðdk. ²ç çàñòîñóâàííÿì Íî-
çåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³¿ ñóìàðíî¿ ìÐÍÊ ðîñëèí
ç [Ð32]-ì³÷åíèìè ñåíñîâèìè òà àíòèñåíñîâèìè
íèçüêîìîëåêóëÿðíèìè ÐÍÊ-çîíäàìè ïåðåâ³ðåíî
íàÿâí³ñòü åêñïðåñ³¿ àíòèíåìàòîäíèõ si/miÐÍÊ
ó òðàíñãåííèõ ðîñëèíàõ ð³ïàêà. Àíàëîã³÷íî çà
äîïîìîãîþ Íîçåðí-áëîò ã³áðèäèçàö³¿ ñóìàðíî¿
ìÐÍÊ íåìàòîä òà ñóìàðíî¿ ìÐÍÊ ðîñëèí ç
[Ð32]-ì³÷åíèìè êÄÍÊ çîíäàìè, àíòèñåíñîâèìè
äî CR-ä³ëÿíêè ãåíà 8H07, ï³äòâåðäæåíî âèñî-
êèé ð³âåíü ñàéëåíñèíãîâî¿ àêòèâíîñò³ si/miÐÍÊ,
ÿê³ åêñïðåñóþòüñÿ â òðàíñãåííèõ ðîñëèíàõ,
ñïåöèô³÷íèõ äî êîíñåðâàòèâíî¿ ä³ëÿíêè ãåíà
8H07. Çàâäÿêè öüîìó â³äáóâàºòüñÿ áëîêóâàí-
íÿ òðàíñëÿö³¿ (ñàéëåíñèíã) ÿê ìÐÍÊ ðîñëèí
(âíàñë³äîê ÷îãî ï³äâèùóºòüñÿ ¿õ ñò³éê³ñòü äî
øê³äíèê³â), òàê ³ ìÐÍÊ íåìàòîä, ÷èì ³ ïîÿñíþ-
ºòüñÿ çíà÷íå çìåíøåííÿ ¿õíüî¿ ê³ëüêîñò³ (äî
80 % â³äíîñíî êîíòðîëþ).  ëàáîðàòîðíèõ óìî-
âàõ çà ô³ç³îëîã³÷íèìè ïîêàçíèêàìè ï³äòâåðä-
æåíî çíà÷íå ï³äâèùåííÿ ñò³éêîñò³ òðàíñãåííèõ
ðîñëèí ð³ïàêà äî êîðåíåïàðàçèòóþ÷î¿ íåìàòîäè
H. schachtii.
V.A. Tsygankova, A.I. Yemets, H.O. Iutinska,
L.O. Beljavska, A.P. Galkin, Ya.B. Blume
Institute of Bioorganic Chemistry & Petrochemistry,
Natl. Acad. of Sci. of Ukraine, Kyiv
E-mail: vTsygankova@ukr.net
Institute of Food Biotechnology and Genomics,
Natl. Acad. of Sci. of Ukraine, Kyiv
Zabolotny Institute of Microbiology and Virology,
Natl. Acad. of Sci. of Ukraine, Kyiv
INCREASING OF RAPE PLANT RESISTANCE
TO PARASITIC NEMATODE HETERODERA
SCHACHTII USING RNAi-TECHNOLOGY
A vector for constitutive expression of antisense to the
conservative region 8Í07 gene of nematode H. schachtii
dsRNA is constructed and genetic transformation of rape
plants is conducted by means of A. tumefaciens. Using
molecular-genetic methods the presence of vector ex-
pression antinematode dsRNA in the genome of trans-
genic rape plants is shown. A high level of their silencing
activity is confirmed both in nematodes and in infected
plants. In laboratory studies for the physiological in-
dexes the considerable increase of resistance was shown
of transgene rape plants to root parasitic nematode H.
schachtii.
Â.À. Öûãàíêîâà, À.È. Åìåö, Ã.À. Èóòèíñêàÿ,
Ë.À. Áåëÿâñêàÿ, À.Ï. Ãàëêèí, ß.Á. Áëþì
ÏÎÂÛØÅÍÈÅ ÓÑÒÎÉ×ÈÂÎÑÒÈ
ÐÀÑÒÅÍÈÉ ÐÀÏÑÀ Ê ÏÀÐÀÇÈÒÈ×ÅÑÊÎÉ
ÍÅÌÀÒÎÄÅ HETERODERA SCHACHTII
Ñ ÈÑÏÎËÜÇÎÂÀÍÈÅÌ ÒÅÕÍÎËÎÃÈÉ
ÐÍÊ-ÈÍÒÅÐÔÅÐÅÍÖÈÈ
Ñêîíñòðóèðîâàí âåêòîð äëÿ êîíñòèòóòèâíîé ýêñ-
ïðåññèè àíòèñìûñëîâûõ ê êîíñåðâàòèâíîé îáëàñòè
ãåíà 8Í07 íåìàòîäû H. schachtii dsÐÍÊ è ïðîâåäå-
íà ãåíåòè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ ðàñòåíèé ðàïñà ñ
èñïîëüçîâàíèåì A. tumefaciens. Ñ ïîìîùüþ ìîëåêó-
ëÿðíî-ãåíåòè÷åñêèõ ìåòîäîâ ïîêàçàíî ïðèñóòñòâèå
â ãåíîìå òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ðàïñà âåêòîðà ýêñ-
ïðåññèè àíòèíåìàòîäíûõ dsÐÍÊ, à òàêæå ïîä-
òâåðæäåí âûñîêèé óðîâåíü èõ ñàéëåíñèíãîâîé àê-
òèâíîñòè êàê â îðãàíèçìå íåìàòîä, òàê è ó èíôè-
öèðîâàííûõ èìè ðàñòåíèé. Â ëàáîðàòîðíûõ îïûòàõ
ïî ôèçèîëîãè÷åñêèì ïîêàçàòåëÿì ïîêàçàíî çíà-
÷èòåëüíîå ïîâûøåíèå óñòîé÷èâîñòè òðàíñãåííûõ
ðàñòåíèé ðàïñà ê êîðíåïàðàçèòèðóþùåé íåìàòîäå
H. schachtii.
ÑÏÈÑÎÊ Ë²ÒÅÐÀÒÓÐÈ
1. Chi twood D.J. Research on plant-parasitic nematode
biology conducted by the United States Department
of Agriculture – Agricultural Research Service //
Pest Manag. Sci. – 2003. – 59. – P. 748–753.
2. Karczmarek A., Overmars H., Helder J., Goverse A.
Feeding cell development by cyst and root-knot
nematodes involves a similar early, local and tran-
44
Â.À. Öèãàíêîâà, À.². ªìåöü, Ã.Î. ²óòèíñüêà òà ³í.
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
sient activation of a specific auxin-inducible promot-
er element // Mol. Plant Path. – 2004. – 5, ¹ 4. –
Ð. 343–346.
3. Fuller V.L, Lilley C.J., Urwin P.E. Nematode resis-
tance // New Phytol. – 2008. – 180. – P. 27–44.
4. Oka Y. Mechanisms of nematode suppression by or-
ganic soil amendments //Appl. Soil Ecol. – 2010. –
44. – P. 101–115.
5. Èóòèíñêàÿ Ã.À., Âàëàãóðîâà Å.Â., Êîçûðèöêàÿ Â.Å.,
Áåëÿâñêàÿ Ë.À., Ïåòðóê Ò.Â., Ïîíîìàðåíêî Ñ.Ï.,
Èêèí Ä. Àâåðêîì – íîâûé àíòèïàðàçèòàðíûé
ïðåïàðàò // Áèîðåãóëÿöèÿ ìèêðîáíî-ðàñòèòåëü-
íûõ ñèñòåì / Ïîä ðåä. Ã.À. Èóòèíñêîé, Ñ.Ï.
Ïîíîìàðåíêî. – Ê.: Íè÷ëàâà, 2010. – C. 276–396.
6. Öèãàíêîâà Â.À., Ïîíîìàðåíêî Ñ.Ï., Áëþì ß.Á.
Ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷í³ ìåõàí³çìè 䳿 ðåãóëÿòîð³â
ðîñòó ðîñëèí ç á³îçàõèñíèìè âëàñòèâîñòÿìè //
³ñí. Óêð. ò-âà ãåíåòèê³â ³ ñåëåêö³îíåð³â. –
2012. – 10, ¹ 1. – Ñ. 86–94.
7. Yu H., Kumar P.P. Post-transcriptional gene silenc-
ing in plants by RNA // Plant Cell Rep. – 2003. –
22. – P. 167–174.
8. Padmanabhan Ch., Zhang X., Jin H. Host small
RNAs are big contributors to plant innate immu-
nity // Curr. Opin. Plant Biol. – 2009. – 12. –
P. 465–472.
9. Gheysen G., Vanholme B. RNAi from plants to nem-
atodes // Trends Biotechnol. – 2006. – 25, ¹ 3. –
P. 89–92.
10. Fairbairn D.J., Cavallaro A.S., Bernard M. et al. Host-
delivered RNAi: an effective strategy to silence genes
in plant parasitic nematodes // Planta. – 2007. –
226. – P. 1525–1533.
11. Gao B., Allen R., Maier T. et al. Identification of
putative parasitism genes expressed in the esophageal
gland cells of the soybean cyst nematode Heterodera
glycines // Mol. Plant-Microbe Interact. – 2001. –
14, ¹ 10. – P. 1247–1254.
12. Elling A.A., Davis E.L., Hussey R.S., Baum T.J. Active
uptake of cyst nematode parasitism proteins into the
plant cell nucleus // Int. J. Parasit. – 2007. – 37. –
P. 1269–1279.
13. Veronico P., Gray L.J., Jones J.T. et al. Nematode
chitin synthases: gene structure, expression and func-
tion in Caenorhabditis elegans and the plant parasitic
nematode Meloidogyne artiellia // Mol. Genet. Ge-
nom. – 2001. – 266. – P. 28–34.
14. Rosso M.N., Dubrana M.P., Cimbolini N. et al. Ap-
plication of RNA interference to root-knot nema-
tode genes encoding esophageal gland proteins //
Mol. Plant-Microbe Interact. – 2005. – 18, ¹ 7. –
P. 615–620.
15. Sindhu A.S., Maier T.R., Mitchum M.G. et al. Effec-
tive and specific in planta RNAi in cyst nematodes:
expression interference of four parasitism genes re-
duces parasitic success // J. Exp. Bot. – 2009. – 60,
¹ 1. – P. 315–324.
16. Ithal N., Recknor J., Nettleton D. et al. Parallel ge-
nome-wide expression profiling of host and patho-
gen during soybean cyst Nematode infection of soy-
bean // Mol. Plant-Microbe Interact. – 2007. – 20,
¹ 3. – P. 293–305.
17. Jammes F., Lecomte F., Almeida-Engler J. et al. Ge-
nome-wide expression profiling of the host response
to root-knot nematode infection in Arabidopsis //
Plant J. – 2005. – 44. – P. 447–458.
18. Tsygankova V.A., Andrusevich Ya.V., Ponomarenko S.P.,
Galkin A.P., Blume Ya.B. Isolation and amplification
of cDNA from the conserved region of the nematode
Heterodera schachtii 8H07 gene with a close similarity
to its homolog in rape plants // Cytology and Gene-
tics. – 2012. – 46, ¹ 6. – P. 335–341.
19. Wesley S.V., Helliwell C.A., Smith N.A. et al. Con-
struct design for efficient, effective and high through-
put gene silencing in plants // Plant J. – 2001. – 27,
¹ 6. – P. 581–590.
20. Gleave A.P. A versatile binary vector system with a T-
DNA organisational structure conducive to efficient
integration of cloned DNA into the plant genome //
Plant Mol. Biol. – 1992. – 20. – P. 1203–1207.
21. Promega Protocols and Applications Guide. 2nd ed. —
USA : Promega Corporation, 1991. – 422 p.
22. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular
Cloning : A Laboratory Manual. – New York : Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989. – 480 ð.
23. Steven J., Clough S.T., Bent A.F. Floral dip: a simpli-
fied method for Agrobacterium-mediated transforma-
tion of Arabidopsis thaliana // Plant J. – 1998. – 16,
¹ 6. – Ð.735–743.
24. Öèãàíêîâà Â.À., Ñòåôàíîâñüêà Ò.Ð., Àíäðóñåâè÷ ß.Â.,
Ïîíîìàðåíêî Ñ.Ï., Ãàëê³í À.Ï., Áëþì ß.Á. ²í-
äóêö³ÿ ðåãóëÿòîðàìè ðîñòó á³îñèíòåçó si/miÐÍÊ
ç àíòèïàòîãåííèìè òà àíòèïàðàçèòàðíèìè âëàñ-
òèâîñòÿìè â êë³òèíàõ ðîñëèí // Á³îòåõíîëîã³ÿ. –
2012. – 5, ¹ 3. – Ñ. 62–74.
25. Hamilton A.J., Baulcombe D.C. A species of small
antisense RNA in posttranscriptional gene silencing
in plants // Science. – 1999. – 286. – P. 950–952.
26. Wang M.B., Wesley S.V., Finnegan E.J. et al. Repli-
cating satellite RNA induces sequence-specific DNA
methylation and truncated transcripts in plants //
RNA. – 2001. – 7. – P. 16–28.
27. Mette M.F., Aufsatz W., Winden J. et al.Transcriptional
silencing and promoter methylation triggered by dou-
ble-stranded RNA // EMBO J. – 2000. – 19, ¹ 19. –
P. 5194–5201.
28. Lim H.-S., Ko T.-S., Lambert K.N. et al. Soybean
mosaic virus helper component-protease enhances
somatic embryo production and stabilizes transgene
expression in soybean // Plant Physiol. Biochem. –
2005. – 43. – P. 1014–1021.
29. Wang M.B., Upadhyaya N.M., Brettell R.I.S., Wa-
terhouse P.M. Intron-mediated improvement of a
selectable marker gene for plant transformation us-
ing Agrobacterium tumefaciens // J. Genet. Breed. –
1997. – 51. – P. 325–334.
45
ϳäâèùåííÿ ñò³éêîñò³ ðîñëèí ð³ïàêà äî ïàðàçèòè÷íî¿ íåìàòîäè Heterodera schachtii
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 4
30. Smith N.A., Singh S.P., Wang M.-B. et al. Total si-
lencing by intron-spliced hairpin RNAs // Nature. –
2000. – 407. – P. 319–320.
31. Horiguchi G. RNA silencing in plants: a shortcut
to functional analysis // Differentiation. – 2004. –
72. – P. 65–73.
32. Kerschen A., Napoli C.A., Jorgensen R.A., Mul-
ler A.E. Effectiveness of RNA interference in
transgenic plants // FEBS Lett. – 2004. – 566,
¹ 1/3. – P. 223–228.
33. Schmidhauser T.J., Helinski D.R. Region of broad-
host range plasmid RK2 involved in replication and
stable maintenance in nine species of gram-negative
bacteria // J. Bacteriol. – 1985. – 164. – P. 446–
455.
34. Rogers S.G., Klee H.J., Horsch R.B., Fraley R.T. Im-
proved vectors for plant transformation : Expression
cassette vectors and new selectable markers // Meth.
Enzymol. – 1987. – 153. – P. 253–277.
35. Jen G.C., Chilton M.D. The right border region of
pTiT37 T-DNA is intrinsically m ore active than the
left border region promoting T-DNA transforma-
tion // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1986. – 83. –
P. 3895–3899.
36. An G., Ebert P.P., Mitra A., Ha S.B. Binary vec-
tors // Plant Molecular Biology Manual / Eds S.B.
Gelvin, R.A. Schilperoort, D.P.S. Verma. – Dor-
drecht : Kluwer Acad. Publ., 1988. – P. A3/1-A3/19.
37. Peralta E.G., Hellmiss R., Ream W. Overdrive, a T-
DNA transmission enhancer on the A. tumefaciens
tumor-inducing plasmid // EMBO J. – 1986. – 5. –
P. 1137–1142.
38. Drouaud J., Marrocco K., Ridel C. et al. A Brassica
napus skp1-like gene promoter drives GUS expres-
sion in Arabidopsis thaliana male and female game-
tophytes // Sex. Plant Rep. – 2000. – 13. – P. 29–
35.
39. Zhao D., Ni W., Feng B. et al. Members of the
Arabidopsis-SKP1-like gene family exhibit a vari-
ety of expression patterns and may play diverse roles
in Arabidopsis // Plant Physiol. – 2003. – 133. –
P. 203–217.
40. Chai L., Biswas M.K., Ge X., Deng X. Isolation,
characterization, and expression analysis of an SKP1-
like gene from ‘Shatian’ Pummelo (Citrus grandis
Osbeck) // Plant Mol. Biol. Rep. – 2010. – 28. –
P. 569–577.
Íàä³éøëà 08.06.12
<<
/ASCII85EncodePages false
/AllowTransparency false
/AutoPositionEPSFiles true
/AutoRotatePages /None
/Binding /Left
/CalGrayProfile (Dot Gain 20%)
/CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
/CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2)
/sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
/CannotEmbedFontPolicy /Error
/CompatibilityLevel 1.4
/CompressObjects /Tags
/CompressPages true
/ConvertImagesToIndexed true
/PassThroughJPEGImages true
/CreateJobTicket false
/DefaultRenderingIntent /Default
/DetectBlends true
/DetectCurves 0.0000
/ColorConversionStrategy /CMYK
/DoThumbnails false
/EmbedAllFonts true
/EmbedOpenType false
/ParseICCProfilesInComments true
/EmbedJobOptions true
/DSCReportingLevel 0
/EmitDSCWarnings false
/EndPage -1
/ImageMemory 1048576
/LockDistillerParams false
/MaxSubsetPct 100
/Optimize true
/OPM 1
/ParseDSCComments true
/ParseDSCCommentsForDocInfo true
/PreserveCopyPage true
/PreserveDICMYKValues true
/PreserveEPSInfo true
/PreserveFlatness true
/PreserveHalftoneInfo false
/PreserveOPIComments false
/PreserveOverprintSettings true
/StartPage 1
/SubsetFonts true
/TransferFunctionInfo /Apply
/UCRandBGInfo /Preserve
/UsePrologue false
/ColorSettingsFile ()
/AlwaysEmbed [ true
]
/NeverEmbed [ true
]
/AntiAliasColorImages false
/CropColorImages true
/ColorImageMinResolution 300
/ColorImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleColorImages true
/ColorImageDownsampleType /Bicubic
/ColorImageResolution 1200
/ColorImageDepth -1
/ColorImageMinDownsampleDepth 1
/ColorImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeColorImages false
/ColorImageFilter /DCTEncode
/AutoFilterColorImages true
/ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG
/ColorACSImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/ColorImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/JPEG2000ColorACSImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/JPEG2000ColorImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/AntiAliasGrayImages false
/CropGrayImages true
/GrayImageMinResolution 300
/GrayImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleGrayImages true
/GrayImageDownsampleType /Bicubic
/GrayImageResolution 1200
/GrayImageDepth -1
/GrayImageMinDownsampleDepth 2
/GrayImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeGrayImages false
/GrayImageFilter /DCTEncode
/AutoFilterGrayImages true
/GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG
/GrayACSImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/GrayImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/JPEG2000GrayACSImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/JPEG2000GrayImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/AntiAliasMonoImages false
/CropMonoImages true
/MonoImageMinResolution 1200
/MonoImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleMonoImages true
/MonoImageDownsampleType /Bicubic
/MonoImageResolution 1200
/MonoImageDepth -1
/MonoImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeMonoImages false
/MonoImageFilter /CCITTFaxEncode
/MonoImageDict <<
/K -1
>>
/AllowPSXObjects false
/CheckCompliance [
/None
]
/PDFX1aCheck false
/PDFX3Check false
/PDFXCompliantPDFOnly false
/PDFXNoTrimBoxError true
/PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
]
/PDFXSetBleedBoxToMediaBox true
/PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
]
/PDFXOutputIntentProfile (None)
/PDFXOutputConditionIdentifier ()
/PDFXOutputCondition ()
/PDFXRegistryName ()
/PDFXTrapped /False
/CreateJDFFile false
/Description <<
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
/BGR <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>
/CHS <FEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000410064006f006200650020005000440046002065876863900275284e8e9ad88d2891cf76845370524d53705237300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002>
/CHT <FEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef69069752865bc9ad854c18cea76845370524d5370523786557406300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002>
/CZE <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>
/DAN <FEFF004200720075006700200069006e0064007300740069006c006c0069006e006700650072006e0065002000740069006c0020006100740020006f007000720065007400740065002000410064006f006200650020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e007400650072002c0020006400650072002000620065006400730074002000650067006e006500720020007300690067002000740069006c002000700072006500700072006500730073002d007500640073006b007200690076006e0069006e00670020006100660020006800f8006a0020006b00760061006c0069007400650074002e0020004400650020006f007000720065007400740065006400650020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e0074006500720020006b0061006e002000e50062006e00650073002000690020004100630072006f00620061007400200065006c006c006500720020004100630072006f006200610074002000520065006100640065007200200035002e00300020006f00670020006e0079006500720065002e>
/DEU <FEFF00560065007200770065006e00640065006e0020005300690065002000640069006500730065002000450069006e007300740065006c006c0075006e00670065006e0020007a0075006d002000450072007300740065006c006c0065006e00200076006f006e002000410064006f006200650020005000440046002d0044006f006b0075006d0065006e00740065006e002c00200076006f006e002000640065006e0065006e002000530069006500200068006f006300680077006500720074006900670065002000500072006500700072006500730073002d0044007200750063006b0065002000650072007a0065007500670065006e0020006d00f60063006800740065006e002e002000450072007300740065006c006c007400650020005000440046002d0044006f006b0075006d0065006e007400650020006b00f6006e006e0065006e0020006d006900740020004100630072006f00620061007400200075006e0064002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020006f0064006500720020006800f600680065007200200067006500f600660066006e00650074002000770065007200640065006e002e>
/ESP <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>
/ETI <FEFF004b00610073007500740061006700650020006e0065006900640020007300e4007400740065006900640020006b00760061006c006900740065006500740073006500200074007200fc006b006900650065006c007300650020007000720069006e00740069006d0069007300650020006a0061006f006b007300200073006f00620069006c0069006b0065002000410064006f006200650020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e00740069006400650020006c006f006f006d006900730065006b0073002e00200020004c006f006f0064007500640020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e00740065002000730061006100740065002000610076006100640061002000700072006f006700720061006d006d006900640065006700610020004100630072006f0062006100740020006e0069006e0067002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020006a00610020007500750065006d006100740065002000760065007200730069006f006f006e00690064006500670061002e000d000a>
/FRA <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>
/GRE <FEFF03a703c103b703c303b903bc03bf03c003bf03b903ae03c303c403b5002003b103c503c403ad03c2002003c403b903c2002003c103c503b803bc03af03c303b503b903c2002003b303b903b1002003bd03b1002003b403b703bc03b903bf03c503c103b303ae03c303b503c403b5002003ad03b303b303c103b103c603b1002000410064006f006200650020005000440046002003c003bf03c5002003b503af03bd03b103b9002003ba03b103c42019002003b503be03bf03c703ae03bd002003ba03b103c403ac03bb03bb03b703bb03b1002003b303b903b1002003c003c103bf002d03b503ba03c403c503c003c903c403b903ba03ad03c2002003b503c103b303b103c303af03b503c2002003c503c803b703bb03ae03c2002003c003bf03b903cc03c403b703c403b103c2002e0020002003a403b10020005000440046002003ad03b303b303c103b103c603b1002003c003bf03c5002003ad03c703b503c403b5002003b403b703bc03b903bf03c503c103b303ae03c303b503b9002003bc03c003bf03c103bf03cd03bd002003bd03b1002003b103bd03bf03b903c703c403bf03cd03bd002003bc03b5002003c403bf0020004100630072006f006200610074002c002003c403bf002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e0030002003ba03b103b9002003bc03b503c403b103b303b503bd03ad03c303c403b503c103b503c2002003b503ba03b403cc03c303b503b903c2002e>
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
/HRV (Za stvaranje Adobe PDF dokumenata najpogodnijih za visokokvalitetni ispis prije tiskanja koristite ove postavke. Stvoreni PDF dokumenti mogu se otvoriti Acrobat i Adobe Reader 5.0 i kasnijim verzijama.)
/HUN <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>
/ITA <FEFF005500740069006c0069007a007a006100720065002000710075006500730074006500200069006d0070006f007300740061007a0069006f006e00690020007000650072002000630072006500610072006500200064006f00630075006d0065006e00740069002000410064006f00620065002000500044004600200070006900f900200061006400610074007400690020006100200075006e00610020007000720065007300740061006d0070006100200064006900200061006c007400610020007100750061006c0069007400e0002e0020004900200064006f00630075006d0065006e007400690020005000440046002000630072006500610074006900200070006f00730073006f006e006f0020006500730073006500720065002000610070006500720074006900200063006f006e0020004100630072006f00620061007400200065002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000200065002000760065007200730069006f006e006900200073007500630063006500730073006900760065002e>
/JPN <FEFF9ad854c18cea306a30d730ea30d730ec30b951fa529b7528002000410064006f0062006500200050004400460020658766f8306e4f5c6210306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103055308c305f0020005000440046002030d530a130a430eb306f3001004100630072006f0062006100740020304a30883073002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d3067958b304f30533068304c3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002>
/KOR <FEFFc7740020c124c815c7440020c0acc6a9d558c5ec0020ace0d488c9c80020c2dcd5d80020c778c1c4c5d00020ac00c7a50020c801d569d55c002000410064006f0062006500200050004400460020bb38c11cb97c0020c791c131d569b2c8b2e4002e0020c774b807ac8c0020c791c131b41c00200050004400460020bb38c11cb2940020004100630072006f0062006100740020bc0f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020c774c0c1c5d0c11c0020c5f40020c2180020c788c2b5b2c8b2e4002e>
/LTH <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>
/LVI <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>
/NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken die zijn geoptimaliseerd voor prepress-afdrukken van hoge kwaliteit. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.)
/NOR <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>
/POL <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>
/PTB <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>
/RUM <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>
/RUS <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>
/SKY <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>
/SLV <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>
/SUO <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>
/SVE <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>
/TUR <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>
/UKR <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>
/ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents best suited for high-quality prepress printing. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.)
>>
/Namespace [
(Adobe)
(Common)
(1.0)
]
/OtherNamespaces [
<<
/AsReaderSpreads false
/CropImagesToFrames true
/ErrorControl /WarnAndContinue
/FlattenerIgnoreSpreadOverrides false
/IncludeGuidesGrids false
/IncludeNonPrinting false
/IncludeSlug false
/Namespace [
(Adobe)
(InDesign)
(4.0)
]
/OmitPlacedBitmaps false
/OmitPlacedEPS false
/OmitPlacedPDF false
/SimulateOverprint /Legacy
>>
<<
/AddBleedMarks false
/AddColorBars false
/AddCropMarks false
/AddPageInfo false
/AddRegMarks false
/ConvertColors /ConvertToCMYK
/DestinationProfileName ()
/DestinationProfileSelector /DocumentCMYK
/Downsample16BitImages true
/FlattenerPreset <<
/PresetSelector /MediumResolution
>>
/FormElements false
/GenerateStructure false
/IncludeBookmarks false
/IncludeHyperlinks false
/IncludeInteractive false
/IncludeLayers false
/IncludeProfiles false
/MultimediaHandling /UseObjectSettings
/Namespace [
(Adobe)
(CreativeSuite)
(2.0)
]
/PDFXOutputIntentProfileSelector /DocumentCMYK
/PreserveEditing true
/UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged
/UntaggedRGBHandling /UseDocumentProfile
/UseDocumentBleed false
>>
]
>> setdistillerparams
<<
/HWResolution [2400 2400]
/PageSize [612.000 792.000]
>> setpagedevice
|