Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК

Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК

Масштаби використання генної інженерії з метою покращення біологічних властивостей різноманітних організмів постійно зростають. Для доставки генетичного матеріалу в клітини-мішені застосовують як вірусні, так і невірусні носії. Серед останніх найбільш перспективними вважають полімерні матеріали прир...

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Дата:2014
Автори: Фінюк, Н.С., Чапля, А.Є., Мітіна, Н.Є., Бойко, Н.М., Лобачевська, О.В., М’ягкота, О.C., Ємець, А.І., Блюм, Я.Б., Заіченко, О.С., Стойка, Р.С.
Формат: Стаття
Мова:Ukrainian
Опубліковано: Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2014
Назва видання:Цитология и генетика
Теми:
Оригинальные работы
Онлайн доступ:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126668
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК / Н.С. Фінюк, А.Є. Чапля, Н.Є. Мітіна, Н.М. Бойко, О.В. Лобачевська, О.C. М’ягкота, А.І. Ємець, Я.Б. Блюм, О.С. Заіченко, Р.С. Стойка // Цитология и генетика. — 2014. — Т. 48, № 6. — С. 3-10. — Бібліогр.: 33 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-126668
record_format dspace
spelling irk-123456789-1266682017-12-02T03:02:49Z Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК Фінюк, Н.С. Чапля, А.Є. Мітіна, Н.Є. Бойко, Н.М. Лобачевська, О.В. М’ягкота, О.C. Ємець, А.І. Блюм, Я.Б. Заіченко, О.С. Стойка, Р.С. Оригинальные работы Масштаби використання генної інженерії з метою покращення біологічних властивостей різноманітних організмів постійно зростають. Для доставки генетичного матеріалу в клітини-мішені застосовують як вірусні, так і невірусні носії. Серед останніх найбільш перспективними вважають полімерні матеріали природного і синтетичного походження. Такі полімери проявили високу ефективність у доставці ДНК в клітини тварин, проте рослинні клітини виявилися малочутливими до їхньої дії. Нами описано метод генетичної трансформації протопластів моху Ceratodon purpureus (Hedw.) Brid., що базується на використанні нових поверхнево-активних полімерних носіїв контрольованої довжини та заряду, які містять ланцюги диметиламіноетилметакрилату. Цей метод дозволяє одержати більше транзієнтних і стабільних трансформантів моху із розрахунку на мікрограм ДНК порівняно з відомим протоколом із використанням поліетиленгліколю. Він є більш простим і зручним у використанні, а також дешевшим, ніж метод «генної гармати». Розглядаються перспективи подальшого вдосконалення структури і функціональних характеристик нових носіїв для доставки генетичного матеріалу в клітини рослин. Масштабы использования генной инженерии с целью улучшения биологических свойств различных организмов постоянно растут. Для доставки генетического материала в клетки-мишени применяют как вирусные, так и невирусные носители. Среди последних наиболее перспективными считаются наноразмерные полимерные материалы природного и синтетического происхождения. Такие полимеры проявили высокую эффективность в доставке ДНК в клетки животных, однако растительные клетки оказались малочувствительными к их действию. Описанный нами метод генетической трансформации протопластов мха Ceratodon purpureus (Hedw.) Brid. основан на использовании новых поверхностно-активных полимерных носителей контролируемой длины и заряда, содержащих цепи полиДМАЕМ. Этот метод позволяет получить больше транзиентных и стабильных трансформантов мха из расчета на микрограмм плазмидной ДНК по сравнению с известным протоколом, который базируется на использовании полиэтиленгликоля. Метод является простым, более удобным и дешевым, чем метод «генной пушки». Рассматриваются перспективы дальнейшего совершенствования структуры и функциональных характеристик новых носителей для доставки генетического материала в клетки растений. There is much progress in application of genetic engineering for improving the biological properties of different organisms. Viral and nonviral carriers are used for delivery of genetic material into target cells. Polymeric materials of natural and synthetic origin are the most promising gene delivery agents. These polymers demonstrated high efficiency of DNA delivery into animal cells, although they were not very effective in plant cells. Here, the procedure for genetic transformation of Ceratodon purpureus (Hedw.) Brid. moss protoplasts is described. The method is based on the application of surface-active polymeric carriers of the poly-DMAEM structure and controlled length and charge. This allows obtaining more transient and stable moss transformants per microgram of plasmid DNA when compared with known protocol based on using polyethyleneglycol. It is easier, more convenient, and cheaper than the “gene gun” method. Prospects for further improvement of structure and functional characteristics of new polymeric carriers are considered for delivery of genetic material into plant cells. 2014 Article Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК / Н.С. Фінюк, А.Є. Чапля, Н.Є. Мітіна, Н.М. Бойко, О.В. Лобачевська, О.C. М’ягкота, А.І. Ємець, Я.Б. Блюм, О.С. Заіченко, Р.С. Стойка // Цитология и генетика. — 2014. — Т. 48, № 6. — С. 3-10. — Бібліогр.: 33 назв. — укр. 0564-3783 DOI: 10.3103/S0095452714060048 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126668 577:581.6 uk Цитология и генетика Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Ukrainian
topic Оригинальные работы
Оригинальные работы
spellingShingle Оригинальные работы
Оригинальные работы
Фінюк, Н.С.
Чапля, А.Є.
Мітіна, Н.Є.
Бойко, Н.М.
Лобачевська, О.В.
М’ягкота, О.C.
Ємець, А.І.
Блюм, Я.Б.
Заіченко, О.С.
Стойка, Р.С.
Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК
Цитология и генетика
description Масштаби використання генної інженерії з метою покращення біологічних властивостей різноманітних організмів постійно зростають. Для доставки генетичного матеріалу в клітини-мішені застосовують як вірусні, так і невірусні носії. Серед останніх найбільш перспективними вважають полімерні матеріали природного і синтетичного походження. Такі полімери проявили високу ефективність у доставці ДНК в клітини тварин, проте рослинні клітини виявилися малочутливими до їхньої дії. Нами описано метод генетичної трансформації протопластів моху Ceratodon purpureus (Hedw.) Brid., що базується на використанні нових поверхнево-активних полімерних носіїв контрольованої довжини та заряду, які містять ланцюги диметиламіноетилметакрилату. Цей метод дозволяє одержати більше транзієнтних і стабільних трансформантів моху із розрахунку на мікрограм ДНК порівняно з відомим протоколом із використанням поліетиленгліколю. Він є більш простим і зручним у використанні, а також дешевшим, ніж метод «генної гармати». Розглядаються перспективи подальшого вдосконалення структури і функціональних характеристик нових носіїв для доставки генетичного матеріалу в клітини рослин.
format Article
author Фінюк, Н.С.
Чапля, А.Є.
Мітіна, Н.Є.
Бойко, Н.М.
Лобачевська, О.В.
М’ягкота, О.C.
Ємець, А.І.
Блюм, Я.Б.
Заіченко, О.С.
Стойка, Р.С.
author_facet Фінюк, Н.С.
Чапля, А.Є.
Мітіна, Н.Є.
Бойко, Н.М.
Лобачевська, О.В.
М’ягкота, О.C.
Ємець, А.І.
Блюм, Я.Б.
Заіченко, О.С.
Стойка, Р.С.
author_sort Фінюк, Н.С.
title Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК
title_short Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК
title_full Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК
title_fullStr Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК
title_full_unstemmed Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК
title_sort генетична трансформація моху ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв днк
publisher Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
publishDate 2014
topic_facet Оригинальные работы
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126668
citation_txt Генетична трансформація моху Ceratodon purpureus за допомогою нових полікатіонних носіїв ДНК / Н.С. Фінюк, А.Є. Чапля, Н.Є. Мітіна, Н.М. Бойко, О.В. Лобачевська, О.C. М’ягкота, А.І. Ємець, Я.Б. Блюм, О.С. Заіченко, Р.С. Стойка // Цитология и генетика. — 2014. — Т. 48, № 6. — С. 3-10. — Бібліогр.: 33 назв. — укр.
series Цитология и генетика
work_keys_str_mv AT fínûkns genetičnatransformacíâmohuceratodonpurpureuszadopomogoûnovihpolíkatíonnihnosíívdnk
AT čaplâaê genetičnatransformacíâmohuceratodonpurpureuszadopomogoûnovihpolíkatíonnihnosíívdnk
AT mítínanê genetičnatransformacíâmohuceratodonpurpureuszadopomogoûnovihpolíkatíonnihnosíívdnk
AT bojkonm genetičnatransformacíâmohuceratodonpurpureuszadopomogoûnovihpolíkatíonnihnosíívdnk
AT lobačevsʹkaov genetičnatransformacíâmohuceratodonpurpureuszadopomogoûnovihpolíkatíonnihnosíívdnk
AT mâgkotaoc genetičnatransformacíâmohuceratodonpurpureuszadopomogoûnovihpolíkatíonnihnosíívdnk
AT êmecʹaí genetičnatransformacíâmohuceratodonpurpureuszadopomogoûnovihpolíkatíonnihnosíívdnk
AT blûmâb genetičnatransformacíâmohuceratodonpurpureuszadopomogoûnovihpolíkatíonnihnosíívdnk
AT zaíčenkoos genetičnatransformacíâmohuceratodonpurpureuszadopomogoûnovihpolíkatíonnihnosíívdnk
AT stojkars genetičnatransformacíâmohuceratodonpurpureuszadopomogoûnovihpolíkatíonnihnosíívdnk
first_indexed 2025-07-09T05:31:07Z
last_indexed 2025-07-09T05:31:07Z
_version_ 1837146120873050112
fulltext 3ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2014. Ò. 48. ¹ 6 ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ УДК 577:581.6 ГЕНЕТИЧНА ТРАНСФОРМАЦІЯ МОХУ CERATODON PURPUREUS ЗА ДОПОМОГОЮ НОВИХ ПОЛІКАТІОННИХ НОСІЇВ ДНК Н.С. ФІНЮК 1, А.Є. ЧАПЛЯ 2, Н.Є. МІТІНА 3, Н.М. БОЙКО 1, О.В. ЛОБАЧЕВСЬКА 2, О.C. М’ЯГКОТА 3, А.І. ЄМЕЦЬ 4, Я.Б. БЛЮМ 4, О.С. ЗАІЧЕНКО 3, Р.С. СТОЙКА 1 1 Інститут біології клітини НАН України, Львів 2 Інститут екології Карпат НАН України, Львів 3 Національний університет «Львівська політехніка» 4 Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Київ Е -mail: stoika@cellbiol.lviv.ua © Í.Ñ. Ô²ÍÞÊ, À.ª. ×ÀÏËß, Í.ª. ̲ҲÍÀ, Í.Ì. ÁÎÉÊÎ, Î.Â. ËÎÁÀ×ÅÂÑÜÊÀ, Î.C. Ì’ßÃÊÎÒÀ, À.². ªÌÅÖÜ, ß.Á. ÁËÞÌ, Î.Ñ. ÇÀ²×ÅÍÊÎ, Ð.Ñ. ÑÒÎÉÊÀ, 2014 Ìàñøòàáè âèêîðèñòàííÿ ãåííî¿ ³íæåíå𳿠ç ìåòîþ ïîêðàùåííÿ á³îëîã³÷íèõ âëàñòèâîñòåé ð³çíîìàí³òíèõ îðãàí³çì³â ïîñò³éíî çðîñòàþòü. Äëÿ äîñòàâêè ãåíå- òè÷íîãî ìàòåð³àëó â êë³òèíè-ì³øåí³ çàñòîñîâóþòü ÿê â³ðóñí³, òàê ³ íåâ³ðóñí³ íîñ³¿. Ñåðåä îñòàíí³õ íàéá³ëüø ïåðñïåêòèâíèìè ââàæàþòü ïîë³ìåðí³ ìàòåð³àëè ïðè- ðîäíîãî ³ ñèíòåòè÷íîãî ïîõîäæåííÿ. Òàê³ ïîë³ìåðè ïðîÿâèëè âèñîêó åôåêòèâí³ñòü ó äîñòàâö³ ÄÍÊ â êë³- òèíè òâàðèí, ïðîòå ðîñëèíí³ êë³òèíè âèÿâèëèñÿ ìà- ëî÷óòëèâèìè äî ¿õíüî¿ ä³¿. Íàìè îïèñàíî ìåòîä ãåíå- òè÷íî¿ òðàíñôîðìàö³¿ ïðîòîïëàñò³â ìîõó Ceratodon purpureus (Hedw.) Brid., ùî áàçóºòüñÿ íà âèêîðèñòàíí³ íîâèõ ïîâåðõíåâî-àêòèâíèõ ïîë³ìåðíèõ íîñ³¿â êîíòðî- ëüîâàíî¿ äîâæèíè òà çàðÿäó, ÿê³ ì³ñòÿòü ëàíöþãè äèìåòèëàì³íîåòèëìåòàêðèëàòó. Öåé ìåòîä äîçâîëÿº îäåðæàòè á³ëüøå òðàí糺íòíèõ ³ ñòàá³ëüíèõ òðàíñ- ôîðìàíò³â ìîõó ³ç ðîçðàõóíêó íà ì³êðîãðàì ÄÍÊ ïî- ð³âíÿíî ç â³äîìèì ïðîòîêîëîì ³ç âèêîðèñòàííÿì ïîë³- åòèëåíãë³êîëþ. Â³í º á³ëüø ïðîñòèì ³ çðó÷íèì ó âè- êîðèñòàíí³, à òàêîæ äåøåâøèì, í³æ ìåòîä «ãåííî¿ ãàðìàòè». Ðîçãëÿäàþòüñÿ ïåðñïåêòèâè ïîäàëüøîãî âäîñêîíàëåííÿ ñòðóêòóðè ³ ôóíêö³îíàëüíèõ õàðàêòå- ðèñòèê íîâèõ íîñ³¿â äëÿ äîñòàâêè ãåíåòè÷íîãî ìàòå- ð³àëó â êë³òèíè ðîñëèí. Êëþ÷îâ³ ñëîâà: ãåíåòè÷íà òðàíñôîðìàö³ÿ ïðîòîïëàñ- ò³â, ïîë³êàò³îíí³ íîñ³¿ ÄÍÊ, ìîõ Ceratodon purpureus. Âñòóï. Ñòâîðåííÿ òðàíñãåííèõ ðîñëèí âæå ïå- ðåòâîðèëîñü íà ðóòèííó òåõíîëîã³þ, ÿêà îõîï- ëþº ìîæëèâîñò³ äîñòàâêè ÷óæèííèõ ãåí³â ÿê ç åêñïåðèìåíòàëüíîþ ìåòîþ, òàê ³ äëÿ ïîë³ïøåí- íÿ ãåíåòè÷íèõ õàðàêòåðèñòèê áàãàòüîõ ñ³ëüñüêî- ãîñïîäàðñüêèõ êóëüòóð ³ ïðîäóêö³¿ á³îëîã³÷íî àê- òèâíèõ ðå÷îâèí [1]. ×óæèíí³ ãåíè ïåðåíîñÿòü äî òèõ ÷è ³íøèõ âèä³â ðîñëèí, ùîá íàäàòè ¿ì íîâ³ âëàñòèâîñò³, òàê³ ÿê, íàïðèêëàä, ïîêðàùåí³ õàð÷îâ³ õàðàêòåðèñòèêè, ñò³éê³ñòü äî ïàòîãåí³â òà òîëåðàíòí³ñòü äî ïîëþòàíò³â, ðåãóëÿö³ÿ ìåòà- áîë³çìó ³ ò.ï. Íà ñüîãîäí³ ìîæëèâî ïåðåíåñòè ãåíè íå ëèøå â³ä åâîëþö³éíî â³ääàëåíèõ âèä³â ðîñëèí, à é íàâ³òü â³ä â³ðóñ³â, áàêòåð³é, ãðèá³â ³ íàâ³òü òâàðèí. Ãåíåòè÷íà òðàíñôîðìàö³ÿ ïåðåäáà÷ຠïðî- íèêíåííÿ ÷óæèííîãî ãåíåòè÷íîãî ìàòåð³àëó ÷å- ðåç ðîñëèííó êë³òèííó ñò³íêó, ùî äîñÿãàºòüñÿ çà äîïîìîãîþ ð³çíèõ á³îëîã³÷íèõ òà ô³çè÷íèõ ìåòîä³â. ³äïîâ³äíî, íàéá³ëüø øèðîêî çàñòî- ñîâóâàíîþ òåõíîëî㳺þ äîñòàâêè ÷óæèííèõ ãå- í³â ç ìåòîþ åêñïðåñ³¿ ðåêîìá³íàíòíèõ á³ëê³â ñòà- ëà ãåíåòè÷íà òðàíñôîðìàö³ÿ ç âèêîðèñòàííÿì àãðîáàêòåð³é (Agrobacterium tumifaciens òà A. rhi- zogenes) [2]. Îäíàê äóæå ÷àñòî ñêëàäí³ ïàòåíòí³ îáìåæåííÿ, ïîâ’ÿçàí³ ç ìîæëèâîñòÿìè âèêî- ðèñòàííÿ Agrobacterium ÿê çàñîáó äëÿ ãåíåòè÷íî¿ ³íæåíåð³¿, òà çàãàëüí³ âèìîãè äî îòðèìàííÿ òðàíñ- ãåííèõ ðîñëèí ñòâîðþþòü îáñòàâèíè, ÿê³ çâó- æóþòü ìîæëèâîñò³ çàñòîñóâàííÿ ö³º¿ òåõíîëî㳿 äëÿ ïðèñêîðåííÿ íàóêîâèõ òà ïðèêëàäíèõ ðîç- ðîáîê ç âèêîðèñòàííÿì áàãàòüîõ âèä³â ðîñëèí. Ó çâ’ÿçêó ç öèìè îáñòàâèíàìè ïðîäîâæóþòü åôåêòèâíî ðîçðîáëÿòèñÿ ³íø³ ìåòîäè äîñòàâêè ãåíåòè÷íîãî ìàòåð³àëó äî ðîñëèííèõ êë³òèí. ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2014. Ò. 48. ¹ 64 Í.Ñ. Ô³íþê, À.ª. ×àïëÿ, Í.ª. ̳ò³íà òà ³í. Çîêðåìà, ðîáîòè îñòàíí³õ ðîê³â ó öüîìó íàïðÿì- êó ïðîäåìîíñòðóâàëè, ùî â³ðóñí³ âåêòîðí³ ñèñ- òåìè ìîæóòü åôåêòèâíî çàñòîñîâóâàòèñü äëÿ óñï³øíî¿ òðàí糺íòíî¿ åêñïðåñ³¿ ÷óæèííèõ á³ë- ê³â ó òðàíñôåêîâàíèõ ðîñëèíàõ, à òàêîæ òå, ùî ³íø³ âèäè áàêòåð³é, à íå ëèøå àãðîáàêòåð³¿, ìî- æóòü áóòè âèêîðèñòàí³ äëÿ îòðèìàííÿ òðàíñ- ãåííèõ ðîñëèí [3]. Âîäíî÷àñ øèðîêîãî çàñòîñó- âàííÿ íàáóëè ð³çí³ ô³çè÷í³ ìåòîäè ãåíåòè÷íî¿ òðàíñôîðìàö³¿ ðîñëèí, ñåðåä ÿêèõ îñîáëèâî ñë³ä â³äçíà÷èòè åëåêòðîïîðàö³þ, áîìáàðäóâàííÿ êë³- òèí íàíî÷àñòèíêàìè (á³îáàë³ñòèêà), âàêóóìíó ³íô³ëüòðàö³þ, à òàêîæ òðàíñôîðìàö³þ ç âèêî- ðèñòàííÿì óëüòðàçâóêó, øîêîâèõ õâèëü àáî âó- ñ³â (whiskers) êàðá³äó êðåìí³þ, ì³êðî- ³ ìàêðî- ³í’ºêö³¿, ëàçåðíó ì³êðîõâèëüîâó îáðîáêó [4].  îñòàíí³ ðîêè òàêîæ çðîñòàþòü ìàñøòàáè âè- êîðèñòàííÿ ç ö³ºþ æ ìåòîþ íàíî÷àñòèíîê [5] ³ íàíîòðóáîê [6]. Ðàçîì ç òèì äëÿ ïåðåíåñåííÿ ÄÍÊ åêçîãåí- íîãî ïîõîäæåííÿ (ðåêîìá³íàíòíèõ ïëàçì³ä) â êë³òèíè òàêîæ ìîæíà âèêîðèñòîâóâàòè íàíî- ðîçì³ðí³ ïîë³ìåðí³ ñèñòåìè [7, 8] òà ¿õí³ ã³áðèäí³ ôîðìè [9, 10], çîêðåìà ó öüîìó â³äíîøåíí³ äîá- ðå çàðåêîìåíäóâàëè ñåáå ïîâåðõíåâî-àêòèâí³ ïîë³àìôîë³òí³ íîñ³¿ ãðåáåíåïîä³áíî¿ áóäîâè [11]. ³äîìî, ùî àñîö³àö³ÿ ÄÍÊ ó êîìïëåêñ ³ç öèìè íîñ³ÿìè òà ¿¿ âèâ³ëüíåííÿ ç íèõ íå ñïðè÷èíÿþòü çì³í ó ñòðóêòóð³ íóêëå¿íîâî¿ êèñëîòè, á³ëüøå òîãî, äîñë³äæóâàí³ ïîë³ìåðí³ íîñ³¿ çàõèùàþòü ÄÍÊ â³ä ¿¿ ðîçùåïëåííÿ íóêëåàçàìè [12]. Ñë³ä çàçíà÷èòè, ùî ö³ ïîë³ìåðí³ íîñ³¿ çäàòí³ òàêîæ åôåêòèâíî äîñòàâëÿòè ÄÍÊ ó òâàðèíí³ êë³òèíè [13].  òîé æå ÷àñ íà ðîñëèííèõ îá’ºêòàõ ¿õí³ âëàñòèâîñò³ ïîêè ùî íå îõàðàêòåðèçîâàí³. Âñòà- íîâëåíî, ùî ïîë³ìåðí³ íîñ³¿ ãðåáåíåïîä³áíî¿ ñòðóêòóðè åôåêòèâíî ïåðåíîñÿòü ÄÍÊ ó äð³æä- æîâ³ êë³òèíè [14]. Îñê³ëüêè â ïîïåðåäí³õ äîñë³äæåííÿõ ïîë³- ìåðí³ íîñ³¿ ãðåáåíåïîä³áíî¿ áóäîâè íå ïðî- äåìîíñòðóâàëè âèñîêî¿ åôåêòèâíîñò³ ïðè âèêî- ðèñòàíí³ äëÿ ãåíåòè÷íî¿ òðàíñôîðìàö³¿ ðîñëèí, ó äàí³é ðîáîò³ çàïðîïîíîâàíî âèêîðèñòàòè äëÿ äîñòàâêè ïëàçì³äíî¿ ÄÍÊ â ö³ êë³òèíè íîâ³ ë³í³éí³ ïîë³êàò³îíí³ ïîë³ìåðè, ÿê³ ì³ñòÿòü ëàí- öþãè äèìåòèëàì³íîåòèëìåòàêðèëàòó (ÄÌÀÅÌ) ð³çíî¿ äîâæèíè ó ìîëåêóëàõ ìîíî- òà äèáëî÷- íî¿ áóäîâè. Äëÿ âèâ÷åííÿ ìîæëèâîñòåé çàñòî- ñóâàííÿ òàêèõ íîñ³¿â ïðè òðàíñôîðìàö³¿ ðîñ- ëèí íàøó óâàãó ïðèâåðíóëè ìîõè, ÿê³ º øè- ðîêî âæèâàíèìè ìîäåëüíèìè îá’ºêòàìè ñåðåä íàçåìíèõ ðîñëèí äëÿ äîñë³äæåíü ó ãàëóç³ ìî- ëåêóëÿðíî¿ òà êë³òèííî¿ á³îëî㳿 ç îãëÿäó íà ¿õ åâîëþö³éíå ïîëîæåííÿ, ïðîñòó àíàòîì³÷íó áóäîâó ³ çðó÷í³ñòü êóëüòèâóâàííÿ in vitro [15– 18]. ³äîìî òàêîæ, ùî ó æèòòºâîìó öèêë³ ìîõ³â äîì³íóº ãàïëî¿äíà ãàìåòîô³òíà ãåíåðàö³ÿ, ùî ðîáèòü ¿õ çðó÷íèì îá’ºêòîì äëÿ äîñë³äæåííÿ [19]. Êð³ì òîãî, ó öèõ ðîñëèí ñïîñòåð³ãàþòü âè- ñîêèé ð³âåíü ãîìîëîã³÷íî¿ ðåêîìá³íàö³¿ [20]. Íà ñüîãîäí³ äëÿ òðàíñôîðìàö³¿ ìîõ³â øèðîêî çàñòîñîâóþòüñÿ ð³çí³ ìåòîäè ãåíåòè÷íî¿ òðàíñ- ôîðìàö³¿: çà äîïîìîãîþ ïîë³åòèëåíãë³êîëþ (ÏÅÃ) [21, 22], àãðîáàêòåð³àëüíî¿ [23, 24] òà á³î- áàë³ñòè÷íî¿ [25] òðàíñôîðìàö³¿. Ñàìå ÷åðåç òå ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷í³ ìàí³ïóëÿö³¿ ³ç ãàïëî¿ä- íîþ ïðîòîíåìîþ ìîõó ñòâîðþþòü õîðîø³ ìîæ- ëèâîñò³ äëÿ ðîçâ’ÿçàííÿ ÿê ôóíäàìåíòàëüíèõ [24], òàê ³ ïðèêëàäíèõ [26] ïðîáëåì ãåíåòè÷íî¿ ³íæåíåð³¿. Àëå â ö³ëîìó åôåêòèâí³ñòü öèõ ïðî- öåäóð çàëèøàºòüñÿ íèæ÷îþ, í³æ ó äð³æäæ³â, õî÷à ð³âí³ òðàíñôîðìàö³¿ ìîõ³â êðàù³, í³æ ó âèùèõ ðîñëèí [27]. Ìåòîþ äàíî¿ ðîáîòè áóëà ñïðîáà ðîçðîáèòè óìîâè äîñòàâêè åêçîãåííî¿ ÄÍÊ çà äîïîìîãîþ ïîë³êàò³îííèõ íîñ³¿â äî êë³òèí ìîõó Ceratodon purpureus òà îö³íèòè åôåêòèâí³ñòü òàêîãî ìåòîäó òðàíñôîðìàö³¿ íà ðîñëèííîìó îá’ºêò³. Ìàòåð³àëè ³ ìåòîäè. Ìîõ C. purpureus áóâ ç³áðàíèé íà òåðèòî𳿠ñ³ð÷àíîãî â³äâàëó ¹ 1 ßç³âñüêîãî ñ³ð÷àíîãî ðîäîâèùà, ï³äïîðÿäêîâà- íîãî ÄÃÕÏ «Ñ³ðêà» (Ëüâ³âñüêà îáëàñòü, Óêðà¿íà). Êóëüòóðó ìîõó îòðèìóâàëè ïðîðîùóâàííÿì éî- ãî ñïîð â ëàáîðàòîðíèõ óìîâàõ. Äëÿ âèðîùó- âàííÿ ìîõó ³ ñåëåêö³¿ òðàíñôîðìàíò³â âèêîðèñ- òîâóâàëè êóëüòóðàëüí³ ñåðåäîâèùà, ðåêîìåíäî- âàí³ äëÿ ìîõó P. patens [28, 29]. Äëÿ òðàíñôîðìàö³¿ ìîõó C. purpureus âèêî- ðèñòîâóâàëè íîâ³ ïîâåðõíåâî-àêòèâí³ ïîë³êà- ò³îíí³ íîñ³¿ ë³í³éíî¿ ìîíî- òà äèáëî÷íî¿ áó- äîâè, ñèíòåçîâàí³ íà êàôåäð³ îðãàí³÷íî¿ õ³ì³¿ Íàö³îíàëüíîãî óí³âåðñèòåòó «Ëüâ³âñüêà ïîë³- òåõí³êà» [11]. Âîíè ÿâëÿþòü ñîáîþ ë³í³éí³ îë³ãîìåðè ÄÌÀÅÌ ³ç ã³äðîôîáíèì ê³íöåâèì äèòðåòáóòèë-àðèëïåðîêñèäíèì ôðàãìåíòîì, à òàêîæ îòðèìàí³ íà éîãî îñíîâ³ äèáëîê-êîïîë³- ìåðè, áóäîâà ÿêèõ ïðåäñòàâëåíà íà ðèñ. 1. Òóò ïîð³âíÿíî ñòðóêòóðó ãðåáåíåïîä³áíîãî íîñ³ÿ ÁÃ- 2m ç á³÷íèìè ëàíöþãàìè ïîë³åòèëåíãë³êîëþ òà íîñ³¿â ³ç ëàíöþãàìè ïîë³ÄÌÀÅÌ. Õàðàêòå- ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2014. Ò. 48. ¹ 6 5 Ãåíåòè÷íà òðàíñôîðìàö³ÿ ìîõó Ñeratodon purpureus çà äîïîìîãîþ íîâèõ ïîë³êàò³îííèõ íîñ³¿â ÄÍÊ ðèñòèêà ³ âëàñòèâîñò³ äîñë³äæåíèõ ïîë³ìåðíèõ íîñ³¿â íàâåäåí³ ó òàáëèö³. ²ç ôóíêö³é ðîçïîä³ëó çà ðîçì³ðîì ì³öåëÿðíèõ ñòðóêòóð, ÿê³ óòâîðþþòüñÿ ó âîäíîìó ðîç÷èí³ äîñë³äæåíèõ ïîë³ìåðíèõ íîñ³¿â, âèäíî (ðèñ. 2), ùî ä³àìåòð ÷àñòèíîê ïîë³ìåð³â ÁÃ-2m, 83/5 ³ 83/6 çíàõîäèòüñÿ ó ä³àïàçîí³ 40–80 íì, òîä³ ÿê ä³àìåòð ÷àñòèíîê ïîë³ìåðà 5Dq (ïîë³ÄÌÀÅÌ) – ó ä³àïàçîí³ 2–5 íì. Äëÿ òðàíñôîðìàö³¿ ìîõó C. purpureus âèêî- ðèñòîâóâàëè ïëàçì³äíó ÄÍÊ pSF3, ÿêà ì³ñòèòü ãåí ñò³éêîñò³ äî ã³ãðîì³öèíó Á òà õèìåðíèé ãåí á³ë- êà ïåðîêñèñîìíîãî ñèãíàëó ïåðøîãî òèïó (pts1), çëèòîãî ç ãåíîì gfp. Êîíñòðóêö³þ îòðèìàíî â ²íñòèòóò³ á³îëî㳿 êë³òèíè ÍÀÍ Óêðà¿íè. Äëÿ ïðîâåäåííÿ òðàíñôîðìàö³¿ ³ç çàñòîñó- âàííÿì ïîë³àìôîë³òíèõ íîñ³¿â âèêîðèñòîâóâà- ëè ìîäèô³êîâàíó ìåòîäèêó, ðîçðîáëåíó äëÿ ìî- õó P. patens [28]. Ç ö³ºþ ìåòîþ äî ðîç÷èí³â ïîë³ìåðíèõ íîñ³¿â ð³çíî¿ êîíöåíòðàö³¿ äîäàâà- ëè 1 ìêã ïëàçì³äíî¿ ÄÍÊ ³ îòðèìàíó ñóì³ø ³íêóáóâàëè ïðîòÿãîì 20 õâ ïðè ê³ìíàòí³é òåì- ïåðàòóð³ äëÿ óòâîðåííÿ êîìïëåêñó íîñ³é/ÄÍÊ [30]. Öåé êîìïëåêñ âíîñèëè äî ñóñïåí糿 ïðî- òîïëàñò³â. Äëÿ òðàíñôîðìàö³¿ ç âèêîðèñòàííÿì ïîë³åòèëåíãë³êîëþ (ÏÅÃ-6000, «Loba Chemie», Àâñòð³ÿ) çàñòîñîâóâàëè ìîäèô³êîâàíó ìåòîäè- êó, òàêîæ ðîçðîáëåíó äëÿ ìîõó P. patens [28, 29]. Òðàíñôîðìîâàí³ ïðîòîïëàñòè âèñ³âàëè íà ÷àøêè Ïåòð³ ³ç ñåðåäîâèùåì PRMB, ùî ì³ñ- òèëî ãëþêîçó (0,5 %) [28], à ÷åðåç 14 äí³â ¿õ ïåðåíîñèëè íà ñåëåêòèâíå ñåðåäîâèùå ç ã³ãðîì³öèíîì (50 ìêã/ìë). ϳñëÿ 14–20 äí³â êóëüòèâóâàííÿ (ïåð³îä, ïðîòÿãîì ÿêîãî ãè- íóòü êë³òèíè ³ç êîðîòêîòðèâàëîþ åêñïðåñ³ºþ ãåòåðîëîã³÷íîãî ãåíà) ðåãåíåðàíòè ñóáêóëüòè- âóâàëè íà ñåðåäîâèùàõ áåç àíòèá³îòèêà ³ ç àíòèá³îòèêîì (êîæåí ðàç ïî 14 äí³â) ïî÷åðãî- âî äëÿ ï³äòâåðäæåííÿ îòðèìàííÿ ñòàá³ëüíèõ òðàíñôîðìàíò³â [31]. Äëÿ ïåðåâ³ðêè íàÿâíîñò³ àáî â³äñóòíîñò³ ïåðåíåñåíîãî ãåíà ³íòåðåñó â îòðèìàíèõ òðàíñ- ôîðìàíòàõ ïðîâîäèëè ÏËÐ-àíàë³ç. ÄÍÊ ³ç òðàíñ- ãåííèõ ðîñëèí âèä³ëÿëè ï³ñëÿ 45 äí³â êóëü- òèâóâàííÿ çà îïèñàíîþ ìåòîäèêîþ [28]. Äëÿ Ðèñ. 1. Ñõåìàòè÷íå ïðåäñòàâëåííÿ ñòðóêòóðè ìîëåêóë ïîë³ìåðíèõ íîñ³¿â, âèêîðèñòàíèõ ó ðîáîò³ ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2014. Ò. 48. ¹ 66 Í.Ñ. Ô³íþê, À.ª. ×àïëÿ, Í.ª. ̳ò³íà òà ³í. âèÿâëåííÿ òðàíñãåíåçó õèìåðíîãî ãåíà gfp-pts1 âèêîðèñòîâóâàëè ïðàéìåðè VN10 (ôîðâàðä- íèé) ³ VN11 (ðåâåðñíèé) («Genomed», Ïîëüùà): VN10 AAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG VN11 AAAGCGGCCGCTGCAGATCTGAGTAC- TTGT ÏËÐ-àíàë³ç çä³éñíþâàëè çà íàñòóïíèõ óìîâ: 1 öèêë ïðè 94 ºÑ ïðîòÿãîì 5 õâ; 30 öèêë³â ïðè 94 ºÑ – 30 ñ, 57 ºÑ – 30 ñ, 72 ºÑ – 80 ñ; 1 öèêë ïðè 72 ºÑ – 1 õâ. Ïðîäóêòè ÏËÐ àíàë³çóâàëè çà äîïîìîãîþ åëåêòðîôîðåçó â 1%-íîìó ãåë³ àãàðîçè [31]. Ðåçóëüòàòè äîñë³äæåíü òà ¿õ îáãîâîðåííÿ. Åôåêòèâí³ñòü âèêîðèñòàíèõ íàìè íîñ³¿â ùîäî çàáåçïå÷åííÿ ãåíåòè÷íî¿ òðàíñôîðìàö³¿ ìîõó C. purpureus áóëà ð³çíîþ, ÿêùî áðàòè äî óâàãè â³äæèâëåííÿ ïðîòîïëàñò³â ³ ôîðìóâàííÿ íè- òîê ïðîòîíåìè ìîõó. Äëÿ òðàíñôåêö³¿ áóëè âèêîðèñòàí³ ð³çí³ ïîë³ìåðí³ íîñ³¿ – 83/5, 83/6, 5Dq ³ ÁÃ-2m: 83/5 11 êëîí³â 83/6 12 êëîí³â 5Dq 1 êëîí ÁÃ-2m 1 êëîí ÏÅà 6000 Êëîíè íå îòðèìàí³ Êîíòðîëü (áåç íîñ³ÿ) Êëîíè íå îòðèìàí³ Óòâîðåííÿ êîìïëåêñó ïîë³êàò³îííîãî íîñ³ÿ ç ïëàçì³äíîþ ÄÍÊ â³äáóâàëîñÿ çà ïðèñóòíîñò³ 0,3%-íîãî ðîç÷èíó â³äïîâ³äíîãî ïîë³ìåðà. Çà òàêî¿ êîíöåíòðàö³¿ ëèøå äâà ïîë³ìåðè – 83/5 òà 83/6 – äîçâîëèëè çàáåçïå÷èòè øâèäêå â³ä- æèâëåííÿ òà àêòèâíèé ð³ñò ïðîòîíåìè. Ó òîé æå ÷àñ çà 䳿 ïîë³ìåð³â 5Dq ³ ÁÃ-2m çíà÷íà ê³ëüê³ñòü ïðîòîïëàñò³â íå âèæèâàëà, à ð³ñò íè- òîê ïðîòîíåìè áóâ ñïîâ³ëüíåíèì. Ñë³ä çàçíà÷èòè, ùî âèêîðèñòàí³ ó ðîáîò³ ïîë³ìåðí³ íîñ³¿ º ðîç÷èííèìè ó øèðîêîìó ä³à- ïàçîí³ ðÍ ³ çäàòí³ óòâîðþâàòè ì³æìîëåêóëÿðí³ êîìïëåêñè ñîëüîâîãî òèïó ì³æ ïîçèòèâíî çà- ðÿäæåíèìè ãðóïàìè ëàíöþã³â ïîë³ÄÌÀÅÌó ³ íåãàòèâíî çàðÿäæåíèìè ôîñôàòíèìè ãðóïàìè íóêëåîòèä³â ó ìîëåêóë³ ÄÍÊ. Íàÿâí³ñòü ã³äðî- ôîáíèõ ôðàãìåíò³â ó ñòðóêòóð³ ïîë³ìåðíîãî íîñ³ÿ íå ëèøå çàáåçïå÷óº éîãî ïîâåðõíåâó àê- òèâí³ñòü, àëå é ñïðèÿº âçàºìî䳿 êîìïëåêñó íîñ³é/ÄÍÊ ³ç ïëàçìàòè÷íîþ ìåìáðàíîþ ðåöè- ﳺíòíèõ êë³òèí. Ìîæëèâî, â³äì³ííîñò³ ó öèõ âëàñòèâîñòÿõ ïîÿñíþþòü ð³çíó åôåêòèâí³ñòü âè- êîðèñòàíèõ íîñ³¿â, ³ íå âèêëþ÷åíî òîêñè÷íó ä³þ äåÿêèõ ç íèõ íà ïðîòîïëàñòè ìîõó. Äëÿ Ïîð³âíÿëüíà õàðàêòåðèñòèêà áóäîâè ìîëåêóë âèêîðèñòàíèõ ïîë³ìåðíèõ íîñ³¿â * Äî ñêëàäó ïîë³ìåðíîãî íîñ³ÿ âõîäèòü ôðàãìåíò ³çîïðîï³ë(òðåò-áóòèëïåðîêñè)ìåòèëåòèëáåíçåíó (²ÏÁÌÁ), [²ÏÁÌ] = 6,00 %. Ðèñ. 2. Ðîçïîä³ëåííÿ çà ðîçì³ðîì ì³öåëÿðíèõ ñòðóê- òóð, ùî óòâîðþþòüñÿ ó âîäíîìó ðîç÷èí³ íîñ³¿â ÁÃ-2m (1), 83/5 (2), 83/6 (3) ³ 5Dq (4). ïî ãîðèçîíòàë³ – ä³àìåòð ÷àñòèíîê, íì; ïî âåðòèêàë³ – óìîâí³ îäèíè- ö³ ³íòåíñèâíîñò³ ïîãëèííÿ â³äïîâ³äíîãî íîñ³ÿ 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 Ïîçíà÷åííÿ Âì³ñò ôóíêö³îíàëüíèõ ôðàãìåíò³â ó ïîë³ìåðíîìó íîñ³¿, % -ïîòåí- ö³àë, ì * Ðîçì³ð ì³öå- ëÿðíèõ ñòðóê- òóð, Dh, íìÔðàãìåíò ² (ñêåëåò) Ôðàãìåíò ²² (ïðèùåïëåí³ ëàíöþãè) l n p a b c d e 1 % ðîç÷èí â Í2Î ÁÃ-2m 83/6 83/5 5Dq * 0,1 – – – 5,0 – – – – 20,0 15,0 94,0 90,0 – – – 4,9 – – – – 64,8 68,8 – – 11,4 12,2 – – 3,8 4,0 – >50 3,3 4,3 45,0 48,0 62,0 68,0 5,0 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2014. Ò. 48. ¹ 6 7 Ãåíåòè÷íà òðàíñôîðìàö³ÿ ìîõó Ñeratodon purpureus çà äîïîìîãîþ íîâèõ ïîë³êàò³îííèõ íîñ³¿â ÄÍÊ òðàíñôîðìàö³¿ ìîõó C. purpureus âèêîðèñòî- âóâàëè ìîäèô³êîâàíó ìåòîäèêó [28], ó ÿê³é ïëàçì³äíó ÄÍÊ êîìïëåêòóâàëè ç ÏÅà àáî âêàçàíèìè íîñ³ÿìè (ÁÃ-2m, 5Dq, 83/5 ³ 83/6). Çàñòîñóâàííÿ êëàñè÷íîãî ìåòîäó òðàíñôîðìà- ö³¿ çà äîïîìîãîþ ÏÅà íå äàëî çìîãè îòðèìàòè òðàíñôîðìàíòè ìîõó, òîä³ ÿê äîñòàâêà ÄÍÊ ïîë³ìåðíèìè íîñ³ÿìè çàáåçïå÷èëà îòðèìàííÿ îäíîãî òðàíñôîðìàíòó çà 䳿 ÁÃ-2m òà 5Dq, 11 òà 12 òðàíñôîðìàíò³â – çà 䳿 83/5 ³ 83/6 â³äïîâ³äíî (ðèñ. 3, äèâ. âêëåéêó â ê³íö³ íîìå- ðà). Êëîíè, ÿê³ ïðîéøëè îäèí ñåëåêòèâíèé â³ä- á³ð íà ñåðåäîâèù³ ç ã³ãðîì³öèíîì Á, ââàæàëè òðàíñôîðìîâàíèìè òðàí糺íòíî. Õî÷à C. purpureus º îäíèì ç âèçíàíèõ ìî- äåëüíèõ âèä³â ìîõ³â, ÿêèé áóëî âèêîðèñòàíî ó ðÿä³ ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷íèõ äîñë³äæåíü [32], ñë³ä çàçíà÷èòè, ùî åôåêòèâí³ñòü ó ìàðêóâàíí³ éîãî ãåí³â âèÿâèëàñÿ çíà÷íî íèæ÷îþ ïîð³âíÿíî äî ìîõó P. patens [33], ñòàíîâëÿ÷è 20,8 % ó P. patens i ëèøå 1,05 % ó C. purpureus. Öèì, íà íà- øó äóìêó, ìîæíà ïîÿñíèòè íåçíà÷íó ê³ëüê³ñòü îòðèìàíèõ òðàí糺íòíèõ ³ ñòàá³ëüíèõ òðàíñ- ôîðìàíò³â C. purpureus. Îñê³ëüêè äëÿ îäåðæàííÿ äîñòîâ³ðíèõ ðåçóëü- òàò³â íåîáõ³äíî áóëî îòðèìàòè çíà÷íó ê³ëüê³ñòü ñòàá³ëüíî òðàíñôîðìîâàíèõ ðîñëèí, ñåëåêö³þ ñòàá³ëüíèõ òðàíñôîðìàíò³â íà ñåëåêòèâíîìó ñå- ðåäîâèù³, ùî ì³ñòèëî 50 ìêã/ìë ã³ãðîì³öèíó Á, ïðîâîäèëè äâ³÷³ ï³ñëÿ 6-äåííîãî êóëüòèâóâàí- íÿ íà ñåðåäîâèù³ äëÿ â³äæèâëåííÿ ïðîòîïëàñ- ò³â (ðèñ. 4, äèâ. âêëåéêó â ê³íö³ íîìåðà). Ðå- çóëüòàòè ñòàá³ëüíî¿ òðàíñôîðìàö³¿ áóëè ñï³â- ñòàâíèìè ç ðåçóëüòàòàìè òðàí糺íòíî¿ òðàíñ- ôîðìàö³¿. ²ç ïðîòîíåìè êîæíî¿ òðàíñãåííî¿ ðîñëèíè áóëî âèä³ëåíî ÄÍÊ äëÿ íàñòóïíîãî ÏËÐ-àíàë³çó ç ìåòîþ ï³äòâåðäæåííÿ ³íòåãðàö³¿ ðåïîðòåðíîãî ãåíà gfp ó ãåíîì ðîñëèíè.  ðåçóëüòàò³ åëåêòðî- ôîðåòè÷íîãî àíàë³çó ïðîäóêò³â ÏËÐ íàìè âè- ÿâëåíî ñìóãó ÄÍÊ, ùî â³äïîâ³äຠçà ðîçì³ðà- ìè âêàçàíîìó ãåíó (ðèñ. 5). Ñï³âñòàâëåííÿ ðåçóëüòàò³â àíàë³çó ñòðóêòóð- íèõ îñîáëèâîñòåé âèêîðèñòàíèõ ïîë³ìåðíèõ íîñ³¿â ïëàçì³äíî¿ ÄÍÊ ç äàíèìè, îäåðæàíèìè â íàø³é ðîáîò³, ùîäî ¿õíüî¿ çäàòíîñò³ çàáåç- ïå÷óâàòè äîñòàâêó ö³º¿ ÄÍÊ ó ãåíîì ìîõó C. purpureus ïîêàçàëî, ùî íàéá³ëüø 䳺âèìè âè- ÿâèëèñÿ ïîë³ìåðè 83/5 ³ 83/6 (11 ³ 12 òðàíñ- ôîðìîâàíèõ êëîí³â â³äïîâ³äíî). Íà â³äì³íó â³ä ³íøèõ âèêîðèñòàíèõ ïîë³ìåð³â ìîëåêóëè öèõ íîñ³¿â º äèáëîê-êîïîë³ìåðàìè, ÿê³, êð³ì ëàí- öþãà ïîë³ÄÌÀÅÌ, ìàþòü ó ñâîºìó ñêëàä³ âîäîðîç÷èííèé ãíó÷êèé áëîê, ùî ì³ñòèòü ëàí- êè â³í³ë-ï³ðîë³äîíó òà ìîíîìåðà ³ç ïåðâèííîþ àì³íîãðóïîþ. Ìîæíà ïðèïóñòèòè, ùî óòâîðåí- íÿ ïîë³ïëåêñó â³äáóâàºòüñÿ â ðåçóëüòàò³ åëåêòðî- ñòàòè÷íî¿ âçàºìî䳿 ÄÍÊ ç áëîêîì ïîë³ÄÌÀÅÌ, ÿêèé ï³ñëÿ öüîãî íàáóâຠã³äðîôîáíèõ âëàñòè- âîñòåé òà óòâîðþº ÿäðî íàíîðîçì³ðíî¿ ì³öåëî- ïîä³áíî¿ ñòðóêòóðè. Öÿ ñòðóêòóðà ñòàá³ë³çóºòüñÿ âîäîðîç÷èííèì áëîêîì ³ç ëàíîê N-â³í³ëï³ðîë³äîíó òà àì³íî- åòèëìåòàêðèëàòó ³ç ïåðâèííîþ àì³íîãðóïîþ. Âàæëèâîþ îñîáëèâ³ñòþ ì³öåëîïîä³áíèõ ñòðóê- òóð, óòâîðþâàíèõ öèìè äèáëîê-êîïîë³ìåðàìè, º ñóòòºâî ìåíøèé ó ïîð³âíÿíí³ ³ç íîñ³ÿìè ÁÃ- 2m òà 5Dq ¿õí³é äçåòà-ïîòåíö³àë (òàáëèöÿ). Óòâîðåííÿ ïîë³ïëåêñó â ðåçóëüòàò³ âçàºìî䳿 íîñ³ÿ ç ÄÍÊ ó äîñë³äæåíîìó ä³àïàçîí³ ¿õ ñï³â- â³äíîøåííÿ ³ñòîòíî íå âïëèâຠíà ðîçì³ð ì³öå- ëîïîä³áíèõ ñòðóêòóð ³ ¿õí³é äçåòà-ïîòåíö³àë. ßêùî ì³öåëîïîä³áíà ñòðóêòóðà, óòâîðåíà íî- ñ³ºì 83/5, ìຠðîçì³ð 68 íì ³ äçåòà-ïîòåíö³àë, ð³âíèé 4,3 ìÂ, òî ðîçì³ð ³ ïîòåíö³àë â³äïîâ³äíèõ ïîë³ïëåêñ³â ç ÄÍÊ äîð³âíþº 62 íì ³ 4,4 ì â³äïîâ³äíî. Íà ï³äñòàâ³ íàÿâíèõ äàíèõ ïîêè ùî ñêëàä- íî ñòâåðäæóâàòè, ÿêà ñàìå ³ç ïåðåðàõîâàíèõ Ðèñ. 5. Åëåêòðîôîðåãðàìà çà ðåçóëüòàòàìè ÏËÐ-àíà- ë³çó òðàíñôîðìàíò³â ìîõó Ceratodon purpureus: 1 – ÄÍÊ-ìàðêåðè; 2 – êîíòðîëü (áåç ÏËÐ); 3, 4, 5, 6 – äîñòàâêà ÄÍÊ íîñ³ÿìè 83/5, 83/6, D5q ³ ÁÃ-2m â³äïîâ³äíî ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2014. Ò. 48. ¹ 68 Í.Ñ. Ô³íþê, À.ª. ×àïëÿ, Í.ª. ̳ò³íà òà ³í. ñòðóêòóðíèõ îñîáëèâîñòåé ìîëåêóëè ïîë³ìåð³â 83/5 ³ 83/6 â³ä³ãðຠíàéá³ëüøó ðîëü ó çàáåçïå÷åí- í³ âèñîêî¿ åôåêòèâíîñò³ äîñòàâêè íèìè ÄÍÊ ó êë³òèíè ìîõ³â ïîð³âíÿíî ç òàêîþ äîñòàâêîþ çà ó÷àñò³ ³íøèõ âèêîðèñòàíèõ ïîë³ìåð³â – 5Dq ³ ÁÃ-2m. Ìîæëèâî, òàêîþ ïåðåâàãîþ äëÿ ïî- ë³ìåð³â 83/5 ³ 83/6 º íàÿâí³ñòü ó íèõ â³ëüíî¿ àì³íîãðóïè, ùî ñïðèÿº êðàùîìó çâ’ÿçóâàííþ ìîëåêóëè ÄÍÊ, ÿêà òðàíñïîðòóºòüñÿ â êë³òèíè.  ö³ëîìó îòðèìàí³ ðåçóëüòàòè ñòîñîâíî åôåê- òèâíî¿ äîñòàâêè ïëàçì³äíî¿ ÄÍÊ ó ãåíîì ìî- õó C. purpureus çà äîïîìîãîþ íîâîñòâîðåíèõ ïîë³ìåðíèõ íîñ³¿â ³ç ëàíöþãàìè ïîë³ÄÌÀÅÌ, ïîçíà÷åíèõ 83/5 ³ 83/6, äîçâîëÿþòü ñòâåðäæó- âàòè, ùî öåé ìîõ âèÿâèâñÿ çðó÷íèì ìîäåëü- íèì ðîñëèííèì îðãàí³çìîì, ç âèêîðèñòàííÿì ÿêîãî âïåðøå ïðîäåìîíñòðîâàíî ìîæëèâîñò³ òà- êîãî ìåòîäó ãåíåòè÷íî¿ òðàíñôîðìàö³¿ äëÿ ìîõ³â. Çàïðîïîíîâàíèé ìåòîä ãåíåòè÷íî¿ òðàíñôîðìà- ö³¿ ïðîòîïëàñò³â ìîõó C. purpureus äîçâîëÿº îò- ðèìàòè á³ëüøå òðàí糺íòíèõ ³ ñòàá³ëüíèõ òðàíñ- ôîðìàíò³â ìîõó ïîð³âíÿíî ç ðåçóëüòàòàìè ïðè çàñòîñóâàíí³ ïðîòîêîëó òðàíñôîðìàö³¿, êîòðèé áàçóºòüñÿ íà âèêîðèñòàíí³ ïîë³åòèëåíãë³êîëþ. Ñë³ä çàçíà÷èòè, ùî îòðèìàí³ äîòåïåð ðåçóëü- òàòè ñâ³ä÷àòü ïðî äóæå íèçüêó åôåêòèâí³ñòü òðàíñôîðìàö³¿ öåðàòîäîíó ó ïîð³âíÿíí³ ç ô³ñ- êîì³òðåëîþ [33]. Òàêèì ÷èíîì, ìîæíà î÷³êó- âàòè, ùî ðîçðîáêà íàìè åôåêòèâíîãî ìåòîäó òðàíñôîðìàö³¿ C. purpureus ñïðèÿòèìå ðîçøè- ðåííþ âèêîðèñòàííÿ öüîãî âèäó ìîõó ÿê ìî- äåëüíîãî îá’ºêòà [18]. Ó ñâîþ ÷åðãó ïîð³âíÿëü- íèé àíàë³ç âçàºìîâ³äíîñèí ì³æ ñòðóêòóðîþ ³ ôóíêö³ºþ çàñòîñîâàíèõ â íàø³é ðîáîò³ ïîë³- ìåðíèõ íîñ³¿â íà îñíîâ³ ïîë³ÄÌÀÅÌ ³ òà- êîãî ïîë³ìåðíîãî íîñ³ÿ, ÿê ÏÅÃ, ìîæå äîçâî- ëèòè êðàùå îö³íèòè ïåðñïåêòèâè ïîäàëüøîãî âäîñêîíàëåííÿ ñòðóêòóðè ³ ôóíêö³îíàëüíèõ õà- ðàêòåðèñòèê íîâèõ ïîë³ìåðíèõ íîñ³¿â, ÿê³ ïðî- ïîíóâàòèìóòüñÿ äëÿ çàáåçïå÷åííÿ á³ëüø åôåê- òèâíî¿ äîñòàâêè ãåíåòè÷íîãî ìàòåð³àëó â ðîñ- ëèíí³ êë³òèíè. Ðîáîòó âèêîíàíî çà ô³íàíñîâî¿ ï³äòðèìêè ãðàí- òó ö³ëüîâî¿ êîìïëåêñíî¿ ïðîãðàìè ôóíäàìåíòàëü- íèõ äîñë³äæåíü Íàö³îíàëüíî¿ àêàäå쳿 íàóê Óê- ðà¿íè «Ôóíäàìåíòàëüí³ îñíîâè ìîëåêóëÿðíèõ òà êë³òèííèõ á³îòåõíîëîã³é» çã³äíî ç äîãîâîðîì ¹ 46, à òàêîæ ãðàíòó, íàäàíîìó Í.Ñ. Ô³íþê Çàõ³äíî- Óêðà¿íñüêèì á³îìåäè÷íèì äîñë³äíèöüêèì öåíòðîì (2013–2014 ðð.). GENETIC TRANSFORMATION OF THE MOSS CERATODON PURPUREUS BY NOVEL POLYÑATIONIC CARRIERS OF DNA N.S. Finiuk, A.Y. Chaplya, N.Y. Mitina, N.M. Boiko, O.V. Lobachevska, Î.S. Miahkota, A.I. Yemets, Ya.B. Blume, O.S. Zaichenko, R.S. Stoika Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine, Lviv Institute of Ecology of the Carpathians, Lviv Lviv National Polytechnic University Institute of Food Biotechnology and Genomics, Êyiv Å-mail: stoika@cellbiol.lviv.ua There is a big progress in application of genetic engineering for improving the biological properties of different organisms. Viral and non-viral carriers are used for delivery of genetic material into target cells. Nanoscale polymeric materials of natural and synthetic origin are the most promising gene delivery agents. These polymers have demonstrated high efficiency of DNA delivery into the mammalian cells, although they were not very effective in plant cells. Here, the procedure for genetic transformation of Ceratodon purpureus (Hedw.) Brid. moss protoplasts is described. Method is based on the application of novel surface-active polymeric carriers of the polyDMAEM structure and controlled length and charge. It allows obtaining more transient and stable moss transformants per microgram of plasmid DNA when compared with known protocol based on using polyethyleneglycol. It is easier, more convenient, and cheaper than the «gene gun» method. Perspectives for further improvement of structure and functional characteristics of novel polymeric carriers are considered for delivery of genetic material into plant cells. ÃÅÍÅÒÈ×ÅÑÊÀß ÒÐÀÍÑÔÎÐÌÀÖÈß ÌÕÀ CERATODON PURPUREUS C ÏÎÌÎÙÜÞ ÍÎÂÛÕ ÏÎËÈÊÀÒÈÎÍÍÛÕ ÍÎÑÈÒÅËÅÉ ÄÍÊ Í.Ñ. Ôèíþê, À.Å. ×àïëÿ, Í.Å. Ìèòèíà, Í.Ì. Áîéêî, Î.Â. Ëîáà÷åâñêàÿ, Î.C. Ìÿãêîòà, À.È. Åìåö, ß.Á. Áëþì, A.Ñ. Çàè÷åíêî, Ð.Ñ. Ñòîéêà Ìàñøòàáû èñïîëüçîâàíèÿ ãåííîé èíæåíåðèè ñ öå- ëüþ óëó÷øåíèÿ áèîëîãè÷åñêèõ ñâîéñòâ ðàçëè÷íûõ îð- ãàíèçìîâ ïîñòîÿííî ðàñòóò. Äëÿ äîñòàâêè ãåíåòè- ÷åñêîãî ìàòåðèàëà â êëåòêè-ìèøåíè ïðèìåíÿþò êàê âèðóñíûå, òàê è íåâèðóñíûå íîñèòåëè. Ñðåäè ïîñëåä- íèõ íàèáîëåå ïåðñïåêòèâíûìè ñ÷èòàþòñÿ íàíîðàç- ìåðíûå ïîëèìåðíûå ìàòåðèàëû ïðèðîäíîãî è ñèíòå- òè÷åñêîãî ïðîèñõîæäåíèÿ. Òàêèå ïîëèìåðû ïðîÿâèëè âûñîêóþ ýôôåêòèâíîñòü â äîñòàâêå ÄÍÊ â êëåòêè æèâîòíûõ, îäíàêî ðàñòèòåëüíûå êëåòêè îêàçàëèñü ìàëî÷óâñòâèòåëüíûìè ê èõ äåéñòâèþ. Îïèñàííûé íà- ìè ìåòîä ãåíåòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè ïðîòîïëàñ- òîâ ìõà Ceratodon purpureus (Hedw.) Brid. îñíîâàí íà èñïîëüçîâàíèè íîâûõ ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûõ ïî- ëèìåðíûõ íîñèòåëåé êîíòðîëèðóåìîé äëèíû è çà- ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2014. Ò. 48. ¹ 6 9 Ãåíåòè÷íà òðàíñôîðìàö³ÿ ìîõó Ñeratodon purpureus çà äîïîìîãîþ íîâèõ ïîë³êàò³îííèõ íîñ³¿â ÄÍÊ ðÿäà, ñîäåðæàùèõ öåïè ïîëèÄÌÀÅÌ. Ýòîò ìåòîä ïîçâîëÿåò ïîëó÷èòü áîëüøå òðàíçèåíòíûõ è ñòà- áèëüíûõ òðàíñôîðìàíòîâ ìõà èç ðàñ÷åòà íà ìèêðî- ãðàìì ïëàçìèäíîé ÄÍÊ ïî ñðàâíåíèþ ñ èçâåñò- íûì ïðîòîêîëîì, êîòîðûé áàçèðóåòñÿ íà èñïîëüçî- âàíèè ïîëèýòèëåíãëèêîëÿ. Ìåòîä ÿâëÿåòñÿ ïðîñòûì, áîëåå óäîáíûì è äåøåâûì, ÷åì ìåòîä «ãåííîé ïóø- êè». Ðàññìàòðèâàþòñÿ ïåðñïåêòèâû äàëüíåéøåãî ñî- âåðøåíñòâîâàíèÿ ñòðóêòóðû è ôóíêöèîíàëüíûõ õà- ðàêòåðèñòèê íîâûõ íîñèòåëåé äëÿ äîñòàâêè ãåíå- òè÷åñêîãî ìàòåðèàëà â êëåòêè ðàñòåíèé. ÑÏÈÑÎÊ Ë²ÒÅÐÀÒÓÐÈ 1. Hefferon K.L. Transgenic plants and biotechnolo- gy // Encyclopedia of Life Sciences Support Sys- tems. – UNESCO, Eolss Publishers, Oxford, UK, 2007. http://www.eolss.net. 2. Barampuram S., Zhang Z.J. Recent advances in plant transformation // Meth. Mol. Biol. – 2011. – 701. – Ð. 1–35. 3. Chung S.-M., Vaidya M., Tzfira T. Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria // Trends Plant Sci. – 2006. – 11, ¹ 1. – Ð. 1–4. 4. Rivera A.L., Gómez-Lim M., Fernández F., Loske A.M. Physical methods for genetic plant transformation // Phys. Life Rev. – 2012. – 9, ¹ 3. – Ð. 308– 345. 5. Fu Y.-Q., Li L.-H., Wang P.-W. et al. Delivering DNA into plant cell by gene carriers of ZnS nanoparticles // Chem. Res. Chinese Univ. – 2012. – 28, ¹ 4. – P. 672–676. 6. Áóðëàêà Î.Ì., ϳðêî ß.Â., ªìåöü À.²., Áëþì ß.Á. Ãåíåòè÷íà òðàíñôîðìàö³ÿ ðîñëèí çà äîïîìîãîþ âóãëåöåâèõ íàíîòðóáîê ÿê íîâèé íàïðÿìîê ó íàíîá³îòåõíîëî㳿 // Íàíîñòðóêòóðíîå ìàòåðèàëî- âåäåíèå. – 2011. – ¹ 2. – Ñ. 84–101. 7. Jäger M., Schubert S., Ochrimenko S. et al. Branched and linear poly(ethylene imine)-based conjugates: syn- thetic modification, characterization, and application // Chem. Soc. Rev. – 2012. – 41. – P. 4755–4767. 8. Kasyanenko N.A., Lysyakova L.A., Dribinskii B.A. et al. DNA-polymer complexes for gene therapy // Poly- mer Sci., Ser. C. – 2012. – 54, ¹ 1. – P. 57–68. 9. Foillard S., Zuber G., Doris E. Polyethylenimine- carbon nanotube nanohybrids for siRNA-mediated gene silencing at cellular level // Nanoscale Res. Lett. – 2011. – 3. – P. 1461–1464. 10. Zhang S., Zhao Y., Zhao B., Wang B. Hybrids of nonviral vectors for gene delivery // Bioconjug. Chem. – 2010. – 21, ¹ 6. – P. 1003–1009. 11. Zaichenko A., Mitina N., Shevchuk O. et al. Development of novel linear, block and branched oligoelectrolytes and functionally targeting nanoparticles // Pure Appl. Chem. – 2008. – 80, ¹ 11. – P. 2309–2326. 12. Ô³íþê Í.C., ³òàê Ò.ß., ̳ò³íà Í.ª. òà ³í. Óòâî- ðåííÿ ïîë³ïëåêñ³â íîâèìè ïîâåðõíåâî-àêòèâíè- ìè ãðåáåíåïîä³áíèìè ïîë³àìôîë³òàìè ³ ïëàç- ì³äíîþ ÄÍÊ // Á³îòåõíîëîã³ÿ. – 2012. – 5, ¹ 6. – C. 66–72. 13. Ficen S.Z., Guler Z., Mitina N. et al. Biophysical stu- dy of novel oligoelectrolyte based non-viral gene delivery systems to mammalian cells // J. Gene Med. – 2013. – 15, ¹ 5. – P. 193–204. 14. Filyak Ye., Finiuk N., Mitina N. et al. A novel method for genetic transformation of yeast cells using oligoelectrolyte polymeric nanoscale carriers// BioTechniques. – 2013. – 54, ¹ 1. – P. 35–43. 15. Cuming A.C. Mosses as model organisms for deve- lopment, cellular, and molecular biology // Bryo- phyte Biology / Ed. B. Goffinet, A.J. Shaw. – Cam- bridge : Univ. Press, 2008. – P. 199–236. 16. Cove D., Bezanilla M., Harries P., Quatrano R. Mosses as a model system for the study of metabolism and development // Annu. Rev. Plant Biol. – 2006. – 57. – P. 497–520. 17. Frank W., Decker E.L., Reski R. Molecular tools to study Physcomitrella patens // Plant Biol. – 2005. – 7. – P. 220–227. 18. Demkiv O.T., Blume Ya.B., Chaban Ch.I., Khorkavtsiv Ya.D. The growth movements of moss protonemata and arrangement of microtubules // Cell Biol. Int. – 1997. – 21, ¹ 12. – P. 860–861. 19. Rensing S.A., Beike A.K., Land D. Evolutionary im- portance of generative polyploidy for genome evo- lution of haploid-dominant land plants // Plant Ge- nome Diversity. Vol. 2. Physical structure, behaviour and evolution of plant genomes. – Wien : Springer- Verlag, 2013. – P. 295–304. 20. Cove D.J., Quatrano R.S. Agravitropic mutants of the moss Ceratodon purpureus do not complement mutants having a reversed gravitropic response // Plant Cell Environ. – 2006. – 57. – P. 1379–1387. 21. Kamisugi Y., Cuming A.C., Cove D.J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens // Nucl. Acids Res. – 2005. – 33, ¹ 19. – e173. 22. Liu Y.C., Vidali L. Efficient polyethylene glycol (PEG) mediated transformation of the moss Physco- mitrella patens // J. Vis. Exp. – 2011. – 50. doi: 10.3791/2560. 23. Schaefer D., Zryd J.P., Knight C.D., Cove D.J. Stable transformation of the moss Physcomitrella patens // Mol. Gen. Genet. – 1991. – 226. – P. 418–424. 24. Cho S.H., Quatrano R.S., Shin J.S. Transgenesis of Physcomitrella patens // Transgenic Plant J. – 2007. – 1, ¹ 1. – P. 99–103. 25. Cove D.J., Perroud P.F., Charron A.J. et al. Trans- formation of moss Physcomitrella patens gametophy- tes using a biolistic projectile delivery system // Cold ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2014. Ò. 48. ¹ 610 Í.Ñ. Ô³íþê, À.ª. ×àïëÿ, Í.ª. ̳ò³íà òà ³í. Spring Harb. Protoc. – 2009. – ¹ 2. doi: 10.1101/ pdb.emo115. 26. Rosales-Mendoza S., Orellana-Escobedo L., Romero- Maldonado A. et al. The potential of Physcomitrella patens as a platform for the production of plant- based vaccines // Exp. Rev. Vaccines. – 2014. – 13, ¹ 2. – P. 203–212. 27. Jing L., Wenjing Q., Dan S., Zhengquan H. Genetic transformation of moss plant // Afr. J. Biotechnol. – 2013. – 12, ¹ 3. – P. 227–232. 28. Cove D.J., Perroud P.-F., Charron A.J. et al. The moss Physcomitrella patens. A novel model system for plant development and genomic studies // Emerging Model Organisms, a Laboratory Manual. Vol. 1. – New York : Cold Spring Harbor, 2009. – P. 69– 104. 29. Knight C.D., Cove D.J., Cuming A.C., Quatrano R.S. Moss gene technology // Molecular Plant Biology / Eds P.M. Gilmartin, C. Bowler. – Oxford : Univ. Press, 2002. – 2. – P. 285–301. 30. Zou W., Liu C., Chen Z., Zhang N. Preparation and characterization of cationic PLA-PEG nanoparticles for delivery of plasmid DNA // Nanoscale Res. Lett. – 2009. – 4, ¹ 9. – P. 982–992. 31. Zeidler M., Hartmann E., Hughes J. Transgene ex- pression in the moss Ceratodon purpureus // J. Plant Physiol. – 1999. – 154, ¹ 5/6. – P. 641–650. 32. McDaniel S.F., Neubig K.M., Payton A.C. et al. Re- cent gene-capture on the UV sex chromosomes of the moss Ceratodon purpureus // Evolution. – 2013. – 67, ¹ 10. – P. 2811–2822. 33. Trouiller B., Charlot F., Choinard S. et al. Comparison of gene targeting efficiencies in two mosses suggests that it is a conserved feature of Bryophyte transformation // Biotechnol. Lett. – 2007. – 29, ¹ 10. – P. 1591– 1598. Íàä³éøëà 28.02.14 << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /None /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Error /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /DetectCurves 0.0000 /ColorConversionStrategy /CMYK /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedOpenType false /ParseICCProfilesInComments true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams false /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage true /PreserveDICMYKValues true /PreserveEPSInfo true /PreserveFlatness true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts true /TransferFunctionInfo /Apply /UCRandBGInfo /Preserve /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /CropColorImages true /ColorImageMinResolution 300 /ColorImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 1200 /ColorImageDepth -1 /ColorImageMinDownsampleDepth 1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages false /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /CropGrayImages true /GrayImageMinResolution 300 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 1200 /GrayImageDepth -1 /GrayImageMinDownsampleDepth 2 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages false /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /CropMonoImages true /MonoImageMinResolution 1200 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleMonoImages true /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages false /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /CheckCompliance [ /None ] /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile (None) /PDFXOutputConditionIdentifier () /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName () /PDFXTrapped /False /CreateJDFFile false /Description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> /CHS <FEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000410064006f006200650020005000440046002065876863900275284e8e9ad88d2891cf76845370524d53705237300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002> /CHT <FEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef69069752865bc9ad854c18cea76845370524d5370523786557406300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002> /CZE <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> /DAN <FEFF004200720075006700200069006e0064007300740069006c006c0069006e006700650072006e0065002000740069006c0020006100740020006f007000720065007400740065002000410064006f006200650020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e007400650072002c0020006400650072002000620065006400730074002000650067006e006500720020007300690067002000740069006c002000700072006500700072006500730073002d007500640073006b007200690076006e0069006e00670020006100660020006800f8006a0020006b00760061006c0069007400650074002e0020004400650020006f007000720065007400740065006400650020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e0074006500720020006b0061006e002000e50062006e00650073002000690020004100630072006f00620061007400200065006c006c006500720020004100630072006f006200610074002000520065006100640065007200200035002e00300020006f00670020006e0079006500720065002e> /DEU <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> /ESP <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> /ETI <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> /FRA <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> /GRE <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a stvaranje Adobe PDF dokumenata najpogodnijih za visokokvalitetni ispis prije tiskanja koristite ove postavke. Stvoreni PDF dokumenti mogu se otvoriti Acrobat i Adobe Reader 5.0 i kasnijim verzijama.) /HUN <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> /ITA <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> /JPN <FEFF9ad854c18cea306a30d730ea30d730ec30b951fa529b7528002000410064006f0062006500200050004400460020658766f8306e4f5c6210306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103055308c305f0020005000440046002030d530a130a430eb306f3001004100630072006f0062006100740020304a30883073002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d3067958b304f30533068304c3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002> /KOR <FEFFc7740020c124c815c7440020c0acc6a9d558c5ec0020ace0d488c9c80020c2dcd5d80020c778c1c4c5d00020ac00c7a50020c801d569d55c002000410064006f0062006500200050004400460020bb38c11cb97c0020c791c131d569b2c8b2e4002e0020c774b807ac8c0020c791c131b41c00200050004400460020bb38c11cb2940020004100630072006f0062006100740020bc0f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020c774c0c1c5d0c11c0020c5f40020c2180020c788c2b5b2c8b2e4002e> /LTH <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> /LVI <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> /NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken die zijn geoptimaliseerd voor prepress-afdrukken van hoge kwaliteit. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.) /NOR <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> /POL <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> /PTB <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> /RUM <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> /RUS <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> /SKY <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> /SLV <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> /SUO <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> /SVE <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> /TUR <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> /UKR <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> /ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents best suited for high-quality prepress printing. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.) >> /Namespace [ (Adobe) (Common) (1.0) ] /OtherNamespaces [ << /AsReaderSpreads false /CropImagesToFrames true /ErrorControl /WarnAndContinue /FlattenerIgnoreSpreadOverrides false /IncludeGuidesGrids false /IncludeNonPrinting false /IncludeSlug false /Namespace [ (Adobe) (InDesign) (4.0) ] /OmitPlacedBitmaps false /OmitPlacedEPS false /OmitPlacedPDF false /SimulateOverprint /Legacy >> << /AddBleedMarks false /AddColorBars false /AddCropMarks false /AddPageInfo false /AddRegMarks false /ConvertColors /ConvertToCMYK /DestinationProfileName () /DestinationProfileSelector /DocumentCMYK /Downsample16BitImages true /FlattenerPreset << /PresetSelector /MediumResolution >> /FormElements false /GenerateStructure false /IncludeBookmarks false /IncludeHyperlinks false /IncludeInteractive false /IncludeLayers false /IncludeProfiles false /MultimediaHandling /UseObjectSettings /Namespace [ (Adobe) (CreativeSuite) (2.0) ] /PDFXOutputIntentProfileSelector /DocumentCMYK /PreserveEditing true /UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged /UntaggedRGBHandling /UseDocumentProfile /UseDocumentBleed false >> ] >> setdistillerparams << /HWResolution [2400 2400] /PageSize [612.000 792.000] >> setpagedevice

Схожі ресурси