Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59
Проведено сравнительное изучение вирионной ДНК эрвиниофагов 49 и 59 с применением биоинформатического анализа и стандартной рестрикции. Установлено, что геномы обоих фагов циклически пермутированные, однако пермутация ДНК фага 59 является непрерывной, в то время как у фага 49 она носит дискретный ха...
Збережено в:
| Дата: | 2017 |
|---|---|
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2017
|
| Назва видання: | Доповіді НАН України |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126698 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59 / М.А. Златогурская, Ф.И. Товкач // Доповіді Національної академії наук України. — 2017. — № 6. — С. 82-87. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-126698 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1266982017-12-02T03:03:54Z Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59 Златогурская, М.А. Товкач, Ф.И. Біологія Проведено сравнительное изучение вирионной ДНК эрвиниофагов 49 и 59 с применением биоинформатического анализа и стандартной рестрикции. Установлено, что геномы обоих фагов циклически пермутированные, однако пермутация ДНК фага 59 является непрерывной, в то время как у фага 49 она носит дискретный характер. Вирионная ДНК фага 49 имеет аномальный SmaI-сайт, который, в отличие от остальных сайтов для эндонуклеазы SmaI, не подвергается полному гидролизу, что, скорее всего, связано с влиянием ближайшего нуклеотидного окружения. Здійснено порівняльне дослідження віріонної ДНК ервініофагів 49 і 59 за допомогою біоінформатичного аналізу та стандартної рестрикції. Встановлено, що геноми обох фагів циклічно пермутовані, однак пермутація ДНК фага 59 є неперервною, тоді як у фага 49 вона має дискретний характер. Віріонна ДНК фага 49 має аномальний SmaI-сайт, який не піддається повному гідролізу, що, найімовірніше по'язано з впливом найближчого нуклеотидного оточення. A comparative study of virion DNAs of phages 49 and 59 by the standard restriction and bioinformatic analyses is conducted. It has been shown that the genomes of both bacteriophages are cyсlically permuted, but phage 59 is characterized by continuous permutation of the genome, while phage 49 has discrete permutation. Virion DNA of phage 49 has an abnormal cleavage site for SmaI restriction enzyme that, unlike the rest SmaIsites, is not completely hydrolyzed. 2017 Article Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59 / М.А. Златогурская, Ф.И. Товкач // Доповіді Національної академії наук України. — 2017. — № 6. — С. 82-87. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. 1025-6415 DOI: doi.org/10.15407/dopovidi2017.06.082 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126698 578.4:578.81:579.842.1/.2 ru Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Біологія Біологія |
| spellingShingle |
Біологія Біологія Златогурская, М.А. Товкач, Ф.И. Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59 Доповіді НАН України |
| description |
Проведено сравнительное изучение вирионной ДНК эрвиниофагов 49 и 59 с применением биоинформатического анализа и стандартной рестрикции. Установлено, что геномы обоих фагов циклически пермутированные, однако пермутация ДНК фага 59 является непрерывной, в то время как у фага 49 она носит дискретный характер. Вирионная ДНК фага 49 имеет аномальный SmaI-сайт, который, в отличие от остальных
сайтов для эндонуклеазы SmaI, не подвергается полному гидролизу, что, скорее всего, связано с влиянием
ближайшего нуклеотидного окружения. |
| format |
Article |
| author |
Златогурская, М.А. Товкач, Ф.И. |
| author_facet |
Златогурская, М.А. Товкач, Ф.И. |
| author_sort |
Златогурская, М.А. |
| title |
Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59 |
| title_short |
Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59 |
| title_full |
Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59 |
| title_fullStr |
Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59 |
| title_full_unstemmed |
Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59 |
| title_sort |
геномика и структура вирионных днк умеренных эрвиниофагов 49 и 59 |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2017 |
| topic_facet |
Біологія |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126698 |
| citation_txt |
Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59 / М.А. Златогурская, Ф.И. Товкач // Доповіді Національної академії наук України. — 2017. — № 6. — С. 82-87. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT zlatogurskaâma genomikaistrukturavirionnyhdnkumerennyhérviniofagov49i59 AT tovkačfi genomikaistrukturavirionnyhdnkumerennyhérviniofagov49i59 |
| first_indexed |
2025-07-09T05:34:14Z |
| last_indexed |
2025-07-09T05:34:14Z |
| _version_ |
1837146316330762240 |
| fulltext |
82 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 6
ОПОВІДІ
НАЦІОНАЛЬНОЇ
АКАДЕМІЇ НАУК
УКРАЇНИ
БІОЛОГІЯ
Ввиду стремительного развития технологий секвенирования анализ первичной последо-
вательности геномов становится незаменимым для современной классификации вирусов
прокариот, понимания их эволюции и молекулярных основ фаговой физиологии, а также
характера их взаимодействия с бактериями-хозяевами [1]. Однако традиционные методы
секвенирования не позволяют установить такие аспекты структурной организации моле-
кулы ДНК батериофага, как природа концевых последовательностей, наличие и характер
пермутации, метилирование нуклеотидов [2]. В связи с этим изучение вирионной ДНК
требует комбинации различных подходов и методов исследования.
Автономные генетические элементы и особенно вирусы бактерий рода Erwinia описы-
ваются редко, а информация о их свойствах является крайне ограниченной, несмотря на ог-
ромную практическую значимость этих фитопатогенных бактерий.
Ранее были обнаружены три эрвиниофага — 49, 59 и Е105. Два из них, 49 и 59, пред-
ставляют собой умеренные фаги, способные лизировать и лизогенизировать клетки фи-
топатогенной бактерии Erwinia “horticola” [3]. Последующие исследования показали, что
их геномы характеризуются значительной степенью гомологии, относящейся в основном к
структурным полипептидам капсида и хвостового отростка [4]. Для вирионной ДНК фага
© М.А. Златогурская, Ф.И. Товкач, 2017
doi: https://doi.org/10.15407/dopovidi2017.06.082
УДК 578.4:578.81:579.842.1/.2
М.А. Златогурская1, Ф.И. Товкач 2
1 Одесский национальный университет им. И.И. Мечникова
2 Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
E-mail: zlatohurska@gmail.com
Геномика и структура вирионных ДНК
умеренных эрвиниофагов 49 и 59
Представлено членом-корреспондентом НАН Украины Ф.И. Товкачем
Проведено сравнительное изучение вирионной ДНК эрвиниофагов 49 и 59 с применением биоинформатичес-
кого анализа и стандартной рестрикции. Установлено, что геномы обоих фагов циклически пермутирован-
ные, однако пермутация ДНК фага 59 является непрерывной, в то время как у фага 49 она носит дискрет-
ный характер. Вирионная ДНК фага 49 имеет аномальный SmaI-сайт, который, в отличие от остальных
сайтов для эндонуклеазы SmaI, не подвергается полному гидролизу, что, скорее всего, связано с влиянием
ближайшего нуклеотидного окружения.
Ключові слова: бактериофаги 49 и 59, рестрикционный анализ, биоинформатический анализ, headful-ме-
ха низм упаковки, циклическая и дискретная пермутация.
83ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 6
Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59
59 был установлен непрерывный характер кольцевой перестановки нуклеотидов и конце вая
избыточность в 2,2 %. Геном фага 49 предположительно является циклически пермутиро-
ванным и его пермутация, скорее всего, имеет дискретный характер [4, 5]. При анализе пер-
вичной последовательности ДНК нам не удалось получить подтверждение этим фактам.
В связи с вышеизложенным цель исследования состояла в изучении структуры вири он-
ной ДНК, а также осуществлении предварительного сравнения геномов эрвиниофагов 49 и
59 на основе данных геномики и рестрикционного анализа.
В исследовании использовали ДНК умеренных бактериофагов 49 и 59 E. “horticla”. Вы-
де ление ДНК и рестрикционный анализ проведены на основе схемы, описанной в работе
[4]. Применяли следующие эндонуклеазы рестрикции: HpaI, EcoRI, SmaI, SalI, KpnI, XhoI,
DraI и BglII.
Первичная последовательность генома установлена с использованием технологии Illu-
mi na Solexa. Анализ и визуализация данных секвенирования осуществлялись с помощью
следу ющих программ: анализ ГЦ-состава нуклеотидных последовательностей — DNA/RNA
GC Content Calculator, поиск открытых рамок считывания – GLIMMER, GeneMark.hmm
2.0, поиск сайтов рестрикции — A plasmid editor, попарное выравнивание нуклеотидных пос-
ледовательностей геномов – mVista, CG view, поиск тРНК — tRNAscan-SE, ARAGORN, дот-
плот сравнение геномов — PipeAlign. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных после-
довательностей относительно референтных геномов, генов и аминокислот баз NCBI про-
водилось с помощью инструментов BLASTn и BLASTp
Исходя из предварительного биоинформатического анализа ДНК, фаг 49 имеет геном
размером 46,8 тыс. п. н., для фага 59 этот показатель составляет 48,1 тыс. п. н., что хорошо
согласуется с данными предыдущих исследований [4]. Содержание ГЦ-пар является при-
близительно одинаковым для обоих вирусов и равно около 50 % (таблица). В геноме фага
49 выявлено 84 открытых рамок считывания, что на одну рамку считывания меньше, чем в
геноме фага 59. Количество обнаруженных гипотетических полипептидов составляет 60 и
66 для фага 49 и 59 соответственно.
При сравнении нуклеотидных и аминокислотных последователь ностей не удалось ус та-
но вить наличие гомологичных последовательностей фагов 49, 59 и гено мов референт ных
Рис. 1. Выравнивание после дова тель нос тей
генома бактерио фага 49 к гено му фага 59
Сравнение характеристик
геномов фагов 49 и 59
Характеристика
Фаг
49 59
Размер генома, т. п. н. 46,8 48,1
ГЦ-состав, % 50,8 50,5
Открытые рамки считывания 84 85
Гипотетические полипептиды 60 66
тРНК — тРНКarg
84 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 6
М.А. Златогурская, Ф.И. Товкач
бакте риофагов, пред ставленных в базе данных NCBI. В то же время между собой эрвинио-
фаги показали 47 % гомологии первичной последовательности нуклеотидов (pис. 1). Этот
факт также согласуется с данными предыдущих исследований, в которых с помощью блот-
гиб ри ди зации установлено 50 % гомологии ДНК этих фагов [6]. При сравнении геномов
эрвиниофагов обнаружено 30 идентичных генов, которые, скорее всего, кодируют структур-
ные белки головки и некоторые регуляторные полипептиды. У обоих фагов кодирующими
являются как плюс-, так и минус-цепь. Кроме того, ДНК фага 59 несет ген тРНК, коди-
рующий аргинин.
Были подтверждены данные предыдущих исследований относительно циклической
пермутации вирионной ДНК бактериофагов 49 и 59 [4, 5]. Наличие дополнительных фраг-
ментов в гидролизной смеси было характерным для вирионных ДНК и отличало их от та-
ковых, полученных in silico (рис. 2.). Мы предположили, что гетерогенный фрагмент “а” и
субмолярный фрагмент “b” при SmaI-гидролизе вирионной ДНК фага 59 происходит от ге-
терогенных концов молекул ДНК и рас-сайта (см. рис. 2, І, а). Такой рестрикционный про-
филь указывает на непрерывный характер пермутации генома фага 59, а также упаковку
вирионной ДНК по headful-механизму [4]. Эрвиниофаг 49, очевидно, упаковывает ДНК по
Рис. 2. І: а — SmaI-гидролиз вирионной ДНК фага 59. М1 — HindIII фрагменты ДНК бактериофага λ;
б — SmaI-сайты в геномной ДНК фага 59. ІІ: а — KpnI-гидролиз вирионной ДНК фага 49. М2 — λ Mix Mar-
ker, 19 (“Fermentas”, США); б — KpnI-сайты в геномной ДНК фага 49. а, b — дополнительные фраг менты
85ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 6
Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59
аналогичной схеме, однако пермутация его генома имеет дискретный характер. Об этом
свидетельствует как отсуствие гетерогенных концевых фрагментов, так и наличие двух
субмолярных фрагментов “a” и “b” при KpnI-гидролизе (см. рис. 2, ІІ, а).
Еще один “аномальный” фрагмент обнаружен при электрофоретическом разделении
продуктов двойного гидролиза ДНК фага 49 эндонуклеазами KpnI и XhoI. Так как данный
субмолярный фрагмент размером 11 тыс. п. н. не исчезал при увеличении концентрации
рестриктаз, он, скорее всего, является рас-фрагментом, образованным ДНК паказой и ре-
стриктазой. Аналогично фагу 59 аномальные фрагменты также не обнаруживались при
изучении первичной последовательности нуклеотидов геномной ДНК фага 49, полученной
традиционным методом секвенирования.
В ДНК фага 49 выявлен необычный сайт, который в стандартных условиях не под-
вергался полному расщеплению рестриктазой SmaI, о чем может свидетельствовать до пол-
нительный фрагмент “А*” размером около 18 тыс. п. н. (рис. 3, а, б). Для установления проис-
хождения этого “аномального” фрагмента применили две стратегии: удлинение времени
реакции гидролиза ДНК и увеличение концентрации фермента. Как следует из рис. 3, а,
по мере увеличения концентрации рестриктазы интенсивность свечения на электрофо-
рег рам ме “аномального” фрагмента уменьшалась вплоть до полного исчезновения полосы
при десятикратной концентрации эндонуклеазы. В то же время пропорционально увеличи-
Рис. 3. Влияние концентрации фермента (а) и элонгации инкубации (б) на SmaI-рестрикционный па терн
вирионной ДНК фага 49. А* — “аномальный” фрагмент. в — SmaI-сайты рестрикции геномной ДНК фага
49; * — “аномальный” сайт
86 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 6
М.А. Златогурская, Ф.И. Товкач
валась интенсивность фрагментов B и C размером 11 и 7 тыс. п. н. соответственно. Схо-
жий эффект наблюдался при увеличении времени реакции, хотя полного гидролиза данно-
го фрагмента после 24 ч инкубации реакционной смеси так и не удалось достичь.
Подобные аномальные сайты связывают как с наличием частичного метелирования, так
и со специфическим влиянием ближайшего нуклеотидного окружения [7, 9]. Последующий
геномный анализ показал, что этот сайт находится между двумя прямыми повторами ну-
клеотидов размером 16 пар оснований, которые по своей структуре напоминают промотор-
ные участки фага λ [8]. Возможно, такое ближайшее окружение сайта физически влияет на
его доступность действию рестриктазы. Кроме того, ряд необычных сайтов также был обна-
ружен при DraI-гидролизе ДНК фагов 49 и 59, объяснить природу которых пока не пред-
ставляется возможным.
Таким образом, сравнительный анализ сайтов рестрикции с использованием традици-
онного и биоинформатического подходов достоверно показал, что геномы эрвиниофагов 49
и 59 являются циклически пермутированными. Обнаруженная пермутация имеет непре-
рывный характер в случае вирионной ДНК фага 59 и дискретный — для ДНК фага 49.
Предварительные геномные исследования свидетельствуют о достаточно большой гомо-
логии геномов, составляющей 47 % и коррелирующей с ранее полученными данными.
Наличие аномальных сайтов рестрикции указывает на существенное различие между ре-
альной структурой вирионной ДНК и первичной нуклеотидной последовательностью ге-
номов, полученной с использованием классических методов секвенирования. Умеренные
бактериофаги 49 и 59 фитопатогенных энтеробактерий неидентичны другим известным ви-
русам и принадлежат к уникальным фагам семейства Siphoviridae.
Авторы выражают благодарность PhD A. Kroponski (University of Guelph, Канада) за по-
мощь в сборке фаговых геномов.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Ackermann H.W., Kropinski A.M. Curated list of prokaryote viruses with fully sequenced genomes. Res
Microbiol. 2007. 158, № 7. Р. 555—566.
2. Sherwood R., Сasjens S.R., Gilcrease E.B. Determining DNA packaging strategy by analysis of the termini of
the chromosomes in tailed-bacteriophage virions. Meth. Mol. Biol. 2009. 502. P. 91—111.
3. Товкач Ф.И., Григорян Ю.А., Рубан В.И., Кишко Я.Г. Сравнительная характеристика умеренных фагов
Erwinia caratovora 268. Мікробіол. журн. 1985. 47, № 1. С. 59—64.
4. Товкач Ф.И., Шевченко Т.В., Горб Т.Е., Муквич Н.С., Романюк Л.В. Сравнительное изучение свойств
умеренных эрвиниофагов 49 и 59. Мікробіол. журн. 2002. 64, № 2. С. 65—81.
5. Товкач Ф.И., Григорян Ю.А., Рубан В.И., Данилейченко В.В., Кишко Я.Г. Рестрикционная карта перму-
тированной ДНК умеренного бактериофага 59 Erwinia caratovora. Мол. генетика, микробиология и виру-
сология. 1988. 1. С. 20—24.
6. Кишко Я.Г., Григорян Ю.А., Товкач Ф.И., Рубан В.И., Машковский Н.Н. Изучение гомологии умерен-
ных вирусов полилизогенной культуры Erwinia caratovora. Докл. АН СССР. 1984. 277, № 5. С. 1250—
1251.
7. McClelland M., Nelson M., Raschke E. Effect of site-specific modification on restriction endonucleases and
DNA modification methyltransferases. Nucleic Acids Res. 1994. 22, № 17. P. 3640—3659.
8. Ptashne M. A Genetic Switch: Phage Lambda. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004. 155 p.
9. Armstrong K., Bauer W.R. Preferential site-dependent cleavage by restriction endonuclease PstI. Nucleic Acids
Res. 1982. 10, № 3. P. 993—1007.
Поступило в редакцию 16.02.2017
87ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 6
Геномика и структура вирионных ДНК умеренных эрвиниофагов 49 и 59
REFERENCES
1. Ackermann, H. W. & Kropinski, A. M. (2007). Curated list of prokaryote viruses with fully sequenced genomes.
Res Microbiol., 158, No. 7, pp. 555-566.
2. Sherwood, R., Сasjens, S. R. & Gilcrease, E. B. (2009). Determining DNA packaging strategy by analysis of the
termini of the chromosomes in tailed-bacteriophage virions. Meth. Mol. Biol., 502, pp. 91-111.
3. Tovkach, F. I., Grigoryan, Yu. A., Ruban, V. I. & Kishko, Ya. G. (1985). Comparative description of temperate
phages Erwinia carotovora 268. Microbiol Zh., 47, No. 1, pp. 59-64 (in Russian).
4. Tovkach, F. I., Shevchenko, T. V., Gorb, T. E., Mukvich, N. S. & Romanyuk, L. V. (2002). Comparative study of
properties of temperate erwiniophages 49 and 59. Microbiol Zh., 64, No. 2, pp. 65-81(in Russian).
5. Tovkach, F. I., Grigoryan, Yu. A., Ruban, V. I., Danileichenko, V. V. & Kishko, Ya. G. (1988). Restriction map of
permutants DNA of temperate bacteriophage 59 Erwinia carotovora. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol., 1, pp.
20–24 (in Russian).
6. Kishko, Ya. G., Grigoryan, Yu. A., Tovkach, F. I., Ruban, V. I. & Mashkovsky, N. N. (1984). Study of homology
of temperate viruses of polylysogenic culture Erwinia carotovora. Dokl. AN SSSR, 277, No. 5, pp. 1250-1251
(in Russian).
7. McClelland, M., Nelson, M. & Raschke, E. (1994). Effect of site-specific modification on restriction endo-
nucleases and DNA modification methyltransferases. Nucleic Acids Res., 22, No. 17, pp. 3640-3659.
8. Ptashne, M. A (2004). Genetic Switch: Phage Lambda. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
9. Armstrong, K. & Bauer, W. R. (1982). Preferential site-dependent cleavage by restriction endonuclease PstI.
Nucleic Acids Res., 10, No. 3, pp. 993-1007.
Received 16.02.2017
М.А. Златогурська1, Ф.І. Товкач 2
1 Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова
2 Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ
E-mail: zlatohurska@gmail.com
ГЕНОМІКА І СТРУКТУРА ВІРІОННИХ ДНК
ПОМІРНИХ ЕРВІНІОФАГІВ 49 І 59
Здійснено порівняльне дослідження віріонної ДНК ервініофагів 49 і 59 за допомогою біоінформатичного
аналізу та стандартної рестрикції. Встановлено, що геноми обох фагів циклічно пермутовані, однак пер-
мутація ДНК фага 59 є неперервною, тоді як у фага 49 вона має дискретний характер. Віріонна ДНК фага
49 має аномальний SmaI-сайт, який не піддається повному гідролізу, що, найімовірніше по'язано з впли-
вом найближчого нуклеотидного оточення.
Ключові слова: бактеріофаги 49 і 59, рестрикційний аналіз, біоінформатичний аналіз, headful-механізм
упаковки, циклічна та дискретна пермутація.
M.A. Zlatohurska1, F.I. Tovkach 2
1 Mechnikov Odessa National University
2 Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of the NAS of Ukraine, Kiev
E-mail: zlatohurska@gmail.com
GENOMICS AND VIRION DNA STRUCTURE
OF TEMPERATE ERWINIOPHAGES 49 AND 59
A comparative study of virion DNAs of phages 49 and 59 by the standard restriction and bioinformatic ana-
lyses is conducted. It has been shown that the genomes of both bacteriophages are cyсlically permuted, but
phage 59 is characterized by continuous permutation of the genome, while phage 49 has discrete permutation.
Virion DNA of phage 49 has an abnormal cleavage site for SmaI restriction enzyme that, unlike the rest SmaI-
sites, is not completely hydrolyzed.
Keywords: bacteriophages 49 and 59, restriction analysis, bioinformatic analysis, headful packaging mecha nism,
circular and discrete permutation.
|