Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью
В работе исследовано состояние биоконструкций на основе криоконсервированных клеток фетальной печени (КФП), заселенных в макропористые альгинат-желатиновые матрицы (АЖМ), и их влияние на структуру печени после имплантации крысам с печеночной недостаточностью. В качестве носителей КФП крыс примен...
Збережено в:
| Дата: | 2014 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2014
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/134507 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью / Д.В. Грицай, А.С. Лебединский, О.В. Оченашко, Ю.А. Петренко, В.В. Волина, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 4. — С. 292–301. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-134507 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1345072018-06-14T03:03:52Z Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью Грицай, Д.В. Лебединский, А.С. Оченашко, О.В. Петренко, Ю.А. Волина, В.В. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. Теоретическая и экспериментальная криобиология В работе исследовано состояние биоконструкций на основе криоконсервированных клеток фетальной печени (КФП), заселенных в макропористые альгинат-желатиновые матрицы (АЖМ), и их влияние на структуру печени после имплантации крысам с печеночной недостаточностью. В качестве носителей КФП крыс применяли широкопористые криогелевые АЖМ. Дополнительная альгинатная оболочка, сформированная вокруг АЖМ, предотвращала заселение матриц клетками реципиента in vivo и не влияла на жизнеспособность и экспансию КФП in vitro. Структура биоконструкции при имплантации сохранялась не менее 28 суток. Экспериментальное повреждение печени у крыс моделировали путем введения ингибитора пролиферации гепатоцитов 2-ацетиламинофлуорена в сочетании с частичной гепатэктомией, что вызывало выраженные изменения структуры органа в виде нарушения трабекулярного строения паренхимы и дуктулярной реакции в портальной и перипортальной зонах. Имплантация АЖМ с альгинатной оболочкой, содержащих КФП, в сальник крыс с экспериментальной печеночной недостаточностью приводила к органотипическому восстановлению структуры патологически измененной печени. Показано, что альгинатная оболочка вокруг АЖМ обеспечивает изоляцию заселенных клеток, а КФП, заселенные в широкопористые АЖМ, оказывают терапевтический эффект при имплантации животным с печеночной недостаточностью. У роботі досліджено стан біоконструкцій на основі кріоконсервованих клітин фетальної печінки (КФП), заселених у макропористі альгінат-желатинові матриці (АЖМ), та їх вплив на структуру печінки після імплантації щурам із печінковою недостатністю. В якості носіїв КФП щурів застосовували широкопористі кріогелеві АЖМ. Додаткова альгінатна оболонка, яка сформувалася навколо АЖМ, запобігала заселенню матриць клітинами реціпієнта in vivo та не впливала на життєздатність та експансію КФП in vitro. Структура біоконструкції при імплантації зберігалась не менш 28 діб. Експериментальне ураження печінки у щурів моделювали шляхом введення інгібітору проліферації гепатоцитів 2-ацетіламінофлуорена в поєднанні з частковою гепатектомією, що викликало виражені зміни структури органа у вигляді порушення трабекулярної будови паренхіми і дуктулярної реакції в портальній та перипортальній зонах. Імплантація АЖМ з альгінатною оболонкою, що містили КФП, у сальник щурів експериментальною печінковою недостатністю приводила до органотіпового відновлення структури патологічно зміненої печінки. Показано, що альгінатна оболонка навколо АЖМ забезпечує ізоляцію заселених клітин, а КФП, заселені в широкопористі АЖМ, надають терапевтичний ефект при імплантації тваринам із печінковою недостатністю. The study demonstrates the state of bioconstructs based on cryopreserved fetal liver cells (FLC), seeded into macroporous alginate-gelatin matrices (AGM), as well as the effect of the bioconstructs implantation on the liver structure in hepatic failure rat models. As carriers for rat FLC the wide-porous cryogel AGM were applied. The additional alginate capsule formed around the AGM prevented the colonization of matrices by the recipient cells in vivo and did not affect the viability and expansion of FLC in vitro. The structure of bioconstructs was maintained during at least 28 days post implantation. The experimental liver damage in rats was modeled by the injection of the hepatocyte proliferation inhibitor 2-acetylaminofluorene together with the partial hepatectomy, that led to pronounced changes in liver structure (disorderin of trabecular structure of the parenchyma and ductular reaction within the portal and periportal areas). The implantation of FLC-seeded AGM additionally covered by the alginate shell into greater omentum of rats with hepatic failure led to organotypic recovery of pathologically altered liver structure. It was shown that the alginate capsule around the AGM provided isolation for seeded cells, and FLC within the wide-porous AGM had a therapeutic effect when implanted in rats with liver failure. 2014 Article Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью / Д.В. Грицай, А.С. Лебединский, О.В. Оченашко, Ю.А. Петренко, В.В. Волина, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 4. — С. 292–301. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/134507 612.647.035:664.644.7:616.36-002-092.9 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Грицай, Д.В. Лебединский, А.С. Оченашко, О.В. Петренко, Ю.А. Волина, В.В. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
В работе исследовано состояние биоконструкций на основе криоконсервированных клеток фетальной печени
(КФП), заселенных в макропористые альгинат-желатиновые матрицы (АЖМ), и их влияние на структуру печени после имплантации
крысам с печеночной недостаточностью. В качестве носителей КФП крыс применяли широкопористые криогелевые
АЖМ. Дополнительная альгинатная оболочка, сформированная вокруг АЖМ, предотвращала заселение матриц клетками
реципиента in vivo и не влияла на жизнеспособность и экспансию КФП in vitro. Структура биоконструкции при имплантации
сохранялась не менее 28 суток. Экспериментальное повреждение печени у крыс моделировали путем введения ингибитора
пролиферации гепатоцитов 2-ацетиламинофлуорена в сочетании с частичной гепатэктомией, что вызывало выраженные изменения
структуры органа в виде нарушения трабекулярного строения паренхимы и дуктулярной реакции в портальной и перипортальной
зонах. Имплантация АЖМ с альгинатной оболочкой, содержащих КФП, в сальник крыс с экспериментальной
печеночной недостаточностью приводила к органотипическому восстановлению структуры патологически измененной
печени. Показано, что альгинатная оболочка вокруг АЖМ обеспечивает изоляцию заселенных клеток, а КФП, заселенные
в широкопористые АЖМ, оказывают терапевтический эффект при имплантации животным с печеночной недостаточностью. |
| format |
Article |
| author |
Грицай, Д.В. Лебединский, А.С. Оченашко, О.В. Петренко, Ю.А. Волина, В.В. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. |
| author_facet |
Грицай, Д.В. Лебединский, А.С. Оченашко, О.В. Петренко, Ю.А. Волина, В.В. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. |
| author_sort |
Грицай, Д.В. |
| title |
Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью |
| title_short |
Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью |
| title_full |
Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью |
| title_fullStr |
Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью |
| title_full_unstemmed |
Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью |
| title_sort |
структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2014 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/134507 |
| citation_txt |
Структурное состояние печени после имплантации макропористых матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью / Д.В. Грицай, А.С. Лебединский, О.В. Оченашко, Ю.А. Петренко, В.В. Волина, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 4. — С. 292–301. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT gricajdv strukturnoesostoâniepečeniposleimplantaciimakroporistyhmatricskriokonservirovannymikletkamifetalʹnojpečenikrysamséksperimentalʹnojpečenočnojnedostatočnostʹû AT lebedinskijas strukturnoesostoâniepečeniposleimplantaciimakroporistyhmatricskriokonservirovannymikletkamifetalʹnojpečenikrysamséksperimentalʹnojpečenočnojnedostatočnostʹû AT očenaškoov strukturnoesostoâniepečeniposleimplantaciimakroporistyhmatricskriokonservirovannymikletkamifetalʹnojpečenikrysamséksperimentalʹnojpečenočnojnedostatočnostʹû AT petrenkoûa strukturnoesostoâniepečeniposleimplantaciimakroporistyhmatricskriokonservirovannymikletkamifetalʹnojpečenikrysamséksperimentalʹnojpečenočnojnedostatočnostʹû AT volinavv strukturnoesostoâniepečeniposleimplantaciimakroporistyhmatricskriokonservirovannymikletkamifetalʹnojpečenikrysamséksperimentalʹnojpečenočnojnedostatočnostʹû AT volkovana strukturnoesostoâniepečeniposleimplantaciimakroporistyhmatricskriokonservirovannymikletkamifetalʹnojpečenikrysamséksperimentalʹnojpečenočnojnedostatočnostʹû AT petrenkoaû strukturnoesostoâniepečeniposleimplantaciimakroporistyhmatricskriokonservirovannymikletkamifetalʹnojpečenikrysamséksperimentalʹnojpečenočnojnedostatočnostʹû |
| first_indexed |
2025-07-09T20:58:57Z |
| last_indexed |
2025-07-09T20:58:57Z |
| _version_ |
1837204497660641280 |
| fulltext |
УДК 612.647.035:664.644.7:616.36-002-092.9
Д.В. Грицай, А.С. Лебединский, О.В. Оченашко,
Ю.А. Петренко, В.В. Волина, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко*
Структурное состояние печени после имплантации макропористых
матриц с криоконсервированными клетками фетальной печени
крысам с экспериментальной печеночной недостаточностью
UDC 612.647.035:664.644.7:616.36-002-092.9
D.V. Gritsay, A.S.Lebedinskiy, O.V. Ochenashko,
Yu.A. Petrenko, V.V. Volina, N.A. Volkova, A.Yu. Petrenko*
Liver Structure in Rats with Experimental Hepatic Failure
Following Implantation of Macroporous Carrier Seeded
with Cryopreserved Fetal Liver Cells
Реферат: В работе исследовано состояние биоконструкций на основе криоконсервированных клеток фетальной печени
(КФП), заселенных в макропористые альгинат-желатиновые матрицы (АЖМ), и их влияние на структуру печени после имп-
лантации крысам с печеночной недостаточностью. В качестве носителей КФП крыс применяли широкопористые криогелевые
АЖМ. Дополнительная альгинатная оболочка, сформированная вокруг АЖМ, предотвращала заселение матриц клетками
реципиента in vivo и не влияла на жизнеспособность и экспансию КФП in vitro. Структура биоконструкции при имплантации
сохранялась не менее 28 суток. Экспериментальное повреждение печени у крыс моделировали путем введения ингибитора
пролиферации гепатоцитов 2-ацетиламинофлуорена в сочетании с частичной гепатэктомией, что вызывало выраженные изме-
нения структуры органа в виде нарушения трабекулярного строения паренхимы и дуктулярной реакции в портальной и пе-
рипортальной зонах. Имплантация АЖМ с альгинатной оболочкой, содержащих КФП, в сальник крыс с экспериментальной
печеночной недостаточностью приводила к органотипическому восстановлению структуры патологически измененной
печени. Показано, что альгинатная оболочка вокруг АЖМ обеспечивает изоляцию заселенных клеток, а КФП, заселенные
в широкопористые АЖМ, оказывают терапевтический эффект при имплантации животным с печеночной недостаточностью.
Ключевые слова: печень, альгинат-желатиновые матрицы, криоконсервированные клетки фетальной печени,
эспериментальная печеночная недостаточность, имплантация.
Реферат: У роботі досліджено стан біоконструкцій на основі кріоконсервованих клітин фетальної печінки (КФП), заселених
у макропористі альгінат-желатинові матриці (АЖМ), та їх вплив на структуру печінки після імплантації щурам із печінковою
недостатністю. В якості носіїв КФП щурів застосовували широкопористі кріогелеві АЖМ. Додаткова альгінатна оболонка,
яка сформувалася навколо АЖМ, запобігала заселенню матриць клітинами реціпієнта in vivo та не впливала на життє-
здатність та експансію КФП in vitro. Структура біоконструкції при імплантації зберігалась не менш 28 діб. Експериментальне
ураження печінки у щурів моделювали шляхом введення інгібітору проліферації гепатоцитів 2-ацетіламінофлуорена в поєднанні
з частковою гепатектомією, що викликало виражені зміни структури органа у вигляді порушення трабекулярної будови
паренхіми і дуктулярної реакції в портальній та перипортальній зонах. Імплантація АЖМ з альгінатною оболонкою, що міс-
тили КФП, у сальник щурів експериментальною печінковою недостатністю приводила до органотіпового відновлення структу-
ри патологічно зміненої печінки. Показано, що альгінатна оболонка навколо АЖМ забезпечує ізоляцію заселених клітин, а
КФП, заселені в широкопористі АЖМ, надають терапевтичний ефект при імплантації тваринам із печінковою недостатністю.
Ключові слова: печінка, альгінат-желатинові матриці, кріоконсервовані клітини фетальної печінки, експериментальна
печінкова недостатність, імплантація.
Abstract: The study demonstrates the state of bioconstructs based on cryopreserved fetal liver cells (FLC), seeded into macro-
porous alginate-gelatin matrices (AGM), as well as the effect of the bioconstructs implantation on the liver structure in hepatic failure
rat models. As carriers for rat FLC the wide-porous cryogel AGM were applied. The additional alginate capsule formed around the
AGM prevented the colonization of matrices by the recipient cells in vivo and did not affect the viability and expansion of FLC in vitro.
The structure of bioconstructs was maintained during at least 28 days post implantation. The experimental liver damage in rats was
modeled by the injection of the hepatocyte proliferation inhibitor 2-acetylaminofluorene together with the partial hepatectomy, that led
to pronounced changes in liver structure (disorderin of trabecular structure of the parenchyma and ductular reaction within the portal
and periportal areas). The implantation of FLC-seeded AGM additionally covered by the alginate shell into greater omentum of rats with
hepatic failure led to organotypic recovery of pathologically altered liver structure. It was shown that the alginate capsule around the
AGM provided isolation for seeded cells, and FLC within the wide-porous AGM had a therapeutic effect when implanted in rats with
liver failure.
Key words: liver, alginate-gelatin matrices, cryopreserved fetal liver cells, hepatic failure model, implantation.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-41-35, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: alexander_petrenko@cryo.org.ua
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 4135, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: alexander_petrenko@cryo.org.ua
Department of Cryobiochemistry, Institute for Problems of Cryobiol-
ogy and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkov, Ukraine
Отдел криобиохимии, Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 24.06.2014
Принята в печать 23.07.2014
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2014. – Т. 24, №4. – С. 292–301.
© 2014 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received June, 24, 2014
Accepted July, 23, 2014
Probl. Cryobiol. Cryomed. 2014. 24(4): 292–301.
© 2014 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 4, 2014
293
Применение трансплантации изолированных
гепатоцитов для коррекции терминальных стадий
печеночной недостаточности ограничено вслед-
ствие слабого приживления, недостаточной выжи-
ваемости и низкой пролиферативной активности
гепатоцитов [11]. В связи с этим актуальным яв-
ляется поиск альтернативных методов коррекции
печеночной недостаточности с использованием
методов клеточной терапии, в том числе на основе
различных биоинженерных конструкций, способст-
вующих функционированию гепатоцитов, например,
путем заключения их в гидрогелевые микросферы
[3], децеллюляризированные фрагменты печени [9],
макропористые полимерные матрицы [4]. Перс-
пективным является использование в подобных
биоинженерных конструкциях стволовых/прогени-
торных клеток, имеющих высокий пролифера-
тивный потенциал, способных к дифференцировке
в гепатическом направлении [2] и продуцирующих
широкий спектр ростовых факторов и цитокинов.
Существенным преимуществом клеток-предшест-
венников фетальной печени по сравнению со зре-
лыми клетками является их более высокая устой-
чивость к факторам криоконсервирования [3, 8],
что позволяет создавать запас этих клеток, пригод-
ных для трансплантации.
Очевидный исследовательский интерес при
коррекции печеночной недостаточности представ-
ляет структурное состояние биоинженерного имп-
лантата, состоящего из клеточной и матричной,
неклеточной части, а также органа-мишени экспе-
риментальных воздействий – печени крыс.
Нами был описан новый широкопористый но-
ситель клеток на основе альгината и желатина [7].
Установлено, что модификация альгинатной матри-
цы путем ковалентного прикрепления желатина (в
качестве якорного сайта) к поверхности стенок пор
способствовала эффективной адгезии и пролифера-
ции мезенхимальных стромальных клеток костного
мозга взрослого человека в составе носителя. Во-
прос о способности этих матриц поддерживать рост
гепатических клеток в системах in vitro и in vivo
остается невыясненным.
Целью настоящей работы явилось изучение
состояния биоконструкций, представляющих собой
криоконсервированные клетки фетальной печени,
заселенные в макропористые альгинат-желати-
новые матрицы, и их влияния на структуру печени
после имплантации крысам с печеночной недоста-
точностью.
Материалы и методы
Объектом исследования служили беспородные
белые крысы. Содержание животных и экспери-
ментальные манипуляции проводили в соответ-
Transplantation of isolated hepatocytes to correct
terminal stages of liver failure is restricted by poor
engraftment, low survival and proliferative activity of
hepatocytes [11]. In this regard, it is important to search
alternative methods of correcting liver failure using
stem cell therapy, including those based on using various
bioengineered structures to facilitate the functioning
of hepatocytes, for example, by encapsulating them
into hydrogel microspheres [2], decellularized liver frag-
ments [9], macroporous polymeric matrix [3]. The use
in such bioengineered constructs of stem/progenitor
cells with a high proliferative potential, capable of dif-
ferentiating in hepatic direction [1], and producing
a wide range of growth factors and cytokines is pro-
mising. A significant advantage of the fetal liver
progenitor cells versus mature cells is their higher
resistance to cryopreservation factors [2, 8], allowing
the establishing of a stock of these cells suitable for
transplantation.
When correcting liver failure the structural state of
bioengineered implant consisting of the cell and matrix,
non-cellular parts, as well as the target organ of expe-
rimental effects, i.e. rat liver is of obvious research
interest.
Previously we have described a new wide-porous
cell carrier based on alginate and gelatin [7]. The
modification of alginate matrix by covalent coupling of
gelatin (as an anchor site) to the surfaces of the pore
wall was established to promote an effective adhesion
and proliferation of adult human bone marrow mesen-
chymal stromal cells within a carrier. However, the
ability of these matrices to support the growth of he-
patic cells in vitro and in vivo remains unclear.
The aim of this work was to study the state of
bioconstructs representing the cryopreserved fetal liver
cells seeded into macroporous alginate-gelatin matrix,
and their impact on the post-implantation liver structure
in rats with liver failure.
Materials and methods
The research was performed in white rats. The
maintenance and experimental manipulations in animals
were carried out in accordance with the General
Principles in Animal Experiments, approved by the 5th
National Congress in Bioethics (Kiev, 2013) and the
requirements of the Bioethics Committee of the
IPC&C of the National Academy of Sciences of
Ukraine agreed with the rules of the European Con-
vention for the Protection of Vertebrate Animals Used
for Experimental and Other Scientific Purposes
(Strasbourg, 1986).
Fetal liver cells (FLCs) were isolated from rat fetu-
ses of 15th gestation day (identification of sperm in
female vaginal smears was assumed as the first day
of pregnancy) under sterile conditions by a combined
294 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 4, 2014
ствии с «Общими принципами экспериментов на
животных», одобренными V Национальным кон-
грессом по биоэтике (Киев, 2013) и требованиями
комитета по биоэтике ИПКиК НАН Украины, со-
гласованными с правилами «Европейской конвен-
ции о защите позвоночных животных, используе-
мых для экспериментальных и других научных
целей» (Страсбург, 1986).
Клетки фетальной печени (КФП) выделяли из
плодов крыс 15 суток гестации (выявление спер-
миев в вагинальных мазках самок считали первым
днем беременности) в стерильных условиях ком-
бинированным ферментативно-механическим
методом. Для этого фрагменты печени обраба-
тывали 0,25%-м раствором трипсина в фосфатном
буферном растворе 0,1 М (рН 7,4) в течение 5 мин
при 20°C, затем дезинтегрировали на одиночные
клетки [6]. Показатель жизнеспособности КФП в
первичной суспензии по окрашиванию трипановым
синим составлял (90,6 ± 5,9)%.
Полученную клеточную суспензию криокон-
сервировали по трехэтапной программе заморажи-
вания [10] с начальной скоростью 1 град/мин до
–40°С и сидингом при –7°С со скоростью 10 град/мин
от –40 до –80°С с последующим погружением в
жидкий азот. Хранение клеток осуществляли при
–196°С в условиях низкотемпературного банка
ИПКиК НАН Украины в течение 2–3 месяцев.
Перед экспериментом КФП отогревали, отмы-
вали от криопротектора и оценивали жизнеспособ-
ность, которая для криоконсервированных КФП
составляла (73,0 ± 3,6)% по тесту с окрашиванием
трипановым синим. После этого клетки заселяли
согласно описанному методу [1] в макропористые
альгинат-желатиновые губки (АЖМ) диаметром
5 мм и толщиной 2 мм, полученные методом крио-
тропного структурирования. Средний диаметр пор
такой губки составляет (106,2 ± 39,6) мкм, а порис-
тость – не менее 80% [7]. Вокруг части носителей
формировали дополнительную альгинатную обо-
лочку двукратным последовательным переносом
биоконструкции сначала в 1,2%-й раствор альгина-
та натрия («Sigma», США), приготовленный на
физиологическом растворе (0,15 M NaCl; 25 мM
HEPES; pH 7,4), затем для полимеризации в такой
же физраствор, обогащенный 100 мМ СaCl2.
Клетки фетальной печени в составе макро-
пористых АЖМ культивировали до 14 суток в
среде α-MEM («Sigma»), дополненной 10% эмбрио-
нальной сывороткой крови крупного рогатого скота
(«РАА», Австрия), 2 мМ L-глутамина, 50 ед/мл
пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина при 37°С,
5% СО2 и влажности 95% с заменой среды каж-
дые 3-е суток. Для визуализации КФП в составе
носителя клетки окрашивали флуоресцеина ди-
enzymatic-mechanical method.For this purpose, the
liver fragments were treated with 0.25% trypsin
solution in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) for 5 min
at 20°C, and disintegrated into single cells [5]. The
viability index of FLCs according to trypan blue staining
in a primary suspension made (90.6 ± 5.9)%.
The resulted cell suspension was cryopreserved by
three-step freezing program [10] with an initial cooling
rate of 1 deg/min down to –40°C, seeding at –7°C and
followed cooling with the rate of 10 deg/min from –40
down to –80°C and immersion into liquid nitrogen. The
cells were stored at –196°C at Low Temperature Bank
of the IPC&C of the National Academy of Sciences
of Ukraine within 2–3 months.
Prior to the experiment, the FLCs were thawed,
washed of a cryoprotectant and the viability was
assessed by trypan blue staining. The viability of cryo-
preserved FLCs made (73.0 ± 3.6)%. Afterwards the
cells were seeded in accordance with the method des-
cribed previously [6] into macroporous alginate-gelatin
matrices (AGM) which were obtained by cryotropic
gelation and had 5 mm diameter and of 2 mm thickness.
The average pore diameter of such a sponge was
(106.2 ± 39.6) µm and the porosity made not less than
80% [7]. Around the carriers an additional alginate
shell was formed by two-fold sequential immersion of
bioconstruct into a 1.2% solution of sodium alginate
(Sigma, USA), prepared with the saline (0.15 M NaCl;
25 mM HEPES; pH 7,4), followed by polymerization
in the same saline, enriched with 100 mM CaCl2.
Fetal liver cells within a macroporous AGM were
cultured up to 14 days in a α-MEM (Sigma) supple-
mented with 10% fetal bovine serum, (PAA, Austria),
2 mM L-glutamine, 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml
streptomycin at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity with
replacing the medium each 3 days. To visualize FLCs
within the carriers the cells were stained with fluores-
cein diacetate (FDA) and examined with a fluorescence
microscope (CETI, Belgium).
The studies on implantation of cell-free and FLC-
seeded AGM were performed in 35 adult male rats.
Cell-free AGM were implanted into an omentum of
five rats. Another animal group (5 rats) was implanted
with the matrices additionally coated with an alginate.
The remaining 25 animals were divided into 4 expe-
rimental groups. Group 1 (control of the same age norm,
n = 4) consisted of the rats not subjected to any stress.
In the animals of groups 2–4 (n = 7 in each group) an
acute liver failure was simulated by administration for
5 days of hepatocyte proliferation inhibitor 2-acetyl-
aminofluorene (AAF) consisting in 30 mg/kg of body
weight intragastrically as an oil solution. After AAF
administration, the Higgins partial hepatectomy (PH)
has been used as a signal for proliferation of hepatic
progenitor cells. In the animals of group 2 (control of
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 4, 2014
295
ацетатом (ФДА) и наблюдали с помощью флуорес-
центного микроскопа («СЕТІ», Бельгия).
Исследования по имплантации бесклеточных и
заселенных клетками фетальной печени АЖМ
проводили на 35 взрослых крысах-самцах. Бескле-
точные АЖМ имплантировали в сальник пяти крыс.
Другой группе (5 крыс) имплантировали матрицы,
дополнительно покрытые оболочкой из альгината.
Остальных 25 животных разделили на 4 экспери-
ментальные группы. Группу 1 (контроль одновоз-
растной нормы, n = 4) составили крысы, которые
не подвергались никаким воздействиям. У живот-
ных 2–4 групп (n = 7 в каждой) формировали
модель острой печеночной недостаточности на ос-
нове введения в течение 5 суток ингибитора
пролиферации гепатоцитов 2-ацетиламинофлуо-
рена (ААФ) из расчета 30 мг/кг массы тела интра-
гастрально в виде масляного раствора. После вве-
дения ААФ проводили частичную гепатэктомию
(ЧГЭ) по Хиггинсу, которая является сигналом к
пролиферации гепатических клеток-предшест-
венников. Животным группы 2 (контроль модели
ААФ/ЧГЭ) в дальнейшем не проводили никаких
манипуляций. Остальным крысам одновременно
с проведением частичной гепатэктомии в большой
сальник имплантировали макропористые АЖМ,
покрытые альгинатной оболочкой: группы 3 –
бесклеточные матрицы, а группы 4 – носители с
иммобилизированными в них КФП крыс. Период
наблюдения за животными после формирования
модели и имплантации макропористых губок сос-
тавил 4 недели.
Препараты для гистологического исследования
имплантатов и печени крыс-реципиентов готовили
по общепринятой методике: после фиксации в
4%-м формалине фрагменты тканей промывали,
обезвоживали в спиртах восходящей концентрации
и заливали в парафин. Гистологические срезы тол-
щиной 4–5 мкм окрашивали гематоксилином Эрли-
ха и эозином, а затем анализировали с помощью
светового микроскопа («СЕТІ», Бельгия).
Результаты и обсуждение
На начальном этапе исследования была постав-
лена задача оценить состояние АЖМ после имп-
лантации здоровым животным. Для ее решения
бесклеточные макропористые криогелевые матри-
цы на основе альгината, модифицированного путем
химического присоединения к поверхности пор мо-
лекул желатина, имплантировали в сальник интакт-
ных животных. Гистологическое наблюдение за
состоянием носителей через 2 недели после имп-
лантации выявило большое количество клеточных
элементов на поверхностях пор матрицы. Значи-
тельная часть клеток была распластана и демон-
стрировала фибробластоподобный вид, местами
AAF/PH model) no manipulations were performed
later. Simulta-neously with the partial hepatectomy the
remaining rats were implanted with alginate-coated
macroporous AGM into the greater omentum. The
animals from Group 3 obtained a cell-free matrix and
group 4 got the carriers with immo-bilized rat FLCs.
The observation period for the animals after the model
simulation and implantation of macro-porous sponges
comprised 4 weeks.
Samples for histology of implants and liver of the
recipient rats were prepared by the traditional method:
after fixation with 4% formalin the tissue fragments
were washed, dehydrated in alcohols of increasing
concentration and paraffin embedded. Histological
sections of 4.5 µm thickness were stained with Ehrlich
hematoxylin and eosin, and then analyzed with light
microscope (CETI, Belgium).
Results and discussion
At an initial stage of the research the task was to
assess the AGM state after implantation to healthy
animals. To solve it the cell-free macroporous cryogel
matrices based on alginate, modified by chemical coup-
ling of gelatin molecules to a surface of the pores were
implanted into the omentum of intact animals. Histo-
logical study of the state of the carries in 2 weeks
after implantation has revealed a large number of cells
on the surfaces of the matrix pores. Most cells were
flattened and had a fibroblast-like morphology, some-
times forming dense areas with fibrous stroma. The
larger macrophage cells were observed on the back-
ground of fibroblast-like cells; in the lumens of some
pores the capillary-like structures, containing predo-
minantly red blood cells were indicated (see Fig. 1A).
The signs of an acute inflammation response to the
implant as lymphocyte-leukocyte infiltration were
observed. The obtained results showed an intensive
populating of the implanted AGM with the recipient's
cells, accompanied by the implant vascularization.
To prevent populating the macroporous AGM with
the recipient cells an additional external alginate capsule
capable of isolation of the porous carries from the mig-
ration of the cells of both macrophage, lymphoid sys-
tems and connective tissue of the recipient was formed.
It has been established that the cells inside the implant
covered by additional alginate capsule were virtually
absent after 2 weeks of cell-free AGM implantation
in omentum of healthy rats (Fig. 1C). At the same
time the layer of fibrous tissue formed by the recipient's
cells was observed on outer surface of the alginate
shell surrounding AGM, i.e. the connective tissue
capsule was formed.
The findings showed that the external alginate
capsule effectively protected porous AGM from penet-
ration of the recipient's cell elements. However, the
question about an influence of alginate coating on the
296 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 4, 2014
образуя плотные участки с волок-
нистой стромой. На фоне фиброблас-
топодобных клеток присутствовали
более крупные клетки макрофагаль-
ного ряда; в просветах отдельных
пор встречались капилляроподоб-
ные структуры, содержащие сво-
бодные элементы крови, среди ко-
торых преобладали эритроциты
(рис. 1, A). Признаки острой воспа-
лительной реакции на имплантат в
виде лимфоцитарно-лейкоцитарной
инфильтрации не наблюдались.
Полученные результаты свиде-
тельствовали об интенсивном засе-
лении имплантированных АЖМ
клеточными элементами реципиен-
та, сопровождающемся васкуляри-
зацией имплантата.
Чтобы предотвратить заселение
макропористых АЖМ клетками
Рис. 1. Гистологические срезы макропористых альгинат-желатиновых
матриц через 14 суток после имплантации в сальник крыс: А –
«открытая» матрица без альгинатной оболочки; B – матрица с внешней
альгинатной оболочкой. Окрашивание гематоксилином и эозином,
×100.
Fig. 1. Histological sections of macroporous alginate-gelatin matrix in 14 days
after implantation into omentum of rats: A – ‘open’ matrix without alginate
shell; B - matrix with outer alginate shell. Hematoxylin and eosin staining,
×100.
state of the cells populated inside the matrix has
remained open.
To reveal possible negative effect of the alginate
shell isolating the matrix from the host cells, the in
vitro study of the state of cryopreserved FLCs inside
AGM was performed. For this aim cell-seeded AGM
covered by alginate shell were placed into culturing
conditions for up to 14 days.
Fig. 2 shows that to the 3rd day of culturing the
cryopreserved FLCs within the encapsulated AGM
actively metabolized FDA, indicating their viability and
enabling to assess their shape.The significant hetero-
geneity of the attached cultured FLCs was found: along
with rounded ones there were revealed elongated,
dendritic and widely flattened cells, the linear dimen-
sions of cell elements varied, likely indicating the pres-
ence of representatives of various histogenetic lineages
in initial suspension.
To the 7th days of culturing (see Fig. 2B) the number
of flattened cells significantly increased. The number
of rounded-shape cells reduced. To the 14th day of
observation only small amount of these cells was det-
ected (see Fig. 2C), while the flattened fibroblastic
cells made the bulk and formed the monolayer on
surfaces of the carrier pores. Thus it has been estab-
lished that encapsulation into alginate AGM seeded
with fetal liver cells, did not vitally affect the viability
and expansion of cryopreserved FLCs during in vitro
culturing.
To identify potential therapeutic effect the encap-
sulated into alginate shell bioconstructs consisting of
macroporous AGM with inoculated therein cryopreser-
ved FLCs were grafted into omentum of the rats with
experimental hepatic failure (AAP /PH) (group 4). The
A B
реципиента была поставлена задача сформировать
дополнительную внешнюю альгинатную капсулу,
способную отграничивать пористые носители от
миграции как клеток макрофагальной и лимфоид-
ной систем, так и соединительнотканных клеток
реципиента. Было установлено, что после 2-х не-
дель пребывания инкапсулированных бесклеточ-
ных АЖМ в сальнике здоровых крыс клеточные
элементы внутри имплантата, заключенного в
альгинатную капсулу, практически отсутствовали
(рис. 1, В). В то же время на внешней поверхности
альгинатной оболочки, окружающей АЖМ, наблю-
дался слой фиброзной ткани, образованный клет-
ками реципиента, то есть формировалась соедини-
тельнотканная капсула.
Полученные результаты свидетельствовали,
что внешняя альгинатная капсула эффективно
защищает пористую АЖМ от проникновения
клеточных элементов реципиента. Однако откры-
тым оставался вопрос о влиянии альгинатного
покрытия на состояние клеток, заселенных внутрь
матриц.
Для выявления возможного негативного дейст-
вия альгинатной оболочки, изолирующей матрицу
от клеток хозяина, на состояние криоконсер-
вированных КФП внутри АЖМ проводили исследо-
вание in vitro. Для этого заселенные АЖМ со
сформированной альгинатной оболочкой помещали
в условия культивирования на срок до 14 суток.
Из рис. 2, А видно, что на 3-и сутки культиви-
рования в составе инкапсулированных АЖМ крио-
консервированные КФП активно метаболизировали
ФДА, что свидетельствовало об их жизнеспособ-
ности и позволяло оценить их форму. Была выяв-
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 4, 2014
297
лена значительная гетерогенность прикрепленных
культивируемых КФП: наряду с округлыми встре-
чались удлиненные, отростчатые и широкорас-
пластанные клетки, линейные размеры клеточных
элементов варьировали, что может указывать на
наличие в исходной суспензии представителей
различных гистогенетических ростков.
К 7-м суткам культивирования (рис. 2, B)
количество распластанных клеток значительно
увеличилось, местами из них образовывались
тяжи. Содержание клеток округлой формы умень-
шалось. На 14-е сутки наблюдения эти клеточные
элементы выявлялись лишь в незначительном
количестве (рис. 2, C), в то время как распластан-
ные фибробластоподобные клетки составляли
большинство и образовывали монослой на поверх-
ностях пор носителя. Таким образом установлено,
что инкапсуляция в альгинат АЖМ, заселенных
клетками фетальной печени, существено не влияла
на жизнеспособность и экспансию криоконсер-
вированных КФП при культивировании.
Для выявления возможного терапевтического
эффекта инкапсулированные в альгинатную обо-
лочку биоконструкции, состоящие из макропорис-
тых АЖМ с инокулированными в них криоконсер-
вированными КФП, подсаживали в сальник крысам
с экспериментальной печеночной недостаточ-
ностью (ААФ/ЧГЭ) (группа 4). Негативным конт-
ролем служили животные с модельной печеночной
недостаточностью ААФ/ЧГЭ, которым в сальник
имплантировали бесклеточные инкапсулирован-
ные АЖМ (группа 3).
Микроскопическое строение печени здоровых
крыс (группа 1), являющихся одновозрастным
контролем для животных, которые перенесли экспе-
риментальные вмешательства, соответствовало
норме: печеночные дольки были правильно органи-
зованы, паренхима печени имела регулярное
Рис. 2. Криоконсервированные КФП в составе инкапсулированной альгинат-желатиновой губки на 3-и (А), 7-е
(B) и 14-е (C) сутки культивирования. Прижизненное наблюдение, окрашивание ФДА, ×250.
Fig. 2. Cryopreserved FLCs within ‘coated’ alginate-gelatin sponge to the 3rd (A), 7th (B) and 14th (C) days of culturing. Vital
observation, FDA staining, ×250.
animals with liver failure model AAF/PH which
received cell-free encapsulated AGM into omentum
(group 3) served as the negative control.
Microscopic structure of the liver of healthy rats
(group 1), being one-age control for the animals, under-
went an experimental interventions, corresponded to
the norm: hepatic lobules were properly organized, liver
parenchyma had regular trabecular structure, there
were observed typical capillaries of sinusoid type. Inter-
lobular connective tissue contained a limited number
of fibroblastic cell elements and somewhere it was
infiltrated by lymphocytes. In the portal zones the inter-
lobular arteries, veins and bile ducts were free. In these
areas the regenerating hepatocytes with large light
nuclei at the stage of mitotic division were detected
(see Fig. 3A).
The structure of rat liver (group 2) underwent the
AAF introduction followed PH, in 21 days after the
impacts differed sharply from the normal one. In parti-
cular, characteristic trabecular structure of liver paren-
chyma was hardly found (Fig. 3B). Increased number
of bile ducts and presence of the structures formed by
cells similar to bile epithelium (ductular reaction), as
well as significant number of young hepatocytes struc-
tures neighboring these structures, the part of which
was in the mitotic division stage, were found. In peri-
portal areas of hepatic lobes the lipid-loaded and necro-
tized hepatocytes were revealed. Cell round infiltration
of liver portal tracts was almost absent. In general,
the state of the liver structure pointed to the reparation
of hepatocellular component of the hepatic parenchy-
ma, affected by the AAF administration, but normal
architecture of an organ was not restored.
Liver histology of the group 3 rats (implanted with
cell-free matrix) on day 21 after surgery reflected signi-
ficantly disordered organ architecture: quite complete
absence of the characteristic trabecular structure and
formation of affected parenchyma multiple sites. The
A B C
298 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 4, 2014
ная инфильтрация портальных трактов печени
практически отсутствовала. В целом структурное
состояние печени указывало на процессы репара-
ции гепатоклеточной составляющей печеночной
паренхимы, пораженной в результате введения
ААФ, однако нормальная архитектоника органа не
восстанавливалась.
Гистологическая картина печени крыс группы 3,
которым была имплантирована бесклеточная
матрица, на 21-е сутки после операции отражала
значительные нарушения архитектоники органа:
практически полное отсутствие характерного тра-
бекулярного строения и формирование множества
участков пораженной паренхимы. По всей площади
препарата были рассеяны молодые крупные пе-
ченочные клетки, а также дистрофически изменен-
ные и некротизированные гепатоциты. Отмечалась
дуктулярная реакция в виде разрастания желчных
протоков и дуктальных структур, которые в пор-
тальной области были окружены инфильтратом
young large liver cells as well as necrotic hepatocytes
and the cells with dystrophic changes had been scat-
tered within the entire area of the section. There was
observed the ductular reaction as outgrowth of the bile
ducts and ductal structures, which in the portal areas
were surrounded with an infiltrate of poorly identifiable
small cell elements (Fig. 3C). In a whole there was
observed a morphological similarity with the liver struc-
ture of rats with experimental AAF/PH model.
In the rats with experimental hepatic insufficiency
which additionally received the carriers with CFP
(group 4), there was traced the characteristic to the
norm trabecular structure of the regenerating liver pa-
renchyma (Fig. 3D). Number of bile ducts in the portal
areas was somewhat increased, they were surrounded
by predominantly full value hepatocytes, among which
there were mitotically dividing cells. Hepatocytes in the
state of fatty degeneration were occasionally detected.
Inflammatory infiltration of portal tracts was almost
absent. In general, the observed morphological pattern
Рис. 3. Структура печени крыс через 21 сутки после ААФ/ЧГЭ с
введением альгинат-желатиновых матриц: А – норма (одновозраст-
ной контроль); B – модель гепатита ААФ/ ЧГЭ; C – модель гепатита
ААФ/ ЧГЭ, имплантация бесклеточных АЖМ; D – модель гепатита
ААФ/ЧГЭ, имплантация АЖМ с КФП. Окрашивание гематоксилином
и эозином, ×400.
Fig. 3. Structure of rats liver in 21 days after AAF/PH with the introduction
of alginate-gelatin matrices: A – norm (the same age control); B –
hepatitis modelling with AAF/PH; C – hepatitis modelling with AAF/PH,
implantation of cell-free AGM; D – hepatitis modelling with AAF/PH,
implantation of AGM with FLCs. Hematoxylin and eosin staining, ×400.
A B
C D
трабекулярное строение, наблюдались
типичные капилляры синусоидного
типа. Междольковая соединительная
ткань содержала ограниченное коли-
чество фибробластических клеточных
элементов и местами была инфильт-
рирована лимфоцитами. В портальных
зонах междольковые артерии, вены и
желчные протоки были свободны.
В этих областях обнаруживались ре-
генерирующие гепатоциты с боль-
шими светлыми ядрами, находящи-
мися на стадии митотического деле-
ния (рис. 3, А).
Структура печени крыс (группа 2),
которые перенесли введение ААФ с
последующей ЧГЭ, через 21 сутки
после воздействий резко отличалась
от нормальной. В частности, практи-
чески не выявлялось характерное тра-
бекулярное строение печеночной па-
ренхимы (рис. 3, B). Обращали на себя
внимание увеличенное количество
желчных протоков и наличие структур,
сформированных клетками, подоб-
ными желчному эпителию (дуктуляр-
ная реакция), а также значительное
количество близлежащих по отноше-
нию к этим структурам групп моло-
дых гепатоцитов, часть из которых
находилась в состоянии митотическо-
го деления. В перипортальных облас-
тях печеночных долек выявлялись
нагруженные липидами и некротизи-
рованные гепатоциты. Круглоклеточ-
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 4, 2014
299
мелкоклеточных плохо идентифицируемых элемен-
тов (рис. 3, С). В целом наблюдалось морфоло-
гическое сходство со структурой печени крыс c
экспериментальной моделью ААФ\ЧГЭ.
У крыс с экспериментальной печеночной недос-
таточностью, которым вводили носители с КФП
(группа 4), прослеживалось свойственное норме
трабекулярное строение регенерирующей паренхи-
мы печени (рис. 3,D). Количество желчных
протоков в портальных областях было несколько
увеличено, они были окружены преимущественно
полноценными гепатоцитами, среди которых
встречались митотически делящиеся клетки. Из-
редка выявлялись гепатоциты в состоянии жиро-
вой дистрофии. Воспалительная инфильтрация
портальных трактов практически отсутствовала.
В целом наблюдаемая морфологическая картина
указывала на нормотипический ход восста-
новления структуры патологически измененной
печени. Таким образом, структурные проявления
деструктивно-восстановительных процессов в
печени крыс с экспериментальной моделью ААФ/
ЧГЭ различались в зависимости от наличия КФП
в имплантированных в сальник биоконструкциях.
При окончании эксперимента на 28-е сутки
после ЧГЭ была проведена оценка состояния имп-
лантированных инкапсулированных АЖМ и засе-
ленных в них клеток. Из рис. 4 видно, что вокруг
матриц сохранялась альгинатная оболочка, сами
АЖМ не проявляли убедительных признаков био-
деградации и сохраняли свою макропористую
структуру. Внутри носителей выявлялись клеточ-
ные элементы, преимущественно в состоянии
дистрофии, а также внеклеточный матрикс. Вокруг
окруженных альгинатной оболочкой матриц наб-
людалась сформированная соединительнотканная
капсула.
Представленные результаты свидетельствуют
о том, что имплантация широкопористых матриц,
заселенных криоконсервированными КФП, крысам
с экспериментальной печеночной недостаточ-
ностью (модель ААФ/ЧГЭ) приводит к существен-
ному улучшению структуры печени, что, в свою
очередь, указывает на определенный терапевти-
ческий потенциал КФП.
В настоящей работе для имплантации использо-
вали оригинальные широкопористые АЖМ, полу-
ченные методом криотропного гелирования и хоро-
шо зарекомендовавшие себя в качестве носителя
клеток в культуре [7]. При имплантации в сальник
они сохраняли свою структуру в течение, по край-
ней мере, 4-х недель, что свидетельствовало об
их медленной биодеградации и перспективности
применения в качестве скаффолда для разработки
биоинженерных эквивалентов печени. В то же
время широкопористые криогелевые матрицы,
indicated the progress in recovery of normotypical
structure of the changed liver. Thus, the structural
manifestations of destructive and regenerative proces-
ses in the liver of the rats with AAF/ PH experimental
model differed depending on the presence of the FLCs
in implanted into the omentum bioconstructs.
To the day 28 after PH the state of implanted
encapsulated AGM and the state of both encapsulated
AGM and cells seeded inside the scaffolds was
evaluated. Fig. 4 shows that around the matrices an
alginate shell was preserved, the AGM themselves did
not demonstrate evident signs of degradation and
retained their macroporous structure. Predominantly
dystrophic cells as well as extracellular matrix were
identified within the carriers (scaffolds, AGM). Around
matrices surrounded with an alginate shell the capsule
of connective tissue was formed.
The results presented indicate that implantation of
wide-porous matrices seeded with cryopreserved
FCLs to the rats with experimental hepatic failure
(AAF/PH model) leads to a significant improvement
of the liver structure, which in turn points to a specific
therapeutic potential of the FLCs.
In this paper for implantation we used the original
wide-porous AGM obtained by cryotropic gelation and
well proved as carrier of cells in culture [7]. When
implanted into the omentum, they maintained their
structure for at least 4 weeks, confirming their slow
biodegradation and promise to be used as scaffolds
for developing the liver bioengineered equivalents. At
the same time the wide-porous cryogel matrices with
open pores after the implantation into the omentum
Рис. 4. Гистологический срез инкапсулированной аль-
гинат-желатиновой матрицы, заселенной КФП, через
28 суток после имплантации в сальник крыс со сфор-
мированной моделью ААФ/ЧГЭ. Окрашивание гемато-
ксилином и эозином, ×100.
Fig. 4. Histological section of encapsulated alginate-gela-
tin matrix populated with FLCs, 28 days post implantation
in the omentum of rats with simulated AAF/PH. Hematoxylin
and eosin staining, ×100.
300 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 4, 2014
имеющие открытые поры, после имплантации в
сальник заселялись клетками реципиента и, таким
образом, не были способны обеспечить in vivo
иммуноизо-ляцию и, соответственно, сохранность
заселенных в них клеток.
Нами показано, что модификация АЖМ, засе-
ленных клетками фетальной печени, путем заклю-
чения таких биоконструкций в альгинатную оболоч-
ку не препятствовала экспансии в них КФП при
культивировании вне организма, но позволяла пре-
дотвратить массовое заселение широкопористых
АЖМ клетками реципиента при имплантации.
Известно, что помещение клеток-предшест-
венников в альгинатную гидрогелевую капсулу
позволяет сохранить их в области введения и пред-
охраняет от неблагоприятного воздействия окру-
жения. При этом клетки реагируют на состояние
окружающей среды реципиента и в ответ на него
синтезируют и высвобождают ростовые факторы,
цитокины, а также другие пептиды и белки, диф-
фундирующие наружу. В то же время гидрогелевая
капсула препятствует проникновению внутрь нее
крупных белков, в частности антител, нарушаю-
щих процесс регенерации [5].
В наших экспериментах альгинатная капсула
была непроницаемой для клеток реципиента, выра-
женная реакция отторжения отсутствовала, вокруг
альгинатной оболочки к 21-м суткам наблюдения
образовывалась соединительнотканная капсула,
сформированная по морфотипу реакции на инород-
ное тело. На основании этих данных можно предпо-
лагать, что КФП внутри матрицы оставались
функционально активными до тех пор, пока соеди-
нительнотканная капсула не блокировала диф-
фузионные и осмотические процессы, происходив-
шие между КФП в матрице и интерстициальной
жидкостью реципиента, причем этого времени
было достаточно для запуска процессов нормоти-
пической регенерации паренхимы печени, подвер-
гавшейся ААФ/ЧГЭ.
Таким образом, выявленная нормализация
структуры органа-мишени – печени в состоянии
экспериментальной недостаточности – в присутст-
вии АЖМ, заселенных клетками фетальной печени,
может служить аргументом в пользу терапевтиче-
ского действия криоконсервированных КФП,
конкретные клеточные источники и механизмы
которого требуют дальнейшего углубленного изу-
чения.
Выводы
Имплантация здоровым животным бесклеточ-
ных альгинат-желатиновых матриц приводит к их
интенсивному заселению клеточными элемен-
тами реципиента и сопровождается васкуляриза-
цией имплантата.
were populated with the recipient’s cells and therefore
were not be able to provide in vivo immune isolation
and correspondingly the preservation of the cells popu-
lated therein.
We have shown that the modification of AGM,
seeded with fetal liver cells, by means of additional
coating of these bioconstructs into alginate shell did
not affect the expansion of FLCs within the AGM
during in vitro culture, but helped preventing massive
populating of wide-porous AGM with the recipient’s
cells after implantation.
It is known that the encapsulation of progenitor cells
into alginate hydrogel allows fixing them in the site of
administration as well as protects from the environ-
mental unfavourable effects. Herewith the cells react
to the environmental state of a recipient, synthesize
and release growth factors, cytokines, as well as other
peptides and proteins diffusing outwards. At the same
time the hydrogel capsule prevents the penetration of
large proteins, in particular the regeneration impairing
antibodies [4].
In our experiments, the alginate capsule was non-
penetrable to the recipient’s cells, the expressed rejec-
tion was absent. To the 21st day of observation the
connective tissue capsule around the alginate shell was
formed due to morphotype response to the foreign
object. On the basis of these data, we can assume
that the FLCs inside the matrix remained functionally
active for as long as the connective tissue capsule did
not block the diffusive and osmotic processes occurring
between FLCs in the matrix and interstitial fluid of a
recipient. Moreover this time period was enough to
start the normotypical regeneration of liver parenchyma
which underwent AAF/PH.
Thus, the revealed normalization of the liver struc-
ture as a target organ in the state of experimental
failure in the presence of AGM seeded with fetal liver
cells, can serve as an argument for the therapeutic
effect of cryopreserved FLCs, but the specific mecha-
nisms of such effect require further profound study.
Conclusions
Implantation of cell-free alginate-gelatin matrices
to healthy animals leads to an intensive populating with
the recipient’s cells and accompanied by vascularization
of the implant.
Formation of the outer alginate capsule effectively
protects the porous AGM from penetration of the
recipient cells, and does not significantly affect the
viability and expansion of cryopreserved FLCs seeded
into the matrix.
Implantation of encapsulated wide-porous matrices
containing FLCs, into the omentum of the rats with
liver failure (AAF/PH model) leads to the organotypic
restoration of the liver structure of experimental ani-
mals.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 4, 2014
301
Формирование внешней альгинатной капсулы
эффективно защищает пористую АЖМ от проник-
новения клеточных элементов реципиента, а также
существенно не влияет на жизнеспособность и
экспансию криоконсервированных КФП, заселен-
ных в матрицу.
Имплантация инкапсулированных широкопо-
ристых матриц, содержащих КФП, в сальник крыс
с печеночной недостаточностью (модель ААФ/
ЧГЭ) приводит к органотипическому восстанов-
лению структуры печени экспериментальных жи-
вотных.
Литература
1. Петренко Ю.А., Иванов Р.В., Лозинский В.И., Петренко А.Ю.
Сравнительное исследование методов заселения широ-
копористых носителей на основе альгинатного криогеля
мезенхимальными стромальными клетками костного
мозга человека // Клеточные технологии в биологии и
медицине. – 2010. – №4. – C. 225–228.
2. Dolle L., Best J., Mei J. et al. The quest for liver progenitor cells:
A practical point of view // J. Hepatol. – 2010. – Vol. 52, №1. –
P. 117–129.
3. Fuller B.J., Petrenko A.Yu., Rodriguez J.V. et al. Biopreservation
of hepatocytes: current concepts on hypothermic preser-
vation, cryopreservation, and vitrification // CryoLetters. –
2013. – Vol. 34, №4. – Р. 432–452.
4. Glicklis R., Shapiro L., Agbaria R. et al. Hepatocyte behavior
within three-dimensional porous alginate scaffolds // Biotechno-
logy and Bioengineering. – 2000. – Vol.67, №3. – P. 344–353.
5. Levit R.D., Landazuri N., Phelps E.A. et al. Cellular encapsulation
enhances cardiac repair // J. American Heart Association –
2013. – Vol. 2, №5. – Р. 1–11.
6. Petrenko A.Yu., Sukach A.N. Isolation of intact mitochondria
and hepatocytes using vibration // Analytical Biochem. –
1991. – Vol. 194, №2. – P. 326–332.
7. Petrenko Yu.A., Ivanov R.V., Petrenko A.Yu., Lozinsky V.I.
Coupling of gelatin to inner surfaces of pore walls in spongy
alginate-based scaffolds facilitates the adhesion, growth and
differentiation of human bone marrow mesenchymal stromal
cells // J. Mater Sci: Mater Med. – 2011. – Vol. 22, №6. –
Р. 1529–1540.
8. Petrenko Y.A., Jones D.R.E., Petrenko A.Y. Cryopreservation
of human fetal liver hematopoietic stem / progenitor cells using
sucrose as an additive to the cryoprotective medium // Cryo-
biology. – 2008. – Vol. 57, №3. – P. 195–200.
9. Ping Zhou, Lessa N., Estrada D.C. et al. Decellularized liver
matrix as a carrier for transplantation of human fetal and prima-
ry hepatocytes in mice // Liver Transpl. – 2011. – Vol. 17,
№4. – P. 418–427.
10.Skorobogatova N.G., Novikov A.N., Fuller B.J., Petrenko A.Yu.
Importance of a three-stage cooling regime and induced ice
nucleation during cryopreservation on colony-forming potential
and differentiation in mesenchymal stem/progenitor cells from
human fetal liver // CryoLetters. – 2010. – Vol.31, №5. – P. 371–
379.
11.Soltys K.A., Soto-Gutierrez A., Nagaya M. et al. Barriers to the
successful treatment of liver disease by hepatocyte transplan-
tation // J. Hepatol. – 2010. – Vol.53, №4 – P. 769–774.
References
1. Dolle L., Best J., Mei J. et al. The quest for liver progenitor cells:
A practical point of view. J Hepatol 2010; 52(1): 117–129.
2. Fuller B.J., Petrenko A.Yu., Rodriguez J.V. et al. Biopreservation
of hepatocytes: current concepts on hypothermic preserva-
tion, cryopreservation, and vitrification. CryoLetters 2013;
34(4): 432–452.
3. Glicklis R., Shapiro L., Agbaria R. et al. Hepatocyte behavior
within three-dimensional porous alginate scaffolds. Biotech-
nology and Bioengineering 2000; 67(3): 344–353.
4. Levit R.D., Landazuri N., Phelps E.A. et al. Cellular encapsulation
enhances cardiac repair. J American Heart Association 2013;
2(5): 1–11.
5. Petrenko A.Yu., Sukach A.N. Isolation of intact mitochondria
and hepatocytes using vibration. Analytical Biochem 1991;
194(2): 326–332.
6. Petrenko Yu.A., Ivanov R.V., Lozinsky V.I, Petrenko A.Yu.
Comparison of the methods for seeding human bone marrow
mesenchymal stem cells to macroporous alginate cryogel
carriers. Cell Technologies in Biology and Medicine 2010; (4):
225–228.
7. Petrenko Yu.A., Ivanov R.V., Petrenko A.Yu., Lozinsky V.I.
Coupling of gelatin to inner surfaces of pore walls in spongy
alginate-based scaffolds facilitates the adhesion, growth and
differentiation of human bone marrow mesenchymal stromal
cells. J Mater Sci: Mater Med 2011; 22(6): 1529–1540.
8. Petrenko Y.A., Jones D.R.E., Petrenko A.Y. Cryopreservation
of human fetal liver hematopoietic stem / progenitor cells using
sucrose as an additive to the cryoprotective medium. Cryo-
biology 2008; 57(3): 195–200.
9. Ping Zhou, Lessa N., Estrada D.C. et al. Decellularized liver
matrix as a carrier for transplantation of human fetal and pri-
mary hepatocytes in mice. Liver Transpl 2011; 17(4): 418–
427.
10. Skorobogatova N.G., Novikov A.N., Fuller B.J., Petrenko A.Yu.
Importance of a three-stage cooling regime and induced ice
nucleation during cryopreservation on colony-forming potential
and differentiation in mesenchymal stem/progenitor cells from
human fetal liver. CryoLetters 2010; 31(5): 371–379.
11. Soltys K.A., Soto-Gutierrez A., Nagaya M. et al. Barriers to
the successful treatment of liver disease by hepatocyte trans-
plantation. J Hepatol 2010; 53(4): 769–774.
|