Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності

Мета: дослідити вплив ліпосомальної форми доксорубіцину (LDox) на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності та визначити його окремі механізми. Об’єкти і методи: резистентна до вільної форми доксорубіцину (Dox) карцинома Герена щурів; клітини раку молочної залози людини MCF-7 та її рези...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2013
Автори:	Тодор, І.М., Лук’янова, Н.Ю., Тимовська, Ю.О., Півнюк, В.М., Чехун, В.Ф.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького 2013
Назва видання:	Онкологія
Теми:	Оригинальные исследования
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/135384
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності / І.М. Тодор, Н.Ю. Лук’янова, Ю.О. Тимовська, В.М. Півнюк, В.Ф. Чехун // Онкологія. — 2013. — Т. 15, № 4. — С. 279-285. — Бібліогр.: 27 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-135384
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1353842018-06-16T03:05:26Z Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності Тодор, І.М. Лук’янова, Н.Ю. Тимовська, Ю.О. Півнюк, В.М. Чехун, В.Ф. Оригинальные исследования Мета: дослідити вплив ліпосомальної форми доксорубіцину (LDox) на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності та визначити його окремі механізми. Об’єкти і методи: резистентна до вільної форми доксорубіцину (Dox) карцинома Герена щурів; клітини раку молочної залози людини MCF-7 та її резистентної до Dox сублінії MCF-7/Dox. Методи експериментальної онкології; культивування клітин; гістологічний, імуноцитохімічний; світлова та лазерна конфокальна мікроскопія. Результати: LDox достовірно гальмує ріст резистентного до вільного Dox штаму карциноми Герена та призводить до патоморфозу паренхіми пухлин. Вільний Dox потрапляє в цитоплазму пухлинних клітин шляхом дифузії, ліпосомальний — шляхом ендоцитозу. LDox не індукує експресію P-gp в пухлинних клітинах і таким чином оминає активне виведення з цитоплазми за допомогою цього білка. Висновки: LDox має переваги порівняно з вільною формою цитостатика стосовно накопичення і впливу на злоякісні клітини. Він може тривало акумулюватися як у цитоплазмі, так і у ядрі пухлинних клітин з фенотипом медикаментозної резистентності. Objective: to investigate the influence of liposomal form of doxorubicin (LDox) on tumor phenotype of drug resistance and to determine its individual mechanisms. Objects and methods: Dox-resistant Guerin carcinoma rats; human breast cancer MCF-7 cells and Dox-resistant subline MCF-7/Dox. Methods of experimental oncology, cell culture, histological, immunocytochemical; the light and laser confocal microscopy. Results: LDox significantly inhibits the growth of free Dox resistant strain Guerin carcinoma and leads to pathomorphosis of tumors parenchyma. Free Dox enters the cytoplasm of tumor cells by diffusion, liposomal — by endocytosis. Liposomal form of the drug, does not induce the expression of P-gp in tumor cells and thus bypas ses the ejection from the cytoplasm by this protein. Conclusions: LDox form has advantages in terms of free-form cytostatic regarding the accumulation and impact on malignant cells. This leads to long-term accumulation of cytostatic as in the cytoplasm and nucleus of tumor cells with the phenotype of drug resistance. 2013 Article Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності / І.М. Тодор, Н.Ю. Лук’янова, Ю.О. Тимовська, В.М. Півнюк, В.Ф. Чехун // Онкологія. — 2013. — Т. 15, № 4. — С. 279-285. — Бібліогр.: 27 назв. — укр. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/135384 uk Онкологія Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Оригинальные исследования Оригинальные исследования
spellingShingle	Оригинальные исследования Оригинальные исследования Тодор, І.М. Лук’янова, Н.Ю. Тимовська, Ю.О. Півнюк, В.М. Чехун, В.Ф. Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності Онкологія
description	Мета: дослідити вплив ліпосомальної форми доксорубіцину (LDox) на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності та визначити його окремі механізми. Об’єкти і методи: резистентна до вільної форми доксорубіцину (Dox) карцинома Герена щурів; клітини раку молочної залози людини MCF-7 та її резистентної до Dox сублінії MCF-7/Dox. Методи експериментальної онкології; культивування клітин; гістологічний, імуноцитохімічний; світлова та лазерна конфокальна мікроскопія. Результати: LDox достовірно гальмує ріст резистентного до вільного Dox штаму карциноми Герена та призводить до патоморфозу паренхіми пухлин. Вільний Dox потрапляє в цитоплазму пухлинних клітин шляхом дифузії, ліпосомальний — шляхом ендоцитозу. LDox не індукує експресію P-gp в пухлинних клітинах і таким чином оминає активне виведення з цитоплазми за допомогою цього білка. Висновки: LDox має переваги порівняно з вільною формою цитостатика стосовно накопичення і впливу на злоякісні клітини. Він може тривало акумулюватися як у цитоплазмі, так і у ядрі пухлинних клітин з фенотипом медикаментозної резистентності.
format	Article
author	Тодор, І.М. Лук’янова, Н.Ю. Тимовська, Ю.О. Півнюк, В.М. Чехун, В.Ф.
author_facet	Тодор, І.М. Лук’янова, Н.Ю. Тимовська, Ю.О. Півнюк, В.М. Чехун, В.Ф.
author_sort	Тодор, І.М.
title	Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності
title_short	Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності
title_full	Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності
title_fullStr	Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності
title_full_unstemmed	Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності
title_sort	вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності
publisher	Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького
publishDate	2013
topic_facet	Оригинальные исследования
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/135384
citation_txt	Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності / І.М. Тодор, Н.Ю. Лук’янова, Ю.О. Тимовська, В.М. Півнюк, В.Ф. Чехун // Онкологія. — 2013. — Т. 15, № 4. — С. 279-285. — Бібліогр.: 27 назв. — укр.
series	Онкологія
work_keys_str_mv	AT todorím vplivdoksorubícinuvlíposomalʹníjformínapuhlinizfenotipommedikamentoznoírezistentností AT lukânovanû vplivdoksorubícinuvlíposomalʹníjformínapuhlinizfenotipommedikamentoznoírezistentností AT timovsʹkaûo vplivdoksorubícinuvlíposomalʹníjformínapuhlinizfenotipommedikamentoznoírezistentností AT pívnûkvm vplivdoksorubícinuvlíposomalʹníjformínapuhlinizfenotipommedikamentoznoírezistentností AT čehunvf vplivdoksorubícinuvlíposomalʹníjformínapuhlinizfenotipommedikamentoznoírezistentností
first_indexed	2025-07-09T23:11:49Z
last_indexed	2025-07-09T23:11:49Z
_version_	1837212853252128768
fulltext	ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß 279ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 279 ВСТУП Застосування цитостатичної терапії призводить до поліпшення безпосередніх і віддалених результа- тів лікування хворих зі злоякісними новоутворен- нями. Але більшості злоякісних пухлин тією чи ін- шою мірою притаманна первинна медикаментозна резистентність [1]. Рак молочної залози (РМЗ), хоч і вважається пухлиною, чутливою до цитостатичної терапії, не є винятком з цього правила [2]. Кількість померлих від РМЗ у всьому світі за рік (а це більше 450 тис. жінок) демонструє, що проблема лікування цього захворювання далека від вирішення. Тому пи- тання подолання резистентності пухлинних клітин (ПК) до цитостатичних препаратів є одним із пріо- ритетних в експериментальній і клінічній онкології. Використання здобутків біо- та нанотехнологій до- зволяє долати природні перешкоди, зокрема феномен первинної медикаментозної резистентності, у форму- ванні якого задіяні численні механізми, пов’язані як зі зменшеним, сповільненим проходженням цитос- татиків через мембрану ПК, так і з прискореним, по- силеним їх виведенням із цитоплазми. Накопичений масив знань про активацію систем детоксикації та ме- ханізми відновлення пошкодженої ДНК, шляхи уник- нення ПК апоптозу, генетичні та епігенетичні зміни в ПК стає підґрунтям для розроблення нових мето- дів подолання медикаментозної резистентності [3, 4]. Антрациклінові антибіотики є одними з най- активніших цитостатичних препаратів, які засто- совують у хворих на РМЗ [5]. Але навіть викорис- тання антрациклінвмісних режимів поліхіміотера- пії не зав жди призводить до бажаного результату [6, 7], тому актуальним є пошук шляхів підвищення їх ефективності. Одним із таких способів є заміна віль- ної форми доксорубіцину (Dox) на ліпосомальну. Ліпосоми набувають все більшого визнання у сві- ті як носії медикаментозних речовин загалом і ци- тостатиків зокрема [8, 9]. Мембрани ліпосом скла- даються з природних фосфоліпідів, що дозволяє їм з’єднуватися з мембранами клітин, що в свою чергу призводить до внутрішньоклітинної доставки вмісту ліпосом. Цитостатики, інкапсульовані в ліпосоми, потрапляють в цитоплазму ПК шляхом ендоцитозу [10]. Слід зазначити, що майже всі проведені дослі- дження з вивчення механізмів доставки і накопи- чення цитостатиків, інкапсульованих у ліпосоми, були проведені на чутливих до цитостатиків моде- лях [11, 12]. Результати, отримані в клінічних дослі- дженнях, показали, що ліпосомальна форма доксо- рубіцину (LDox) ефективна у хворих зі злоякісними новоутвореннями [13–15]. Крім того, встановлено ефективність цієї форми препарату у хворих із ре- зистентними до LDox пухлинами [16–18]. Нас зацікавили механізми впливу LDox на пух- лини з фенотипом медикаментозної резистентнос- ті. Визначення окремих механізмів і становило мету проведеного нами дослідження. Вивчено проникну здатність ліпосомальної форми цитостатика в ци- топлазму ПК, резистентних до Dox, та досліджено механізм проникнення; оцінено ефективність те- рапевтичного впливу LDox на пухлини, резистент- ні до вільної форми препарату. ВПЛИВ ДОКСОРУБІЦИНУ В ЛІПОСОМАЛЬНІЙ ФОРМІ НА ПУХЛИНИ З ФЕНОТИПОМ МЕДИКАМЕНТОЗНОЇ РЕЗИСТЕНТНОСТІ Мета: дослідити вплив ліпосомальної форми доксорубіцину (LDox) на пух- лини з фенотипом медикаментозної резистентності та визначити його окремі механізми. Об’єкти і методи: резистентна до вільної форми доксо- рубіцину (Dox) карцинома Герена щурів; клітини раку молочної залози лю- дини MCF-7 та її резистентної до Dox сублінії MCF-7/Dox. Методи експе- риментальної онкології; культивування клітин; гістологічний, імуноцито- хімічний; світлова та лазерна конфокальна мікроскопія. Результати: LDox достовірно гальмує ріст резистентного до вільного Dox штаму карциноми Герена та призводить до патоморфозу паренхіми пухлин. Вільний Dox по- трапляє в цитоплазму пухлинних клітин шляхом дифузії, ліпосомальний — шляхом ендоцитозу. LDox не індукує експресію P-gp в пухлинних клітинах і таким чином оминає активне виведення з цитоплазми за допомогою цього білка. Висновки: LDox має переваги порівняно з вільною формою цитоста- тика стосовно накопичення і впливу на злоякісні клітини. Він може три- вало акумулюватися як у цитоплазмі, так і у ядрі пухлинних клітин з фе- нотипом медикаментозної резистентності. І.М. Тодор Н.Ю. Лук’янова Ю.О. Тимовська В.М. Півнюк В.Ф. Чехун Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, Україна Ключові слова: медикаментозна резистентність, ліпосомальний доксорубіцин, ендоцитоз, P-gp. ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 ÎÐ ÈÃÈÍÀËÜÍÛ Å ÈÑÑËÅÄÎ ÂÀ ÍÈß 280 ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ На основі даних, отриманих із літературних джерел та напрацьованих в Інституті експеримен- тальної патології, онкології і радіобіології (ІЕПОР) ім. Р.Є. Кавецького НАН України, ми висунули гі- потезу, що за допомогою LDox можна подолати медикаментозну резистентність до Dox. Для під- твердження цього припущення спочатку провели експериментальне дослідження з визначення ефек- тивності застосування LDox у тварин. 24 щурам-са- мицям лінії Wistar з масою тіла 150–200 г розведення експериментальної бази ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України було перещеплено клітини резистент- ного до Dox штаму карциноми Герена. Усі етапи до- слідження in vivo проводили, дотримуючись правил Комісії з етичних норм роботи з експериментальни- ми тваринами. Як модель пухлинного росту вико- ристовували перещеплену пухлину резистентного до Dox штаму карциноми Герена [19]. Усім щурам вказану пухлину перещепили шляхом підшкірного введення 0,5 мл 22% зависі пухлинної тканини з до- триманням правил асептики. На 11-ту добу після перещеплення у всіх щурів визначали об’єм пухлини. Після цього тварин роз- поділили на 3 групи. Тваринам першої групи (осно- вної) вводили LDox у дозі 2,5 мг/кг; другої (конт- роль № 1) — фізіологічний розчин (0,9%) хлориду натрію; третьої (контроль № 2) — вільний Dox у дозі 2,5 мг/кг. Усі досліджувані групи були тотожними за об’ємом (розміром) пухлин. Препарати вводи- ли внутрішньочеревно (1 раз на 2 доби) на 11; 13 та 15-й день після перещеплення пухлини. В ці ж тер- міни визначали об’єм пухлини. Тривалість спосте- реження за тваринами всіх груп — 18 діб. На 18-ту добу визначали кінцевий об’єм та масу пухлини. Оцінювали динаміку росту пухлин, визначаючи ортогональні розміри штангенциркулем з точніс- тю до 0,1 мм. Після завершення експерименту масу кожної пухлини визначали за допомогою торсійних техніко-хімічних ваг 2-го класу типу WT-40 з мак- симальним навантаженням 40 г. Для морфологічного дослідження брали пухлин- ну тканину у всіх тварин з кожної групи. Гістологіч- ні препарати (зрізи товщиною 3–6 мкм) готували за загальноприйнятою методикою та забарвлюва- ли гематоксиліном та еозином. Морфологічні до- слідження тканини здійснювали за допомогою мі- кроскопа Laborlux S (Leitz). Наступним етапом було вивчення механізмів проникнення та накопичення в цитоплазмі ПК, ре- зистентних до вільного Dox, ліпосомальної форми препарату. Дослідження були проведені на кліти- нах лінії MCF-7 (РМЗ людини) та її сублінії MCF- 7/Dox, резистентної до цитотоксичного впливу вільного Dox. Резистентна сублінія була отримана з вихідної лінії у відділі механізмів протипухлин- ної терапії ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН Укра- їни. Клітини культивували в середовищі Dulbecco ISCOV («Sigma», США) з додаванням 10% ембріо- нальної сироватки телят («Sigma», США) у зволоже- ній атмосфері з 5% СО 2 при температурі 37 °С; пе- ресівали двічі на тиждень, щільність посіву стано- вила 2–4•104 клітин/см2 поверхні. Пересів клітин здійснювали, коли 50% поверхні ємності для куль- тивування були зайняті клітинами. Для дослідження процесу ендоцитозу вихід- ні й резистентні до Dox клітинні лінії культивува- ли при стандартних умовах протягом 1 год із цито- халазином В («DakoCytomation», Данія), який до- давали в культуральне середовище в концентрації 5 мкг/мл. Потім проводили заміну поживного сере- довища і подальше культивування клітин із препа- ратом Dox або LDox протягом 4 год при температурі 37 °С у зволоженій атмосфері з 5% СО 2 . Після цьо- го фіксували клітини у суміші метанол/ацетон (1/1), відмивали і поміщали у Faramount Aqeous Mounting Medium («DakoCytomation», Данія). Оскільки Dox належить до препаратів, які мають здатність до влас- ної флуоресценції при довжині хвилі збуджен- ня λ ех = 540 нм і хвилі емісії λ еm = 590 нм, то знахо- дження і розподіл Dox і LDox в клітинах ми вивчали за допомогою лазерного конфокального мікроскопа LSM 510 META («CARL ZEISS», Німеччина). Екс- пресію P-глікопротеїну визначали з використан- ням моноклональних антитіл і системи візуалізації EnVision («DakoCytomation», Данія). Статистичну обробку результатів проводили з ви- користанням t-критерію Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ При проведенні досліджень in vivo на 18-ту добу після перещеплення резистентного до Dox штаму карциноми Герена у тварин основної та контроль- ної груп були різні показники об’єму та маси транс- плантованої пухлини. Дані щодо кінетики рос- ту пухлини в основній та контрольних 1-й та 2-й (№ 1 та № 2) групах в різні проміжки часу представ- лені на рис. 1. Î á’ ºì ï óõ ëè íè , ñ ì 3 35 30 25 20 15 10 5 0 Äîáà ï³ñëÿ ïåðåùåïëåííÿ 11-òà 13-òà 15-òà 18-òà Îñíîâíà Êîíòðîëüíàÿ ¹ 1 Êîíòðîëüíàÿ ¹ 2 Рис. 1. Динаміка росту резистентного штаму карциноми Герена щурів лінії Wistar в основній і контрольних групах Як свідчать дані рис. 1 і табл. 1, на початку дослі- дження (11-та доба після перещеплення пухлини) ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß 281ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 281 групи були тотожними за об’ємом первинної пухли- ни (р > 0,05). Уже на 13-ту добу середній об’єм пух- лини в основній групі був меншим порівняно з обо- ма групами контролю (р < 0,05). На 18-ту добу досто- вірність відмінностей між основною і кон т рольними групами була найбільшою (р < 0,01). Між контроль- ними групами відмінностей не виявлено (р > 0,05). Результати визначення середньої маси пухлин на- ведено також в табл. 1. Таблиця 1 Об’єм і маса пухлини залежно від проведеної терапії Г р у п а Об’єм пухлини (см3) Маса пух- лини (г) 11-та доба 13-та доба 15-та доба 18-та доба 18-та доба О с н о в - н а 9,1±0,7 13,9±0,7 15,7±0,9 18,1±1,3 27,5±2,2 К о н тр о л ь - н а № 1 10,8±1,2 18,3±1,8* 22,6±1,9* 31,9±3,2** 42,9±2,5* К о н тр о л ь - н а № 2 9,0±0,9 17,8±0,9* 21,1±1,1* 28,7±1,8** 41,5±1,5* Примітка: p<0,05, p<0,01 у порівнянні з основною групою. За значенням середньої маси пухлин також вста- новлено достовірну різницю між основною та обо- ма контрольними групами (р < 0,05). Між конт- рольними групами № 1 і № 2 статистично значущої різниці не виявлено. Після визначення об’єму та маси пухлини в основній групі та контрольній № 2 обчислили відсотки гальмування пухлинного рос- ту. Тварини контрольної групи № 1 цито статичної терапії не отримували, тому відсоток гальмування не визначали. Результати наведено в табл. 2. Таблиця 2 Відсоток гальмування пухлинного росту залежно від проведеної терапії Групи Відсоток гальмування за об’ємом пухлини за масою пухлини Час (доба) Час (доба) 13-та 15-та 18-та 18-та Основна 24,0±1,8 30,5±2,0* 43,3±3,2* 36,0±2,9* Контрольна 2,7±0,2 6,6±0,7 10,0±0,8 3,3±0,4 Примітка: *р<0,05 у порівнянні з контрольною групою. Як свідчать дані табл. 2, відсоток гальмування об’єму пухлини вищий на 33,3% при застосуван- ні ліпосомальної форми, порівняно з вільним Dox, відсоток гальмування маси пухлини в основній гру- пі перевищує аналогічний показник у контрольній групі № 2 на 32,7% (р < 0,05). Після того як визначили відсоток гальмування пухлинного росту, з усіх пухлин було виготовлено гістологічні препарати та проведено патоморфоло- гічне дослідження. Морфологічна структура карци- номи Герена зі сформованою медикаментозною ре- зистентністю до Dox у групах щурів, які отримували 0,9% розчин хлориду натрію (контроль № 1), віль- ну (контроль № 2) та ліпосомальну (основна група) форми Dox, була відмінною. У контрольній групі № 1 у всіх препаратах була представлена структу- ра інтактної пухлини. У контрольній групі № 2 в 1 (12,5%) пухлині патоморфологічних змін, характер- них для лікувального патоморфозу (ЛП), не виявле- но, в 5 (62,5%) — визначався ЛП І ступеня (рис. 2), в 2 (25,0%) — ЛП ІІ ступеня. В основній групі сту- пінь патоморфологічних змін був вищим (рис. 3), ніж у контрольній групі № 2. Паренхіма складалася зі світлих ПК зі щільними дрібними ядрами та діля- нок некрозу. В одних випадках площа некрозу ста- новила 20–30% від усієї площі препарату, в інших — відзначали масивні зони некротичного розплавлен- ня. В 1 (12,5%) пухлині зареєстровано ЛП І ступеня, в 4 (50%) пухлинах – ЛП ІІ ступеня, в 3 (37,5%) — ЛП ІІІ ступеня. У 6 (75%) пухлинах виявляли замі- щення некротичних ділянок сполучною тканиною. Встановлено, що на 18-ту добу після перещеплення ракових клітин рівень морфологічних змін у пухли- нах тварин основної групи перевищував відповідні у тварин конт рольної групи № 2 (р < 0,05). Ми виявили, що при застосуванні LDox можна досягти ефекту щодо резистентних до вільного Dox пухлин: загальмувати ріст пухлин та викликати не- Рис. 2. Резистентний до Dox штам карциноми Герена. Ознаки ЛП 0–І ступеня після терапії вільною формою Dox. ×200 Рис. 3. Резистентний до Dox штам карциноми Герена. Ознаки ЛП III ступеня після терапії LDox. ×200 ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 ÎÐ ÈÃÈÍÀËÜÍÛ Å ÈÑÑËÅÄÎ ÂÀ ÍÈß 282 кротичні зміни в ії паренхімі. M.G. Zykova та спів- автори [20] дослідили вплив LDox на резистентний штам карциноми легені Lewis та досягли гальмуван- ня росту пухлини на 40,0%, тобто також продемон- стрували ефективність LDox для гальмування росту пухлин, резистентних до вільної форми препарату. Таким чином, в експериментальних дослідженнях на різних модельних пухлинах підтверджено вису- нуту гіпотезу, що за допомогою LDox можна дола- ти медикаментозну резистентність до вільного Dox. Результати цієї серії досліджень стали підґрун- тям для вивчення механізмів проникнення та на- копичення LDox у резистентних до вільної форми препарату ПК (сублінії клітин РМЗ MCF-7/Dox). Як відомо, препарати, розміщені в ліпосомах, про- никають у цитоплазму клітин шляхом ендоцитозу [20–22], тоді як вільні форми цитостатиків — шля- хом простої дифузії. Для визначення інтенсивності накопичення Dox та LDox у цитоплазмі чутливих і резистентних клітин MCF-7 та MCF-7/Dox (шля- хом дифузії чи ендоцитозу) ми провели досліджен- ня з блокуванням процесу ендоцитозу за допомо- гою блокатора останнього — цитохалазину В. Ме- ханізм актинової регуляції ендоцитозу складається з кількох ланок [23]. Актиновий цитоскелет функ- ціонує на всіх стадіях ендоцитозу: при утворенні ен- доцитозного комплексу, його відокремленні від ци- топлазматичної мембрани, при наступному пере- міщенні ендосом у клітині. Деякі стадії ендоцитозу потребують значної локальної полімеризації акти- ну. На пізніх стадіях дозрівання ендоцитозних ве- зикул полімеризація актину сприяє відштовхуван- ню ендосом від плазматичної мембрани. Інгібіто- ри полімеризації актину призводять до порушення ендомембранних компартментів і блокують процес ендоцитозу. Цитохалазин В належить до інгібіторів полімеризації актину, перешкоджає з’єднанню фі- ламентів з позитивним кінцем актинового ланцю- га і таким чином блокує приєднання нових моно- мерів актину, у результаті чого припиняється зрос- тання актинового ланцюга. Ми встановили, що блокування ендоцито- зу не впливає на накопичення Dox клітинами ви- хідної лінії MCF-7 (рис. 4) і резистентної сублінії MCF-7/Dox (рис. 5). Після 4 год інкубації з препа- ратом реєстрували флуоресценцію Dox у клітинах. Цей факт також вказує на те, що вільна форма Dox надходить до цитоплазми шляхом пасивної дифузії. Але розподіл Dox в чутливих і резистентних кліти- нах був різним: у клітинах лінії MCF-7 препарат був сконцентрований в ядрі клітини, виявляли невели- кі скупчення препарату в цитоплазмі, тоді як в клі- тинах сублінії MCF-7/Dox фіксували незначну ди- фузну флуоресценцію в цитоплазмі. Це вказувало на те, що вільний Dox проникає шляхом дифузії як у чутливі, так і в резистентні клітини. Відомо, що цитотоксичний ефект цього препарату реалізуєть- ся на рівні ядра: проникаючи в ядро ПК, Dox пору- шує опосередкований топоізомеразою-ІІ механізм відновлення ДНК, а вільні радикали, які утворю- ються внаслідок дії цього цитостатика, призводять до розриву ДНК [24]. Виходячи із сукупних резуль- татів дослідження, ми також встановили, що, хоча Dox проникає в чутливі та резистентні клітини шля- хом дифузії, ефективним він є лише відносно чут- ливих клітин. При дослідженні накопичення LDox клітинами MCF-7 під дією цитохалазину В виявлено різке зни- ження рівня флуоресценції: лише невеликі, слабко визначені контури клітин візуалізуються за допомо- гою конфокального мікроскопа (рис. 6). Те саме спо- стерігали відносно резистентних клітин MCF-7/Dox (рис. 7). Якщо без впливу цитохалазину В для ре- зистентних клітин характерна досить виражена ди- фузна флуоресценція цитоплазми та поява значних за розміром і більш яскравих ділянок флуоресценції у перинуклеарному просторі, то під дією блокатора різко знижується рівень світіння LDox в клітинах. Dox потрапляє до цитоплазми ПК, як зазначе- но вище, шляхом дифузії через плазматичну мемб- рану, але з резистентних клітин препарат швид- ко виводиться за допомогою P-gp [25, 26]. Перева- ги ліпосомальної форми препарату, у першу чергу, полягають в особливостях його трансмембранно- го транспорту: шляхом ендоцитозу з формуванням ендосом, що знижує безпосередній зв’язок LDox з P-gp. C. Riganti та співавтори [27] встановили, що LDox не тільки менше виводиться з цитоплазми за допомогою P-gp, а ще й ліпосоми, у свою чергу, пригнічують насосну функцію цього трансмембран- ного білка-транспортера. За допомогою імуноцитохімічного методу і кон- фокальної мікроскопії ми провели дослідження екс- пресії P-gp під впливом Dox і LDox. Після культи- вування клітин лінії MCF-7 протягом 12 год з Dox у 80,0% клітин відзначали експресію P-gp (рис. 8, а), тоді як взаємодія цих клітин з LDox не призво- дила до появи експресії P-gp ні через 24 год, ні через 48 год інкубації (рис. 8, б). Таким чином, ми вста- новили, що Dox у вільній формі, який потрапляє в клітину шляхом дифузії, активує енергозалежний трансмембранний білок-транспортер P-gp, внаслі- док чого частково виводиться з клітини. При засто- суванні препарату у ліпосомальній формі експресія P-gp не проявлялася. Результати, отримані в проведених раніше в на- шому відділі дослідженнях [10, 23], продемонстру- вали, що як для чутливих до Dox клітин вихідної лінії MCF-7, так і для клітин резистентної сублінії MCF-7/Dox характерне не тільки підвищене нако- пичення, а й більш тривала акумуляція в цитоплаз- мі та ядрі ПК LDox, ніж Dox, що таким чином при- зводить до посилення цитотоксичної дії препарату. Отже, ми встановили, що LDox ефективно галь- мує ріст in vivo резистентних до Dox пухлин (на при- кладі резистентного штаму карциноми Герена). За- вдяки ендоцитозу Dox проникає в цитоплазму та акумулюється в ядрі чутливих і резистентних клі- ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß 283ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 283 Рис. 4. Розподіл Dox у клітинах лінії MСF-7: а — без дії цитохалазину В; б — під впливом цитохалазину В. ×400 Рис. 5. Розподіл Dox у клітинах лінії MСF-7/Dox: а –без дії цитохалазину В; б — під впливом цитохалазину В. ×200 Рис. 6. Розподіл LDox у клітинах лінії MCF-7. а — без дії цитохалазину В; б — під впливом цитохалазину В. ×400 Рис. 7. Розподіл LDox у клітинах лінії MCF-7/Dox. а — без дії цитохалазину В; б — під впливом цитохалазину В. ×400 ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 ÎÐ ÈÃÈÍÀËÜÍÛ Å ÈÑÑËÅÄÎ ÂÀ ÍÈß 284 тин лінії MCF-7 та MCF-7/Dox, успішно уникаю- чи активного виведення з цитоплазми трансмемб- ранним білком-транспортером P-gp. ВИСНОВКИ На основі даних, отриманих у результаті прове- деного нами дослідження, зроблено такі висновки: 1. LDox на 33,3% більше гальмує ріст резистент- ного до вільного Dox штаму карциноми Герена та в 37,5% призводить до патоморфологічної регресії паренхіми пухлин, що відповідає ІІІ ступеню ліку- вального патоморфозу. 2. LDox проникає в чутливі клітини лінії MCF-7 і резистентні клітини сублінії MCF-7/Dox шляхом ен- доцитозу та акумулюється переважно в ядрі клітин. 3. Вільна форма Dox, яка потрапляє в клітини лі- нії MCF-7 шляхом дифузії, активує енергозалежний трансмембранний білок-транспортер P-gp, внаслі- док чого Dox виводиться з клітин. 4. LDox не призводить до появи експресії білка P-gp в досліджуваних клітинах лінії MCF-7. СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ 1. Gottesman MM. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med 2002; 53: 615–27. 2. Wind NS, Holen I. Multidrug resistance in breast cancer: from in vitro models to clinical studies. Int J Breast Cancer 2011; 96: 12–24. 3. Чехун ВФ, Микитенко ДО, Лук’янова НЮ. Корекція порушень метилування ДНК як можливий шлях модуля- ції лікарської резистентності злоякісних клітин. Укр біохім журн 2006; 78 (6): 5–14. 4. Kutanzi KR, Yurchenko OV, Chekhun VF, et al. Mi- croRNA-mediated drug resistance in breast cancer. Clin Epige- net 2011; 2: 171–85. 5. Семиглазов ВВ, Топузов ЭЭ. Рак молочной железы. Моск ва: МЕДпресс-информ, 2009. 172 с. 6. Hortobagyi GN, Pivot X, Asmar L. Special lecture: Antra- cycline-resistant breast cancer. Breast Cancer 1997; 4 (4): 221–7. 7. Pivot X, Asmar L, Buzdar AU, et al. A unified definition of clinical anthracycline resistance breast cancer. Br J Cancer 2000; 82 (3): 529–34. 8. O’Shaughnessy J. Liposomal anthracyclines for breast can- cer: Overview Joyce. Oncologist 2003; 8 (2): 1–2. 9. Кулик ГИ, Пономарева ОВ, Король ВИ, Чехун ВФ. Токсичность и противоопухолевая активность липосомаль- ной лекарственной формы доксорубицина. Онкология 2004; 6 (3): 207–10. 10. Rusetskaya NV, Khariton N, Yurchenko OV, Chekhun VF. Distribution and accumulation of liposomal form of doxorubicin in breast cancer cells of MCF-7 line. Exp Oncol 2011; 33 (2): 78–80. 11. Abrahan SA, Waterhouse DN, Mayer LD. The liposomal formulation of doxorubicin. Methods Enzymol 2005; 391: 71–97. 12. Andresen TL, Jensen SS, Jorgesen K. Advanced strategies in liposomal cancer therapy: problems and prospects of active and tumor specific drug release. Prog Lipid Res 2005; 44 (1): 68–97. 13. Chao TC, Wang WS, Yen CC, et al. A dose-escalating pi- lot study of sterically stabilized, pegylated liposomal doxorubicin (Lipo-Dox) in patients with metastatic breast cancer. Cancer In- vest 2003; 21 (6): 837–47. 14. Ranson MR, Carmichael J, O’Byrne K, et al. Treatment of advanced breast cancer with sterically stabilized liposomal doxo- rubicin: results of a multicenter phase II trial. J Clin Oncol 1997; 15 (10): 3185–91. 15. Reynolds JG, Geretti E, Hendriks BS, et al. HER2-targe- ted liposomal doxorubicin displays enhanced anti-tumorigenic effects without associated cardiotoxicity. Toxicol Appl Pharma- col 2012; 262 (1): 1–10. 16. Al-Batran S-E, Güntner M, Pauligk C, et al. Anthracycline rechallenge using pegylated liposomal doxorubicin in patients with metastatic breast cancer: a pooled analysis using individual data from four prospective trials. Br J Cancer 2010; 103 (10): 1518–1523. 17. Півнюк ВМ, Тимовська ЮО, Пономарьова ОВ та ін. Використання ліпосомальних форм препаратів у хворих на резистентний до доксорубіцину рак молочної залози. Он- кологія 2007; 10 (2): 121–4. 18. Tимовська ЮО, Півнюк ВМ, Олійніченко ГП, Че- хун ВФ. Первинна медикаментозна резистентність до ан- трациклінових антибіотиків у хворих з місцево-розповсю- дженим раком молочної залози та можливості її подолання. Онкологія 2010; 12 (2): 154–9. 19. Чехун ВФ, Тодор ИН, Соляник ГИ, Кулик ГИ, Трин- дяк ВП. Особенности окислительного фосфорилирова- ния и энергетического статуса чувствительной и резистент- ной к доксорубицину карциномы Герена. Эксп Онкол 2000; 22 (4): 195–9. 20. Zykova MG, Medvedeva NV, Torkhovskaya TI, et al. Influ- ence of doxorubicin inclusion into phospholipid nanoformulation on its antitumor activity in mice: increased efficiency for resistant tumor model. Exp Oncol 2012; 34: 12–24. 21. Lee KD, Hong K. Recognition of liposome by cells: in vitro building and endocytosis mediated by specific lipid headgroups and surface charge density. Biochim Biophys Acta 1992; 1103: 85–97. 22. Pollock S, Antrobus R, Newton L, et al. Uptake and traf- ficking of liposomes to the endoplasmic reticulum. FASEB J 2010; 24 (6): 1866–78. Рис. 8. Зміна експресії P-gp у клітинах РМЗ MCF-7 при культивуванні з Dox (а) та LDox (б) протягом 24 год. ×400 ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß 285ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 285 23. Rusetskaya NV, Khariton NG, Yurchenko OV, Naleski- na LA, Chekhun VF. Features of liposomal doxorubicin accumu- lation and distribution in tumor cells of human breast cancer. Ma- terials of international conference «Tumor and host: novel aspects and old problems». Exp Oncol 2010; 32 (3): 24. 24. Smythe E, Ayscough KR. Actin regulation in endocytosis. J Cell Sci 2006; 119: 4589–98. 25. Thorn CF, Oshiro C, Marsh S, et al. Doxorubicin path- ways: pharmacodynamics and adverse effects. Pharmacogenet Geno mics 2011; 21 (7): 440–6. 26. Shen F, Chu S, Bence AK, et al. Quantitation of Doxoru- bicin Uptake, Efflux, and Modulation of Multidrug Resistance (MDR) in MDR Human Cancer Cells. J Pharmacol Exp Ther 2008; 324 (1): 95–102. 27. Riganti C, Voena C, Kopecka J. Liposome-encapsulated doxorubicin reverses drug resistance by inhibiting P-glycoprotein in human cancer cells. Mol Pharm 2011; 8 (3): 683–700. THE EFFECT OF LIPOSOMAL DOXORUBICIN FORM ON DRUG RESISTANT TUMOR PHENOTYPE I.M. Todor, N.Y. Lukyanova, Y.O. Tymovska, V.M. Pivnyuk, V.F. Chekhun Summary. Objective: to investigate the influence of lipo- somal form of doxorubicin (LDox) on tumor phenotype of drug resistance and to determine its individual mech- anisms. Objects and methods: Dox-resistant Guerin car- cinoma rats; human breast cancer MCF-7 cells and Dox-resistant subline MCF-7/Dox. Methods of exper- imental oncology, cell culture, histological, immunocy- tochemical; the light and laser confocal microscopy. Re- sults: LDox significantly inhibits the growth of free Dox resistant strain Guerin carcinoma and leads to patho- morphosis of tumors parenchyma. Free Dox enters the cytoplasm of tumor cells by diffusion, liposomal — by en- docytosis. Liposomal form of the drug, does not induce the expression of P-gp in tumor cells and thus bypas ses the ejection from the cytoplasm by this protein. Conclu- sions: LDox form has advantages in terms of free-form cytostatic regarding the accumulation and impact on malignant cells. This leads to long-term accumulation of cytostatic as in the cytoplasm and nucleus of tumor cells with the phenotype of drug resistance. Key words: drug resistance, liposomal doxorubicin, endocytosis, P-gp. Адреса для листування: Тодор І.М. 03022, Київ, вул. Васильківська, 45 Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України E-mail: todor_igor@yahoo.com Одержано: 2.08.2013

Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності

Репозитарії

Схожі ресурси