Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина
Проведены исследования по криоконсервированию эритроцитов лошади, быка, собаки под защитой проникающих и непроникающих криопротекторов. Выявлено, что криопротекторы ДМСО и ПЭО-1500 являются достаточно эффективными для криоконсервирования эритроцитов исследуемых животных....
Gespeichert in:
| Datum: | 2005 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2005
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/137094 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина / О. Н. Денисова, Г. Ф. Жегунов, Л. А. Бабийчук // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 2. — С. 195-201. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-137094 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1370942018-06-17T03:05:52Z Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина Денисова, О.Н. Жегунов, Г.Ф. Бабийчук, Л.А. Криоконсервирование биообъектов Проведены исследования по криоконсервированию эритроцитов лошади, быка, собаки под защитой проникающих и непроникающих криопротекторов. Выявлено, что криопротекторы ДМСО и ПЭО-1500 являются достаточно эффективными для криоконсервирования эритроцитов исследуемых животных. Проведено дослідження по заморожуванню еритроцитів коня, собаки, бика під захистом проникаючих та непроникаючих кріопротекторів. Встановлено, що кріопротектори ДМСО та ПЕО-1500 є достатньо ефективними для кріоконсервування еритроцитів досліджуваних тварин. Researches on cryopreservation of equine, bovine and canine erythrocytes with penetrative and non-penetrative cryoprotectants were carried-out. DMSO and PEO-1500 were revealed to be quite efficient for erythrocyte cryopreservation of animals under study. 2005 Article Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина / О. Н. Денисова, Г. Ф. Жегунов, Л. А. Бабийчук // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 2. — С. 195-201. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/137094 612.111:615.014.41:547.42 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов |
| spellingShingle |
Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов Денисова, О.Н. Жегунов, Г.Ф. Бабийчук, Л.А. Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Проведены исследования по криоконсервированию эритроцитов лошади, быка, собаки под защитой проникающих и непроникающих криопротекторов. Выявлено, что криопротекторы ДМСО и ПЭО-1500 являются достаточно эффективными для криоконсервирования эритроцитов исследуемых животных. |
| format |
Article |
| author |
Денисова, О.Н. Жегунов, Г.Ф. Бабийчук, Л.А. |
| author_facet |
Денисова, О.Н. Жегунов, Г.Ф. Бабийчук, Л.А. |
| author_sort |
Денисова, О.Н. |
| title |
Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина |
| title_short |
Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина |
| title_full |
Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина |
| title_fullStr |
Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина |
| title_full_unstemmed |
Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина |
| title_sort |
криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2005 |
| topic_facet |
Криоконсервирование биообъектов |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/137094 |
| citation_txt |
Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина / О. Н. Денисова, Г. Ф. Жегунов, Л. А. Бабийчук // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 2. — С. 195-201. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT denisovaon kriokonservirovanieéritrocitovživotnyhpodzaŝitojdimetilsulʹfoksidapoliétilenoksidaglicerina AT žegunovgf kriokonservirovanieéritrocitovživotnyhpodzaŝitojdimetilsulʹfoksidapoliétilenoksidaglicerina AT babijčukla kriokonservirovanieéritrocitovživotnyhpodzaŝitojdimetilsulʹfoksidapoliétilenoksidaglicerina |
| first_indexed |
2025-07-10T02:23:39Z |
| last_indexed |
2025-07-10T02:23:39Z |
| _version_ |
1837224921664585728 |
| fulltext |
195
УДК 612.111:615.014.41:547.42
Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой
диметилсульфоксида, полиэтиленоксида, глицерина
О.Н. ДЕНИСОВА1, Г.Ф. ЖЕГУНОВ1, Л.А. БАБИЙЧУК2
1Харьковская государственная зооветеринарная академия
2Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Cryopreservation of Animal’s Erythrocytes under Dimethyl Sulfoxide,
Polyethylene Oxide and Glycerol Protection
O.N. DENISOVA1, G.F. ZHEGUNOV1, L.A. BABIJCHUK2
1Kharkov State Veterinary Academy
2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy
of Sciences of the Ukraine, Kharkov
Проведены исследования по криоконсервированию эритроцитов лошади, быка, собаки под защитой проникающих и
непроникающих криопротекторов. Выявлено, что криопротекторы ДМСО и ПЭО-1500 являются достаточно эффективными
для криоконсервирования эритроцитов исследуемых животных.
Ключевые слова: эритроциты быка, коня, собаки, криоконсервирование, ПЭО-1500, глицерин, ДМСО.
Проведено дослідження по заморожуванню еритроцитів коня, собаки, бика під захистом проникаючих та непроникаючих
кріопротекторів. Встановлено, що кріопротектори ДМСО та ПЕО-1500 є достатньо ефективними для кріоконсервування
еритроцитів досліджуваних тварин.
Ключові слова: еритроцити бика, коня, собаки, кріоконсервування, ПЕО-1500, гліцерин, ДМСО.
Researches on cryopreservation of equine, bovine and canine erythrocytes with penetrative and non-penetrative cryoprotectants
were carried-out. DMSO and PEO-1500 were revealed to be quite efficient for erythrocyte cryopreservation of animals under study.
Key-words: bovine, equine, canine erythrocytes, cryopreservation, PEO-1500, glycerol, DMSO.
UDC 612.111:615.014.41:547.42
Адрес для корреспонденции: Бабийчук Л.А.., Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины, ул. Переяславская,
23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 373-01-26, факс: +38
(057) 373-30-84, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Address for correspondence: Babijchuk L.A., Institute for Problems
of Cryobiology&Cryomedicine of the Natl. Acad. Sci. of Ukraine, 23,
Pereyaslavskaya str.,Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 0126,
fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
В повседневной практике ветеринары часто
проводят различные трансфузиологические
операции. В частности, переливание крови
применяют при острых кровопотерях, состояниях
миелодепрессии с анемией, острых отравлениях
гемолитическими ядами, уремии. Поэтому
необходим определенный запас донорской крови.
Цельная кровь при положительных темпе-
ратурах (2-6°С) сохраняется ограниченное время.
Функциональная активность клеток крови при
использовании раствора “Глюгицир” снижается к
концу третьей недели хранения в результате
истощения содержания ферментов, ответственных
за поддержание метаболических процессов. При
добавлении метаболитов углеводно-фосфорного
обмена полноценные эритроциты сохраняются 30-
35 дней [5], но по истечении этого срока морфо-
функциональные свойства эритроцитов ухуд-
шаются. Поэтому запасы донорской крови живот-
ных можно создать лишь при длительном хранении
клеток в замороженном состоянии.
В настоящее время существуют методы крио-
консервирования клеток крови человека, позво-
ляющие хранить ее долгое время. Разработка
Different transfusive operations are frequent in the
veterinary routine practice. In particular, blood trans-
fusion is applied at an acute blood loss, myelodepression
states with anemia, acute poisoning with hemolytic
venoms, uremia. Therefore a certain stock for donor’s
blood is indispensable.
Under positive temperatures (2-6°C) the whole
blood is preserved for a limited time. Functional activity
of blood cells when using “Glygicir” solution decreases
to the end of third storage week as a result of
exhausting of enzyme content, responsible for metabolic
processes maintenance. When adding metabolites of
carbohydrate-phosphorus metabolism the integral
erythrocytes are preserved within 30-35 days [5], but
after that erythrocyte morphofunctional properties are
getting worse. Therefore the stocks of animal donor
blood can be created only when storing cells for a long
time in frozen state.
Nowadays there are the methods for human blood
cell cryopreservation, enabling its long-term storage.
The elaboration of such methods of blood storage for
animals will enable the blood bank creation, the
preservation of blood cell integrity and their usage for
treating different diseases.
КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ
БИООБЪЕКТОВ
CRYOPRESERVATION
OF BIOSYSTEMS
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
196
таких методов хранения крови для животных
позволит создать банк крови, сохранить полно-
ценность клеток крови и использовать их для
лечения различных заболеваний.
Цель работы – экспериментальный подбор
криопротекторов и условий криоконсервирования
эритроцитов, разработка методов замораживания
крови животных для дальнейшего создания банка
крови млекопитающих.
Материалы и методы
Объект исследований – эритроциты лошади,
быка, собаки, человека. В работе применяли
полиэтиленоксид молекулярной массой 1500
(ПЭО-1500), глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО).
Использовали криоконсерванты.
1. ЦНИИГПК 114: 4 % маннита; 0,7% NaCl;
0,03% Na2HPO4×12H2O; 30% глицерина.
2. 20%-й ДМСО; 150 мМ NaCl; 10 мМ фосфат-
ного буфера (рН 7,4).
3. 30%-й ПЭО; 150 мМ NaCl; 10 мМ фосфат-
ного буфера (рН 7,4).
Криоконсерванты добавляли к эритроцитам в
соотношении 1:1, замораживали до –196°С погруже-
нием контейнера в жидкий азот. Отогрев после
хранения производили в водяной бане 42-45°С.
Проникающие криопротекторы (глицерин и
ДМСО) удаляли из эритроцитов методом последо-
вательного центрифугирования. После оттаивания
к эритроцитам при постоянном помешивании
медленно добавляли отмывочные сахарозно-
солевые или солевые растворы.
Для первого отмывания (соотношение 1:1)
брали: 30,0 г сахарозы; 0,7 г NaCl; 10 мМ
фосфатного буфера; до 100 мл дистиллированной
воды или 0,6 М NaCl; 10 мМ фосфатного буфера.
После тщательного перемешивания взвесь
центрифугировали. Супернатант удаляли.
Для второго отмывания (соотношение 1:1)
использовали: 10,0 г сахарозы; 0,7 г NaCl; 10 мМ
фосфатного буфера; до 100 мл дистиллированной
воды или 0,15 М NaCl; 10 мМ фосфатного буфера.
После тщательного перемешивания взвесь
центрифугировали. Супернатант удаляли.
Для третьего отмывания (соотношение 1:1)
брали: 5,0 г сахарозы; 0,9 г NaCl; 10 мМ фосфат-
ного буфера; до 100 мл дистиллированной воды или
0,15М NaCl; 10мМ фосфатного буфера. После
тщательного перемешивания взвесь центри-
фугировали. Супернатант удаляли.
Показателем устойчивости клеток служил
гемолиз, который определяли согласно [4].
Моделирование трансфузии осуществляли
переносом суспензии эритроцитов в изотоническую
среду (150 мМ NaCl). Разведение эритроцитов
составляло 1:10, инкубацию проводили при 37°С в
течение часа.
The work aim was to experimentally select
cryoprotectants and conditions for erythrocyte
cryopreservation, to elaborate the methods of animal
blood freezing for further mammalian blood bank
creation.
Materials and methods
The investigation object was the equine, bovine,
canine and human erythrocytes. Polyethylene oxide
with 1500 molecular mass (PEO-1500), glycerol and
dimethyl sulfoxide (DMSO) were applied in the
research.
The following cryopreservatives were used:
1. Central R&D Institute of Hematology and Blood
Transfusion (CRDIHBT) 114: 4% mannitol; 0.7% NaCl;
0.03% Na2HPO4×12H20; 30% glycerol.
2. 20% DMSO, 150 mM NaCl; 10mM phosphate
buffer (pH 7.4).
3. 30%PEO; 150mM NaCl; 10 mM phosphate
buffer (pH 7.4).
Cryopreservatives were added to erythrocytes in
1:1 ratio, frozen down to –196°C by immersing
container into liquid nitrogen. Thawing after storage
was done on 42-45°C water bath.
Penetrative cryoprotectants (glycerol and DMSO)
were removed out of erythrocytes by the method of
successive centrifugation. After thawing the washing-
out sucrose-saline or saline solutions were slowly added
to erythrocytes at a constant mixing.
The first washing-out (1:1 ratio) comprised 30.0 g
sucrose; 0.7 g NaCl; 10 mM phosphate buffer; up to
100 ml distilled water or 0.6 M NaCl; 10 mM phosphate
buffer. After a thorough mixing the suspension was
centrifuged. The supernatant was removed.
For the second washing-out (1:1 ratio) we used
10.0 g sucrose; 0.7 g NaCl; 10 mM phosphate buffer;
up to 100 ml distilled water or 0.15 M NaCl; 10 mM
phosphate buffer. After thorough mixing the suspension
was centrifuged. The supernatant was removed.
For the third washing-out (1:1 ratio) it was 5.0 g
sucrose; 0.9 g NaCl; 10 mM phosphate buffer; up t o
100 ml distilled water or 0.15 M NaCl; 10 mM
phosphate buffer. After thorough mixing the suspension
was centrifuged. The supernatant was removed.
The index of cell resistance, i.e hemolysis was
determined as reported [4].
Transfusion modelling was carried-out by trans-
ferring erythrocyte suspension into isotonic medium
(150 mM NaCl). Erythrocyte dilution made 1:10, the
incubation was performed at 37°C for an hour.
The data were statistically processed with “Stat
Graphics Plus” Software. Number of experiments in
each series was above five.
Results and discussion
Nowadays there are different variants for human
donor blood cell cryopreservation. The most spread
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
197
Статистическую обработку данных осу-
ществляли по программе “Stat Graphics Plus”.
Количество экспериментов в каждой серии опытов
было пять и более.
Результаты и обсуждение
В настоящее время существуют различные
варианты криоконсервирования клеток донорской
крови человека. Наиболее распространен в
практике низкотемпературных банков нашей
страны метод криоконсервирования эритроцитов с
ограждающим раствором ЦНИИГПК 114 [1],
основу которого составляет глицерин в конечной
концентрации 15% в сочетании с экзоцеллюлярным
защитным веществом (маннитом). Криоконсервант
добавляли к клеточной массе в соотношении 1:1.
Данный метод позволяет сохранить до 80%
эритроцитов человека. Глицерин, хорошо про-
никающий в эритроциты человека и создающий в
них условия гиперосмолярности, необходимо
удалять после оттаивания клеток до их инкубации
в изоосмотической среде во избежание набухания
и лизиса клеток. Метод отмывания основан на
принципе постепенного разведения эритроцитов,
содержащих глицерин, гипертоническими раст-
ворами непроникающих в клетку веществ.
Осмотическая активность понижается при
уменьшении концентрации внутриклеточного
глицерина.
Проведенные исследования показали, что
процент гемолиза эритроцитов человека при
удалении глицерина сахарозно-солевыми и соле-
выми растворами соответственно составляет 16,09
и 18,8%; для эритроцитов собаки – 64,2 и 53,95%,
быка – 77,68 и 89,3%, лошади – 65,4 и 78,38%
(рис. 1). По-видимому, данный криопротектор не
проникает или проникает слабо через мембрану
клеток исследуемых животных.
Поскольку глицерин как криопротектор не дал
положительного результата при криоконсер-
вировании, был использован ДМСО, который
лучше, чем глицерин, проникает в эритроциты [3],
но в высоких концентрациях он разрушает клетку.
Поэтому выбрана его 10%-я конечная концентра-
ция. Экспериментально установлено оптимальное
время инкубации с криопротектором (в минутах)
до замораживания для полного проникновения
ДМСО в эритроциты исследуемых животных: для
эритроцитов лошади – 15, быка – 60, собаки – 75.
По данным [3] для эритроцитов человека равно-
весие достигается через 15 мин.
На рис. 2, а представлены результаты гемолиза
после замораживания-отогрева эритроцитов
млекопитающих с ДМСО. Разница заметна после
удаления криопротектора из эритроцитов быка
сахарозно-солевыми и солевыми отмывочными
method in practice of low temperature banks in our
country is that of erythrocyte cryopreservation with
CRDIHBT 114 limited solution [1], based on glycerol
in 15% final concentration together with exocellular
protective substance (mannitol). The cryopreservative
agent was added to cell mass in 1:1 ratio. This method
enables preservation up to 80% human erythrocytes.
Glycerol, well penetrating into human erythrocytes and
creating in them conditions of hyperosmolarity should
be removed after cell thawing prior to their incubation
in isoosmotic medium to avoid cell swelling and lysis.
The washing-out method is based on the principle of a
gradual dilution of glycerol-contained erythrocytes with
hypertonic solutions of non-penetrative substances into
a cell. An osmotic activity decreases with a reduction
in intracellular glycerol concentration.
Our investigations demonstrated that the hemolysis
percentage of human erythrocytes at glycerol removal
with sucrose-saline and saline solutions made 16.09
and 18.8%, correspondingly; 64.2 and 53.95% for
canine erythrocytes; 77,68 and 89.3% for bovine; 65.4
and 78.38% for equine ones (Fig. 1). Apparently, this
cryoprotectant does not penetrate or slightly does
through a cell membrane of the animals under study.
Since glycerol as cryoprotectant showed no positive
effect during cryopreservation, we used DMSO,
penetrating into erythrocytes better than glycerol [3],
but destroying a cell under high concentrations.
Therefore 10% final concentration was chosen. There
was experimentally established the optimal incubation
time with a cryoprotectant (in minutes) prior to freezing
for a complete DMSO penetration into erythrocytes
of studied animals: 15 for horse, 60 for bull and 75 for
dog. According to the data [3] the balance for human
erythrocytes is reached after 15 min.
Fig. 2a shows the results of hemolysis after
mammalian erythrocyte freeze-thawing with DMSO.
The difference is noticeable after cryoprotectant
removal out of bovine erythrocytes with sucrose-saline
and saline washing-out solutions. In equine and canine
erythrocytes there are less differences but in human
ones they are practically absent. For modelling
erythrocyte transfusion the temperature of 37°C and
isotonic medium are necessary. The modelling was
performed for 1 hour. Such conditions correspond to
physiological indices in a recipient’s blood channel, that
enables judging about a degree of cell engraftment.
During transfusion modelling the hemolysis percentage
of these cells in all studied animals is not high (Fig. 2, b).
Consequently, during freezing DMSO protects
erythrocytes of these animals better than glycerol.
For human erythrocytes there were elaborated
cryopreservation methods with non-penetrative
cryoprotectant PEO-1500, not requiring removal out
of frozen-thawed cells. This considerably facilitates
the procurement of qualitative frozen-thawed cells,
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
198
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
растворами. В эритроцитах лошади и собаки
различий меньше, а в эритроцитах человека они
практически отсутствуют. Для моделирования
трансфузии эритроцитов необходимы температура
37°С и изотоническая среда. Моделирование
проводили в течение часа. Такие условия соот-
ветствуют физиологическим показателям в
кровеносном русле реципиента, что позволяет
судить о степени приживаемости клеток. При
моделировании трансфузии процент гемолиза этих
клеток у всех исследуемых животных небольшой
(рис. 2, б). Следовательно, ДМСО защищает
эритроциты данных видов животных при замора-
живании лучше, чем глицерин.
Для эритроцитов человека разработаны методы
криоконсервирования под защитой непрони-
кающего криопротектора ПЭО-1500, который не
требует удаления из размороженных клеток. Это
значительно упрощает получение качественных
деконсервированных клеток, пригодных для
практического применения. На основании этого мы
также использовали ПЭО-1500 в конечной
концентрации 15% для криоконсервирования
эритроцитов исследуемых животных. Результаты
проведенных экспериментов (рис. 3, а) показали
незначительный гемолиз эритроцитов млеко-
питающих сразу после размораживания (0,5-2%).
Однако при моделировании трансфузии, т. е.
переносе размороженных эритроцитов в изото-
ническую среду, наблюдается значительный
гемолиз вследствие повреждения наименее
устойчивых эритроцитов (рис. 3, б). Наиболее
осмотически устойчивыми являются эритроциты
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
Рис. 1. Процент гемолиза эритроцитов, замороженных
под защитой криоконсерванта ЦНИИГПК 114: 1 – лошадь;
2 – бык; 3 – собака; 4 – человек; – отмывание сахарозно-
солевыми растворами; – отмывание солевыми раство-
рами. Результаты представлены в виде М±m, n=5.
Fig. 1. Hemolysis percentage of erythrocytes, frozen under
CRDIHBT 114 protection: 1 – horse; 2 – bull; 3 – dog; 4 –
human; – washing-out with sucrose-saline solutions; –
washing-out with saline solutions. Results are shown in
M±m, n=5.
Рис. 2. Уровень гемолиза эритроцитов, замороженных под защитой ДМСО: а – после размораживания и отмывания;
б – моделирования трансфузии; 1 – лошадь; 2 – бык; 3 – собака; 4 – человек; – отмывание сахарозно-солевыми
растворами; – отмывание солевыми растворами. Результаты представлены в виде М±m, n = 8.
Fig. 2. Hemolysis level of erythrocytes, frozen under DMSO protection: a – after freeze-thawing and washing-out; b – after
transfusion modelling; 1 – horse; 2 – bull; 3 – dog; 4 – human; – washing-out with sucrose-saline solutions; –
washing-out with saline solutions. Results are shown in M±m, n=8.
suitable for practical application. Based on this fact
we used PEO-1500 in 15% final concentration for
erythrocyte cryopreservation of animals under study
as well. The results of experiments performed (Fig. 3, a)
demonstrated a slight hemolysis of mammalian
erythrocytes just after freeze-thawing (0.5-2%).
However when modelling transfusion, i.e. the frozen-
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
а а б b
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
199
thawed erythrocyte transferring into isotonic medium,
a considerable hemolysis due to a damage of less
resistant erythrocytes is observed (Fig. 3, b). Human
erythrocytes are the most osmotically resistant ones
[2]. Hemolysis of equine erythrocytes after their
transfer into the media with isotonic tonicity is also
low and makes about 25%. Most considerable damage
is observed in bovine and canine erythrocytes.
The obtained differences in erythrocyte resistance
of different animals to cryopreservation can be related
to the peculiarities of their membrane structure. At
the same time both protein and lipid membrane
components affect the erythrocyte resistance to low
temperature effect. As reported in the papers [6, 7, 9]
in the membrane of bovine erythrocytes phospha-
tidylcholine is completely absent or is in trace amounts,
but in canine, equine and human erythrocytes it is 46.9;
42.4; 29.3%, correspondingly. The ratio of phospha-
tidylcholine to sphingomyelin is one of the factors,
determining the membrane fluidity. In the paper [11] it
was revealed, that erythrocytes with a low ratio of
these lipids were less damaged at the presence of
cation peptides than membranes with their high ratio.
The ratio of these phospholipids in the studied animals
is as follows: 3.141 for horse, 4.343 for dog and 1.149
for human. In erythrocytes of these animals a molar
ratio of cholesterol to phospholipids is different: it is
approximately 0.8 for human; 0.92 for bull and horse;
0.96 for dog.
Now it is known that the membrane and cytoskeletal
proteins are very important in a cell resistance to
extreme effects, including low temperatures. Based
on the comparison of erythrocyte membrane protein
composition in different animals using electrophoresis
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1 2 3 4
Рис. 3. Уровень гемолиза эритроцитов, криоконсервированных с ПЭО-1500: а – после размораживания;
б – моделирования трансфузии; 1 – лошадь; 2 – бык; 3 – собака; 4 – человек. Результаты представлены в виде М±m, n = 6.
Fig. 3. Hemolysis level of erythrocytes, cryopreserved with PEO-1500: a – after freeze-thawing; b – after transfusion
modelling; 1 – horse; 2 – bull; 3 – dog; 4 – human. Results are shown in M±m, n=6.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1 2 3 4
человека [2]. Гемолиз эритроцитов лошади после
их переноса в среды с изотонической тоничностью
также невелик и составляет порядка 25%. Более
значительное повреждение наблюдается в эритро-
цитах быка и собаки.
Полученные отличия в устойчивости эритро-
цитов различных видов животных к криоконсер-
вированию могут быть связаны с особенностями
строения их мембран. При этом на устойчивость
эритроцитов к низкотемпературному воздействию
оказывают влияние как белковые, так и липидные
компоненты мембраны. Согласно данным работ
[6, 7, 9] в мембране эритроцитов быка фосфати-
дилхолин отсутствует полностью или содержится
в следовых количествах, а в эритроцитах собаки,
лошади, человека – 46,9; 42,4; 29,3% соответственно.
Соотношение фосфатидилхолина к сфингомиелину -
один из факторов, определяющих текучесть
мембраны. В работе [11] установлено, что
эритроциты с низким соотношением этих липидов
повреждаются меньше в присутствии катионных
пептидов, чем мембраны с высоким их со-
отношением. Отношение этих фосфолипидов у
исследуемых животных следующее: лошадь –
3,141; собака – 4,343; человек – 1,149. В эритро-
цитах этих животных молярное соотношение
холестерина к фосфолипидам различно: для
человека – примерно 0,8; быка и лошади – 0,92;
собаки – 0,96.
Сейчас известно, что важную роль в устой-
чивости клеток к экстремальным воздействиям,
в том числе и низким температурам, играют белки
мембраны и цитоскелета. На основании сравнения
состава белков мембран эритроцитов различных
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
а а б b
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
200
видов животных с помощью электрофореза [8]
можно сделать вывод: при общей картине
мембранных белков у всех видов исследуемых
млекопитающих имеются отличия. Так, основные
мембранные белки, включающие полосы 1, 2, 3 и
5, присутствуют в эритроцитах лошади, быка,
собаки и человека, но в эритроцитах быка для белка
полосы 3 (анионный обменник) характерна
молекулярная масса выше (100 кДа). Эритроциты
быка, собаки и человека имеют отдельные полосы
4.1 и 4.2, в эритроцитах лошади обнаружен дефицит
белка полосы 4.2, который является важным
компонентом в стабилизации клеток [10]. Однако
в эритроцитах лошади в большом количестве
присутствуют белки полос 4.5 и 4.9. Следует
отметить, что в работе [8] наибольшие различия
на электрофореграммах были обнаружены в
области белков полосы 4.5 и ниже белка полосы 7,
которые идентифицируются как составные
компоненты системы транспорта воды плазма-
тической мембраны. Эти различия в составе
белков, вовлеченных в водную диффузию, по
мнению авторов [8], обусловливают различия в
проницаемости воды, обнаруженные ранее для
различных видов животных, что может влиять на
устойчивость эритроцитов к криоконсервированию.
Выводы
Криоконсервирование эритроцитов иссле-
дуемых животных под защитой консерванта
ЦНИИГПК 114 (достаточно эффективного для
замораживания эритроцитов человека) не дало
положительного результата.
Метод криоконсервирования эритроцитов
млекопитающих с ДМСО эффективно сохраняет
клетки после размораживания и переноса в
изоосмотические условия.
Криоконсервирование с ПЭО-1500 также
позволяет сохранить клетки после размора-
живания. Однако при переносе эритроцитов быка
и собаки в среду физиологической тоничности
наблюдается значительное повреждение этих
клеток.
[8] we can conclude as follows: at a common picture
of membrane proteins there are certain differences in
all studied mammals. Thus, all main membrane proteins,
including those for band 1, 2, 3 and 5 are present in
equine, bovine, canine and human erythrocytes, but in
bovine ones the higher molecular mass (100 kDa) is
typical for band 3 protein (anion exchanger). Bovine,
canine and human erythrocytes have separated 4.1
and 4.2 bands, in the equine ones there was found out
the band 4.2 protein lack, which is an important
component in cell stabilisation [10]. However in equine
erythrocytes the band 4.5 and 4.9 proteins are present
in a big amount. Of note is that in the paper [8] the
most differences in electrophoregrams were revealed
in band 4.5 protein area and below band 7 protein,
which are identified as the components of water
transport system of plasmatic membrane. The authors
believe [8] that these differences in composition of
proteins, involved in water diffusion, stipulate the
differences in water permeability, revealed earlier for
different animals, that can affect the erythrocyte
resistance to cryopreservation.
Conclusions
Cryopreservation of studied animals’ erythrocyte
under CRDIHBT 114 preservative protection (quite
efficient for human erythrocyte freezing) was
unsuccessful.
Method of mammalian erythrocyte cryopreser-
vation with DMSO efficiently preserves cells after
freeze-thawing and transfer into isoosmotic conditions.
Cryopreservation with PEO-1500 also enables cell
preservation after freeze-thawing. However when
transferring bovine and canine erythrocytes into the
medium with physiological tonicity a considerable
damage in these cells is observed.
Литература
Аграненко В.А., Федорова Л.И. Замороженная кровь и
её клиническое применение.– М.: Медицина, 1983.– 96 с.
Бабийчук Л. А. Механизмы температурно-осмотической
стабилизации эритроцитов при охлаждении и замо-
раживании в присутствии непроникающего крио-
протектора: Автореф. дис. ... докт. биол. наук.– Харьков,
2002.– 24 с.
Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология.- Киев: Наук.
думка, 1994.– 432 с.
References
Agranenko V.A., Fedorova L.I. Frozen blood and its clinical
application.– Moscow: Meditsina, 1983.– 96 p.
Babijchuk L.A. Mechanisms of temperature-osmotic
erythrocyte stabilisation during cooling and freezing at the
presence of non-penetrative cryoprotectant: Author’s
abstract of thesis for doctor’s degree obtaining (biology).–
Kharkov, 2002.– 24 p.
Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology.– Kiev: Naukova
Dumka, 1994.– 432 p.
Derviz G.V., Byalko N.K. Specification of the method of
haemoglobin determination, dissoluble in blood plasm // Lab.
delo.– 1966.– N8.– P. 461-464.
Mokeev I.N. Infusion-transfusion therapy: Reference book.–
Moscow, 1998.– 232 p.
Chernitsky E.A., Vorobej A.B. Structure and function of
erythrocyte membrane.– Minsk: Nauka i tekhnika, 1981.– 213 p.
Florin-Christensen J., Suarez C.E., Florin-Christensen M. et al.
A unique phospholipid organization in bovine erythrocyte
membranes // PNAS Biochemistry.– 2001.– Vol. 98, N14.–
P. 7736-7741.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
1.
2.
3.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
201
Matei H., Frentescu L., Benga Gh. Comparative studies of
the protein composition of red blood cell membranes from
eight mammalian species // J. Cell. Mol. Med.– 2000.– Vol. 4,
N4.– P. 270-276.
Nouri-Sorkhabi M.H., Agar N.S., Sullivan D.R. et al.
Phospholipid composition of erythrocyte membranes and
plasma of mammalian blood including Australian marsupials;
quantitative 31P NMR analysis using detergent // Comp.
Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol.– 1996.– Vol. 113,
N2.– P. 221-227.
Oguz K. Baskurt, Robert A. Farley, Herbert J. Meiselman.
Erythrocyte aggregation tendency and cellular properties in
horse, human and rat: a comparative study // Am. J. Physiol.
Heart. Circ. Physiol.– 1997.– Vol. 273.– P. H2604-H2612.
Oyewale J.O. Changes in osmotic resistance of erythrocytes
of cattle, pigs, rats and rabbits during variation in temperature
and pH // Zentralbl. Veterinarmed. A.– 1992.– Vol.39, N2.–
P. 98-104.
Accepted in 22.02.05.
Дервиз Г. В., Бялко Н. К. Уточнение метода определения
гемоглобина, растворенного в плазме крови // Лаб. дело. –
1966.– №8.– С.461-464.
Мокеев И. Н. Инфузионно-трансфузионная терапия:
Справочник.– М., 1998.– 232 с.
Черницкий Е.А., Воробей А.Б. Структура и функция
эритроцитарных мембран.– Минск: Наука и техника,
1981.– 213 с.
Florin-Christensen J., Suarez C. E., Florin-Christensen M. et al.
A unique phospholipid organization in bovine erythrocyte
membranes // PNAS Biochemistry.– 2001.– Vol. 98, N14.–
P. 7736-7741.
Matei H., Frentescu L., Benga Gh. Comparative studies of
the protein composition of red blood cell membranes from
eight mammalian species // J.Cell.Mol.Med.– 2000.– Vol. 4, N4.–
Р. 270-276.
Nouri-Sorkhabi M. H., Agar N. S., Sullivan D. R. et al.
Phospholipid composition of erythrocyte membranes and
plasma of mammalian blood including Australian marsupials;
quantitative 31P NMR analysis using detergent // Comp.
Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol.– 1996.– Vol. 113,
N2.– Р. 221-227.
Oguz K. Baskurt, Robert A. Farley, Herbert J. Meiselman.
Erythrocyte aggregation tendency and cellular properties in
horse, human and rat: a comparative study // Am. J. Physiol.
Heart. Circ. Physiol. – 1997.– Vol. 273.– Р. H2604- H2612.
Oyewale J.O. Changes in osmotic resistance of erythrocytes
of cattle, pigs, rats and rabbits during variation in temperature
and pH // Zentralbl. Veterinarmed. A.– 1992.– Vol. 39, N2.–
Р. 98-104.
Поступила 22.02.05
8.
9.
10.
11.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
|