Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных

Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Дата:2005
Автори: Жегунов, Г.Ф., Денисова, О.Н., Землянских, Н.Г.
Формат: Стаття
Мова:Russian
Опубліковано: Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2005
Назва видання:Проблемы криобиологии и криомедицины
Теми:
Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
Онлайн доступ:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138173
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных / Г.Ф. Жегунов, О.Н. Денисова, Н.Г. Землянских // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 3. — С. 566–569. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-138173
record_format dspace
spelling irk-123456789-1381732018-06-19T03:03:16Z Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных Жегунов, Г.Ф. Денисова, О.Н. Землянских, Н.Г. Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине 2005 Article Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных / Г.Ф. Жегунов, О.Н. Денисова, Н.Г. Землянских // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 3. — С. 566–569. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138173 615.014.41:547.422 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
topic Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
spellingShingle Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
Жегунов, Г.Ф.
Денисова, О.Н.
Землянских, Н.Г.
Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных
Проблемы криобиологии и криомедицины
format Article
author Жегунов, Г.Ф.
Денисова, О.Н.
Землянских, Н.Г.
author_facet Жегунов, Г.Ф.
Денисова, О.Н.
Землянских, Н.Г.
author_sort Жегунов, Г.Ф.
title Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных
title_short Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных
title_full Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных
title_fullStr Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных
title_full_unstemmed Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных
title_sort криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных
publisher Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate 2005
topic_facet Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138173
citation_txt Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных / Г.Ф. Жегунов, О.Н. Денисова, Н.Г. Землянских // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 3. — С. 566–569. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.
series Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv AT žegunovgf kriokonservirovanieisohrannostʹéritrocitovživotnyh
AT denisovaon kriokonservirovanieisohrannostʹéritrocitovživotnyh
AT zemlânskihng kriokonservirovanieisohrannostʹéritrocitovživotnyh
first_indexed 2025-07-10T05:16:06Z
last_indexed 2025-07-10T05:16:06Z
_version_ 1837235773626122240
fulltext 566ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №3 УДК 615.014.41:547.422 Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных Г.Ф. ЖЕГУНОВ,1 О.Н. ДЕНИСОВА 1, Н.Г. ЗЕМЛЯНСКИХ2 1Харьковская государственная зооветеринарная академия 2Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Адрес для корреспонденции: Жегунов Г.Ф., Харьковская государственная зооветеринарная академия , пгт. Малая Даниловка, Харьковская обл., Украина 62341 Переливание крови издавна считается высо- коэффективным методом интенсивной терапии. Наиболее частым показанием для трансфузии является острая или хроническая кровопотеря, а также анемии различного генеза. В ветеринарной практике часто возникают ситуации, когда необходимо быстро восполнить кровопотерю животного, а подходящего донора в этот момент нет. Ветеринарные врачи иногда из-за недостатка донорской крови не могут оказать помощь животному, и оно гибнет на операционном столе. Консервированная цельная кровь с добавлением раствора ADSOL хранится при температуре 4°С около 42 дней. Однако при таком хранении изменяется функциональность эритроцитов на протяжении 28 дней, трансфузия таких клеток носит повреждающий характер при клиническом приме- нении [5, 12]. Поэтому создание запасов донорской крови животных возможно лишь при долгосрочном хранении клеток в замороженном состоянии. Целью данной работы было разработать методы криоконсервирования, определить сохран- ность и функциональные показатели эритроцитов лошади, быка, собаки после цикла замораживания- отогрева под защитой диметилсульфооксида (ДМСО) и полиэтиленгликоля м.м.1500 (ПЭГ-1500). Материалы и методы Эритроциты лошади, быка, собаки замора- живали с 30% глицерином, 20% ДМСО и 30% ПЭО−1500. Криоконсерванты добавляли к эритро- цитам в соотношении 1:1. Отогрев после низкотем- пературного хранения производили в водяной бане 42-45°С. Проникающий криопротектор удаляли серийным центрифугированием. На первом этапе к взвеси оттаянных эритроцитов добавляли равный объем гипертонического солевого раствора, содержащего 0,6 М NaCl, рН 7,4. После чего эритроциты дважды промывали изотоническим раствором NaCl, рН 7,4. Моделирование транс- фузии осуществляли путем переноса суспензии эритроцитов в среду с физиологической тонич- ностью при 37°С. Разведение эритроцитов изотоническим раствором составляло 1:10. Индекс осмотической хрупкости определяли как концент- рацию NaCl, при которой происходит 50%-й гемолиз. После цикла замораживания–оттаивания определяли концентрацию 2,3-ДФГ по методу [4] и АТФ по методу [6]. Эритроциты жвачных характеризуются низким содержанием 2,3-ДФГ, что биохимически обусловлено укорочением N- терминального конца І-цепи гемоглобина, где в других видах эритроцитов находится сайт для связывания 2,3-ДФГ [7]. Поэтому определение данного метаболита в эритроцитах быка не проводилось. Тени эритроцитов получали гипо- тоническим шоком по методу [8], лизируя клетки на ледяной бане в 5 мМ фосфатном буфере, рН 8,0. Белки разделяли в ПААГ с градиентом порис- тости геля 5-20Т4С. Статистическую обработку данных проводили согласно программе “Stat Graphics Plus”. Коли- чество экспериментов в каждой серии опытов было пять и более. Результаты и обсуждение Для всех исследованных групп клеток мини- мальный уровень гемолиза после размораживания отмечался для ПЭО-1500 (1-3%), а макси- мальный – для глицерина (рис. 1). После криокон- сервирования клеток с ДМСО уровень гемолиза в надосадке колеблется от 18% ( у человека) до 28% ( у лошади). При этом менее всего повреждаются эритроциты человека и собаки, а больше всего − эритроциты лошади. На основании первичной оценки сохранности клеток в процессе криокон- сервирования был сделан вывод, что глицерин не способен обеспечить приемлемый уровень защиты эритроцитов животных при низких температурах. Возможно, это связано с тем, что данный криопротектор слабо или вообще не проникает через мембрану эритроцитов лошади, быка и собаки. ДМСО лучше, чем глицерин проникает в большинство биологических объектов [3] и позволяет сохранить достаточно высокий процент выживаемости эритроцитов данных животных после замораживания-отогрева. Поэтому для более детального анализа функциональных параметров клеток в дальнейшем сравнивали эффективность ПЭО–1500 и ДМСО. Стабильность суспензии эритроцитов была тестирована по индексу осмотической хрупкости, который свидетельствует об изменении механо- 567ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №3 эластических свойств плазматической мембраны. Индекс осмотической хрупкости (рис. 2) для эритроцитов, криоконсервированных под защитой ПЭО, достоверно выше в сравнении как с контрольными клетками, так и с эритроцитами, замороженными под защитой ДМСО. При сравне- нии данного показателя в группе контрольных и криоконсервированных с ДМСО клеток не обнаружено достоверно значимых отличий. При сравнении индекса осмотической хрупкости эритроцитов исследуемых животных видно, что эритроциты лошади являются менее осмотически устойчивыми, в то время как эритроциты собаки наиболее осмотически устойчивыми. Аналогич- ные закономерности были отмечены и при оценивании уровня гемолиза после размора- живания клеток. Видовая специфика устойчивости эритроцитов к стрессовым воздействиям, очевид- но, связана со структурными особенностями мембранно–цитоскелетного комплекса. Сравни- тельное изучение белков мембран эритроцитов с помощью электрофореза показало, что основные полосы 1, 2, 3 и 5 присутствуют в эритроцитах всех исследуемых нами животных. Белки полосы 4.1 и 4.2 присутствуют в белковом спектре у быка, собаки и человека. Однако в эритроцитах лошади обнаружен дефицит белка полосы 4.2, который является важным компонентом, определяющим осмотическое поведение (устойчивость) клеток [10]. Перенос клеток в условия с физиологической тоничностью при 37°С дает предварительное представление о степени сохранности эритроцитов в кровеносном русле. Из проведенных экспери- ментов (рис. 3) видно, что перенос эритроцитов во всех группах животных в изоосмотические условия после замораживания под защитой ДМСО не показал достоверно значимых отличий от контроля на протяжении суток. Перенос эритроцитов лошади, быка, собаки после их криоконсервирования под защитой ПЭО-1500 в изотонический раствор NaCl при 37°С ведет к резкому возрастания гемолиза, что отражает глубину повреждений клеток. Эти отличия для эритроцитов животных, криокон- сервированных с ПЭО–1500 от контроля (и клеток, замороженных в присутствии ДМСО) видны уже в течение первого часа. По истечении суток в данной серии экспериментов гемолиз увеличи- вается с 32−36 до 50%. Восстановление полноценности эритроцитов после низкотемпературного хранения предполагает оптимизацию как энергетического потенциала и жизнеспособности (показателем которых является АТФ), так и функциональных свойств (коррели- рующих с 2,3-ДФГ) [1]. Концентрация АТФ и 2,3- ДФГ в эритроцитах лошади, быка, собаки при Рис. 1. Уровень гемолиза эритроцитов млекопитающих после замораживания-отогрева под защитой криопро- текторов: – ПЭО; – ДМСО; – глицерин. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 лошадь бык собака человек Ге м ол из , % . 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 лошадь бык собака И нд ек с хр уп ко ст и Рис. 2. Индекс осмотической хрупкости эритроцитов млекопитающих в растворах криопротектора: – контроль; – ДМСО; – ПЭО. добавлении криопротекторов и последующем цикле замораживания – оттаивания достоверно не отличается от концентрации данных метаболитов в контрольной группе. Для выявления нарушений метаболизма эритроцитов использовали модель трансфузии. Так как инкубационная среда не содержала энергетических субстратов, то с течением времени происходит истощение энергетического потенциала. Однако этот методи- ческий подход позволит оценить в функциональном аспекте метаболическую стабильность клеток, криоконсервированных с различными криопро- текторами. Использование модели трансфузии показало, что после криоконсервирования эритро- цитов животных под защитой ПЭО-1500 уровень АТФ (рис. 4) и 2,3-ДФГ (рис. 5) в клетках падает. 568ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №3 Рис. 3. Уровень гемолиза эритроцитов собаки (а), лошади (в), быка (с) после моделирования трансфузии: – контроль; – после криоконсерви- рования под защитой 30%-го раствора ПЭО; – после криоконсервирова- ния под защитой 20%-го раствора ДМСО. а в с 0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 24 1 2 24 1 2 24 Время, час Ге м ол из , % а в с 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 24 0 24 0 24 Время , час ко нц ен тр аи я АТ Ф , м км ол ь/ г Н в Рис. 4. Динамика изменений уровня АТФ в эритроцитах собаки (а), лошади (в), быка (с) после криоконсервирования (n =6): – контроль; – под защитой 30%-го раствора ПЭО; – под защитой 20%-го раствора ДМСО. Величина данных метаболитов в эритроцитах исследуемых живот- ных, криоконсервированных под защитой ДМСО, достоверно не отличается от контрольной группы. Сохранение высоких уровней АТФ и 2,3-ДФГ в клетках после низкотемпературной консервации под защитой ДМСО свидетель- ствует о том, что клетки после цикла замораживания-отогрева обеспечивают поддержание мета- болизма на приемлемом уровне. Оптимальная концентрация АТФ и 2,3-ДФГ в эритроцитах связана с эффективностью трансфузии. Жиз- неспособность эритроцитов после трансфузии зависит от концентра- ции АТФ, хотя уровень этого метаболита не может быть лими- тирующем фактором определения их посттрансфузионной выжи- ваемости. Функция транспорта кислорода гемоглобином связана с уровнем 2,3-ДФГ. В случае исто- щения уровня АТФ в клетке 2,3- ДФГ является резервным источ- ников этого макроэргического соединения [9]. Исследования [11] показывают, что АТФ является инициатором гликолиза в эритро- цитах и его лимитирующим факто- ром, а также источником энергии для Na+,K+-АТФазы, Mg2+-АТФазы и Са2+,Mg2+-АТФазы. Принято считать, что биоло- гические мембраны являются наиболее криочувствительным компонентом клеток [2]. Результаты электро- форетического анализа свидетельствуют о том, что белковый спектр мембраны эритроцитов животных после обработки криопротекторами и после- дующего их криоконсервирования качественно не меняется (не происходит выпадения или образо- вания новых полос). Отсутствие выраженных изменений в организации мембранных белков при действии низких температур может быть связано с их криостабильностью или недостатком применя- емой методики для выявления возможных изменений. Выводы Установлено, что ПЭО-1500 способен воздейст- вовать на клетки как положительно, выступая в роли протектора и защищая их от разрушений в условиях криоконсервирования, обеспечивая а в 0 5 10 15 20 25 30 0 24 0 24 Время, час Ко нц ен тр ац ия 2 ,3 -Д Ф Г, м км ол ь/ г Н в Рис. 5. Динамика изменений уровня 2,3-ДФГ в эритро- цитах собаки (а), лошади (в) после криоконсервирования (n =6): – контроль; – под защитой 30%-го раствора ПЭО; – под защитой 20%-го раствора ДМСО. 569ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №3 высокий уровень выживаемости после размо- раживания, так и отрицательно, вызывая дестаби- лизацию мембран, что проявляется в физиоло- гических условиях. Наиболее эффективным (по совокупности исследуемых параметров) для эритроцитов лошади, быка, собаки оказался ДМСО, который обеспечивает приемлемый уровень сохранности клеток после замораживания- отогрева и последующую стабильность клеток. Литература Аграненко В.А., Федорова Л.И. Замороженная кровь и ее клиническое применение.– М.: Медицина, 1983.– 96 с. Белоус А.М., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении.– Киев: Наук. думка, 1982.– 255 с. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология.– Киев: Наук. думка, 1994.– 432 с. Мешкова Н.П., Алекахина В.В. Определение фосфоглице- риновой кислоты // Успехи биологической химии.– 1954.– С. 285-288. Мокеев И. Н. Инфузионно-трансфузионная терапия: Справочник.– М., 1998.– 232 с. Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods.– New York: Crune and stration.– 1975.– 160 p. Bunn Н.F. Evolution of mammalian hemoglobin function // Blood.– 1981.– Vol. 58, N2.– Р. 189-197. Fairbanks G., Steсk T.L., Wallach D.F.H. Electrolitic analysis of the major polypeptides of human erythrocyte membrane // Biochemistry.– 1971.– Vol. 10.– P. 2606-2617. Juel R. 2-3-diphosphoglycerate: its role in health and disease // CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Sci.– 1979.– Vol. 10, N2.– P. 113-146. Matei H., Frentescu L., Benga Gh. Comparative studies of the protein composition of red blood cell membranes from eight mammalian species // J. Cell. Mol. Med.– 2000.– Vol. 4.– N4.– Р. 270-276. Schrier S.H. Human erythrocytes membrane enzymes: current status and clinical correlates // Blood.– 1977.– Vol. 50, N2.– P. 227-237. Walker R.H. Technical Manual “American Association of Blood Banks”.– Bethesda.– 1996.– 200 p. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

Схожі ресурси