Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков
Приведены результаты исследований по оптимизации криозащитных и санитарных показателей желтоксодержащей среды. Установлено, что концентрирование желтоксодержащей среды и прогрев концентрата при 75°С в течение 30 мин обеспечивает стерильность и стабильность криозащитных свойств при хранении его в усл...
Gespeichert in:
| Datum: | 2007 |
|---|---|
| 1. Verfasser: | |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2007
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138194 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков / Б.М. Павленко // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 3. — С. 263-271. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-138194 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1381942018-06-19T03:06:57Z Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков Павленко, Б.М. Криоконсервирование биообъектов Приведены результаты исследований по оптимизации криозащитных и санитарных показателей желтоксодержащей среды. Установлено, что концентрирование желтоксодержащей среды и прогрев концентрата при 75°С в течение 30 мин обеспечивает стерильность и стабильность криозащитных свойств при хранении его в условиях комнатной температуры не менее 12 месяцев. Наведено результати досліджень по оптимізації кріозахисних і санітарних показників середовища, яке містить жовток. Встановлено, що концентрування такого середовища і прогрів концентрату при 75°С на протязі 30 хв забезпечує стерильність і стабільність кріозахисних властивостей при зберіганні його в умовах кімнатної температури не менше 12 місяців. The research results on optimization of cryoprotective and sanitary indices of yolk-containing medium were presented. It has been established that concentrating of yolk-containing medium and a concentrate warming at 75°C for 30 min provided sterility and stability of cryoprotective properties at its storage at room temperature conditions for 12 months as minimum. 2007 Article Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков / Б.М. Павленко // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 3. — С. 263-271. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138194 547.42:591.463.1.085.54.043 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов |
| spellingShingle |
Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов Павленко, Б.М. Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Приведены результаты исследований по оптимизации криозащитных и санитарных показателей желтоксодержащей среды. Установлено, что концентрирование желтоксодержащей среды и прогрев концентрата при 75°С в течение 30 мин обеспечивает стерильность и стабильность криозащитных свойств при хранении его в условиях комнатной температуры не менее 12 месяцев. |
| format |
Article |
| author |
Павленко, Б.М. |
| author_facet |
Павленко, Б.М. |
| author_sort |
Павленко, Б.М. |
| title |
Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков |
| title_short |
Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков |
| title_full |
Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков |
| title_fullStr |
Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков |
| title_full_unstemmed |
Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков |
| title_sort |
исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2007 |
| topic_facet |
Криоконсервирование биообъектов |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138194 |
| citation_txt |
Исследование влияния концентрированной криозащитной среды на выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированной спермы быков / Б.М. Павленко // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 3. — С. 263-271. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT pavlenkobm issledovanievliâniâkoncentrirovannojkriozaŝitnojsredynavyživaemostʹioplodotvorâûŝuûsposobnostʹdekonservirovannojspermybykov |
| first_indexed |
2025-07-10T05:18:44Z |
| last_indexed |
2025-07-10T05:18:44Z |
| _version_ |
1837235938462269440 |
| fulltext |
263 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, № 3
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
УДК 547.42:591.463.1.085.54.043
Б.М. ПАВЛЕНКО
Исследование влияния концентрированной криозащитной среды
на выживаемость и оплодотворяющую способность
деконсервированной спермы быков
UDC 547.42:591.463.1.085.54.043
B.M. PAVLENKO
Study of Effect of Concentrated Cryoprotective Medium
on Survival and Fertilizing Ability of Frozen-Thawed Bovine Sperm
Приведены результаты исследований по оптимизации криозащитных и санитарных показателей желтоксодержащей среды.
Установлено, что концентрирование желтоксодержащей среды и прогрев концентрата при 750С в течение 30 мин обеспечивает
стерильность и стабильность криозащитных свойств при хранении его в условиях комнатной температуры не менее 12 месяцев.
Ключевые слова: эякулят, сперма, желток, сахароза, глицерин, стерилизация, денатурация, спермодоза, криоконсервирование.
Наведено результати досліджень по оптимізації кріозахисних і санітарних показників середовища, яке містить жовток.
Встановлено, що концентрування такого середовища і прогрів концентрату при 750С на протязі 30 хв забезпечує стерильність
і стабільність кріозахисних властивостей при зберіганні його в умовах кімнатної температури не менше 12 місяців.
Ключові слова: еякулят, сперма, жовток, сахароза, гліцерин, стерилізація, денатурація, спермодоза, кріоконсервування.
The research results on optimization of cryoprotective and sanitary indices of yolk-containing medium were presented. It has been
established that concentrating of yolk-containing medium and a concentrate warming at 75°C for 30 min provided sterility and stability
of cryoprotective properties at its storage at room temperature conditions for 12 months as minimum.
Key-words: ejaculate, sperm, yolk, sucrose, glycerol, sterilization, denaturation, sperm dose, cryopreservation.
* Адрес для корреспонденции: ул. 7-й Гв. Армии, 3, п.о. Кулиничи,
Харьковская обл.Украина 62404; тел.:+38 (057) 740-33-16, факс:
+38 (057) 740-31-79, электронная почта: it_uaan@bk.ru
*Address for correspondence: 3, 7th Gv. Armii str., Kharkov region,
Ukraine 62404; tel.:+380 57 740 3316, fax: +380 57 740 3179, e-
mail: it_uaan@bk.ru
Institute of Cattle Breeding of Ukrainian Academy of Agrarian Sciences,
Kharkov, Ukraine
Институт животноводства УААН, г. Харьков
One of the cryoprotective media components at
sperm cryopreservation is 20-30% yolk of chicken eggs
restricting their storage term for one day [7, 8, 16, 17].
Often the yolk is the carrier of the Koch’s bacillus [8],
pullorosis agent, typhus, St. Sebastian’s disease,
aspergillosis, mycoplasmosis, salmonellosis [8, 12] that
may evoke a microbic contamination of genetic material
and then disorder a female reproductive function.
Other contamination of medium with environmental
air microflora at their preparing ex tempore under
conditions of breeding establishments also is not
excluded [2, 9] .
For sterilization of thermolabile biological media the
physical, chemical and mechanical ways: lyophilization,
pasterization, tinadelization, ultrafiltration, ultrasound
and radiation sterilization, chemical sterilization by
ethylene oxide and β-propyl acton are used. However
these ways are not acceptable for sterilization of yolk-
containing media due to yolk denaturation, lipid
peroxidation toxicity and technologic problems of
asepsis process.
The research aim is thedesigning of the stored for
a long time concentrated cryoprotective medium for
freezing of bovine sperm on the base of yolk, glycerol,
carbohydrates and a method of its industrial production.
При криоконсервировании спермы одним из
компонентов криозащитных сред является желток
куриных яиц в концентрациях 20-30%, ограничи-
вающий их срок хранения до одних суток [7, 8, 16,
17]. Часто желток бывает носителем микобактерий
туберкулёза [8], возбудителем пуллороза, тифа,
чумы, аспергиллёза, микоплазмоза и сальмо-
неллёза [8, 12], что может вызвать микробную
контаминацию генетического материала и затем
нарушить репродуктивную функцию самок. Не
исключена также дополнительная контаминация
сред микрофлорой окружающего воздуха при
приготовлении их ex tempore в условиях племенных
предприятий [2, 9].
Для стерилизации термолабильных биоло-
гических сред применяют физические, химические
и механические способы: лиофилизацию, пасте-
ризацию, тиндализацию, ультрафильтрацию,
ультразвуковую и радиационную стерилизацию,
химическую стерилизацию окисью этилена и β-про-
пилактоном. Однако эти способы неприемлемы
для стерилизации желтоксодержащих сред из-за
денатурации желтка, перекисного окисления
липидов, токсичности и технических сложностей
процесса обеззараживания [6, 13].
264
Materials and methods
The research objects were native frozen and
thawed bovine sperm cryoprotective media and their
components: chicken eggs’ yolk, lactose, sucrose and
glycerol. For the control we used the cryoprotective
lactose-glycerol-yolk medium [9, 10, 14, 15] used for
the sperm cryopreservation according to the Kharkov
technique (8.0 lactose; 7.0 glycerol, 30.0 yolk and
distilled water up to100 ml.
In the base of the research there was laid the
hypothesis on possible achieving the medium sterility
by concentrating in the yolk of carbohydrates and
glycerol having bacteriostatic properties at other
temperature treatment.
For experiments we used 2-7 years aged the sperm
of servicing bulls of black-and-white breed . Volume
and number of sexual cells their motility, survival and
bacterial contamination were examined according to
the functional standard on native and frozen sperm
[3].
Temperature shock of sexual cells treated with the
experimental medium was induced by removal of
thermostated 0.1 ml sperm sample at 18°C in the vial
cooled down to 0°C [5]. Coefficient of spermatozoa
cryoresistance was counted according to the formula:
R =
1
2
a
a ,
where
1
2
a
a
– the ratio of spermatozoa motility after
cryoeffect to the index of their motility prior to
cryoeffect, points.
Index of the absolute survival of frozen-thawed
spermatozoa was counted according to the formula:
Sa = a1+(at)n, [6]
where a1 – sperm motility just after freeze-thawing,
points; a – sperm motility at intervals during their
incubation at 38°C, points; t – the time between previous
and following determination of the sperm motility, hrs.
The concentrating of carbohydrates and glycerol
with suspension of disaccharide (lactose and sucrose)
and glycerol directly in chicken yolk was achieved.
Into the obtained suspensions the distilled water (0,
15.5; 31; 46.5 and 62 ml) was added, and thereby
provided different extense of lactose and glycerol
concentrations in yolk.
The effect of different yolk (15, 20, 25 and 30%)
and glycerol (2, 3, 4, 5, 6, and 7%) concentrations was
studied in sperm cells during freezing. Solubility extent
in yolk for disaccharide and thermal stability level of the
obtained thermolabile suspensions in the cryopreservation
medium composition was examined. During developing
of the medium sterilization method there were
determined the temperature limits, not causing the yolk
coagulation. Experimental and control media were
packed and kept on water bath with exposures of 10,
Цель исследований – создание долгохранящейся
концентрированной криозащитной среды для
замораживания спермы быков на основе желтка,
глицерина, углеводов и способа её промышленного
производства.
Материалы и методы
Объектами исследований были нативная,
замороженная и отогретая сперма быков, криопро-
текторные среды и их составляющие: желток
куриных яиц, лактоза, сахароза и глицерин. Для
контроля использовали криопротекторную лактозо-
глицерин-желточную среду [9, 10, 14, 15], приме-
няемую для криоконсервирования спермы по
Харьковской технологии (лактоза – 8,0; глицерин – 7,0;
желток – 30,0 и вода дистиллированная – до 100 мл).
В основу исследований положена гипотеза о
возможности достижения стерильности среды
концентрированием в желтке углевода и глицерина,
обладающих бактериостатическими свойствами
при дополнительной температурной обработке.
Для опытов использовали сперму быков-
производителей чёрно-пёстрой породы в возрасте
2-7 лет. Объём и количество половых клеток, их
подвижность, выживаемость и бактериальную
загрязненность определяли согласно действу-
ющему стандарту на нативную и замороженную
сперму [3].
Температурный шок половых клеток, обрабо-
танных опытной средой, вызывали перенесением
термостатированного при 18°С образца спермы
объёмом 0,1 мл в пробирку, охлаждённую до 0°С
[5]. Коэффициент криорезистентности спермиев
вычисляли по формуле:
R =
1
2
a
a ,
где
1
2
a
a
– отношение подвижности спермиев после
криовоздействия к показателю их подвижности до
криовоздействия, баллы.
Показатель абсолютной выживаемости декон-
сервированных спермиев вычисляли по [6]:
Sa = a1+(at)n,
где а1 – подвижность спермиев непосредственно
после деконсервирования, баллы; а – подвижность
спермиев через определённые промежутки
времени в условиях инкубирования их при 38°С,
баллы; t – время между предыдущим и после-
дующим определением подвижности спермиев, ч.
Концентрирования углеводов и глицерина в
криозащитной среде достигали суспензированием
дисахаридов (лактозы и сахарозы) и глицерина
непосредственно в курином желтке. В полученные
суспензии добавляли дистиллированную воду (0;
15,5; 31; 46,5 и 62 мл), что обеспечивало различные
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, № 3
265
20, 30, 40, 50 and 60 min at temperatures of 60, 65, 70,
75 and 80°C. The medium was considered as
homogeneous, if after its hydration the yolky globules
evenly distributed in a microscope vision field. Their
agglutination to the isolated conglomerates pointed to
yolk temperature denaturation.
For competitive experiments as basic components
of the improved medium there was used 25 ml native
chicken yolk, where 8.0 g sucrose was diluted, into
the obtained suspension 5.0 glycerol was added with
no water. After temperature treatment the suspension
was stored in as a concentrated one, but just prior to
the sperm dilution the medium concentrate was
additionally diluted with distilled water up to the optimal
osmolarity. When investigating the effect of medium
storage terms on their quality on sanitary indices and
stability of protective properties in the produced medium
as a model microflora the test-cultures E. Coli, Proteus
vulgaris, Staphilococcus aureus, Streptococcus
faecalis, Bac. subtilis microorganisms and virus of the
infectious rhinotracheitis (VIR) as well as virus diarrhea
(VD) were introduced. In the experimental tests per 1 ml
medium 250 thousands of microbial cells and viruses
were introduced and as for viruses it was assumed as
basis 50 units of the cytopathic effect (CPE) in 1 ml
medium. Microbiological investigations of experimental
medium after infection were performed with the
standard methods [1]. There were performed the
results of bacteriological research on the number of
revealed colony-forming units (CFU) in the material
under examination and for the viruses this was done
on the recorded CPD units. The media were sealed in
glass ampoules and warmed on water bath at 75°C
for 30 min. Afterwards they were maintained at room
temperature for 12 months. Medium quality was
estimated quarterly with determining total bacterial
contamination and Coli-titer.
Sperm were frozen with convector method
providing dosed high-rate cooling of the sealed sperm
doses [11]. Results were statistically processed by
Student’s method using Statgraph software [5].
Results and discussion
The possibility of decreasing the yolk and glycerol
concentrations in cryoprotective medium composition to
reduce their toxic effect on sexual cells was studied in
the first series of experiments. Maximum cell motility was
observed in the media samples with 20-25% yolk
concentration. Sperm motility in them made 4.5 points,
7.0 hrs survival at 38°C and 20 rel. units index of absolute
survival. Maximum sperm motility was observed during
freeze-thawing in the medium with 5% glycerol. In
comparison with 7% glycerol concentration after freeze-
thawing we observed an increase for the sperm activity
by 0.4 points, 0.5 for the survival, 4.3 rel. units for
absolute survival index.
степени концентрирования лактозы и глицерина в
желтке.
Изучали влияние на спермии при замо-
раживании различных концентраций желтка (15, 20,
25 и 30%) и глицерина (2, 3, 4, 5, 6 и 7%) В составе
среды консервирования определяли степень
растворимости дисахаридов в желтке и уровень
термоустойчивости полученных термолабильных
суспензий. При разработке способа стерилизации
среды устанавливали пределы температур, не
вызывающие коагуляции желтка. Опытные и
контрольные среды расфасовывали и выдерживали
в водяной бане с экспозициями 10, 20, 30, 40, 50 и
60 мин при температурах 60, 65, 70, 75 и 80°С.
Гомогенной считали среду, в которой после её
гидратации в поле зрения микроскопа равномерно
распределялись желточные глобулы. Склеивание
их в отдельные конгломераты указывало на
температурную денатурацию желтка.
Для сравнительных опытов как основные
составляющие усовершенствованной среды
использовали нативный желток куриных яиц
объёмом 25 мл, в котором растворяли 8,0 г
сахарозы. В полученную суспензию вносили 5,0 мл
глицерина без добавления воды. После темпе-
ратурной обработки суспензию хранили в кон-
центрированном виде, а непосредственно перед
разбавлением спермы концентрат среды допол-
нительно растворяли дистиллированной водой до
уровня оптимальной осмомолярности. При
изучении влияния сроков хранения сред на их
качество по санитарным показателям и ста-
бильности защитных свойств в изготовленную
среду в качестве модельной микрофлоры вносили
тест-культуры микроорганизмов E. Coli, Proteus
vulgaris, Staphilococcus aureus, Streptococcus
faecalis, Bac. Subtilis, а также вирусы инфек-
ционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи
(ВД). В опытные пробы на 1 мл среды вносили по
250 тыс микробных клеток, а вирусов – из расчёта
50 единиц цитопатического действия (ЦПД) в 1 мл
среды. Микробиологические исследования опытных
сред после заражения проводили общепринятыми
методами [1]. Результаты бактериологических
исследований учитывали по количеству выявлен-
ных в исследуемом материале колониеобра-
зующих единиц (КОЕ), а вирусов – по учтённым
единицам ЦПД. Среды герметизировали в
стеклянных ампулах и прогревали на водяной бане
при температуре 75°С в течение 30 мин. После
этого их выдерживали в условиях комнатной тем-
пературы 12 месяцев. Качество сред оценивали
через каждые 3 месяца определением общей
бактериальной загрязнённости и Коли-титра.
Сперму замораживали конвекторным способом,
обеспечивающим дозированное высокоскоростное
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, № 3
266
Warming of the concentrated medium up to 75°C
and the storage for 30 days at 4°C, did not change its
cryoprotective properties: motility after sperm freeze-
thawing remained at the control level (standard lactose-
glycerol-yolk medium subjected to thermal treatment). The
activity after dilution was 7.2±0.01 points, 4.8±0.02 points
after freeze-thawing, and 17.5±0.5 rel.units for the index
of the spermatozoa absolute survival at animal’s body
temperature.
During preparing and storage of the concentrated
media unsatisfactory solubility of lactose, manifesting
in the formation of heterogeneous suspension and its
stratification was found.
Analysis of the physical-chemical properties of
disaccharides showed that the most appropriate for
preparing the concentrated cryoprotective media of
sperm was sucrose. So, in the next experiment the
substitution efficiency of lactose to sucrose was studied
in the media under study. Herewith after freeze-
thawing the highest survival of sexual cells was achieved
when using sucrose. Sperm motility was 5.0 points, their
survival at 38°C was 9.2 hrs, 18.6 rel. units for absolute
survival index of spermatozoa at animal’s body
temperature.
It has been established that the substitution of
lactose to sucrose provided medium homogeny due to
total dilution of sucrose in yolk. Research data for
determining of the maximum admissible temperatures,
not causing yolk coagulation under high hypertonic
sucrose and glycerol concentrations were shown in
Table 1.
It has been established that the medium concentrating
contributes to an increase of temperature point of yolk
coagulation up to 80°C. So, at 75°C a yolk denaturation
in the experimental medium did not appear for 30-mins’
exposure, meanwhile as in the control it was recorded
after 10-mins’ exposure at 70°C. The obtained data
show the possibility of application for sterilization of the
experimental medium either at 80°C for 20 min or for
30 min at 75°C.
Thus, concentrated media in comparison with
standard diluters have higher stability to high
temperatures that provides a sterilization safety.
According to the obtained data experimental
medium was prepared, it was firstly tested as for
spermatozoa cryoresistance within the range of positive
temperatures and then we determined its efficiency at
sperm freezing. It has been established that the
spermatozoa diluted with the experimental medium,
which was warmed at 75°C for 30 min kept their
survival at the control level with non-warmed medium.
Motility of spermatozoa diluted of experimental medium
after temperature shock decreased from 7.9±0.05 to
5.2±0.05 points and the coefficient of cell cryoresistance
was 0.65±0.04. The same results were obtained when
using the medium not been subjected to temperature
охлаждение герметизированных спермодоз [11].
Статистическую обработку результатов выполняли
по методу Стьюдента с использованием програм-
много пакета “Statgraph” [5].
Результаты и обсуждение
В первой серии экспериментов изучали воз-
можность снижения в составе криозащитной среды
концентрации желтка и глицерина для уменьшения
их токсического влияния на половые клетки.
Максимальную подвижность клеток наблюдали в
образцах сред с концентрацией желтка 20-25%.
Подвижность спермиев в них составляла 4,5 балла,
выживаемость при температуре 38°С – 7,0 ч, а
показатель абсолютной выживаемости –20 усл. ед.
Максимальная подвижность спермиев наблюдалась
при замораживании-оттаивании в среде с 5%
глицерина. По сравнению с 7%-й концентрацией
глицерина после замораживания-оттаивания
наблюдали повышение активности спермиев на 0,4
балла, выживаемости – на 0,5 ч, показателя
абсолютной выживаемости – на 4,3 усл. ед.
Прогревание концентрированной среды до 75 °С
и хранение на протяжении 30 суток при 4°С не
изменяли её криозащитные свойства: подвижность
после замораживания-отогрева спермиев оста-
валась на уровне контроля (стандартная лактозо-
глицерин-желточная среда, не подвергавшаяся
термической обработке). Активность после
разбавления составляла 7,2±0,01 балла, после
замораживания-оттаивания – 4,8±0,02 балла, а
показатель абсолютной выживаемости спермиев
при температуре тела животных – 17,5±0,5 усл. ед.
В процессе изготовления и хранения концентри-
рованных сред выявлена неудовлетворительная
растворимость лактозы, проявляющаяся в образо-
вании гетерогенной суспензии и её расслоении.
Анализ физико-химических свойств дисаха-
ридов показал, что наиболее пригодной для
изготовления концентрированных криопротекторных
сред спермы является сахароза. Поэтому в
следующем опыте нами была изучена эффек-
тивность замены в исследуемых средах лактозы
на сахарозу. При этом после замораживания-
оттаивания лучшая выживаемость половых клеток
была достигнута при использовании сахарозы.
Подвижность спермиев составила 5,0 баллов,
выживаемость их при 38°С – 9,2 ч, показатель
абсолютной выживаемости спермиев при тем-
пературе тела животных – 18,6 усл. ед.
Установлено, что замена лактозы на сахарозу
обеспечила гомогенность среды за счет полного
растворения сахарозы в желтке. Данные иссле-
дований по определению максимально допусти-
мых температур, не вызывающих коагуляции
желтка в условиях высокогипертоничных концент-
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, № 3
267
адерС
muideM
,инабйонядоварутарепмеТ С°
C°,htabretawfoerutarepmeT
ним,енабйонядоввыдерсяицизопскЭ
nim,htabretawnierusopxemuideM
01 02 03 04 05 06
)тыпо(КЖГС
)tnemirepxe(MCYGS
06
- - - - - -
)ьлортнок(ЖГЛ
)lortnoc(YGL - - - - - -
)тыпо(КЖГС
)tnemirepxe(MCYGS
56
- - - - - -
)ьлортнок(ЖГЛ
)lortnoc(YGL - - - - - -
)тыпо(КЖГС
)tnemirepxe(MCYGS
07
- - - - - -
)ьлортнок(ЖГЛ
)lortnoc(YGL - + + + + +
)тыпо(КЖГС
)tnemirepxe(MCYGS
57
- - - + + +
)ьлортнок(ЖГЛ
)lortnoc(YGL + + + + + +
)тыпо(КЖГС
)tnemirepxe(MCYGS
08
- - + + + +
)ьлортнок(ЖГЛ
)lortnoc(YGL + + + + + +
Таблица 1. Влияние режима термообработки концентрированной среды с желтком на агрегатное состояние
разбавителя
Table 1. Effect of of thermal treatment regimen of concentrated medium with yolk on diluter aggregate state
Примечание: СГЖК– сахарозо-глицерин-желточная концентрированная среда; ЛГЖ – стандартная лактозо-глицерин-
желточная среда; (+) – наличие коагуляции желтка; (-) – отсутствие коагуляции желтка.
Notes: SGYCM - sucrose-glycerol-yolk concentrated medium; LGY – standard lactose-glycerol-yolk medium; (+) – presence of
yolk coagulation; (-) – absence of yolk coagulation.
treatment with 0.65±0.03 cryoresistance coefficient.
Research results prove that concentrated medium after
warming at high temperatures (75-80°C) do not lose
its cryoprotective properties.
For determining the protective activity of thermally
treated medium, the effect on bovine sperm quality
indices has been studied during freeze-thawing. Table 2
shows these research results.
Table data show higher survival of frozen-thawed
spermatozoa in the experimental SGYCM in comparison
with the control. Index of spermatozoa absolute survival
in the experiment made 23.8 vs 15.3 rel.units in the
control.
Thus, the proposed medium in comparison with
standard one provides more efficient protection of the
spermatozoa from cryodestructions at their preservation.
In the next experiment we studied sanitary
conditions’ efficiency of the proposed preparing method
of concentrated preservative, i.e. thermal treatment in
the conditions of artificial contamination with bacteria
and viruses isolated from reproductive tracts of cows
with endometriosis. Simultaneously we determined the
protective from cryodestruction media effect on bovine
sperm during deep freezing in liquid nitrogen. Research
results are shown in Tables 3, 4.
раций сахарозы и глицерина, приведены в табл. 1.
Установлено, что концентрирование среды
способствует повышению температурной точки
коагуляции желтка почти до 80°С. Так, при 75°С
денатурация желтка в исследуемой среде не
наступала в течение 30-минутной экспозиции, в то
время как в контроле она зарегистрирована после
10-минутной экспозиции при температуре 70°С.
Полученные данные свидетельствуют о возмож-
ности применения для стерилизации опытной среды
при 80°С в течение 20 мин или при 75°С – 30 мин.
Таким образом, концентрированные среды по
сравнению со стандартными разбавителями
имеют более высокую стойкость к повышенным
температурам, что обеспечивает надёжность
стерилизации.
С учётом полученных данных была изготовлена
исследуемая среда, которую сначала проверили на
криорезистентность спермиев в диапазоне
положительных температур, а затем определили
её эффективность при замораживании спермы.
Установлено, что спермии, разбавленные экспери-
ментальной средой, которую прогревали при 75°С
в течение 30 мин, сохраняли свою выживаемость
на уровне контроля, в котором использовали
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, № 3
268
ымрепсавтсечакилетазакоП
secidniytilauqmrepS
ЖГЛ
)ьлортнок(
)lortnoc(YGL
)тыпо(КЖГС
MCYGS
)tnemirepxe(
елсопьтсонживдоП
яинелвабзар
noitulidretfaytilitoM
2,0±3,7 2,0±3,7
елсопьтсонживдоП
-яинавижаромаз
яинавиатто
gniwaht-ezeerfretfaytilitoM
2,1±5,4 2,1±7,4
ьтсомеавижывяантюлосбА
lavivrusetulosbA 20,0±3,51 20,0±8,32
ч,ьтсомеавижыВ
srh,lavivruS 50,0±5,7 50,0±3,9
Таблица 2. Влияние термически обработанной
исследуемой среды на качественные показатели
спермы быков-производителей при
ее замораживании-отогреве ( n = 10)
Table 2. Effect of thermally treated medium under
study on qualitative indices of servicing bulls’ sperm
during freeze-thawing (n=10)
The obtained data show that concentrating and
warming of the medium provide high sperm survival
and medium sterility that may be the base for practical
application of new medium variant of its production
method.
The experiments for the determining of sperm
fertilizing ability were carried out depending on the used
for its cryopreservation medium in “Vostok” agricultural
cooperative of Izumskiy district (Kharkov region).
Use of this medium provided 76.0% fertilization and
maximum 65.7% at the standard one. In addition,
thermal treatment of medium deprives the yolk protein
components of damaging for the spermatozoa non-
specific immunological directivity [4, 6].
The comparison data of suggested variant with the
prototype have been shown in Table 5.
Data of Table 5 indicate that suggested cryo-
protective medium for sperm preservation of breeders
in comparison with the prototype has the following
advantages:
Expenses for purchasing of glass ampoules and for
the storage and transportation of produced media too
are reduced in 2.5 times.
At the storage and delivery to a consumer of the
batches of media in cold season the possibility of failure
of sealed glass ampoules with media (cracking) due to
a decrease of concentrate freezing point is excluded.
The keeping of stability of sanitary and biological quality
of the medium during two years’ storage is achieved.
Survival and fertilizing ability of spermatozoa are
increased by 17% due to elimination of toxic and
microbial factors.
The temperature point of yolk denaturation increa-
ses that makes possible the use of higher temperatures
непрогретую среду. Подвижность разбавленных
исследуемой средой спермиев после темпера-
турного шока снижалась с 7,9±0,05 до 5,2±0,05
балла, а коэффициент криорезистентности клеток
составлял 0,65±0,04. Аналогичные результаты
получены при использовании среды, которую не
подвергали температурной обработке, с коэффи-
циентом криорезистентности 0,65±0,03. Резуль-
таты исследований доказывают, что концентри-
рованная среда после прогревания при высоких
температурах (75-80°С) не теряет своих крио-
защитных свойств.
Для определения защитного действия тер-
мически обработанной среды изучено её влияние на
качественные показатели спермы быка при её
замораживании-отогреве. Результаты этих иссле-
дований приведены в табл.2.
Данные таблицы свидетельствуют о получении
более высокой выживаемости замороженно –
отогретых спермиев в опытной СГЖК среде по
сравнению с контролем. Показатель абсолютной
выживаемости спермиев в опыте составлял 23,8
(в контроле – 15,3) усл. ед.
Таким образом, предложенная среда по
сравнению со стандартной обеспечивает более
эффективную защиту спермиев от криопов-
реждений при их консервировании.
В следующем опыте изучали санирующую
эффективность предложенного способа изго-
товления концентрированного консерванта –
термообработки в условиях искусственного
загрязнения его культурами бактерий и вирусов,
выделенных из половых путей коров, больных
эндометритом. Параллельно с этим определяли
защитное от криоповреждений воздействие сред
на сперму быков при глубоком её замораживании
в жидком азоте. Результаты исследований приве-
дены в табл. 3 и 4.
Полученные данные показывают, что кон-
центрирование и нагрев среды обеспечивают
высокую выживаемость спермиев и стерильность
среды, что может служить основанием для
внедрения в практику нового варианта среды и
способа её изготовления.
Опыты по определению оплодотворяющей
способности спермы в зависимости от исполь-
зованной для ее криоконсервирования среды
проведены в сельскохозяйственном кооперативе
“Восток” Изюмского р-на Харьковской области.
Применение этой среды дало возможность
получить оплодотворение на уровне 76,0%, а при
стандартной среде – не более 65,7 %. Кроме того,
термическая обработка среды лишает белковые
компоненты желтка вредной для спермиев неспеци-
фической иммунологической настроенности [4, 6].
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, № 3
269
вомзинагрооркимарутьлук-тсеТ
serutluc-tsetmsinagroorciM
мс0,1влетхынборким(атнавреснокьтсоннёнзяргазяанборкиМ 3)
mc0.1niseidoblaiborcim(evitavreserpehtfonoitanimatnoclairetcaB 3)
яинесенвод
вомзинагроорким
fonoitcudortnierofeb
smsinagroorcim
яинесенвелсоп
вомзинагроорким
fonoitcudortniretfa
smsinagroorcim
ииктобарбоомретелсоп
вецясем21еинечетвяиненарх
dnatnemtaertlamrehtretfa
shtnom21rofegarots
iloc.Е оньлиретС
eliretS
мс/.к.м.сыт052 3
laiborcimsdnasuoht052
mc/seidob 3
оньлиретС
eliretS
siragluvsuetorP -
мс/.к.м.сыт052 3
laiborcimsdnasuoht052
mc/seidob 3
-
sueruasuccocolihpatS -
мс/.к.м.сыт052 3
laiborcimsdnasuoht052
mc/seidob 3
-
silaceаfsuccocotpertS -
мс/.к.м.сыт052 3
laiborcimsdnasuoht052
mc/seidob 3
-
ТРИсуриВ
suriVTRI -
мс/05ДПЦ 3
mc/05DPC 3 -
ДВсуриВ
suriVDV -
мс/05ДПЦ 3
mc/05DPC 3 -
енымзинагроорким(ьлортноК
)илисонв
fonoitcudortnion(lortnoC
)smsinagroorcim
- оньлиретС
eliretS -
Таблица 3. Влияние термообработки консерванта, искусственно контаминированного тест- культурами
микроорганизмов, на его санитарную стабильность при хранении
Table 3. Effect of thermal treatment of preservative artificially contaminated with microorganism test-cultures on its
sanitary stability during storage
репсяинавиатто-яинавижаромазелсопкотелкхыволопьтсонживдоП сем,яиненархвокорстоитсомисивазв,ыллаб,ым
shtnom,smretegarotsnognidnepedgniwaht-ezeerfmrepsretfaslleclauxesfoytilitoM
0 3 6 9
тыпО
tnemirepxE
ьлортноК
lortnoC
тыпО
tnemirepxE
ьлортноК
lortnoC
тыпО
tnemirepxE
ьлортноК
lortnoC
тыпО
tnemirepxE
ьлортноК
lortnoC
тыпО
tnemirepxE
ьлортноК
lortnoC
0,5 5,4 0,5 0,4 5,4 0,4 5,4 5,4 0,5 5,4
Таблица 4. Биологическая активность деконсервированной спермы в зависимости
от сроков хранения консерванта
Table 4. Biological activity of frozen-thawed sperm depending on preservative storage terms
for the medium warming and provides their reliable
sterilization.
Conclusions
It has been established that native yolk provides a
complete solubility of sucrose in it and forms
homogeneous colloidal solution with glycerol.
It has been established that concentration increase
in yolk of sucrose up to 32% and of glycerol up to 20 %
makes the conditions for increase of the point of yolk
denaturation up to 80°C (65°C in control) that enables
the rise in reliability of thermal sterilization of medium.
Данные сравнения предложенного варианта с
прототипом приведены в табл. 5.
Данные табл. 5 свидетельствуют, что предло-
женная криопротективная среда для консерви-
рования спермы производителей в сравнении с
прототипом имеет следующие преимущества.
В 2,5 раза сокращаются затраты на при-
обретение стеклянных ампул, а также на хранение
и транспортировку изготовленных сред. При
хранении и поставке потребителю партий сред в
холодное время года исключается возможность
нарушения герметичности стеклянных ампул со
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, № 3
270
Tаблица 5. Сравнительная эффективность использования
концентрированной долгохранящейся среды
Table 5. Comparative efficiency of use of concentrated medium stored
for a long time medium
илетазакоП
secidnI
тыпО
tnemirepxE
ьлортноК
lortnoc
лм,ыдерсясйещянархмеъбО
lm,muidemderotsfoemuloV 024 0001
яинавориртнецнокьнепетС
etargnitartnecnoC 3,2 0
ииквосафсарялдлупмаовтсечилоК
тш,ыдерсяиненарх
dnagnikcaprofseluopmaforebmuN
stinu,muidemfoegarots
4,8 02
,ыдерсиицазиллатсиркарутарепмеТ С°
C°,muidemfoerutarepmetnoitazillatsyrC 02- 8-
ыдог,ыдерситсондогирпкорС
sraey,mretytidilavmuideM 2 -
елсопвеимрепсьтсомеавижыВ
%,яинавижаромаз
%,gnizeerfretfalavivrusmrepS
05 24
елсопворокьтсомеяровтодолпО
%,яиненемесооговреп
tsrifehtretfaswocfonoitazilitreF
%,noitanimesni
28 56
Use of the concentrating components’ of yolk-
containing medium jointly with warming at 75°C for
30 min provided the sterility of pre-contaminated
medium and did not decrease its protective properties
during sperm cryopreservation.
Suggested composition and preparing method for
yolk-containing medium make it possible to save
original cryoprotective and sanitary properties for 24
storage months at room temperature (observation time).
средой (растрескивание) за счет сниже-
ния точки замерзания концентрата.
Достигается сохранение стабильности
санитарного и биологического качества
среды на протяжении двух лет хранения.
Повышаются выживаемость и оплодотво-
ряющая способность спермиев на 17% за
счет устранения токсичного и микробного
факторов. Повышается температурная
точка денатурации желтка, что дает
возможность использовать более высокие
температуры для нагрева среды и обеспе-
чить надежную их стерилизацию.
Выводы
Установлено, что нативный желток
обеспечивает полную растворимость в
нём сахарозы и образует в комплексе с
глицерином гомогенный золь.
Установлено, что повышение концент-
рации в желтке сахарозы до 32 и глицерина
до 20% создаёт условия для повышения
точки денатурации желтка до 80°С (65°С
в контроле), позволяющие повысить
надёжность термической стерилизации среды.
Применение концентрирования компонентов
желтоксодержащей среды в комплексе с прогревом
при 75°С в течение 30 мин обеспечило стерильность
предварительно загрязнённой среды и не снизило
её защитных свойств при криоконсервировании
спермы. Предложенные состав и способ изго-
товления желтоксодержащей среды позволяют
сохранить первоначальные криозащитные и
санитарные свойства её в течение 24 месяцев
хранения при комнатной температуре (срок
наблюдения).
Литература
Балашов Н.Г. Ветеринарный контроль при искус-
ственном заражении животных.– М.: Колос, 1980.– 272 с.
Варнавский А.Н. Микробное загрязнение семени
сельскохозяйственных животных и меры его устранения //
Животноводство.– 1963.– №10.– С. 66-68.
ДСТУ 3535-97. Сперма бугаїв нативна. Технічні умови. –
Київ, 1998. – 23 с.
Загаевский И.С. Источники обсеменения яиц микрофлорой
и их дезинфекция // Птицеводство.– №6.– 1969.– С. 33-34.
Лакин Г.Ф. Биометрия. – М.: Высш. школа, 1990. – 352 с.
Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусст-
венное осеменение животных. Монография.– М., 1962.–
696 с.
Осташко Ф.И. Биотехнология воспроизведения крупного
рогатого скота.– Киев: Аграрна наука, 1995.– 180 с.
Осташко Ф.И. О природе холодового удара живчиков //
Искусственное осеменение сельскохозяйственных
животных: Сб. научных трудов.– Харьков, 1963.– С. 22-41.
Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное
хранение спермы производителей.– Киев: Урожай, 1978.–
255 с.
References
Balashov N.G. Veterinary control at the artificial infection of
animals.– Moscow: Kolos, 1980.– 272 p.
Varnavsky A.N. Microbial contamination of agricultural animals
sperm and methods of its elimination // Zhivotnovodstvo.–
1963.– №10.– P. 66-68.
STSU 3535-97. Native sperm of bulls. State technical
standards of Ukraine.– Kiev, 1998.– 23 p.
Zagaevskiy I.S. Sources of eggs microflora contamination
and their disinfecting // Ptitsevodstvo.– №6.– 1969.– P.33-34.
Lakin G.F. Biometry.– Moscow: Vysshaya Shkola, 1990.–
352 p.
Milovanov V.K. Reproduction biology and artificial insemination
of animals: Monography. – Moscow, 1962.– 696 p.
Ostashko F.I. Reproduction biotechnology of bovine cattle.–
Kiev: Agrarna Nauka, 1995.– P.180.
Ostashko F.I. About character of spermatozoa cold shock //
Artificial insemination of agricultural animals: Coll. of scientific
papers.– Kharkov, 1963.– P. 22-41.
Ostashko F.I. Deep freezing and long-term storage of servicing
bulls’ sperm.– Kiev: Urozhay, 1978.– 255 p.
Ostashko F.I., Pavlenko M.P., Pavlenko L.N. Determining
method of anti-shock characteristic of protective components
in diluters at the effect of low temperature on spermatozoa //
New in the methods of zootechnic investigations.– Kharkov,
1992.– P. 138-142.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, № 3
271
Pavlenko B.M. Effect of sperm freezing with convector
method on the survival and fertilizing capacity after freeze-
thawing // Problems of cryobiology.– 2007.– Vol.17,№2.–
P.173-178.
Pavlenko M.P. Development and production technologies of
servicing bulls’ sperm cryopreservation: Authors abstract of
the thesis of doctor of biol. science.– Kharkov, 1981.– 20 p.
Pavlenko L.M. Long-term storage medium for cryopreservation
of bovine sperm and methods of its production: Author’s abstract
of the thesis of doctor of agricul. sciences.– Kharkov, 1999.–
19 p.
Sokolov V.D., Malinin A.I. About transovarially transmitted
avian diseases // Veterinariya.– 1981. Issue 8. – P.66-68.
Author’s certificate of the USSA №523693. Cl. A61D7/02.
Cryopreservation method of animals’ sperm / F.I. Ostashko,
M.P. Pavlenko. Applied 26.07.1974. Publ.05.08.1976. Bull. 29.
Ostashko F.I., Pavlenko M.P., Pavlenko L.N. Anti-shock
effect of yolk and components in cooling spermatozoa of bull,
ram and boar / 10th international Congress of Animal Reproduction
and A.I.– Illinois (USA).– 1984.– Vol.1.– P. 209-211.
Phillips P.H., Lardy H.A. A yolk-buffered pabulum for the
preservation of the bull semen // J. Dairy Sci.– 1940.– Vol.23.–
P. 394-396.
Accepted in 30.03.2007
Осташко Ф.І. Павленко М.П., Павленко Л.М. Методика
визначення антишокових властивостей захисних
компонентів в розбавлювачах при дії низьких температур
на спермії // Нове в методах зоотехнічних досліджень.–
Харків, 1992. – С.138-142.
Павленко Б.М. Влияние замораживания спермы конвек-
торным методом на выживаемость и оплодотворяющую
способность после деконсервирования // Пробл. криобио-
логии.– 2007.– Т. 17, №2.– С. 173-178.
Павленко М.П. Усовершенствование и разработка техно-
логии криоконсервации спермы быков-производителей:
Автореф. дис. ... канд. биол. наук.– Харьков, 1981.– 20 с.
Павленко Л.М. Довгозбережне середовище для кріокон-
сервації сперми бугаїв та способи його виготовлення:
Автореф. ... дис. канд. с-г. наук.– Харків, 1999.– 19 с.
Соколов В.Д., Малинин А.И. О болезнях птиц, пере-
дающихся трансовариально // Ветеринария.– 1981. Вып. 8.–
С. 66-68.
А.с. СССР №523693. Кл. А61Д7/02. Способ консер-
вирования спермы животных / Ф.И. Осташко, М.П. Пав-
ленко. Заявл. 26.07.1974. Публ. 05.08.1976. Бюл. №29.
Оstashko F.I., Pavlenko M.P., Pavlenko L.N. Antishock effect
of yolk and components in cooling spermatozoa of bull, ram
and boar / 10th International Congress of Animal Reproduction
and A.I.– Illinois (USA).– 1984.– Vol. 1.– P. 209-211.
Phillips P.H., Lardy H.A. A yolk-buffered pabulum for the
preservation of the bull semen // J.Dairy Sci.– 1940.– Vol.23.–
Р. 394-396.
Поступила 30.03.2007
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, № 3
|