Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК

Подкожная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы (мфПЖ) рассматривается в качестве альтернативного подхода трансплантации островков и используется при невозможности получения «истинных» островков из фетальной ПЖ человека или ткани неонатальных животных (поросята, кролики). В работе ис...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2015
Автори:	Копич, Ю.И., Божок, Г.А., Легач, Е.И.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2015
Назва видання:	Проблемы криобиологии и криомедицины
Теми:	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/140002
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК / Ю.И. Копич, Г.А. Божок, Е.И. Легач // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2015. — Т. 25, № 1. — С. 45–56. — Бібліогр.: 44 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-140002
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1400022018-06-22T03:03:03Z Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК Копич, Ю.И. Божок, Г.А. Легач, Е.И. Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Подкожная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы (мфПЖ) рассматривается в качестве альтернативного подхода трансплантации островков и используется при невозможности получения «истинных» островков из фетальной ПЖ человека или ткани неонатальных животных (поросята, кролики). В работе исследовали уровень глюкозы у крыс с экспериментальным сахарным диабетом (СД) I типа после трансплантации мфПЖ неонатальных поросят, а также структурную сохранность трансплантата в зависимости от его предварительной обработки путем культивирования или гипотермического хранения (ГХ) в растворе НТК («Custodiol®»). После подкожной трансплантации мфПЖ новорожденных поросят крысам с моделью стрептозотоцинового СД уровень глюкозы нормализовался к 45 суткам. В результате трансплантации мфПЖ, которые были подвергнуты гипотермическому хранению в растворе НТК, наблюдалось ослабление гипергликемии, сходное с тем, что и после использования свежевыделенных мфПЖ. Путем гистологического и морфометрического анализа установлено, что к 15–22 суткам в трансплантате происходит замещение секреторной ткани ПЖ на соединительную, причем этот процесс более интенсивный в культивированных мфПЖ. Поскольку уровень глюкозы у крыс с моделью СД нормализовался на фоне отсутствия инсулинопродуцирующей ткани ПЖ в трансплантате, предполагается существование специфических факторов, приводящих к стимуляции неогенеза β-клеток в собственной железе реципиента. Підшкірна трансплантація мікрофрагментів підшлункової залози (мфПЗ) розглядається в якості альтернативного підходу трансплантації острівців та використовується при неможливості отримання «істинних» острівців із фетальної ПЗ людини або тканини неонатальних тварин (поросята, кролики). У роботі досліджували рівень глюкози у щурів із експериментальним цукровим діабетом (ЦД) I типу після трансплантації мфПЗ неонатальних поросят, а також структурну цілісність трансплантата в залежності від його попередньої обробки шляхом культивування або гіпотермічного зберігання в розчині НТК («Custodiol®»). Після підшкірної трансплантації мфПЗ неонатальних поросят щурам із моделлю стрептозотоцинового ЦД рівень глюкози нормалізувався на 45 добу. У результаті трансплантації мфПЗ, які були піддані гіпотермічному зберіганню в розчині НТК, спостерігалося послаблення гіперглікемії, подібне до того, що й після використання свіжовиділених мфПЗ. За допомогою гістологічного та морфометричного аналізу встановлено, що на 15–22 добу в трансплантаті відбувається заміщення секреторної тканини ПЗ на сполучну, причому цей процес більш інтенсивний у культивованих мфПЗ. Оскільки нормалізація рівня глюкози у щурів із моделлю ЦД спостерігалася на тлі відсутності інсулінопродукуючої тканини ПЗ у трансплантаті, передбачається існування специфічних факторів, які призводять до стимуляції неогенезу β-клітин у власній залозі реципієнта. Subcutaneous transplantation of pancreas microfragments (PMFs) is regarded as an alternative approach for islets transplantation and applied in case of impossibility to derive ‘true’ islets from human fetal pancreas or tissue of neonatal animals (piglets, rabbits). The research involved the study of glucose level in rats with experimental I type Diabetes mellitus (DM) after transplantation of PMFs of neonatal piglets, as well as structural integrity of graft depending on its pre-treatment either by culturing or hypothermal storage (HS) in HTK solution (Custodiol®). After subcutaneous transplantation of PMFs of newborn piglets into rats with streptozotocin-induced DM the glucose level was normalized to the 45th day. After transplantation of PMFs being stored hypothermally in HTK solution a hyperglycemia weakening was observed similar to the one after the applying native PMFs. Using histological and morphometrical analysis a replacement of secretory tissue of pancreas to connective one was revealed in transplant to the 15th–22nd days, moreover the process was more intensive in cultured PMFs. Since glucose level in rats with DM was normalized without insulinproducing tissue of pancreas in transplant, the existence of specific factors resulting in stimulation of β-cell neogenesis in the recipient’s own gland was assumed. 2015 Article Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК / Ю.И. Копич, Г.А. Божок, Е.И. Легач // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2015. — Т. 25, № 1. — С. 45–56. — Бібліогр.: 44 назв. — рос. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/140002 612.34.014.089.6.085.2 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология
spellingShingle	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Копич, Ю.И. Божок, Г.А. Легач, Е.И. Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК Проблемы криобиологии и криомедицины
description	Подкожная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы (мфПЖ) рассматривается в качестве альтернативного подхода трансплантации островков и используется при невозможности получения «истинных» островков из фетальной ПЖ человека или ткани неонатальных животных (поросята, кролики). В работе исследовали уровень глюкозы у крыс с экспериментальным сахарным диабетом (СД) I типа после трансплантации мфПЖ неонатальных поросят, а также структурную сохранность трансплантата в зависимости от его предварительной обработки путем культивирования или гипотермического хранения (ГХ) в растворе НТК («Custodiol®»). После подкожной трансплантации мфПЖ новорожденных поросят крысам с моделью стрептозотоцинового СД уровень глюкозы нормализовался к 45 суткам. В результате трансплантации мфПЖ, которые были подвергнуты гипотермическому хранению в растворе НТК, наблюдалось ослабление гипергликемии, сходное с тем, что и после использования свежевыделенных мфПЖ. Путем гистологического и морфометрического анализа установлено, что к 15–22 суткам в трансплантате происходит замещение секреторной ткани ПЖ на соединительную, причем этот процесс более интенсивный в культивированных мфПЖ. Поскольку уровень глюкозы у крыс с моделью СД нормализовался на фоне отсутствия инсулинопродуцирующей ткани ПЖ в трансплантате, предполагается существование специфических факторов, приводящих к стимуляции неогенеза β-клеток в собственной железе реципиента.
format	Article
author	Копич, Ю.И. Божок, Г.А. Легач, Е.И.
author_facet	Копич, Ю.И. Божок, Г.А. Легач, Е.И.
author_sort	Копич, Ю.И.
title	Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК
title_short	Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК
title_full	Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК
title_fullStr	Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК
title_full_unstemmed	Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК
title_sort	экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе нтк
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2015
topic_facet	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/140002
citation_txt	Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК / Ю.И. Копич, Г.А. Божок, Е.И. Легач // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2015. — Т. 25, № 1. — С. 45–56. — Бібліогр.: 44 назв. — рос.
series	Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv	AT kopičûi éksperimentalʹnaâtransplantaciâmikrofragmentovpodželudočnojželezyneonatalʹnyhporosâtposlekulʹtivirovaniâiligipotermičeskogohraneniâvrastvorentk AT božokga éksperimentalʹnaâtransplantaciâmikrofragmentovpodželudočnojželezyneonatalʹnyhporosâtposlekulʹtivirovaniâiligipotermičeskogohraneniâvrastvorentk AT legačei éksperimentalʹnaâtransplantaciâmikrofragmentovpodželudočnojželezyneonatalʹnyhporosâtposlekulʹtivirovaniâiligipotermičeskogohraneniâvrastvorentk
first_indexed	2025-07-09T21:24:18Z
last_indexed	2025-07-09T21:24:18Z
_version_	1837206089768108032
fulltext	УДК 612.34.014.089.6.085.2 Ю.И. Копич, Г.А. Божок, Е.И. Легач Экспериментальная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы неонатальных поросят после культивирования или гипотермического хранения в растворе НТК UDC 612.34.014.089.6.085.2 Yu.I. Kopich, G.A. Bozhok, E.I. Legach Experimental Transplantation of Newborn Piglet Pancreatic Microfragments after Culturing or Hypothermal Storage in HTK Solution Реферат: Подкожная трансплантация микрофрагментов поджелудочной железы (мфПЖ) рассматривается в качестве альтернативного подхода трансплантации островков и используется при невозможности получения «истинных» островков из фетальной ПЖ человека или ткани неонатальных животных (поросята, кролики). В работе исследовали уровень глюкозы у крыс с экспериментальным сахарным диабетом (СД) I типа после трансплантации мфПЖ неонатальных поросят, а также структурную сохранность трансплантата в зависимости от его предварительной обработки путем культивирования или гипотермического хранения (ГХ) в растворе НТК («Custodiol®»). После подкожной трансплантации мфПЖ новорожденных поросят крысам с моделью стрептозотоцинового СД уровень глюкозы нормализовался к 45 суткам. В результате транс- плантации мфПЖ, которые были подвергнуты гипотермическому хранению в растворе НТК, наблюдалось ослабление ги- пергликемии, сходное с тем, что и после использования свежевыделенных мфПЖ. Путем гистологического и морфометри- ческого анализа установлено, что к 15–22 суткам в трансплантате происходит замещение секреторной ткани ПЖ на соединительную, причем этот процесс более интенсивный в культивированных мфПЖ. Поскольку уровень глюкозы у крыс с моделью СД нормализовался на фоне отсутствия инсулинопродуцирующей ткани ПЖ в трансплантате, предполагается существование специфических факторов, приводящих к стимуляции неогенеза β-клеток в собственной железе реципиента. Ключевые слова: сахарный диабет, поджелудочная железа, гипотермическое хранение, трансплантация, глюкоза. Реферат: Підшкірна трансплантація мікрофрагментів підшлункової залози (мфПЗ) розглядається в якості альтернативного підходу трансплантації острівців та використовується при неможливості отримання «істинних» острівців із фетальної ПЗ людини або тканини неонатальних тварин (поросята, кролики). У роботі досліджували рівень глюкози у щурів із експеримен- тальним цукровим діабетом (ЦД) I типу після трансплантації мфПЗ неонатальних поросят, а також структурну цілісність трансплантата в залежності від його попередньої обробки шляхом культивування або гіпотермічного зберігання в розчині НТК («Custodiol®»). Після підшкірної трансплантації мфПЗ неонатальних поросят щурам із моделлю стрептозотоцинового ЦД рівень глюкози нормалізувався на 45 добу. У результаті трансплантації мфПЗ, які були піддані гіпотермічному зберіганню в розчині НТК, спостерігалося послаблення гіперглікемії, подібне до того, що й після використання свіжовиділених мфПЗ. За допомогою гістологічного та морфометричного аналізу встановлено, що на 15–22 добу в трансплантаті відбувається замі- щення секреторної тканини ПЗ на сполучну, причому цей процес більш інтенсивний у культивованих мфПЗ. Оскільки норма- лізація рівня глюкози у щурів із моделлю ЦД спостерігалася на тлі відсутності інсулінопродукуючої тканини ПЗ у трансплантаті, передбачається існування специфічних факторів, які призводять до стимуляції неогенезу β-клітин у власній залозі реципієнта. Ключові слова: цукровий діабет, підшлункова залоза, гіпотермічне зберігання, трансплантація, глюкоза. Abstract: Subcutaneous transplantation of pancreas microfragments (PMFs) is regarded as an alternative approach for islets transplantation and applied in case of impossibility to derive ‘true’ islets from human fetal pancreas or tissue of neonatal animals (piglets, rabbits). The research involved the study of glucose level in rats with experimental I type Diabetes mellitus (DM) after trans- plantation of PMFs of neonatal piglets, as well as structural integrity of graft depending on its pre-treatment either by culturing or hypothermal storage (HS) in HTK solution (Custodiol®). After subcutaneous transplantation of PMFs of newborn piglets into rats with streptozotocin-induced DM the glucose level was normalized to the 45th day. After transplantation of PMFs being stored hypothermally in HTK solution a hyperglycemia weakening was observed similar to the one after the applying native PMFs. Using histological and morphometrical analysis a replacement of secretory tissue of pancreas to connective one was revealed in transplant to the 15th–22nd days, moreover the process was more intensive in cultured PMFs. Since glucose level in rats with DM was normalized without insulin- producing tissue of pancreas in transplant, the existence of specific factors resulting in stimulation of β-cell neogenesis in the recipient’s own gland was assumed. Key words: Diabetes mellitus, pancreas, hypothermal storage, transplantation, glucose. Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию: ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38 057) 373-30-07, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта: bozhokgaru@mail.ru To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57 373 3084, e-mail: bozhokgaru@mail.ru Department of Biochemistry and Pharmacology of Neurohumoral Systems, Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Отдел биохимии и фармакологии нейрогуморальных систем, Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Поступила 27.05.2014 Принята в печать 02.09.2014 Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2015. – Т. 25, №1. – С. 45–56. © 2015 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины Received May, 27, 2014 Accepted September, 02, 2014 Probl. Cryobiol. Cryomed. 2015. 25(1): 45–56. © 2015 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine оригинальное исследование research article 46 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 Current medical practice utilizes the cell therapy as not experimental method so far, but as conventional one, and this could be confirmed at least by legal framework [2, 40–44]. In clinical practice it is used in treatment of Type I Diabetes mellitus (Type I DM) [42], as allogeneic transplantation of pancreatic islets in particular, which in some cases enables to achieve even insulin independence in the recipients [34, 44], and mostly allow to reduce the daily dose of exogenous insulin and to arrest the development of secondary complications of DM [10, 37]. Transplantology utilizes the approaches intended to the highest preservation of transplant properties and re- duction of its ischemia outcomes. Cryopreservation and hypothermic storage are the most principal among other preservation technologies. It is well known that hypo- thermia does not fully inhibit the cell metabolism, so the components for hypothermic storage solutions should be chosen with a purpose to prevent cell damage. Contemporary transplantology applies quite a nar- row range of preservative solutions, i. e. the UW, HTK (Custodiol®), Celsior being the basic ones [6, 8, 32]. Storage of liver, kidney, heart transplants as well as other organs involve widely the HTK solution with a low viscosity, enabling the rapid cooling of organ [14, 23, 25, 26]. Recently, HTK solution has been also used for pancreas storage before transplantation or deri- vation of islets [33]. It should be noted also that contemporary transplan- tation protocol of pancreas islets, which meant to be appropriate for clinic, should include isolation of gland accompanied with organ perfusion by HTK solution, storage in the solution during up to 12 hrs, derivation of islets with enzyme method, their concentrating in density gradient and obligatory culturing for 12–72 hrs at 18...37°C [11]. Subcutaneous transplantation of pancreatic micro- fragments (PMFs) is usually used if ‘true’ islets are impossible to derive from either fetal or newborn animal (piglet or rabbit) tissues [5, 13, 35]. Primary advantages of this approach are low invasiveness of performed procedure, low material and labor costs at transplant derivation, and minimal risk of complications. To date there are the reports about application of cryopreserved microfragments of pancreas tissue to decrease the hyperglycemia level [21, 29], however, no reports about hypothermic storage of PMFs for further transplan- tation are known so far. It has been known that a short-term culture of pan- creatic islets before transplantation results in the redu- ced immunogenic properties and prolonged survival of transplant in recipient’s organism [4]. It is of interest to elucidate whether culturing of PMFs would lead to the same result or not. The research aim was to study glucose level in rats with experimental Type I DM following the transplan- В современной медицинской практике клеточ- ная терапия является не экспериментальным, а об- щепринятым методом, что подтверждено законо- дательной базой [11, 40–44]. В мировой клинической практике он применяется в терапии сахарного диабета I типа (СД I типа) [42], для аллогенной трансплантации островков поджелудочной железы (ПЖ) [19], которая в некоторых случаях позволяет достичь инсулиновой независимости у реципиентов [36, 44], но чаще снизить ежедневную дозу экзо- генного инсулина и купировать развития вторичных осложнений СД [17, 37]. В трансплантологии применяют подходы, на- правленные на максимальное сохранение свойств трансплантата и уменьшение последствий его ише- мии. Среди сберегающих технологий основными являются криоконсервирование и гипотермическое хранение. Известно, что гипотермия не полностью ингибирует клеточный метаболизм, поэтому сос- тав растворов для гипотермического хранения дол- жен быть подобран таким образом, чтобы пред- отвратить повреждение клеток. В современной трансплантологической практике используют достаточно узкий спектр консервирую- щих растворов, основными из которых являются UW (США), HTK («Custodiol®», Германия), «Celsior» (США) [14, 16, 34]. Для хранения трансплантатов печени, почек, сердца и других органов широко применяют раствор НТК [5, 21, 28, 30], имеющий низкую вязкость, что способствует быстрому ох- лаждению органа. В последнее время раствор HTK используют также для хранения ПЖ перед транс- плантацией или получением островков [35]. Следует отметить, что современный протокол трансплантации островков ПЖ, принятый в клини- ческой практике, включает забор железы с перфу- зией органа раствором НТК, хранение в нем не более 12 ч, получение островков с помощью фер- ментативного метода, их очистку в градиенте плот- ности и обязательное культивирование в течение 12–72 ч при 22...37°С [18]. Подкожная трансплантация микрофрагментов ПЖ (мфПЖ), как правило, используется при невоз- можности получения «истинных» островков из фетальной ткани или ткани неонатальных живот- ных (поросята, кролики) [1, 9, 20]. Основными пре- имуществами данного подхода являются малая инвазивность проводимой процедуры, незначитель- ные материало- и трудозатраты при получении трансплантата, минимальный риск осложнений. В современной научной литературе описаны экспе- риментальные данные о применении криоконсерви- рованных микрофрагментов ткани ПЖ для сниже- ния уровня гипергликемии [4, 7], однако отсутст- вуют результаты гипотермического хранения мфПЖ для последующей трансплантации. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 47 tation of pancreatic tissue of newborn piglets, as well as structural integrity of transplant depending on pre- treatment by terms of culturing or hypothermic storage. Materials and methods The experiments in animals were performed accor- ding to the General Ethical Principles of Experiments in Animals, approved by the 5th National Congress for Bioethics (Kiev, 2013) and agreed with the statements of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes (Strasbourg, 1986). The research was performed in pancreas of new- born piglets (n = 24) provided by Slobozhanskiy agricultural company (Ukraine).White breedless rats were used as recipients for transplantation (n = 48). Anesthetized animals were decapitated, pancreas were derived aseptically and placed into cooled sterile nutrient medium 199 (Sigma, USA) with antibiotics (200 IU/ml penicillin and 150 µg/ml kanamycin), and thereafter the tissue was fragmented by 0.5–1.0 mm3. Then the product was washed 3–4 times free of blood with medium 199 supplemented with antibiotics. A part of derived PMFs was cultured according to Turchin I.S. et al. [9] in nutrient medium 199 supple- mented with 10% thermoinactivated fetal bovine serum (FBS, Sigma), antibiotics (100 IU/ml penicillin and 75µg/ml kanamycin) for 24 hrs in atmosphere with 5% CO2 at 37°C in the ratio: fragments of one gland in 2 ml of medium. Another part of PMFs was kept under hypothermic storage (HS) conditions in HTK solution (Dr. F. Kohler Chemie GmbH, Germany) for 24 hrs at 4°C. Due to the fact that HTK is mannitol-containing solution, we have chosen Turusol (Yuriya-Pharm, Ukraine), a man- nitol-containing solution for comparative assessments and a possible alternative solution. Type I DM was induced in 3–4 month-old mice by single intraperitoneal injection of Streptozotocin (STZ, Sigma) in a doze of 55 mg/kg of animal mass. Glucose level in blood was controlled with Ge- moglan indicator strips (Ukraine) and glucometer Glucofot-II (Norma, Ukraine). Taking into account a possibility of spontaneous remission of experimental streptozotocin-induced Diabetes mellitus [30], only the animals with glucose level not lower than 15 µmol/l were selected for transplantation. A week following STZ injection, the PMFs were transplanted with Dufaut’s needle into adipose tissue of withers region of the rats with DM. Single rat was injected with endocrine material obtained from single pancreas. Transplantation area was marked with a stai- ned suture. The experimental animals were divided into the fol- lowing groups: the 1st group – transplantation of freshly isolated PMFs; the 2nd one – transplantation of PMFs Известно, что при краткосрочном культивирова- нии островков ПЖ перед трансплантацией сни- жается иммуногенность и пролонгируется выжи- ваемость трансплантата в организме реципиента [13]. Важно выяснить, приведет ли культивирование мфПЖ к подобному результату. Цель данной работы – исследование уровня глюкозы у крыс с экспериментальным СД I типа после трансплантации ткани ПЖ неонатальных поросят, а также структурной сохранности транс- плантата в зависимости от предварительной обра- ботки путем культивирования или гипотермиче- ского хранения. Материалы и методы Эксперименты проводили в соответствии с «Общими принципами экспериментов на живот- ных», одобренными V Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2013) и согласованными с поло- жениями «Европейской конвенции о защите позво- ночных животных, используемых для эксперимен- тальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). Работу выполняли на ПЖ новорожденных поро- сят (n = 24), предоставленных агрокомплексом «Слобожанский» (Харьковская область). В ка- честве реципиентов для трансплантации исполь- зовали белых беспородных крыс (n = 48). Наркотизированных животных декапитировали, ПЖ извлекали в стерильных условиях и помещали в охлажденную стерильную питательную среду 199 («Sigma», США) с антибиотиками (пеницил- лин – 200 ЕД/мл и канамицин – 150 мкг/мл), в которой ткань измельчали на фрагменты размером 0,5–1,0 мм3. Отмывали 3–4 раза от крови средой 199 с антибиотиками. Часть полученных мфПЖ культивировали по методу, описанному в работе И.С. Турчина и соавт. [2] в питательной среде 199 с добавлением 10% теплоинактивированной фетальной телячьей сыво- ротки (ФТС, «Sigma»), антибиотиков (пенициллин – 100 МЕ/мл и канамицин – 75 мкг/мл) в течение 24 ч в атмосфере 5% СО2 при 37°С в соотношении: фрагменты из одной железы в 2 мл среды. Другую часть мфПЖ помещали в условия ги- потермического хранения (ГХ) в раствор НТК («Dr. F. Kohler Chemie GmbH», Германия) на 24 ч при 4°С. В связи с тем, что НТК относится к манни- тол-содержащим растворам, в качестве раствора для сравнения и возможной альтернативы в экспе- риментах также использовали маннитол-содержа- щий раствор «Турусол» («Юрия-Фарм», Украина). У 3–4-месячных крыс СД I типа вызывали путем одноразовой внутрибрюшинной инъекции стрептозотоцина (СТЗ, «Sigma») в дозе 55 мг/кг массы животного. 48 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 after HS in HTK solution; the 3rd – transplantation of PMFs after HS in Turusol solution; the 4th – transplan- tation of PMFs after culturing; 5 – no transplantation. Every week a blood sampling was performed in rats to measure glucose level. Experimental animals were sacrified to the 3rd, 8th, 15th, 22nd and 45th days. To perform histological analysis the transplants derived on different days following transplantation were fixed in 10% formalin and embedded to paraffin. Serial sections of 5 µm were stained with hematoxylin and eosin. Microscope Olympus IX-71 (Japan) was used for photomicrography of the samples. Images were studied using image-processing AxioVision Rel 4.7 software (Germany). Morphometric study of serial sections of transplants involved the evaluation of the following parameters: total area of transplant; area of transplant with preser- ved alveolar and tubular structure characteristic for pancreas; area of autolysis loci; area of zones with infiltration; area occupied by connective tissue. The methods of descriptive statistics were used for statistical processing of the results [20]. The differen- ces between the indices of independent groups were assessed using nonparametric Mann-Whitney criterion, the data of dependent groups were compared with paired Wilcoxon test. Results and discussion Assessment of glycemic index revealed that ani- mals with Type I DM without transplantation had a high glucose level through all the observation period (Fig. 1). The animals of all the experimental groups with transplantation had a reduction of glucose level to the 8th day, which progressively decreased there- after. By the 45th day this index was within the physio- logical norm limits. No statistically significant differen- ces in the dynamics of glycemia depending on the type of transplant were revealed. To assess the state of transplanted pancreatic tissue histological and morphometric studies were conducted on different days following transplantation. Transplants of fresh isolated PMFs had a well-preserved sections of pancreatic tissue to the 3rd day after procedure; which kept their characteristic alveolar and tubular structure (Fig. 2A), and besides that there were large areas of tissue underwent autolytic changes such as discoupling of the acini, obliteration of their structure, karyopyknosis of nuclei and disappearance of cell contours (Fig. 2B). An infiltration by polymorpho- nuclear cells and macrophages was observed on periphery of PMFs, which had large phagocyted frag- ments in their cytoplasm (Fig. 2C). Visual examination of transplant site to the 8th and 15th day in subcutaneous adipose tissue revealed a demarcation inflammation around preserved PMFs. Уровень глюкозы в крови контролировали с помощью индикаторных пластинок «Гемоглан» (Украина) на глюкометре «Глюкофот-ІІ» (ППП «Норма», Украина). Учитывая возможность спонтанной ремиссии экспериментального стрепто- зотоцинового диабета [32], для трансплантации от- бирали животных, у которых уровень глюкозы был не ниже 15 ммоль/л. Крысам с СД через неделю после инъекции СТЗ выполняли трансплантацию мфПЖ в подкожно- жировую клетчатку в области холки с помощью иглы Дюфо. Одной крысе вводили эндокринный материал, полученный из одной ПЖ. Место транс- плантации отмечали с помощью окрашенного шов- ного материала. Экспериментальные животные были разделены на следующие группы: 1 – трансплантация свеже- выделенных мфПЖ; 2 – трансплантация мфПЖ после ГХ в растворе НТК; 3 – трансплантация мфПЖ после ГХ в растворе «Турусол»; 4 – транс- плантация мфПЖ после культивирования; 5 – без трансплантации. Еженедельно у крыс проводили забор крови для измерения уровня глюкозы. Экспериментальных животных забивали на 3-и, 8-, 15-, 22- и 45-е сутки. Для гистологических исследований трансплан- таты, взятые на разных сутках после транспланта- ции, фиксировали в 10%-м формалине и заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 5 мкм окра- шивали гематоксилином и эозином. Для микрофо- тосъемки образцов использовали микроскоп «Olympus IX-71» (Япония). Фотографии анализиро- вали с помощью программы для обработки изобра- жения «AxioVision Rel 4.7» (Германия). При морфометрическом исследовании серий- ных срезов трансплантатов оценивали следующие показатели: общую площадь трансплантата; пло- щадь трансплантата, сохраняющего альвеолярно- трубчатое строение, характерное для ПЖ; пло- щадь очагов аутолиза; площадь зон с инфильтра- цией; площадь соединительной ткани. Для статистической обработки результатов ис- пользовали методы описательной статистики [3]. Различия между показателями независимых групп оценивали с помощью непараметрического крите- рия Манна-Уитни, между показателями зависимых групп – парного теста Вилкоксона. Результаты и обсуждение При изучении гликемического показателя уста- новлено, что у животных с моделью СД I типа без трансплантации высокий уровень глюкозы сохра- нялся на протяжении всего срока наблюдения (рис. 1). У животных всех экспериментальных групп с трансплантацией на 8-е сутки наблюдалось проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 49 Histological analysis found the remnants of acinar structures in the central part of the transplant. In general, the transplant had strongly marked infiltration with leukocytes and histiocytes; large areas of con- nective tissue were present (Fig. 2, D). By the 22nd day following transplantation a produc- tive inflammation was almost completed, and the for- med connective tissue cicatrices were observed in transplantation zone. Described histologic pattern was characteristic for transplants of all four experimental groups. The results of morphometric analysis of PMF trans- plants state in various terms after transplantation are shown in the Table. It is obvious that PMFs cultured prior to transplantation had a significantly smaller surface of preserved pancreatic tissue to the 3rd day if compared with other groups. To the 8th day, no tissue with structure typical for pancreas was found in transplantation site, at the same time the areas with infiltration in these transplants were the same as in case of fresh samples. However, to the 15th day they have been already significantly smaller. Starting from the 8th observation day the area occupied by connective tissue within the transplants of cultured PMFs was significantly increased if compared to the samples of other groups. уменьшение уровня глюкозы, который прогрес- сивно снижался в дальнейшем. К 45-м суткам данный показатель был в пределах физиологи- ческой нормы. Статистически значимых отличий в динамике гликемии в зависимости от вида транс- плантата выявлено не было. Для оценки состояния трансплантированной ткани ПЖ были проведены гистологический и морфометрический анализы в разные сутки после трансплантации. В трансплантатах свежевыделен- ных мфПЖ на 3-и сутки после операции выявля- лись участки хорошо сохранившейся ткани ПЖ с характерным альвеолярно-трубчатым строением (рис. 2, А) и обширные участки ткани, подверг- шейся аутолитическим изменениям в виде дис- комплексации ацинусов, стирания их структуры, кариопикноза ядер и исчезновения контуров клеток (рис. 2, В). На периферии мфПЖ обнаружена ин- фильтрация полиморфно-ядерными клетками и макрофагами, в цитоплазме которых определялись крупные фагоцитированные фрагменты (рис. 2, С). При визуальном осмотре места трансплантации на 8- и 15-е сутки в подкожной жировой клетчатке было обнаружено демаркационное воспаление вокруг сохранившихся мфПЖ. Гистологический анализ выявил остатки ацинарных структур в цент- ральной части трансплантатов. В целом в транс- плантатах была ярко выражена инфильтрация лейкоцитами и гистиоцитами. Присутствовали об- ширные участки соединительной ткани (рис. 2, D). К 22-м суткам после трансплантации процесс продуктивного воспаления был практически завер- шен, и в области трансплантации наблюдались сформировавшиеся соединительнотканные рубцы. Описанная гистологическая картина была ха- рактерна для трансплантатов всех четырех экспе- риментальных групп. Результаты морфометрического анализа сос- тояния трансплантатов мфПЖ в разные сроки после трансплантации представлены в таблице. За- метно, что в мфПЖ, культивированных перед трансплантацией, на 3-и сутки площадь сохранив- шейся ткани ПЖ значимо меньше, чем в других группах. На 8-е сутки в зоне трансплантации не обнаружено ткани с характерным для ПЖ строе- нием, при этом площадь участков с инфильтрацией в этих трансплантатах не отличалась от свежевы- деленных. Однако на 15-е сутки они были значимо меньше. С 8-х суток наблюдения площадь, зани- маемая соединительной тканью в трансплантатах культивированных мфПЖ, значимо увеличена по сравнению с образцами других групп. В трансплантатах мфПЖ, хранившихся в гипо- термических условиях в растворе НТК, не наблю- далось значимых отличий в динамике замещения Рис. 1. Содержание глюкозы в крови крыс с СД I типа без трансплантации ( ) и после трансплантации: – свежевыделенные мфПЖ; – мфПЖ после ГХ в раст- воре НТК; – мфПЖ после ГХ в «Турусоле»; – мфПЖ после культивирования. Уровень глюкозы у интактных крыс находился в пределах 2–5 нмоль/л. Fig. 1. Glucose content in blood of rats with Type I DM without transplantation ( ) and after transplantation of: – fresh PMFs; – PMFs after HS in NTK solution; – PMFs after HS in Turusol solution; – PMFs after culturing. Glucose level of intact animals was 2–5 nmol/l. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 8 15 22 45 С од ер жа ни е гл ю ко зы , м м ол ь/ л G lu co se c on te nt , µm ol /l Сутки после трансплантации Days after transplantation 50 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 Transplants of PMFs stored hypothermically in HTK solution did not exhibit any significant differences in the dynamics of replacement of pancreatic tissue by connective one if compared with case of fresh PMFs. The samples after HS in Turusol solution showed a rapid replacement of transplant by con- nective tissue by the 22nd day of grafting. Formation of large areas of autolysis to the 3rd day after transplantation was one of the main morphological features of transplanted PMFs. It is known that under physiological conditions lipolytic enzymes such as type A phospholipase and lipase are secreted by panc- reas in an active state, at the same time the proteolytic enzymes are inactive and accumulated in granules [36]. Release of lipases in case of tissue damage activates a breackdown of cell membrane lipids and accelerates destructive processes. As a result of accumulation of lipolysis and cytolysis products in damaged areas an acid shift of pH occurs, stimulating the transition of свидетельствует о запуске процессов распознава- ния и отторжения чужеродной ткани в организме реципиента. Влияет ли соотношение площади сохранных и аутолитических участков ткани ПЖ на активность иммунного ответа и скорость оттор- жения трансплантата? Исходя из данных морфо- метрического исследования такая зависимость четко не установлена. Однако на скорость заме- щения ткани ПЖ соединительной тканью этот показатель несомненно влияет. Так, в транспланта- тах культивированных мфПЖ, которые изначально характеризовались высоким уровнем аутолиза ткани, около 87% площади было замещено соеди- нительной тканью уже к 15-м суткам после транс- плантации. Указанные признаки свидетельствуют о том, что в процессе культивирования наблю- даются перестройки, связанные с изменением нативной структуры ткани, уменьшением ее имму- ногенности и фактически формированием биологи- D Рис. 2. Трансплантат свежевыделенных фрагментов ПЖ на 3-и и 15-е сутки после трансплантации: А – участок сохранившейся ткани ПЖ (3-и сутки, ×400); B – участок аутолиза ткани ПЖ (3-и сутки, ×200); С – инфильтрация трансплантата (3-и сутки, ×200); D – формирование соединительной ткани (15-е сутки, ×200). Гистологический препарат, окраска гематоксилином и эозином. Fig. 2. Transplant of fresh pancreatic tissue fragments to the 3rd and 15th day after transplantation: A – area of preserved pancreatic tissue (day 3, ×400); B – area of pancreatic tissue with autolysis (day 3, ×200); C – transplant infiltration (day 3, ×200); D – formation of connective tissue (day 15, ×200). Histological sections, hematoxylin and eosin staining. ткани ПЖ соединительной тканью по сравнению с свежевыделенны- ми мфПЖ. К 22-м суткам в образ- цах после ГХ в растворе «Турусол» установлено ускоренное замеще- ние трансплантата соединительной тканью. Одним из основных морфологи- ческих признаков трансплантатов мфПЖ является формирование обширных участков аутолиза уже на 3-и сутки после трансплантации. Известно, что в физиологических ус- ловиях липолитические ферменты фосфолипаза А и липаза выделя- ются железой в активном состоя- нии, при этом протеолитические ферменты неактивны и запасаются в гранулах [8]. Освобождение ли- паз при повреждении ткани акти- вирует расщепление липидов клеточных мембран и ускоряет де- структивные процессы. В резуль- тате накопления в поврежденных участках продуктов липолиза и распада клеток наблюдается сдвиг рН в кислую сторону, что стимулирует переход внутрикле- точного трипсиногена в трипсин, который, в свою очередь, активи- рует лизосомальные ферменты и протеиназы, что приводит к фер- ментативному аутолизу ткани ПЖ. Инфильтрация трансплантата иммунокомпетентными клетками BA C B C D иктуС -tsopsyaD noitatnalpsart еиняотсоС ататналпснарт etatstnalpsnarT еыннеледывежевС ЖПфм sFMPhserF КТНеровтсарвХГ noitulosKTHniSH еровтсарвХГ »лосуруТ« losuruTniSH noitulos еыннаворивитьлуK ЖПфм sFMPderutluC 3 ЖПьнакТ eussitcitaercnaP 2,11±3,04 5,9±2,63 8,8±8,24 9,6±1,51 зилотуА saerasisylotuA 5,9±2,73 5,5±8,73 6,8±5,72 5,01±8,65 яицартьлифнИ saeranoitartlifnI 7,8±2,12 6,21±1,02 1,9±1,62 3,9±7,12 ьнактяаньлетинидеоС eussitevitcennoC 1,1±3,1 4,3±9,5 8,1±6,3 1,7±4,6 8 ЖПьнакТ eussitcitaercnaP 1,4±0,82 0,7±6,8 1,4±0,5 – зилотуА saerasisylotuA 9,7±5,21 4,5±2,11 5,6±2,81 8,9±4,51 яицартьлифнИ saeranoitartlifnI 6,6±9,14 9,7±8,45 0,01±8,24 4,8±1,84 ьнактяаньлетинидеоС eussitevitcennoC 2,8±6,71 4,8±4,52 6,7±0,43 40,31±5,63 51 ЖПьнакТ eussitcitaercnaP – – – – зилотуА saerasisylotuA 2,4±1,7 – – – яицартьлифнИ saeranoitartlifnI 3,8±5,85 7,11±2,24 3,21±7,71 2,6±6,21 ьнактяаньлетинидеоС eussitevitcennoC 0,21±4,43 5,01±8,75 4,8±3,28 1,9±4,78 22 ЖПьнакТ eussitcitaercnaP – – – – зилотуА saerasisylotuA – – – – яицартьлифнИ saeranoitartlifnI 3,2±9,3 8,3±6,5 – – ьнактяаньлетинидеоС eussitevitcennoC 8,4±1,69 1,6±4,49 001 001 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 51 intracellular trypsinogen into trypsin, which in turn activates lysosomal enzymes, proteases, that finally leads to enzymatic autolysis of pancreatic tissue. Transplant infiltration by immunocompetent cells testifies to an initiation of the recognition process and further rejection of foreign tissue in a recipient’s organism. Does the ratio of intact vs. autolytic sections of surfaces in pancreas tissue affect the activity of immune response and rate of transplant rejection? Based on the data of our morphometric study, this dependence was not clearly established. However, this index affected undoubtedly the rate of replacement of ческого «скаффолда», который активно заселяется соединительно-тканными элементами после транс- плантации. Предтрансплантационная обработка ткани яв- ляется необходимым этапом любого протокола клеточно-тканевой трансплантации. Для получения трансплантата, как правило, используют техноло- гии забора, подготовки и хранения ткани, которые в дальнейшем могут влиять на его иммунобио- логические свойства. Подготовительные этапы могут инициировать как иммуномодулирующие, так и некротические процессы в пересаживаемой Морфометрический анализ состояния трансплантатов мфПЖ (% от общей площади трансплантата) на разные сутки после трансплантации Morphometric analysis of PMF transplants state (% of total area of transplant) on different days after transplantation Примечание: – отличия статистически значимы по сравнению с трансплантацией свежевыделенных мфПЖ, p ≤ 0,05. Note: * – the differences are statistically significant if compared with transplantation of fresh PMFs, p ≤ 0.05. 52 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 pancreas tissue by connective one. In particular, the cultured PMFs transplants which were initially charac- terized by a high level of tissue autolysis, had about 87% of tissue replaced by connective one to the 15th day after transplantation. These features show that culture is accompanied with some rearrangements associated with changes in tissue native structure, decreasing its immunogenicity and, actually, forming of biological ‘scaffold’, actively populated with connec- tive-tissue elements following transplantation. Pre-transplantation treatment of tissue is a manda- tory step in any protocol of cell-tissue transplantation. To get a transplant one usually applies the technologies of isolation, preparation and storage of tissue which later may affect its immunobiological properties. Prepa- ratory stages may initiate both immunomodulatory and necrotic processes in the grafted tissue, inevitably af- fecting transplant integrity. The results of presented study show that HS of PMFs of newborn piglets in HTK solution did not significantly affect the basic characteristics of tissue and allowed to weaken hyperglycemia down to the same indices which were obtained after transplantation of fresh microfragments. Thus, the mannitol-containing HTK and Turusol solutions could be used in developing the technological requirements for deriving the PMFs for transplantation. The described method of pancreatic tissue storage could be tested in genetically modified pigs, having reduced expression of main xenoantigen Gal-α-1,3-Gal, that results in absence of hyperacute rejection of their organs and possible application for transplantation. Summarizing these results, we may conclude that subcutaneous transplantation of PMFs of newborn pig- lets results in a gradual decrease of blood glucose level in rats with Type I Diabetes mellitus, and, moreover, reaching normoglycemia to the 45th day post-transplan- tation. At the same time, the structural changes of transplant tissue depend on pre-treatment, activity of rejection and the rate of replacement by connective tissue. Due to the absence of pancreatic secretory tissue already after 15 days post-transplantation, the normoglycemia found to the 45th day could be asso- ciated not with insulin secretion by cells of transplanted tissue, but rather resulted from regeneration and reco- very processes in rats own pancreas influenced by the transplant. In the light of current concepts the effect of hormone-active cell preparations is associated not only with their hormone function, but also with their ability to stimulate regeneration in the diseased gland [44]. It is known that turnover rate of β-cell population in pancreas during life is not high, but there is a possibility of β-cells neogenesis from ductal cells [7, 17]. ткани, что неизбежно отразится на сохранности трансплантата. Из результатов представленных исследований следует, что ГХ мфПЖ новорожденных поросят в растворе НТК значительно не влияет на основные характеристики ткани и позволяет снизить гипер- гликемию до показателей, которые были получены после пересадки свежевыделенных микрофраг- ментов. Таким образом, маннитол-содержащие растворы НТК и «Турусол» могут использоваться при разработке технологических условий получения мфПЖ для трансплантации. Описанный способ хранения ткани ПЖ может быть апробирован на генномодифицированных свиньях, которые имеют пониженную экспрессию главного ксеноантигена Gal-α-1,3-Gal, за счет чего их органы не вызывают гиперострого отторжения и могут быть применены для трансплантации. Обобщая полученные результаты, можно сде- лать вывод о том, что после подкожной трансплан- тации мфПЖ неонатальных поросят постепенно снижается уровень глюкозы в крови крыс с мо- делью СД I типа с достижением нормогликемии к 45-м суткам. При этом наблюдаются структурные перестройки ткани трансплантата, зависящие от предобработки, активности процесса отторжения и скорости замещения соединительной тканью. Ввиду отсутствия секреторной ткани ПЖ на сро- ках более 15 суток после трансплантации можно заключить, что достижение нормогликемии к 45-м суткам происходит не вследствие секреции инсу- лина клетками пересаженной ткани, а в результате регенерационно-восстановительных процессов, происходящих в собственной ПЖ крыс под влия- нием трансплантата. В свете современных представлений действие гормонально активных клеточных препаратов связывают не только с их гормонозаместительной функцией, но и с возможностью стимуляции реге- неративных процессов в поврежденной болезнью железе [44]. Известно, что скорость обновления популяции β-клеток в поджелудочной железе в те- чение жизни не высока, однако существует вероят- ность неогенеза β-клеток из клеток протоков [15, 24]. Показано, что после субтотальной панкреатэк- томии у крыс объем β-клеточной массы активно увеличивается за счет неогенеза β-клеток из про- гениторных клеток, локализованных в стенках про- токов желез или внутри оставшихся островков [15, 24]. Процесс регенерации занимает до 40 суток и реализуется путем формирования так называемых «фокальных зон» мест активной клеточной проли- ферации, которые дифференцируются в островки Лангерганса или ацинусы. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 53 Одной из биологических особенностей свиней является способность к быстрому росту и увели- чению живой массы. Поросята рождаются с неко- торой анатомической и функциональной незрелос- тью органов пищеварительного аппарата, в том числе и поджелудочной железы [38]. В первые не- дели жизни наблюдается интенсивный прирост β-клеточной массы в ПЖ за счет дифференцировки из клеток-предшественников, пролиферации β-кле- ток и увеличения их размеров [10]. Островки ПЖ новорожденных поросят содержат значительное количество клеток-предшественников, которые могут дифференцироваться в зрелые клетки ост- ровков [12, 29, 33]. G.S. Korbutt и соавт. показали в условиях in vitro, что в первую неделю после рож- дения количество эндокринных клеток в островках ПЖ поросят увеличивается с 7 до 35% [26]. В дру- гих исследованиях [31, 39] после трансплантации островков ПЖ неонатальных поросят через шесть недель наблюдалось увеличение количества β-кле- ток на 30%, относительной площади β-клеток в трансплантате на 60%, содержания инсулина в 12 раз. Таким образом, пересаженные мфПЖ ново- рожденных поросят могут быть источником росто- вых и дифференцировочных факторов, тканеспеци- фических для данного органа. Регенерация β-кле- точной массы, вероятно, происходит в результате активной секреции или пассивной диффузии фак- торов из трансплантата ПЖ неонатальных поросят [23]. Подобная стимуляция неогенеза β-клеток ПЖ крыс была описана в работе A.A. Hardikar и соавт. [22], хотя в условиях эксперимента использовался не трансплантат, а экстракт, полученный из реге- нерирующей железы. В пользу данного предполо- жения также свидетельствует тот факт, что экс- тракты, изготовленные из ПЖ неонатальных поро- сят, способствуют индукции дифференцировки ме- зенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в инсулинпродуцирующие клетки [6]. Поиск биологически активных факторов, присут- ствующих в ПЖ неонатальных поросят и способ- ствующих регенерации β-клеток, может стать предметом дальнейшего перспективного направ- ления в терапии СД I типа. Выводы После подкожной трансплантации мфПЖ ново- рожденных поросят крысам с моделью стрептозо- тоцинового диабета наблюдается нормализация уровня глюкозы к 45-м суткам. После транспланта- ции мфПЖ, которые были подвергнуты гипотерми- ческому хранению в растворе НТК, гипергликемия снизилась до показателей, полученных при исполь- зовании свежевыделенных мфПЖ. Установлено, It is shown that after subtotal pancreatectomy in rats a volume of β-cell mass actively increases due to β-cell neogenesis from progenitor cells located in the walls of ducts or glands inside the remaining islets [7, 17]. The regeneration process takes up to 40 days and is implemented by forming so-called ‘focal zones’, i. e. active sites of cell proliferation, which differentiate into Langerhans islets or acini. Ability of rapid growth and increasing body weight is one of biological peculiarities of pigs. Piglets are born with a certain anatomical and functional imma- turity of the digestive system organs, including pancreas [38]. In the first weeks of life a high increase of β-cell mass in pancreas occurs due to the differentiation of progenitor cells, proliferation of β-cells and increase of their dimensions [1]. Pancreatic islets of newborn piglets contain a significant number of progenitor cells that can differentiate into mature islet cells [3, 24, 31]. G.S. Korbutt et al. demonstrated that under in vitro conditions, a number of endocrine cells in pancreatic islets of pigs in the first postnatal week increased from 7 to 35% [19]. Other reports [27, 39] showed an increa- se in the number of β-cells by 30%, relative area of β-cells in transplant by 60%, and insulin content in 12 times after six weeks following transplantation of pancreatic islets of newborn piglets. Thus, the transplanted PMFs of newborn piglets can be a source of growth and differentiation factors, being tissue-specific for a given organ. Regeneration of β-cell mass likely occurs as a result of either active secretion or passive diffusion of the factors from newborn piglet pancreas transplant [16]. Such a stimu- lation of β-cell neogenesis in rat pancreas was reported by A.A. Hardikar et al. [15], although their experi- ments were not done with transplants, but rather with an extract derived from regenerating gland. This as- sumption could be also evidenced by the fact that the extracts prepared from pancreas of newborn piglets, promote the induction of differentiation of mesen- chymal stromal cells of human adipose tissue into insulin-producing cells [28]. Screening of bioactive factors in the pancreas of newborn piglets which could promote the regeneration of β-cells, may be the subject of further perspective direction in treatment of the Type I Diabetes mellitus. Conclusions Subcutaneous transplantation of PMFs of newborn piglets to the rats with streptozotocin-induced Diabetes mellitus resulted in a normalization of blood glucose level to the 45th day. Transplantation of PMFs which were hypothermically stored in HTK solution led to a decrease of hyperglycemia to the same indices as were obtained using fresh PMFs. It was established that 54 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 the transplants had their secretory tissue replaced by a connective one to the 15th–22nd days, and this process was more intensive in case of cultured microfragments. Normalization of glucose level in rats with experimental Diabetes mellitus was observed even in the absence of insulin-producing pancreatic tissue in transplant site, that suggested the existence of some inducing factors introduced by transplantation, which could stimulate islet neogenesis in a recipient own gland. что в трансплантате замещение секреторной ткани ПЖ соединительной наблюдается уже к 15–22 сут- кам, причем этот процесс более интенсивный в культивированных микрофрагментах. Нормализа- ция уровня глюкозы у крыс с моделью диабета наблюдается на фоне отсутствия инсулин-продуци- рующей ткани ПЖ в трансплантате, что предпола- гает существование индуцирующих факторов трансплантации, стимулирующих неогенез остров- ков в собственной железе реципиента. Литература 1. Беникова Е.А.. Турчин И.С, Белякова Л.С. и др. Опыт лече- ния детей, страдающих сахарным диабетом, при помощи алло- и ксенотрансплантации культуры островковых кле- ток поджелудочной железы // Проблемы эндокринологии. – 1987. – №2. – C.19–22. 2. Данилова А.И., Зубкова С.Т., Ефимов А.С. и др. Влияние трансплантации культуры островковых клеток поджелу- дочной железы на состояние диабетических ангиопатий // Проблемы эндокринологии. – 1989. – Т. 35, №2. – С. 9–14. 3. Ланг Т.А., Сесик М. Как описывать статистику в медицине. Руководство для авторов, редакторов и рецензентов. М.: Практическая медицина, 2011. 480 с. 4. Легач Є.І., Божок Г.А., Турчин I.С., Бондаренко Т.П. Показники вуглеводного обміну у щурів зі стрептозотоциновим діа- бетом після комбінованої ксенотрансплантації // Клінічна ендокринологія та ендокринна хірургія. – 2006. – Т.16, №2. – С. 64–68. 5. Никоненко А.С., Ступаков В.И., Собокарь В.А. Опыт приме- нения кардиоплегического раствора «Кустодиол»: Тезисы и сообщения III Всероссийского съезда сердечно-сосудис- тых хирургов // Грудная и сердечно-сосудистая хирур- гия. – 1996. – №6. – С. 275–276. 6. Петренко Ю.А., Мазур С.П., Грищук В.Л. и др. Выбор усло- вий индукции дифференцировки мультипотентных мезен- химальных стромальных клеток жировой ткани человека в инсулинпродуцирующие клетки in vitro // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2011. – Т. 6, №1. – С. 1–7. 7. Побеленский О. Н. Экспериментальная модель и её обосно- вание в целесообразности клинического применения криоконсервированных культур микрофрагментов ост- ровковых клеток поджелудочной железы при сахарном диабете // Медицина сегодня и завтра. – 2004. – №2. – С. 66–69. 8. Теппермен Д., Теппермен Х. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. – М.: Мир, 1989. – 653 с. 9. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Игнатенко С.Н. и др. Резуль- таты трансплантации культур островковых клеток под- желудочной железы больным сахарным диабетом // Проб- лемы эндокринологии. – 1985. – №5. – С. 67–70. 10. Ackermann A.M., Gannon M. Molecular regulation of pancreatic β-cell mass development, maintenance, and expansion // J. Mol. Endocrinol.– 2007. – Vol. 38, №1–2. – P. 193–206. 11. Agarwal A., Brayman K.L. Update on islet cell transplantation for type 1 diabetes // Semin. Intervent. Radiol. – 2012. – Vol. 29, № 2. – P. 90–98. 12.Basta G., Racanicchi L., Mancuso F. et al. Transdifferentiation molecular pathways of neonatal pig pancreatic duct cells into endocrine cell phenotypes // Transplant. Proc. – 2004. – Vol. 36, №9. – P. 2857–2863. References 1. Ackermann A.M., Gannon M. Molecular regulation of pancreatic β-cell mass development, maintenance, and expansion. Journ Mol Endocrinol 2007; 38(1–2): 193–206. 2. Agarwal A., Brayman K.L. Update on islet cell transplantation for type 1 diabetes. Semin Intervent Radiol 2012; 29 (2): 90–98. 3. Basta G., Racanicchi L., Mancuso F. et al. Transdifferentiation molecular pathways of neonatal pig pancreatic duct cells into endocrine cell phenotypes. Transplant Proc 2004; 36 (9): 2857–2863. 4. Benhamou P.Y., Mullen Y. Immunomodulation of pancreatic islets by culture. In: Lanza R.P., Chick W.L., editors. Pancreatic islet transplantation, Boca Raton, FL: CRC Press; 1994; 2: 99–109. 5. Benikova E.A.. Turchin I.S, Belyakova L.S. et al. Experience with the treatment of children with Diabetes mellitus using allo- and xenografts of cultures of pancreatic islet cells. Probl Endokrinol (Mosk) 1987; 33 (2): 19–22. 6. Blankensteijn J.D., Terpstra O.T. Liver preservation: the past and the future. Hepatology 1991; 13 (6): 1235–1250. 7. Bonner-Weir S. Life and death of the pancreatic beta cells. Trends Endocrinol Metab 2000; 11( 9): 375–378. 8. Cavallari A., Cillo U., Nardo B. et al. A multicenter pilot prospective study comparing Celsior and University of Wisconsin preser-ving solutions for use in liver transplantation. Liver Transpl 2003; 9 (8): 814–821. 9. Danilova A.I., Zubkova S.T., Efimov A.S. et al. Effect of the trans- plantation of cultured pancreatic islet cell on the status of diabetic microangiopathy. Probl Endokrinol (Mosk) 1989; 35 (2): 9–14. 10.Fiorina P., Folli F., Bertuzzi F. et al. Long-term beneficial effect of islet transplantation on diabetic macro-/microangiopathy in type 1 diabetic kidney-transplanted patients. Diabetes Care 2003; 26 (4): 1129–1136. 11.Gaba R.C., Garcia-Roca R., Oberholzer J.J. Pancreatic islet cell transplantation: an update for interventional radiologists. Vasc Interv Radiol 2012; 23 (5): 583–594. 12.Girman P., Saudek F. The IKEM pancreas and islet transplant program as part of healthcare for type 1 diabetes patients: retrospective analysis of outcome from 1983 to 2010. Rev Diabet Stud 2011; 8(1): 35–43. 13.Groth C.G., Korsgren O., Tibell A. et al. Transplantation of porcine fetal pancreas to diabetic patients. Lancet 1994; 344 (8934): 1402–1404. 14.Gutierrez J., Guzman C., Correa G. et al. Liver transplantation in Medellin, Colombia: initial experience. Transplant Proc 2004; 36(6): 1677–1680. 15.Hardikar A.A., Bhonde R.R. Modulating experimental diabetes by treatment with cytosolic extract from the regenerating pancreas. Diabetes Res Clin Pract 1999; 46(3): 203–211. 16.Hsu B.R., Hsu S., Fu S.H. et al. Neonatal pig pancreatic cell cluster accelerates regeneration of mouse pancreatic beta cells. Transplant Proc 2003; 35(1): 492. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 55 13.Benhamou P.Y., Mullen Y. Immunomodulation of pancreatic islets by culture. In: Lanza R.P., Chick W.L. (Eds.), Pancreatic islet transplantation. – Boca Raton FL: CRC Press, 1994. – Vol. 2. – P. 99–109. 14.Blankensteijn J.D., Terpstra O.T. Liver preservation: the past and the future // Hepatology. – 1991. – Vol. 13, № 6. – P. 1235– 1250. 15.Bonner-Weir S. Life and death of the pancreatic beta cells // Trends Endocrinol. Metab. – 2000. – Vol. 11, №9. – P. 375–378. 16.Cavallari A., Cillo U., Nardo B. et al. A multicenter pilot prospec- tive study comparing Celsior and University of Wisconsin pre- serving solutions for use in liver transplantation // Liver Transpl. – 2003. – Vol. 9, №8. – P. 814–821. 17. Fiorina P., Folli F., Bertuzzi F. et al. Long–term beneficial effect of islet transplantation on diabetic macro-/microangiopathy in type 1 diabetic kidney-transplanted patients // Diabetes Care. – 2003. – Vol. 26, №4. – P. 1129–1136. 18. Gaba R.C., Garcia–Roca R., Oberholzer J.J. Pancreatic islet cell transplantation: an update for interventional radiologists // Vasc. Interv. Radiol. – 2012. – Vol. 23, №5. – P. 583–594. 19.Girman P., Saudek F. The IKEM pancreas and islet transplant program as part of healthcare for type 1 diabetes patients: retrospective analysis of outcome from 1983 to 2010 // Rev. Diabet Stud. – 2011. – Vol. 8, №1. – P. 35–43. 20.Groth C.G., Korsgren O., Tibell A. et al. Transplantation of porcine fetal pancreas to diabetic patients // Lancet. – 1994. – Vol. 344, №8934. – P. 1402–1404. 21.Gutierrez J., Guzman C., Correa G. et al. Liver transplantation in Medellin, Colombia: initial experience // Transplant. Proc. – 2004. – Vol. 36, №6. – P. 1677–1680. 22.Hardikar A.A., Bhonde R.R. Modulating experimental diabetes by treatment with cytosolic extract from the regenerating pan- creas // Diabetes Res. Clin. Pract. – 1999. – Vol. 46, №3. – Р. 203–211. 23.Hsu B.R., Hsu S., Fu S.H. et al. Neonatal pig pancreatic cell cluster accelerates regeneration of mouse pancreatic beta cells // Transplant Proc. – 2003. – Vol. 35, №1. – P. 492. 24.Inada A., Nienaber C., Katsuta H. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2008. – Vol. 105, №50. – P. 19915–19919. 25. Kin T. Islet isolation for clinical transplantation // Adv. Exp. Med. Biol. – 2010. – Vol. 654. – P. 683–710. 26.Korbutt G.S., Elliott J.F., Ao Ziliang et al. Large scale isolation, growth, and function of porcine neonatal islet cells // J.Clin. Invest. – 1996. – Vol. 97, №9. – P. 2119–2129. 27.Limbert C., Path G., Jakob F., Seufert J. Beta-cell replacement and regeneration: Strategies of cell-based therapy for type 1 diabetes mellitus // Diabetes Res. Clin. Pract. – 2008. – Vol. 79, №3. – P. 389–399. 28.Loganathan S., Radovits T., Hirschberg K. et al. Effects of Custodiol-N, a novel organ preservation solution, on ischemia/ reperfusion injury // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. – 2010. – Vol. 139, №4. – P. 1048–1056. 29. Luca G., Nastruzzi C., Calvitti M. et al. Accelerated functional maturation of isolated neonatal porcine cell clusters: in vitro and in vivo results in NOD mice // Cell Transplant. – 2005. – Vol. 4, №5. – P. 249–261. 30. Maglione M., Oberhuber R., Cardini B. et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ische- mia reperfusion injury in a mouse model // Am. J. Transplant. – 2010. – Vol. 10, №10. – P. 2231–2240. 31.Omer A., Duvivier-Kali V.F., Trivedi N. et al. Survival and matu- ration of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice // Diabetes. – 2003. – Vol. 52, №1. – P. 69–75. 32.Portha B., Kergoat M. Dynamics of glucose-induced insulin release during the spontaneous remission of streptozotocin diabetes induced in the newborn rat // Diabetes. – 1985. – Vol. 34, №6. – P. 574–579. 17.Inada A., Nienaber C., Katsuta H. Carbonic anhydrase II- positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105(50): 19915–19919. 18.Kin T. Islet isolation for clinical transplantation. Adv Exp Med Biol 2010; 654: 683–710. 19.Korbutt G.S., Elliott J.F., Ao Ziliang et al. Large scale isolation, growth, and function of porcine neonatal islet cells. J Clin Invest 1996; 97(9): 2119–2129. 20.Lang T.A., Secic M. How to Report Statistics in Medicine: Annotated Guidelines for Authors, Editors, and Reviewers. Moscow: Prakticheskaya Meditsina; 2011. 21.Lehach E.I., Bozhok G.A., Turchin I.S., Bondarenko T.P. Indices of sugar metabolism in rats with streptozotocin induced diabetes after combined xenotransplantation. Klinichna endokrinologiya ta endokrinna hirurgiya 2006; 16 (2): 64–68. 22.Limbert C., Path G., Jakob F., Seufert J. Beta-cell replacement and regeneration: Strategies of cell-based therapy for type 1 Diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract 2008; 79(3): 389– 399. 23.Loganathan S., Radovits T., Hirschberg K. et al. Effects of Custodiol-N, a novel organ preservation solution, on ischemia/ reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg 2010; 139(4): 1048–1056. 24.Luca G., Nastruzzi C., Calvitti M. et al. Accelerated functional maturation of isolated neonatal porcine cell clusters: in vitro and in vivo results in NOD mice. Cell Transplant 2005; 4(5): 249–261. 25.Maglione M., Oberhuber R., Cardini B. et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant 2010; 10(10): 2231–2240. 26. Nikonenko A.S., Stupakov V.I., Sobokar V.A. Experience in the use of cardioplegic solution "Custodiol": Abstracts of III All-Russian Congress of Cardiovascular Surgeons. Grudnaya i serdechno-sosudistaya hirurgiya 1996; (6): 275–276. 27.Omer A., Duvivier-Kali V.F., Trivedi N. et al. Survival and matu- ration of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice. Diabetes 2003; 52(1): 69–75. 28.Petrenko Y.A., Mazur S.P., Grischuk V.L. et al. The choice of induction factors for differentiation of multipotent mesen- chymal stromal cells from human adipose tissue to insulin- producting cells in vitro. Kletochnaya Transplantologiya i Tkanevaya Inzheneriya 2011; 6 (1): 1–7. 29.Pobelensky O.N. Experimental model and its basis in the expediency for clinical application of cryopreserved cultures of the microfragments of islet cells at Diabetes mellitus. Meditsina Syogodni i Zavtra 2004; (2): 66–69. 30.Portha B., Kergoat M. Dynamics of glucose-induced insulin release during the spontaneous remission of streptozotocin diabetes induced in the newborn rat // Diabetes 1985; 34(6): 574–579. 31.Rayat G.R., Rajotte R.V., Hering B.J. et al. In vitro and in vivo expression of Galalpha-(1,3)Gal on porcine islet cells is age dependent // J Endocrinol 2003; 177(1): 127–135. 32.Ringe B., Braun F., Moritz M. et al. Safety and efficacy of living donor liver preservation with HTK solution // Transplant Proc 2005; 37(1): 316. 33.Salehi P., Hansen M.A., Avila J.G. et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with histidine-tryptophan ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Trans- plantation 2006; 82(7): 983–985. 34.Shapiro A.M., Lakey J.R., Ryan E.A. et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a gluco- corticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med 2000; 343(4): 230–238. 35. Shumakov V.I., Bliumkin V.N., Ignatenko S.N. et al. Results of transplantation of pancreatic islet cell cultures to patients with Diabetes mellitus. Probl Endokrinol (Mosk) 1985; 31(5): 67–70. 56 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 33.Rayat G.R., Rajotte R.V., Hering B.J. et al. In vitro and in vivo expression of Galalpha-(1,3)Gal on porcine islet cells is age dependent // J. Endocrinol. – 2003. – Vol. 177, №1. – P. 127– 135. 34.Ringe B., Braun F., Moritz M. et al. Safety and efficacy of living donor liver preservation with HTK solution // Transplant. Proc. – 2005. – Vol. 37, №1. – P. n316. 35.Salehi P., Hansen M.A., Avila J.G. et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with histidine-tryptophan ketoglutarate versus University of Wisconsin solution // Trans- plantation. – 2006. – Vol. 82, №7. – P. 983–985. 36.Shapiro A.M., Lakey J.R., Ryan E.A. et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocor- ticoid-free immunosuppressive regimen // N. Engl. J. Med. – 2000. – Vol. 343, №4. – P. 230–238. 37.Thompson D.M., Begg I.S., Harris C. et al. Reduced progression of diabetic retinopathy after islet cell transplantation compared with intensive medical therapy // Transplantation. – 2008. – Vol. 85, №10. – P. 1400–1405. 38.Trahair J.F., Sangild P.T. Systemic and luminal influences on the perinatal development of the gut // Equine Vet. J. Suppl. – 1997. – №24. – P. 40–50. 39.Trivedi N., Hollister-Lock J., Lopez-Avalos M. D. et al. Increase in β-cell mass in transplanted porcine neonatal pancreatic cell clusters is due to proliferation of β-cells and differentiation of duct cells // Endocrinology. – 2001. – Vol. 142, №5. – P. 2115– 2122. 40.Weber D.J., McFarland R.D., Irony I. Selected Food and Drug Administration review issues for regulation of allogeneic islets of Langerhans as somatic cell therapy // Transplantation. – 2002. – Vol. 74, №12. – P. 1816–1820. 41.Weber D.J. FDA regulation of allogeneic islets as a biological product // Cell Biochem. Biophys. – 2004, Suppl. 3. – Vol. 40. – P. 19–22. 42.Weir G.C., Cavelti-Weder C., Bonner-Weir S. Stem cell approa- ches for diabetes: towards beta cell replacement // Genome Med. – 2011. – Vol. 3, №9. – P. 61. 43.Yamamoto T., Horiguchi A., Ito M. et al. Quality control for clinical islet transplantation: organ procurement and pre- servation, the islet processing facility, isolation, and potency tests // J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. – 2009. – Vol. 16, №2. – P. 131–136. 44.Yamaoka T. Regeneration therapy of pancreatic beta cells: towards a cure for diabetes? // Biochem. Biophys. Res. Com- mun. – 2002. – Vol. 296, №5. – P. 1039–4103. 36. Teppermen D., Teppermen H. Physiology of metabolism and the endocrine system. Moscow: Mir; 1989. 37.Thompson D.M., Begg I.S., Harris C. et al. Reduced progression of diabetic retinopathy after islet cell transplantation compared with intensive medical therapy. Transplantation 2008; 85(10): 1400–1405. 38.Trahair J.F., Sangild P.T. Systemic and luminal influences on the perinatal development of the gut. Equine Vet J Suppl 1997; (24): 40–50. 39.Trivedi N., Hollister-Lock J., Lopez-Avalos M. D. et al. Increase in β-cell mass in transplanted porcine neonatal pancreatic cell clusters is due to proliferation of β-cells and differentiation of duct cells. Endocrinology 2001; 142(5): 2115–2122. 40.Weber D.J., McFarland R.D., Irony I. Selected Food and Drug Administration review issues for regulation of allogeneic islets of Langerhans as somatic cell therapy. Transplantation 2002; 74(12): 1816–1820. 41.Weber D.J. FDA regulation of allogeneic islets as a biological product. Cell Biochem Biophys 2004; 40(3Suppl): 19–22. 42.Weir G.C., Cavelti-Weder C., Bonner-Weir S. Stem cell approa- ches for diabetes: towards beta cell replacement. Genome Med 2011; 3(9): 61. 43.Yamamoto T., Horiguchi A., Ito M. et al. Quality control for clinical islet transplantation: organ procurement and preser- vation, the islet processing facility, isolation, and potency tests. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2009; 16(2): 131–136. 44.Yamaoka T. Regeneration therapy of pancreatic beta cells: to- wards a cure for diabetes? Biochem Biophys Res Commun 2002; 296(5): 1039–4103.

Репозитарії

Схожі ресурси