Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р.

У статті обговорено основні результати досліджень лауреатів Нобелівської премії з хімії 2017 р. Жака Дюбоше (Jacques Dubochet), Йоахіма Франка (Joachim Frank) і Річарда Гендерсона (Richard Henderson). Представлено історичну ретроспективу розвитку досліджень з кріоелектронної мікроскопії. Обґрунтова...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2018
1. Verfasser:	Гольцев, А.М.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України 2018
Schriftenreihe:	Вісник НАН України
Schlagworte:	Статті та огляди
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/141111
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р. / А.М. Гольцев // Вісник Національної академії наук України. — 2018. — № 6. — С. 75-85. — Бібліогр.: 44 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-141111
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1411112018-07-30T01:22:49Z Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р. Гольцев, А.М. Статті та огляди У статті обговорено основні результати досліджень лауреатів Нобелівської премії з хімії 2017 р. Жака Дюбоше (Jacques Dubochet), Йоахіма Франка (Joachim Frank) і Річарда Гендерсона (Richard Henderson). Представлено історичну ретроспективу розвитку досліджень з кріоелектронної мікроскопії. Обґрунтовано важливість цього відкриття для сучасної науки. Окреслено основні переваги використання кріоелектронної мікроскопії з високою роздільною здатністю для визначення структури біомолекул у розчині. Розглянуто практичне значення цього методу досліджень для медицини і біотехнології, насамперед у галузі створення нових лікарських препаратів, а також ідентифікації нових хвороб. The article explained the core messages of the research of the Nobel Prize winners in chemistry for 2017 Jacques Dubochet, Joachim Frank, and Richard Henderson. The development of cryo-electron microscopy research was presented in historical retrospective. There was substantiated the importance of this discovery for the current scientific community. The main advantages of using a high-resolution cryo-electron microscopy for determining the structure of biomolecules in solution were outlined. The review considered the practical importance of this research for medicine and biotechnology, namely in designing novel therapeutic drugs and identification of new diseases. 2018 Article Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р. / А.М. Гольцев // Вісник Національної академії наук України. — 2018. — № 6. — С. 75-85. — Бібліогр.: 44 назв. — укр. 0372-6436 DOI: doi.org/10.15407/visn2018.06.075 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/141111 uk Вісник НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Статті та огляди Статті та огляди
spellingShingle	Статті та огляди Статті та огляди Гольцев, А.М. Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р. Вісник НАН України
description	У статті обговорено основні результати досліджень лауреатів Нобелівської премії з хімії 2017 р. Жака Дюбоше (Jacques Dubochet), Йоахіма Франка (Joachim Frank) і Річарда Гендерсона (Richard Henderson). Представлено історичну ретроспективу розвитку досліджень з кріоелектронної мікроскопії. Обґрунтовано важливість цього відкриття для сучасної науки. Окреслено основні переваги використання кріоелектронної мікроскопії з високою роздільною здатністю для визначення структури біомолекул у розчині. Розглянуто практичне значення цього методу досліджень для медицини і біотехнології, насамперед у галузі створення нових лікарських препаратів, а також ідентифікації нових хвороб.
format	Article
author	Гольцев, А.М.
author_facet	Гольцев, А.М.
author_sort	Гольцев, А.М.
title	Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р.
title_short	Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р.
title_full	Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р.
title_fullStr	Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р.
title_full_unstemmed	Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р.
title_sort	кріобіологічний постамент нобелівської премії з хімії 2017 р.
publisher	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
publishDate	2018
topic_facet	Статті та огляди
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/141111
citation_txt	Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р. / А.М. Гольцев // Вісник Національної академії наук України. — 2018. — № 6. — С. 75-85. — Бібліогр.: 44 назв. — укр.
series	Вісник НАН України
work_keys_str_mv	AT golʹcevam kríobíologíčnijpostamentnobelívsʹkoípremíízhímíí2017r
first_indexed	2025-07-10T11:59:26Z
last_indexed	2025-07-10T11:59:26Z
_version_	1837261152882524160
fulltext	ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2018, № 6 75 СТАТТІ СТАТТІ ТА ОГЛЯДИТА ОГЛЯДИ КРІОБІОЛОГІЧНИЙ ПОСТАМЕНТ НОБЕЛІВСЬКОЇ ПРЕМІЇ З ХІМІЇ 2017 р. У статті обговорено основні результати досліджень лауреатів Нобелів- ської премії з хімії 2017 р. Жака Дюбоше (Jacques Dubochet), Йоахіма Франка (Joachim Frank) і Річарда Гендерсона (Richard Henderson). Пред- ставлено історичну ретроспективу розвитку досліджень з кріоелектрон- ної мікроскопії. Обґрунтовано важливість цього відкриття для сучасної науки. Окреслено основні переваги використання кріоелектронної мікро- скопії з високою роздільною здатністю для визначення структури біомоле- кул у розчині. Розглянуто практичне значення цього методу досліджень для медицини і біотехнології, насамперед у галузі створення нових лікар- ських препаратів, а також ідентифікації нових хвороб. Ключові слова: Нобелівська премія з хімії, кріоелектронна мікроскопія, зображення, структура біомолекул, нові лікарські препарати. Величезного успіху в отриманні точного зображення біомо- лекул (від голкоподібних структур, якими бактерії атакують клітину, до структури вірусу Зіка) досягли троє вчених, які у 2017 р. стали лауреатами Нобелівської премії в галузі хімії. Найпрестижніша наукова нагорода дісталася Жаку Дюбоше (Jacques Dubochet) з Лозаннського університету (Швейцарія), Йоахіму Франку (Joachim Frank) з Колумбійського універси- тету (США) та Річарду Гендерсону (Richard Henderson) з Ла- бораторії медичних досліджень молекулярної біології у Кемб- риджі (Велика Британія). Кожен із них зробив істотний внесок у розвиток потужного методу, за допомогою якого можна отри- мувати зображення біологічних молекул з точністю до атомних розмірів. І хоча їхні дослідження Нобелівський комітет відніс безпосередньо до галузі хімічних наук з формулюванням «за розроблення кріоелектронної мікроскопії для визначення структури біомолекул з високою роздільною здатністю в роз- чині», ці результати значною мірою сприяли розвитку одно- го з найважливіших розділів біологічної науки — структурної біології. Безсумнівно, зображення — ключ до розуміння будь-якого з процесів, що відбуваються навколо. Наукові відкриття часто залежать від того, наскільки успішною є візуалізація об’єктів. ГОЛЬЦЕВ Анатолій Миколайович — академік НАН України, доктор медичних наук, професор, директор Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України doi: https://doi.org/10.15407/visn2018.06.075 76 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2018. (6) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ Людське око дає можливість сприймати на- вколишній світ у «макроформі». Мікроскоп, сконструйований близько 300 років тому гол- ландським натуралістом Левенгуком, дозволив ученим зазирнути в мікросвіт різних форм жи- вої матерії і розгледіти структури, які не можна було побачити раніше неозброєним оком. Проте отримання зображення того чи іншого об’єкта за допомогою мікроскопа часто потребує викорис- тання барвників або фіксаторів. Крім того, слід враховувати, що в разі малих розмірів біологіч- них структур для проведення їх досліджень не- можливо використовувати оптичні мікроскопи, оскільки їх роздільна здатність обмежена до- вжиною світлових хвиль. Для вивчення зразків у твердому (жорстко- му) стані застосовують такий метод візуаліза- ції, як рентгенівська кристалографія. Однак цей метод не дає достатньої інформації щодо динаміки процесів, які відбуваються, напри- клад, у білках чи ферментах. Альтернативною методикою отримання зображення об’єкта в мікроскопії є просвічування його пучком елек- тронів — техніка, відома як трансмісійна елек- тронна мікроскопія (TEM). Проте ТЕМ- мікроскопія придатна для дослідження об’єктів тільки неживої матерії. Це пов’язано з тим, що аналіз проводиться з використанням потужно- го електронного пучка, який руйнує тонкі біо- логічні структури. До того ж про цеду ра елект- ронно-мікроскопічних досліджень виконуєть- ся в умовах вакууму, що потребує застосування певних способів фіксації біологічних об’єктів (хімічної або кріофіксації) та методів попере- дньої підготовки зразків. Отже, перелічені вище методи у переважній більшості випадків не дозволяють інформа- тивно візуалізувати молекулярні механізми, які відбуваються в природних біологічних об’єктах [1–5]. Ширші можливості візуалізації біомолекул у їх природному стані дає метод кріоелектрон- ної мікроскопії, який ґрунтується на кріофік- сації та надшвидкому охолодженні біомате- ріалу. Добре відомо, що практично безальтер- нативним процесом під час заморожування макрооб’єктів біологічного матеріалу є криста- лоутворення [6, 7]. Тому паралельно з техніч- ним розвитком кріоелектронної мікроскопії фахівці розв’язували проблему керування про- цесом кристалоутворення та досліджували ме- ханізми взаємодії кристалів льоду з біологіч- ними об’єктами [8, 9]. Одним із найінформа- тивніших методів кріоелектронної мікроскопії був і залишається метод заморожування-ско- лювання (freeze-fracture method). Він виявив- ся ефективним під час досліджень та фіксації швидкоплинних процесів у клітині, а також Жак Дюбоше (Jacques Dubochet) Йоахім Франк (Joachim Frank) Річард Гендерсон (Richard Henderson) ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2018, № 6 77 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ вивчення динаміки поза- і внутрішньоклітин- ного кристалоутворення [10]. Таким чином, кріоелектронна мікроскопія вперше дала мож- ливість візуалізувати біомолекули в природній конфігурації. Використання методу кріоелектронної мі- кроскопії (кріо-ЕМ) дає змогу зменшити ви- паровування води і захистити біологічний матеріал від радіаційного ушкодження. На по- чатку 1950-х років Умберто Фернандес-Моран оприлюднив результати досліджень щодо можливості заморожування зразків і підго- товки тонких кріозрізів для кріо-ЕМ. Слід за- значити, що методи охолодження було також використано для вивчення кристалів білка методом рентгенівської кристалографії, а для запобігання формуванню кристалічного льоду застосовували сахарозу або гліцерин [11, 12]. Дещо пізніше Тейлор і Глейзер [13, 14] показа- ли, що охолодження зразків до кріогенних тем- ператур підвищує їх стійкість до радіаційного ушкодження і забезпечує можливість тривалі- шої експозиції зразка з більш високою інтен- сивністю опромінення електронами. Однак, як зазначалося раніше, під час замо- рожування вода, як правило, утворює криста- лічний лід, який спричинює сильну дифракцію електронів, розмиваючи сигнали, що йдуть від зразка. При цьому з’ясувалося, що утворен- ня кристалів льоду змінює структуру зразка. Тобто доступні дослідникам технології не до- зволяли візуалізувати тонку структуру біоло- гічного об’єкта, не кажучи вже про можливість констатувати хоч якісь природні молекулярні механізми. Поставали нові проблеми і нові питання, ви- рішення яких потребувало глибокого аналізу історичних подій. Виявилося, що ще в 1940-х роках один із основоположників досліджень у галузі кріобіології Базіль Люйє стикнувся з проблемою формування кристалічного льоду під час охолодження клітин [15]. Б. Люйє зро- зумів, що уникнути цього явища можна за до- помогою швидкого охолодження біологічного матеріалу. У цьому випадку вода може зберіга- тися в рідкому аморфному (так званому вітри- фікованому) стані. Однак до 1980 р. питання про те, чи зможе об’ємна вода переходити у вітрифікований твердий стан, все ще залишалося відкритим, оскільки теорія підтверджувала той факт, що необхідна швидкість охолодження є практич- но недосяжною. Цей феномен було продемон- стровано, але тільки для конденсації водяної пари на холодних металевих поверхнях [16]. Дещо оптимістичнішими виявилися результа- ти дослідів Брюгеллера зі співавторами [17], які в 1980 р. показали утворення вітрифікова- ної води за швидкого охолодження крапельок об’ємної води мікрометрового розміру. Пізніше (у 1981 р.) швейцарський біолог Жак Дюбоше з співавторами зрештою запропонував метод, який дав змогу сформувати плівку некриста- лічної води на склі зразка для спостереження під електронним мікроскопом. Воду розпилю- вали на вуглецеву плівку, встановлену на сітці, після чого сітку швидко занурювали в рідкий етан або пропан, охолоджений до –196 °С рід- ким азотом [1, 10, 18]. Жак Дюбоше розробив метод склування води: він охолоджував її настільки швидко, що при твердненні вода навколо зразка зберігала структуру, яку мала в рідкому вигляді. Біоло- гічна молекула, укладена в таку «скляну льо- динку», зберігала свою природну форму навіть в умовах вакууму. Показано, що тонкий шар вітрифікованої води може майже однорідно поглинати елек- трони у кріо-ЕМ. Змінюючи температурні режими, Ж. Дюбоше зі співавторами спосте- рігали, що аморфна структура води перетво- рювалася на кристалічну під час нагрівання приблизно до –140 °С, а склоподібний лід можна було підтримувати навколо зразка про- тягом тривалого часу за температури менш як –196 °С. Повний потенціал методу Дюбоше з підго- товки зразків було реалізовано в 1984 р., коли група дослідників продемонструвала елект- рон ні мікрофотографії суспензій вірусів, охо- лоджених з використанням удосконаленого методу, який дозволив отримати тонкі водні шари у вітрифікованому стані [19, 20] (рис. 1). Ж. Дюбоше та його колеги показали, що метод 78 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2018. (6) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ підготовки зразка можна широко застосовува- ти в кріо-ЕМ дослідженнях і для інших біоло- гічних частинок. Новий метод підготовки було прийнято науковою спільнотою за основний, і до сьогодні його використовують як у дослі- дженнях комплексів окремих частинок, так і в кріотомографічних дослідженнях окремих об’єктів [21]. Очевидно, що метод вітрифікації (склуван- ня) середовища, в якому міститься біологічний об’єкт, став «родзинкою» цього варіанта кріо- ЕМ, оскільки він дає змогу бачити не лише структуру (основу) самої молекули білка, а й його амінокислотні відгалуження, які простя- гаються поряд і є необхідним компонентом для реалізації хімічних процесів за участю білків. Більше того, тільки за допомогою цього методу відкриваються можливості як для забезпечен- ня «прозорості» самого учасника біохімічно- го процесу, так і для розвитку цього процесу в динаміці. Останні вдосконалення методики дозволяють реєструвати розвиток біохімічних процесів постадійно. Роблячи знімки однієї й тієї самої системи в різні моменти часу, а потім складаючи їх послідовно, вчені тепер можуть відобразити біологічні процеси у вигляді філь- му. Зараз дослідники мають можливість замо- розити біологічні молекули не в стаціонарно- му стані, а безпосередньо під час їх руху, спо- стерігаючи за характером реалізації їх функції. Відтепер хімічні процеси, які відбуваються в окремій молекулі будь-якої речовини, можна роздивитися в найдрібніших деталях. Основна проблема досліджень незабарвле- них, некристалічних, асиметричних, випадко- во орієнтованих частинок у розчині полягає у «вирівнюванні» ознак, які погано проявляють- ся на тлі «шумів» приладу [22]. Вирішенням цієї проблеми ще в середині 1970-х років за- ймався німецький, а зараз уже американський біофізик Йоахім Франк. Ці дослідження [22] стали відправною точкою для майбутніх ро- біт, за які йому фактично й було присуджено Нобелівську премію. Упродовж майже десяти років Й. Франк намагався знайти спосіб, як з дуже «мутних» двовимірних зображень, одер- жаних на електронному мікроскопі, зробити тривимірне зображення досліджуваної струк- тури. Зрештою йому вдалося розробити метод, оснований на аналізі та порівнянні двовимір- них «електронних» зображень, який сьогодні набув значного поширення. Йоахім Франк і його колеги запропонували метод вирівнюван- ня низькодозових зображень окремих молекул з використанням функцій взаємної кореляції [22, 23]. На основі узагальненого аналізу було зроблено висновок щодо можливості виявлен- ня випадково розташованих частинок, вико- ристовуючи при цьому дози електронів, які їх не руйнують. Сенс цієї роботи полягав у мож- Рис. 1. Схема методу Ж. Дюбоше швидкого охоло- дження водних розчинів зразків біологічних об’єктів (схема з сайту nobelprize.org) ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2018, № 6 79 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ ливості усереднити зображення кількох час- тинок і отримати дані з високою роздільною здатністю [24]. Важливим аспектом досліджень Йоахіма Франка та його колег було також те, що свої розрахунки вони виконували для некриста- лічних зразків, які складаються з однорідних частинок. Однак біологічні зразки рідко бу- вають структурно однорідними. У зв’язку з цим постало завдання щодо визначення по- ложення та орієнтації кожної частинки, тобто параметрів, які характеризують їх двовимірне положення в площині та тривимірну орієнта- цію. У 1981 р. Йоахім Франк і Марін ван Хеєль запропонували метод, який дозволяв сортува- ти зображення частинок на класи на основі їх орієнтації та структурних особливостей [25, 26] (рис. 2). Загальний метод визначення від- носної тривимірної орієнтації з класів двови- мірних проекцій асиметричних частинок було розроблено Й. Франком і М. Радермахером в 1986–1987 рр. [27–29]. Цей метод дістав назву «метод випадкового конічного нахилу». Значний внесок у розвиток кріоелектронної мікроскопії зробили Річард Гендерсон та його колеги [30]. Вони вперше показали можли- вість отримання за допомогою кріоелектрон- ної мікроскопії структури біомолекул з висо- кою роздільною здатністю через усереднення за безліччю копій одного й того самого об’єкта. В їхньому експерименті сигнали виходили від багатьох молекул бактеріородопсину у дво- вимірному кристалі (рис. 3). Дослідження по- казали, що за ультранизьких температур раді- аційне навантаження може бути обмеженим, що дозволяє достатньою мірою утримувати інформаційний контент для виявлення по- зицій амінокислотних бічних ланцюгів білка. У подальшому аналогічний підхід було вико- ристано для визначення з високою роздільною здатністю структур інших об’єктів, наприклад димеру тубуліну [31] та аквапоринів [32]. У своєму новаторському дослідженні Р. Ген- дерсон та його колеги для оптимізації якості даних використовували кілька електронних мікроскопів по всьому світу [30]. Вони визна- чили ряд технічних обмежень для цих мікро- Рис. 2. Схема методу Й. Франка для побудови якісно- го 3D-зображення молекул (схема з сайту nobelprize. org) скопів, а також проблеми, пов’язані з підготов- кою зразків, які могли обмежувати роздільну здатність. Р. Гендерсон дійшов висновку, що на той час жоден з мікроскопів не був ідеаль- ним. На його думку, конкретні технічні удо- сконалення та необхідна підготовка зразків полегшили б розроблення загальної методики кріо-ЕМ: «Тоді це перетворило б методику, що ми використовуємо, на рутинний і швидкий метод, який можна використовувати на більш складних зразках, у тому числі на некриста- лічних молекулярних ансамблях» [30]. Авто- ри вважали, що низькоінтенсивне, «щадне» електронне опромінення у фазоконтрастній електронній мікроскопії дозволить визначити двовимірне положення і тривимірну орієнта- 80 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2018. (6) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ цію окремих частинок, навіть у разі їх досить великої молекулярної маси. Інформація дала б змогу усереднити ансамблі випадково розподі- лених частинок, досягаючи тим самим розділь- ної здатності на рівні атомів. У сучасному світі удосконалення методів обробки зображень і комп’ютерних програм має велике значення. Наприклад, коли за до- помогою нових електронних детекторів було досягнуто більш високої роздільної здатності, алгоритми методу максимальної правдоподіб- ності [33] почали відігравати особливо важли- ву роль в електронній мікроскопії. Кріо-ЕМ з використанням моночастинок високих енер- гій — одночастинкова (single part) кріоелек- тронна мікроскопія — унікальна тим, що не по- требує кристалізації, використовує дуже малу кількість матеріалу і охоплює широкий діа- пазон розмірів — від частинок розміром з мо- лекулу гемоглобіну (64 кДа) до дуже великих частинок, розміром аж до кількох мільйонів дальтон. Для визначення структури ще біль- ших за розміром об’єктів, таких як органели чи клітини, використовують кріоелектронну томографію, з тим, щоб у подальшому можна було отримувати інформацію з високою роз- дільною здатністю від молекул або комплексів безпосередньо в такому біологічному об’єкті, тобто in situ [34]. Отже, завдяки розробкам останніх 15–20 років у кріоелектронної мікроскопії значно підвищилася якість (рис. 4) і розширився діа- пазон розмірів об’єктів для визначення струк- тури в розчині — від клітин і органел до моле- кулярних комплексів, молекул і атомів, з яких складаються ці молекули. Більш того, кріо-ЕМ дала змогу ідентифікувати біологічний об’єкт не лише в його статичному стані, а й у дина- міці. Оскільки підготовка зразка для кріо-ЕМ пов’язана з миттєвим охолодженням розчину, а склад розчину може постійно змінюватися, ми можемо відстежувати стан системи в часі, наприклад вивчати інтегральні мембранні біл- ки у стані, близькому до природного оточення. Інакше кажучи, ті чи інші частинки можуть бути «захоплені» у структурних підстанах або навіть під час дії, скажімо, в момент, коли фер- мент каталізує хімічну реакцію. Такі дані мо- жуть надавати також і функціональну інфор- мацію, відкриваючи можливості для контролю структурних змін, визначення діапазонів віль- ної енергії тощо [35–39]. Тому описані тут розробки, безумовно, за- слуговують на найвищу оцінку. Однак особли- ву увагу привертає можливість впровадження результатів цих робіт у медичну практику. Оче- видне порушення гармонійної взаємодії бодіго- меостазу та екогомеостазу в останні десятиліття зумовило розширення спектра хвороб людини. Не викликає сумнівів, що в основі успішного лі- кування будь-якого захворювання лежить пере- дусім розуміння характеру таких змін (причин і механізмів їх розвитку). Фактори, причетні до порушення фізіологічного стану людини, можуть бути різними, наприклад генетично детермінована спадковість, дія агресивних зо- внішніх чинників, постійний психоемоціний тиск, вживання неякісних продуктів харчуван- ня і, як наслідок, порушення стану облігатної мікрофлори організму тощо. Все це призво- дить до розбалансованості функціонування так званого «золотого трикутника» забезпечення гомеостазу (здоров’я) людини, зокрема нейро- імуно-ендокринного блока [40]. Це спричинює змінення фізіологічного профілю організму і на молекулярно-генетичному рівні зумовлює не- Рис. 3. Структура молекули бактеріородопсину: а — перша, доволі груба модель, опублікована Річардом Гендерсоном у 1975 р. в журналі Nature. 257: 28; б — мо- дель Р. Гендерсона з атомарною роздільною здатністю, опублікована в 1990 р. в роботі [30] ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2018, № 6 81 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ бажані зміни у формуванні дуже важливих для функціонування організму медіаторних регу- ляторних молекул (цитокінів). Комплекси таких біологічно значущих мо- лекул виступають як ліганди до відповідних рецепторів і мають важливе значення в процесі передачі хімічних сигналів. При цьому на тип створеного сигналу суттєво впливає відносна орієнтація двох взаємодіючих молекул. В умо- вах розвитку вищезазначеного «цитокінового шторму» [41] можуть з’являтися нові форми регуляторних сполук (білки, пептиди, аміно- кислотні залишки тощо). Не виключена також можливість зміни їх стандартної структури внаслідок так званого misfolding, тобто не- правильного скручування, згортання. Інакше кажучи, може скластися така ситуація, що фі- зіологічна регуляторна активність молекули- ліганду може змінитися на патологічну [42]. Наразі доведено значущість зміни структури ряду регуляторних пептидів у розвитку пев- них патологій (див. табл.) [43]. Зараз уже загальновизнано, що збільшення кількості хвороб, таких як хвороба Альцгейме- Зв’язок неправильно згорнутих білків (misfolding) з нейродегенеративними захворюваннями Протеїнопатія Агрегуючі білки Хвороба Альцгеймера Бета-амілоїдний пептид (Ab); Tau Хвороба Паркінсона α-синуклеїн Численні таупатії Білок Tau (асоційований з мікротрубочками) Хвороба Гантінгтона Гантінгтин з тандемними повторами глютаміну Аміотрофічний латераль- ний склероз Супероксид дисмутази 1 Губчасті енцефалопатії Пріонові білки Сімейна амілоїдна полі- нейропатія Транстиретин (мутантні форми) Рис. 4. Роздільна здатність електронного мікроскопа кардинально поліпши- лася за останні роки — від зображення безформних плям (ліворуч) до візуа- лізації білків на атомарному рівні (праворуч) (схема з сайту nobelprize.org) ра, Паркінсона, діабет ІІ типу, пріонові захво- рювання тощо, пов’язане з появою в організмі агрегатів білкового амілоїду в тканинах люди- ни. До того ж частота цих захворювань зростає зі старінням людини, тобто на тлі істотної змі- ни профілю регуляторних медіаторів [44]. Точ- ні механізми дії таких «білків захворювання» 82 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2018. (6) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ достеменно невідомі, але доведено, що є кілька етапів їх існування: від початкового синтезу до деградації. При цьому не слід забувати про можливість біомолекул та їх комплексів екзо- генного походження, до яких належать віруси, бактерії та продукти їх життєдіяльності, віді- гравати роль патогенетичних чинників. Використання кріо-ЕМ у запропонованій нобелівськими лауреатами модифікації дозво- ляє вченим не тільки вивчати та ідентифікува- ти точну поверхневу архітектуру таких ендо- та екзогенних «агресивних» сполук (молекул), а й напрацьовувати різні шляхи пошуку їх мо- ле кул-антиподів, які будуть комплементарно з ними зв’язуватися та інгібувати їх активність. Це дає змогу по-новому підійти як до розумін- ня хімічних процесів, які відбуваються у при- роді взагалі, так і до розроблення відповідних лікарських препаратів. Лікувальне таргету- вання патогенних сполук визначає основні за- вдання, пов’язані з розробленням лікарських препаратів та врахуванням динамічної приро- ди білків, залучених до процесу таргетування. Це стосується визначення форми білків (мо- номери, олігомери або нерозчинні агрегати) певного захворювання, які відповідають за клітинну токсичність; з’я су ван ня, які компо- ненти катіонного протео статичного механізму взаємодіють з білками цих хвороб, тощо. Інак- ше кажучи, потрібно мати точне зображення структури-матриці (молекули), з якої в той чи інший спосіб належить зробити відбиток необ- хідної форми. Застосування методів, запропо- нованих Ж. Дюбоше, Й. Франком та Р. Гендер- соном, значно спрощує і полегшує отримання зображень таких біологічних молекул. Вико- ристовуючи високу роздільну здатність цього методу, в майбутньому дослідники зможуть не лише отримувати інформацію про струк- туру молекул, а й спостерігати особливості їх взаємодії і за потреби — коригувати розвиток процесів, що відбуваються всередині клітин або органел. Учені постійно отримують нові знання про механізми різних захворювань, удосконалюють засоби моделювання стану захворювань in vitro та in vivo, виявляють нові біомаркери. З вико- ристанням запропонованого методу кріо-ЕМ відкривається перспектива розроблення таких терапевтичних засобів, які зможуть запобігти, завадити або затримати прогресування захво- рювань. Завдяки точній візуалізації структури розширюється коло застосувань нанотехноло- гій, наприклад створення наномашин, які інак- тивуватимуть патогенну активність тих чи тих структур. І насамкінець. Підтвердженням значущос- ті досліджень, які минулого року було від- значено Нобелівською премією, можуть бути яскраві висловлювання видатних науковців. Так, Венкі Рамакришнан, експерт зі структур- ної біології Лабораторії медичних досліджень молекулярної біології, лауреат Нобелівської премії з хімії 2009 р. (за дослідження в галу- зі рентгенівської кристалографії), оцінив цю подію як «революцію у структурній біології». Холгер Старк, експерт з кріо-ЕМ, який очолює Інститут біофізичної хімії імені Макса План- ка в Геттингені (Німеччина), зазначив, що в останні роки роздільна здатність методу різ- ко підвищилася і дозволяє побачити не тіль- ки контур хребта білка, а й відгалужені гілки амінокислоти. Тобто науковці вже мають необ- хідні дані для розуміння хімічної дії білка, і це, безумовно, сприятиме створенню нових ліків. Баррі Фуллер, професор хірургічних наук у медичній школі Університетського коледжу Лондона, підкреслив, що «ця технологія спря- мована на виявлення біомолекул у життєвому процесі, «замороженому» в часі. Знання про конфігурації та стабільність біомолекул за наднизьких температур може прискорити до- сягення вчених у галузі кріобіології, спрямо- вані на вітрифікування тканин та органів лю- дини для наступного їх зберігання протягом тривалого часу». ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2018, № 6 83 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ REFERENCES [СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ] 1. Robards A.W., Sleytr U.B. Low temperature methods in biological electron microscopy (Practical methods in electron microscopy). (Amsterdam–New York–Oxford: Elsevier, 1985). 2. Author’s certificate USSR No. 399937. Kabylyakov V.A., Kapreliantz A.S., Pushkar N.S. et al. An electron micro- scope-analyzer of a translucent type, for example, of biological objects. 1973. [А.с. СССР № 399937. Кабыляков В.А., Капрельянц А.С., Пушкарь Н.С. и др. Электронный микроскоп- анализатор просвечивающего типа, например биологических объектов. 1973.] 3. Author’s certificate USSR No. 557288. Pankov E.Ya., Kapreliantz A.S., Zhuravlev V.S., Chemeris I.I., Kabylyak- ov V.A. Method for processing biological samples for cryo-ultratomy. 1977. [А.с. СССР № 557288. Панков Е.Я., Капрельянц А.С., Журавлев В.С., Чемерис И.И., Кабыляков В.А. Способ обработки биологических образцов для криоультратомии. 1977.] 4. Author’s certificate USSR No. 690360. Kaprelyants A.S., Zhuravlev V.S., Repin N.V. Cryo-ultratome. 1979. [А.с. СССР № 690360. Капрельянц А.С., Журавлев В.С., Репин Н.В. Криоультратом. 1979.] 5. Author’s certificate USSR No. 1157597. Repin N.V., Skornyakov B.A., Khramtsov V.P., Vaysman A.L. Device for fracturing biological objects in vacuum. 22.01.1985. [А.с. СССР № 1157597. Репин Н.В., Скорняков Б.А., Храмцов В.П., Вайсман А.Л. Устройство для скалывания биологических объектов в вакууме. 22.01.1985.] 6. Itkin Yu.A., Bronshtein V.L., Rozanov L.F. Study of the effect of ice structure on dehydration process and intracel- lular crystallization during freezing of cell suspension. Kriobiologiya i Kriomeditsina (Cryobiology and Cryomedicine). 1977. (3): 35. [Иткин Ю.А., Бронштейн В.Л., Розанов Л.Ф. Изучение влияния структуры льда на процесс обезвоживания и внутриклеточную кристаллизацию при замораживании клеточной суспензии. Криобиология и криомедицина. 1977. Вып. 3. С. 35–41.] 7. Repin N.V. Study of extra-and intracellular crystallization in human erythrocytes under different cooling conditions. Kriobiologiya (Cryobiology). 1986. (3): 31. [Репин Н.В. Изучение вне- и внутриклеточной кристаллизации в эритроцитах человека при различных условиях охлаждения. Криобиология. 1986. № 3. С. 31–36.] 8. Zinchenko A.V., Mank V.V., Ovcharenko F.D., Repin N.V. Skornyakov B.A. Structure and phase states of water- glycerol solutions. Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine. 1982. Ser. B. (8): 38. [Зинченко А.В., Манк В.В., Овчаренко Ф.Д., Репин Н.В., Скорняков Б.А. Строение и фазовые состояния водно-глицериновых растворов. Доп. АН УРСР. 1982. Сер. Б, № 8. С. 38–42.] 9. Yurchenko T.N., Kozlova V.F., Skornyakov B.A., Strona V.I., Repin N.V. Influence of cryoprotectants on biological systems. (Kyiv: Naukova Dumka, 1989). [Юрченко Т.Н., Козлова В.Ф., Скорняков Б.А., Cтрона В.И., Репин Н.В. Влияние криопротекторов на биологические системы. К.: Наук. думка, 1989.] 10. Repin N.V. To the question about two-step rapid freezing method. Estimation of aqueous membrane permeability in erythrocytes at temperature exposure stage. CryoLetters. 2009. (4): 251. 11. Haas D.J. X-ray studies on lysozyme crystals at –50°C. Acta Cryst. B. 1968. 24: 604. 12. Haas D.J., Rossmann M.G. Crystallographic studies on lactate dehydrogenase at –75 degrees C. Acta Cryst. 1970. 26: 998. 13. Taylor K.A. Glaeser R.M. Electron diffraction of frozen, hydrated protein crystals. Science. 1974. 186(4168): 1036. http://dx.doi.org/10.1126/science.186.4168.1036 14. Taylor K.A., Glaeser R.M. Electron microscopy of frozen hydrated biological specimens. J. Ultrastruct. Res. 1976. 55(3): 448. http://dx.doi.org/10.1016/S0022-5320(76)80099-8 15. Schmidt P.J. Basile J. Luyet and the beginnings of transfusion cryobiology. Transfus. Med. Rev. 2006. 20(3): 242. https://doi.org/10.1016/j.tmrv.2006.03.004 16. Dowell L.G., Rinfret A.P. Low-temperature forms of ice as studied by X-ray diffraction. Nature. 1960. 188(4757): 1144. http://dx.doi.org/10.1038/1881144a0 17. Brüggeller P., Mayer E. Complete vitrification in pure liquid water and dilute aqueous solutions. Nature. 1980. 288(5791): 569. http://dx.doi.org/10.1038/288569a0 18. Repin N.V., Skornyakov B.A. Methodological features and technical support of the method of freeze-fracturing. Krio- biologiya i Kriomeditsina (Cryobiology and Cryomedicine). 1982. 10: 89. 84 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2018. (6) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ [Репин Н.В., Скорняков Б.А. Методические особенности и техническое обеспечение метода замораживания- скалывания. Криобиология и криомедицина. 1982. Вып. 10. С. 89–92.] 19. Dubochet J., Adrian M., Chang J.-J., Homo J.-C., Lepault J., McDowall A.W., Schultz P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 1988. 21(2): 129. http://dx.doi.org/10.1017/S0033583500004297 20. Adrian M., Dubochet J., Lepault J., McDowall A.W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 1984. 308(5954): 32. http://dx.doi.org/10.1038/308032a0 21. Beck M., Baumeister W. Cryo-electron tomography: can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail? Trends Cell Biol. 2016. 26(11): 825. http://dx.doi.org/10.1016/j.tcb.2016.08.006 22. Frank J. Averaging of low exposure electron micrographs of non-periodic objects. Ultramicroscopy. 1975. 1(2): 159. http://dx.doi.org/10.1016/S0304-3991(75)80020-9 23. Saxton W.O., Frank J. Motif detection in quantum noise-limited electron micrographs by cross-correlation. Ultrami- croscopy. 1977. 2: 219. http://dx.doi.org/10.1016/S0304-3991(76)91385-1 24. Frank J., Goldfarb W., Eisenberg D., Baker T.S. Reconstruction of glutamine synthetase using computer averaging. Ultramicroscopy. 1978. (3): 283. http://dx.doi.org/10.1016/S0304-3991(78)80038-2 25. van Heel M., Frank J. Use of multivariate statistics in analysing the images of biological macromolecules. Ultrami- croscopy. 1981. (6): 187. http://dx.doi.org/10.1016/0304-3991(81)90059-0 26. Frank J., van Heel M. Correspondence analysis of aligned images of biological particles. J. Mol. Biol. 1982. (161): 134. http://dx.doi.org/10.1016/0022-2836(82)90282-0 27. Radermacher M., Wagenknecht T., Verschoor A., Frank J. A new 3D reconstruction scheme applied to the 50s ribo- somal subunit of E. coli. J. Microsc. 1986. (141): RP1. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2818.1986.tb02693.x 28. Radermacher M., Wagenknecht T., Verschoor A., Frank J. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. J. Microsc. 1987. (146): 113. http:// dx.doi.org/10.1111/j.1365-2818.1987.tb01333.x 29. Radermacher M. Dreidimensionale Rekonstruktion bei kegelförmiger Kippung im Elektronenmikroskop. Thesis, Technical University, Munich, 1980. http://www.uvm.edu/%7Emraderma/thesis/M_Radermacher_PhD_Thesis. pdf 30. Henderson R., Baldwin J.M., Ceska T.A., Zemlin F., Beckmann E., Downing K.H. Model for the structure of bac- teriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy. J. Mol. Biol. 1990. (213): 899. http://dx.doi. org/10.1016/S0022-2836(05)80271-2 31. Nogales E., Wolf S.G., Downing K.H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 1998. (391): 199. http://dx.doi.org/10.1038/34465 32. Murata K., Mitsuoka K., Hiral T., Walz T., Agre P., Heymann J.B., Engel A., Fujiyoshi Y. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. 2000. (407): 599. http://dx.doi.org/10.1038/35036519 33. Scheres S.H.W., Gao H., Valle M., Herman G.T., Eggermont P.P.B., Frank J., Carazo J.M. Disentangling conforma- tional states of macromolecules in 3D-EM through likelihood optimization. Nature Methods. 2007. (4): 27. http:// dx.doi.org/10.1038/nmeth992 34. Oikonomou C.M., Jensen G.J. Cellular electron cryotomography: toward structural biology in situ. Annu. Rev. Bio- chem. 2017. (86): 873. http://dx.doi.org/10.1146/annurev-biochem-061516-044741 35. Rubinstein J.L. Cryo-EM captures the dynamics of ion channel opening. Cell. 2017. (168): 341. http://dx.doi. org/10.1016/j.cell.2017.01.011 36. Fischer N., Konevega A.L., Wintermeyer W., Rodnina M.V., Stark H. Ribosome dynamics and tRNA movement by time-resolved electron cryomicroscopy. Nature. 2010. (466): 329. http://dx.doi.org/10.1038/nature09206 37. Hite R.K., MacKinnon R. Structural titration of Slo2.2, a Na+-dependent K+ channel. Cell. 2017. (168): 390. http:// dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.12.030 38. Zhao J., Benlekbir S., Rubinstein J.L. Electron cryomicroscopy observation of rotational states in a eukaryotic V- ATPase. Nature. 2015. (521): 241. http://dx.doi.org/10.1038/nature14365 39. Dashti A., Ben Hail D., Mashayekhi G., Schwander P., des Georges A., Frank J., Ourmazd A. Conformational dynam- ics and energy landscapes of ligand binding in RyR1. bioRxiv, 2017. http://dx.doi.org/10.1101/167080 40. Goltsev A.N., Popova K.N., Sirous M.A. Cryopreservation as optimizing factor in therapeutic effect of products of embryofetoplacental complex (PEFPC). Part 1. Pathology of autoimmune genesis as assessment model of therapeu- tic effect of PEFPC application. Probl. Criobiol. 2006. 16(3): 326. [Гольцев А.Н., Попова К.Н., Сироус М.А. Криоконсервирование – фактор оптимизации терапевтического эффекта продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса (ПЭФПК). Часть 1. Патология аутоиммунного ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2018, № 6 85 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ генеза как модель оценки терапевтического эффекта применения ПЭФПК. Проблемы криобиологии. 2006. Т. 16, № 3. С. 326–340.] 41. Grischenko V.I., Goltsev A.N. Transplantation of the products of embryofetoplacental complex. From understanding of mechanism of the effect to increasing the efficiency of application. Probl. Cryobiol. 2002. (1): 54. [Грищенко В.И., Гольцев А.Н. Трансплантация продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса. От пони- мания механизма действия к повышению эффективности применения. Проблемы криобиологии. 2002. № 1. С. 58–54.] 42. Meng X.-Y., Zhang H.-X., Mezei M., Cui M. Molecular Docking: A powerful approach for structure-based drug dis- covery. Curr. Comput. Aided Drug Des. 2011. 7(2): 146. http://dx.doi.org/10.2174/157340911795677602 43. Sweeney P., Park H., Baumann M., Dunlop J., Frydman J. et al. Protein misfolding in neurodegenerative diseases: implications and strategies. Transl. Neurodegener. 2017. 6: 6. http://dx.doi.org/10.1186/s40035-017-0077-5 44. Vozianov A.F., Butenko A.K., Zak K.P. Cytokines. Biological and antitumour properties. (Kyiv: Naukova Dumka, 1998). [Возианов А.Ф., Бутенко А.К., Зак К.П. Цитокины. Биологические и противоопухолевые свойства. К.: Наук. думка, 1998.] Стаття надійшла 25.01.2018 A.M. Goltsev Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine (Kharkiv) CRYOBIOLOGICAL PEDESTAL OF THE NOBEL PRIZE IN CHEMISTRY FOR 2017 The article explained the core messages of the research of the Nobel Prize winners in chemistry for 2017 Jacques Dubochet, Joachim Frank, and Richard Henderson. The development of cryo-electron microscopy research was presented in historical retrospective. There was substantiated the importance of this discovery for the current scientific community. The main advantages of using a high-resolution cryo-electron microscopy for determining the structure of biomolecules in solution were outlined. The review considered the practical importance of this research for medicine and biotechnology, namely in designing novel therapeutic drugs and identification of new diseases. Keywords: Nobel Prize, cryo-electron microscopy, image, structure of biomolecule, novel drugs. << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /None /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Error /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /DetectCurves 0.0000 /ColorConversionStrategy /CMYK /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedOpenType false /ParseICCProfilesInComments true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams false /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage true /PreserveDICMYKValues true /PreserveEPSInfo true /PreserveFlatness true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts true /TransferFunctionInfo /Apply /UCRandBGInfo /Preserve /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /CropColorImages true /ColorImageMinResolution 300 /ColorImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 1200 /ColorImageDepth -1 /ColorImageMinDownsampleDepth 1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages false /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /CropGrayImages true /GrayImageMinResolution 300 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 1200 /GrayImageDepth -1 /GrayImageMinDownsampleDepth 2 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages false /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /CropMonoImages true /MonoImageMinResolution 1200 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleMonoImages true /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages false /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /CheckCompliance [ /None ] /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile (None) /PDFXOutputConditionIdentifier () /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName () /PDFXTrapped /False /CreateJDFFile false /Description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> /CHS <FEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000410064006f006200650020005000440046002065876863900275284e8e9ad88d2891cf76845370524d53705237300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002> /CHT <FEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef69069752865bc9ad854c18cea76845370524d5370523786557406300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002> /CZE <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> /DAN <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> /DEU <FEFF00560065007200770065006e00640065006e0020005300690065002000640069006500730065002000450069006e007300740065006c006c0075006e00670065006e0020007a0075006d002000450072007300740065006c006c0065006e00200076006f006e002000410064006f006200650020005000440046002d0044006f006b0075006d0065006e00740065006e002c00200076006f006e002000640065006e0065006e002000530069006500200068006f006300680077006500720074006900670065002000500072006500700072006500730073002d0044007200750063006b0065002000650072007a0065007500670065006e0020006d00f60063006800740065006e002e002000450072007300740065006c006c007400650020005000440046002d0044006f006b0075006d0065006e007400650020006b00f6006e006e0065006e0020006d006900740020004100630072006f00620061007400200075006e0064002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020006f0064006500720020006800f600680065007200200067006500f600660066006e00650074002000770065007200640065006e002e> /ESP <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> /ETI <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> /FRA <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> /GRE <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a stvaranje Adobe PDF dokumenata najpogodnijih za visokokvalitetni ispis prije tiskanja koristite ove postavke. Stvoreni PDF dokumenti mogu se otvoriti Acrobat i Adobe Reader 5.0 i kasnijim verzijama.) /HUN <FEFF004b0069007600e1006c00f30020006d0069006e0151007300e9006701710020006e0079006f006d00640061006900200065006c0151006b00e90073007a00ed007401510020006e0079006f006d00740061007400e100730068006f007a0020006c006500670069006e006b00e1006200620020006d0065006700660065006c0065006c0151002000410064006f00620065002000500044004600200064006f006b0075006d0065006e00740075006d006f006b0061007400200065007a0065006b006b0065006c0020006100200062006500e1006c006c00ed007400e10073006f006b006b0061006c0020006b00e90073007a00ed0074006800650074002e0020002000410020006c00e90074007200650068006f007a006f00740074002000500044004600200064006f006b0075006d0065006e00740075006d006f006b00200061007a0020004100630072006f006200610074002000e9007300200061007a002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e0030002c0020007600610067007900200061007a002000610074007400f3006c0020006b00e9007301510062006200690020007600650072007a006900f3006b006b0061006c0020006e00790069007400680061007400f3006b0020006d00650067002e> /ITA <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> /JPN <FEFF9ad854c18cea306a30d730ea30d730ec30b951fa529b7528002000410064006f0062006500200050004400460020658766f8306e4f5c6210306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103055308c305f0020005000440046002030d530a130a430eb306f3001004100630072006f0062006100740020304a30883073002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d3067958b304f30533068304c3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002> /KOR <FEFFc7740020c124c815c7440020c0acc6a9d558c5ec0020ace0d488c9c80020c2dcd5d80020c778c1c4c5d00020ac00c7a50020c801d569d55c002000410064006f0062006500200050004400460020bb38c11cb97c0020c791c131d569b2c8b2e4002e0020c774b807ac8c0020c791c131b41c00200050004400460020bb38c11cb2940020004100630072006f0062006100740020bc0f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020c774c0c1c5d0c11c0020c5f40020c2180020c788c2b5b2c8b2e4002e> /LTH <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> /LVI <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> /NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken die zijn geoptimaliseerd voor prepress-afdrukken van hoge kwaliteit. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.) /NOR <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> /POL <FEFF0055007300740061007700690065006e0069006100200064006f002000740077006f0072007a0065006e0069006100200064006f006b0075006d0065006e007400f300770020005000440046002000700072007a0065007a006e00610063007a006f006e00790063006800200064006f002000770079006400720075006b00f30077002000770020007700790073006f006b00690065006a0020006a0061006b006f015b00630069002e002000200044006f006b0075006d0065006e0074007900200050004400460020006d006f017c006e00610020006f007400770069006500720061010700200077002000700072006f006700720061006d006900650020004100630072006f00620061007400200069002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e0030002000690020006e006f00770073007a0079006d002e> /PTB <FEFF005500740069006c0069007a006500200065007300730061007300200063006f006e00660069006700750072006100e700f50065007300200064006500200066006f0072006d00610020006100200063007200690061007200200064006f00630075006d0065006e0074006f0073002000410064006f0062006500200050004400460020006d00610069007300200061006400650071007500610064006f00730020007000610072006100200070007200e9002d0069006d0070007200650073007300f50065007300200064006500200061006c007400610020007100750061006c00690064006100640065002e0020004f007300200064006f00630075006d0065006e0074006f00730020005000440046002000630072006900610064006f007300200070006f00640065006d0020007300650072002000610062006500720074006f007300200063006f006d0020006f0020004100630072006f006200610074002000650020006f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e0030002000650020007600650072007300f50065007300200070006f00730074006500720069006f007200650073002e> /RUM <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> /RUS <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> /SKY <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> /SLV <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> /SUO <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> /SVE <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> /TUR <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> /ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents best suited for high-quality prepress printing. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.) /UKR <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> >> /Namespace [ (Adobe) (Common) (1.0) ] /OtherNamespaces [ << /AsReaderSpreads false /CropImagesToFrames true /ErrorControl /WarnAndContinue /FlattenerIgnoreSpreadOverrides false /IncludeGuidesGrids false /IncludeNonPrinting false /IncludeSlug false /Namespace [ (Adobe) (InDesign) (4.0) ] /OmitPlacedBitmaps false /OmitPlacedEPS false /OmitPlacedPDF false /SimulateOverprint /Legacy >> << /AddBleedMarks false /AddColorBars false /AddCropMarks false /AddPageInfo false /AddRegMarks false /ConvertColors /ConvertToCMYK /DestinationProfileName () /DestinationProfileSelector /DocumentCMYK /Downsample16BitImages true /FlattenerPreset << /PresetSelector /MediumResolution >> /FormElements false /GenerateStructure false /IncludeBookmarks false /IncludeHyperlinks false /IncludeInteractive false /IncludeLayers false /IncludeProfiles false /MultimediaHandling /UseObjectSettings /Namespace [ (Adobe) (CreativeSuite) (2.0) ] /PDFXOutputIntentProfileSelector /DocumentCMYK /PreserveEditing true /UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged /UntaggedRGBHandling /UseDocumentProfile /UseDocumentBleed false >> ] >> setdistillerparams << /HWResolution [2400 2400] /PageSize [612.000 792.000] >> setpagedevice

Кріобіологічний постамент Нобелівської премії з хімії 2017 р.

Institution

Ähnliche Einträge