Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro
За допомогою трансфекції клітин МТ-4 та ВНК ДНК із зразків епітелію шийки матки хворих із папіломавірусною інфекцією створено модель, що є пермісивною для репродукції вірусів папіломи людини (ВПЛ). У стабільно трансфікованих клітинах підтримується високий рівень вірусного навантаження і під час ел...
Gespeichert in:
| Datum: | 2018 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2018
|
| Schriftenreihe: | Доповіді НАН України |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/144529 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro / М.Я. Співак, С.Л. Рибалко, Д.Б. Старосила, М.П. Завелевич, І.П. Олексієнко, С.Т. Дядюн, А.В. Руденко, В.П. Атаманюк // Доповіді Національної академії наук України. — 2018. — № 10. — С. 103-111. — Бібліогр.: 12 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-144529 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1445292018-12-28T01:23:03Z Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro Співак, М.Я. Рибалко, С.Л. Старосила, Д.Б. Завелевич, М.П. Олексієнко, І.П. Дядюн, С.Т. Руденко, А.В. Атаманюк, В.П. Біологія За допомогою трансфекції клітин МТ-4 та ВНК ДНК із зразків епітелію шийки матки хворих із папіломавірусною інфекцією створено модель, що є пермісивною для репродукції вірусів папіломи людини (ВПЛ). У стабільно трансфікованих клітинах підтримується високий рівень вірусного навантаження і під час електронно-мікроскопічного дослідження виявляються внутрішньоклітинні вірусні частинки та нуклеокапсиди. Вітчизняний флавоноїдвмісний препарат Протефлазід пригнічує реплікацію вірусної ДНК і нормалізує показники мітозу в трансфікованих клітинах. Пригнічення ВПЛ в трансфікованих клітинах супроводжується збільшенням експресії клітинних білків, що є продуктами генів-супресорів пухлинного росту. С помощью трансфекции клеток МТ-4 и ВНК ДНК из образцов эпителия шейки матки больных с папилломавирусной инфекцией создана модель, пермиссивная для репродукции вирусов папилломы человека (ВПЧ). В стабильно трансфицированных клетках поддерживается высокий уровень вирусной нагрузки и при электронно-микроскопическом исследовании выявляются внутриклеточные вирусные частицы и нуклеокапсиды. Отечественный флавоноидсодержащий препарат Протефлазид подавляет репликацию вирусной ДНК и нормализует показатели митоза в трансфицированных клетках. Подавление ВПЧ в трансфицированных клетках сопровождается увеличением экспрессии клеточных белков, являющихся продуктами генов-супрессоров опухолевого роста. A model permissive for the reproduction of human papillomaviruses (HPV) is developed by transfecting MT-4 and BHK cells with DNA isolated from cervical epithelium of the patients with papillomavirus infection. The steadily transfected cells maintain the high level of viral load. In cell sections, the intracellular viral particles and nucleocapsids are revealed under electron microscopic studies. The domestic flavonoid-containing composition Proteflazid inhibits the replication of viral DNA and normalizes the mitotic indices in transfected cells. HPV inhibition is in line with increased expression of cell proteins, which are products of tumor suppressor genes. 2018 Article Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro / М.Я. Співак, С.Л. Рибалко, Д.Б. Старосила, М.П. Завелевич, І.П. Олексієнко, С.Т. Дядюн, А.В. Руденко, В.П. Атаманюк // Доповіді Національної академії наук України. — 2018. — № 10. — С. 103-111. — Бібліогр.: 12 назв. — укр. 1025-6415 DOI: doi.org/10.15407/dopovidi2018.10.103 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/144529 54.0+615.281.8:576.22 uk Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біологія Біологія |
| spellingShingle |
Біологія Біологія Співак, М.Я. Рибалко, С.Л. Старосила, Д.Б. Завелевич, М.П. Олексієнко, І.П. Дядюн, С.Т. Руденко, А.В. Атаманюк, В.П. Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro Доповіді НАН України |
| description |
За допомогою трансфекції клітин МТ-4 та ВНК ДНК із зразків епітелію шийки матки хворих із папіломавірусною інфекцією створено модель, що є пермісивною для репродукції вірусів папіломи людини (ВПЛ).
У стабільно трансфікованих клітинах підтримується високий рівень вірусного навантаження і під час
електронно-мікроскопічного дослідження виявляються внутрішньоклітинні вірусні частинки та нуклеокапсиди. Вітчизняний флавоноїдвмісний препарат Протефлазід пригнічує реплікацію вірусної ДНК і нормалізує показники мітозу в трансфікованих клітинах. Пригнічення ВПЛ в трансфікованих клітинах супроводжується збільшенням експресії клітинних білків, що є продуктами генів-супресорів пухлинного росту. |
| format |
Article |
| author |
Співак, М.Я. Рибалко, С.Л. Старосила, Д.Б. Завелевич, М.П. Олексієнко, І.П. Дядюн, С.Т. Руденко, А.В. Атаманюк, В.П. |
| author_facet |
Співак, М.Я. Рибалко, С.Л. Старосила, Д.Б. Завелевич, М.П. Олексієнко, І.П. Дядюн, С.Т. Руденко, А.В. Атаманюк, В.П. |
| author_sort |
Співак, М.Я. |
| title |
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro |
| title_short |
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro |
| title_full |
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro |
| title_fullStr |
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro |
| title_full_unstemmed |
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro |
| title_sort |
оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2018 |
| topic_facet |
Біологія |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/144529 |
| citation_txt |
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папілома вірусної інфекції in vitro / М.Я. Співак, С.Л. Рибалко, Д.Б. Старосила, М.П. Завелевич, І.П. Олексієнко, С.Т. Дядюн, А.В. Руденко, В.П. Атаманюк // Доповіді Національної академії наук України. — 2018. — № 10. — С. 103-111. — Бібліогр.: 12 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT spívakmâ ocínkavplivuflavonoídvmísnogopreparatuproteflazídnamodelípapílomavírusnoíínfekcííinvitro AT ribalkosl ocínkavplivuflavonoídvmísnogopreparatuproteflazídnamodelípapílomavírusnoíínfekcííinvitro AT starosiladb ocínkavplivuflavonoídvmísnogopreparatuproteflazídnamodelípapílomavírusnoíínfekcííinvitro AT zavelevičmp ocínkavplivuflavonoídvmísnogopreparatuproteflazídnamodelípapílomavírusnoíínfekcííinvitro AT oleksíênkoíp ocínkavplivuflavonoídvmísnogopreparatuproteflazídnamodelípapílomavírusnoíínfekcííinvitro AT dâdûnst ocínkavplivuflavonoídvmísnogopreparatuproteflazídnamodelípapílomavírusnoíínfekcííinvitro AT rudenkoav ocínkavplivuflavonoídvmísnogopreparatuproteflazídnamodelípapílomavírusnoíínfekcííinvitro AT atamanûkvp ocínkavplivuflavonoídvmísnogopreparatuproteflazídnamodelípapílomavírusnoíínfekcííinvitro |
| first_indexed |
2025-07-10T19:34:49Z |
| last_indexed |
2025-07-10T19:34:49Z |
| _version_ |
1837289812897300480 |
| fulltext |
103ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 10
Серед речовин, що мають противірусну активність, останнім часом широко вивчаються і зна-
ходять практичне застосування сполуки природного походження, зокрема сполуки, що на-
лежать до великого класу флавоноїдів [1]. Ці речовини, що поширені в рослинному світі,
виявляють, крім суто противірусної дії, різноманітні ефекти в клітинах, взаємодіючи з різ-
ними біологічними молекулами та модулюючи цілу низку внутрішньоклітинних процесів.
Таким чином, вони цілком відповідають сучасній поліфармакологічній концепції, яка пе-
редбачає розробку та застосування фармакологічних агентів, що можуть бути поліміше-
невими за механізмами своєї дії [2].
Одним з таких засобів полімішеневої дії в Україні є флавоноїдвмісний препарат Про те-
флазід [3], ефективність якого доведена щодо низки вірусних інфекцій. Полімішеневий ме-
© М.Я. Співак, С.Л. Рибалко, Д.Б. Старосила, М.П. Завелевич, І.П. Олексієнко, С.Т. Дядюн,
А.В. Руденко, В.П. Атаманюк, 2018
doi: https://doi.org/10.15407/dopovidi2018.10.103
УДК 54.0+615.281.8:576.22
М.Я. Співак 1, С.Л. Рибалко 2, Д.Б. Старосила 2,
М.П. Завелевич 2, І.П. Олексієнко 2, С.Т. Дядюн 2,
А.В. Руденко 3, В.П. Атаманюк 4
1 Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ
2 ДУ “Інститут епідеміології та інфекційних хвороб
ім. Л.В. Громашевського НАМН України”, Київ
3 ДУ “Інститут урології НАМН України”, Київ
4 ТОВ “НВК “Екофарм”, Київ
E-mail: n.spivak@ukr.net, y_dasha@ukr.net
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід
на моделі папіломавірусної інфекції in vitro
Представлено членом-кореспондентом НАН України М.Я. Співаком
За допомогою трансфекції клітин МТ-4 та ВНК ДНК із зразків епітелію шийки матки хворих із папіло-
мавірусною інфекцією створено модель, що є пермісивною для репродукції вірусів папіломи людини (ВПЛ).
У стабільно трансфікованих клітинах підтримується високий рівень вірусного навантаження і під час
електронно-мікроскопічного дослідження виявляються внутрішньоклітинні вірусні частинки та нуклео-
капсиди. Вітчизняний флавоноїдвмісний препарат Протефлазід пригнічує реплікацію вірусної ДНК і нор-
малізує показники мітозу в трансфікованих клітинах. Пригнічення ВПЛ в трансфікованих клітинах супро-
воджується збільшенням експресії клітинних білків, що є продуктами генів-супресорів пухлинного росту.
Ключові слова: віруси папіломи людини, трансфекція, флавоноїди, антивірусні засоби.
104 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2018. № 10
М.Я. Співак, С.Л. Рибалко, Д.Б. Старосила, М.П. Завелевич, І.П. Олексієнко, С.Т. Дядюн та ін.
ханізм дії Протефлазіду раніше показаний, зокрема, на моделях ВІЛ-інфекції in vitro [4] та
грипозної інфекції [5]. Інгібувальна активність препарату встановлена також для фагової
РНК-полімерази і Taq-полімерази [6].
Питання своєчасної діагностики та ефективного лікування папіломавірусної інфекції по-
сідають чільне місце серед актуальних проблем сучасної біології і медицини. Це обумовлено
все більшим зростанням поширеності інфікування вірусом папіломи людини (ВПЛ), висо-
кою контагіозністю цієї інфекції та її роллю в онкогенезі. Незважаючи на розробку та впрова-
дження вакцин проти ВПЛ, чималий контингент жінок вже інфікований ВПЛ і наражається
на небезпеку розвитку патологічних процесів шийки матки, що призводять до ракових ура-
жень. Тому виникає потреба в пошуку і розробці засобів, які б запобігали реп лікації ВПЛ в
організмі, інтегруванню геному ВПЛ до клітини та розвитку непластичних процесів.
Слід зазначити, що, попри чималу кількість препаратів специфічної дії проти вірусів
різних таксономічних груп, досі не існує специфічних синтетичних або природних препара-
тів, спрямованих проти ВПЛ. Це, зокрема, обумовлено особливостями реплікації ВПЛ, в
геномі якого кодується лише один вірус-специфічний фермент, пов’язаний із реплікацією
вірусу (геліказа — білок Е1), і для реплікації вірусного геному використовується ДНК-по-
лімераза клітини хазяїна [7]. Тому у випадку ВПЛ проблематично розраховувати на високу
ефективність препаратів, мішенями яких є полімерази та інші ферменти, специфічні для ві-
русів інших груп. Водночас, за даними ряду досліджень, флавоноїди ефективно гальмують
in vitro ріст клітин, одержаних з ракових пухлин, відносно яких доведена участь ВПЛ в он-
когенезі [8]. Тому логічно постає питання, а чи можуть флавоноїдні композиції блокувати
репродукцію ВПЛ подібно до того, як це відомо для вірусів інших таксономічних груп.
Але пошук речовин, які б ефективно інгібували реплікацію ВПЛ, ускладнюється ще й
відсутністю доступних моделей інфекції ВПЛ in vitro, зокрема ВПЛ неможливо культивува-
ти в моношарових культурах, як це роблять з багатьма вірусами різних таксономічних груп,
оскільки життєвий цикл вірусу тісно пов’язаний із диференціюванням епітеліальних клі-
тин, в яких він репродукується in vivo. Тому більшість досліджень in vitro проводиться або в
органотипових експлантатах, або на складних моделях рекомбінантних вірусів, реплікація
яких відбувається незалежно від диференціювання клітин-хазяїв [9].
Мета нашого дослідження полягала у створенні моделі папіломавірусної інфекції in
vitro і визначенні на цій моделі противірусної активності флавоноїдвмісного препарату
Протефлазід. Для створення моделі застосовували метод трансфекції ДНК із зразків епіте-
лію шийки матки хворих із папіломавірусною інфекцією. Для підтвердження того, що в
одержаних культурах персистує ВПЛ, визначали вірусне навантаження та наявність вірусо-
подібних структур на ультратонких зрізах трансфікованих клітин. Розроблена модель дала
можливість дослідити вплив препарату Протефлазід на реплікацію вірусу та стан трансфі-
кованих клітин.
Матеріали і методи. Культури клітин. Дослідження проводили на перещеплюваних
лініях культур клітин: МТ-4 — культура Т-клітинного гострого лімфобластного лейкозу;
ВНК — клітини нирки хом’яка; HeLa — клітини епітеліоїдної карциноми шийки матки.
Культури клітин вирощували за стандартними методиками.
Флавоноїдвмісний препарат. Застосовували препарат Протефлазід (“НВК “Екофарм”,
Україна), що містив суміш флавоноїдів трицину, лютеоліну, апігеніну та кверцетину, а та-
105ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 10
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папіломавірусної інфекції in vitro
кож їхніх О- та С-глікозидів, одержану шляхом етанольної екстракції з трави щучки дер-
нистої (Deschampsia caespitosa L.) та війника наземного (Calamagrostis epigeios L.) Вміст
кожного з компонентів було визначено методами високоефективної рідинної хроматографії
та ЯМР мас-спектрометрії [3]. Загальний вміст флавоноїдів в етанольному розчині ста-
новив 0,64 мг/мл у перерахунку на рутин. Для дослідів у культурі клітин препарат розводи-
ли в живильному середовищі так, аби кінцева концентрація етанолу не перевищувала 0,2 %.
Модельна система папіломавірусної інфекції in vitro. У хворих з патологією шийки матки,
у яких було визначено персистентну папіломавірусну інфекцію, з матеріалів цервікальних
вишкрібань виділяли ДНК за допомогою набору innuPREP Virus DNA Kit-KFml (Analityk
Jena AG, Німеччина). Препаратами виділеної ДНК трансфікували суспензійну культуру МТ-4
(щільність 5 · 105 клітин/мл), а також епітеліальну культуру ВНК за допомогою трансфіку-
вального агента Turbofect (ThermoFisher Scientific, США) за стандартними протоколами.
Трансфіковані культури інкубували при 37 °С в газовому середовищі з 5 % СО2 з регуляр-
ним додаванням інтактних клітин МТ-4. Через 7 діб після трансфекції клі тини в суспензії
тестували на наявність ДНК ВПЛ методом ПЛР. Для виявлення та гено типування ДНК ві-
русів папіломи високого канцерогенного ризику проводили ПЛР у реальному часі за до-
помогою набору реагентів АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-FL (AmpliSens, РФ). ПЛР ви-
конували на приладі qTOWER 2.2 (Analytik Jena, Німеччина). Вірусне на вантаження для
ДНК ВПЛ за даними ПЛР визначали як логарифм кількості копій ДНК на 105 клітин.
Електронна мікроскопія трансфікованих клітин. Осад клітин МТ-4, одержаний цен-
трифугуванням, фіксували спочатку 3 % глутаральдегідом, а потім 4 % тетраоксидом осмію.
Фіксований осад клітин заливали в епон-аралдит. Ультратонкі зрізи виготов ляли на ультра-
мікротомі УМПП-5 та досліджували в трансмісійному електронному мікроскопі ЕМВ-100А
при збільшенні 100 тис.
Мітотичний режим та аномальні мітози. Для визначення показників мітозу клітини,
вирощені на покривних скельцях, фіксували в нітраті міді на етанолі — формаліні (9 : 1) і
фарбували гематоксилін-еозином. Цитологічні препарати досліджували під мікроскопом
Standard 20 (Zeiss, Німеччина). Мітотичний індекс розраховували в проміле (‰, кількість
мітозів на 1000 клітин). Одночасно аналізували кількість патологічних мітозів.
Імуноферментний аналіз. Вміст вірусасоційованих антигенів та клітинних білків — про-
дуктів генів-супресорів пухлинного росту визначали в осаді та в культуральній рідині транс-
фікованих клітин. Клітини перед проведенням аналізу руйнували шляхом триразового
циклу заморожування — відтавання. Одержані розчинні антигени сорбували в лунках мікро-
планшетів (Maxisorp, Бельгія). Для виявлення антигенів використовували такі монокло-
нальні антитіла (монАТ): монАТ проти онкопротеїну Е7 ВПЛ (Novus Biologicals, США),
монАТ проти капсидного білка L1 ВПЛ (Novus Biologicals, США), анти-р53 монАТ (Biomol,
Німеччина), антиRB монАТ (Bioss, США). Після відмивання та блокування вільних ділянок
розчином знежиреного молока до лунок планшета з адсорбованими антигенами дода вали
антитіла у відповідних розведеннях. Після інкубування з первинними антитілами лунки
промивали і проводили інкубування із козячими антитілами проти IgG миші, кон’югованими
з пероксидазою. Для проявлення як субстрат використовували тетраметилбензидин (набір
ДіапрофМед, Україна). Оптичну густину в лунках вимірювали за допомогою мікроплан-
шетного фотометра iMark (Bio-Rad, США) у двохвильовому режимі (450/630 нм).
106 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2018. № 10
М.Я. Співак, С.Л. Рибалко, Д.Б. Старосила, М.П. Завелевич, І.П. Олексієнко, С.Т. Дядюн та ін.
Рис. 1. Електронограми ультратонких зрізів клітин, що містять
частинки віріонів та нуклеокапсидів ВПЛ: а — клітини МТ-4,
трансфіковані ДНК ВПЛ типу 59; б — клітини МТ-4, трансфіко-
вані ДНК ВПЛ типу 35; в — клітини МТ-4, трансфіковані ДНК
ВПЛ типу 16; г — клітини HeLa, що продукують ВПЛ типу 18
Рис. 2. Зміни експресії білків ВПЛ та клітинних білків — про-
дуктів генів-супресорів пухлинного росту в клітинах МТ-4,
трансфікованих ДНК ВПЛ типу 16, під дією Протефлазіду за да-
ними імуноферментного визначення з відповідними монокло-
нальними антитілами. Результати визначення нормалізували по
відношенню до відповідних показників, одержаних на ту саму
добу, у трансфікованих клітинах, культивованих без Протефлазі-
ду, які для кожної часової точки приймали за 100 %. Значення по ординаті відповідають збільшенню або
зменшенню експресії відповідного білка у відсотках під впливом Протефлазіду: а — L1; б — Е7; в — р53; г — Rb
Результати та їх обговорення. Трансфекція ДНК, виділених із цервікальних вишкрі-
бань хворих із папіломавірусною інфекцією, в клітинах МТ-4 виявилась ефективною (табл.
1). Генотипування вірусу та вірусне навантаження вперше визначали на 7-му добу після
трансфікування. Показники вірусного навантаження в діапазоні 3—5 lg/105 клітин, що збе-
рігалися стабільно впродовж подальшого культивування, свідчили про активну реплікацію
вірусної ДНК в трансфікованих клітинах. Оскільки трансфіковані клітини МТ-4 через 3—4
107ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 10
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папіломавірусної інфекції in vitro
доби зазнавали часткових дегенеративних змін, для підтримання віруспродукувальної сис-
теми раз на 3 доби до трансфікованих клітин додавали інтактні клітини МТ-4. Отримані
таким чином культури стабільно підтримувалися впродовж багатьох пасажів та могли бу-
ти використані для подальшого вивчення. Було отримано п’ять культур клітин МТ-4, що
містили ДНК різних генотипів ВПЛ високого канцерогенного ризику, з яких три, що місти-
ли ДНК генотипів ВПЛ 16, 35 та 59, були відібрані для подальших досліджень.
Для підтвердження утворення вірусних частинок у створеній модельній системі транс-
фікованих клітин МТ-4 досліджували ультратонкі зрізи клітин за допомогою електронної
мікроскопії (рис. 1). Вірусні частинки виявляли в ядрі, цитоплазмі та в невеликій кількості
в міжклітинному просторі. Зокрема, в нуклеоплазмі були виявлені електроннощільні гра-
нули діаметром 40—50 нм, що, ймовірно, являли собою нуклеокапсиди. В цитоплазмі ви-
являли структури діаметром 60—70 нм, що відповідали віріонам ВПЛ. Для порівняння на
рис. 1 наведено також електронограму клітин HeLa, що стабільно продукують ВПЛ типу 18.
Аналогічні дані отримані при трансфікуванні епітеліальних клітин ВНК, в результаті
чого вдалося одержати дві лінії клітин, стабільно продукуючих ВПЛ типів 16 та 35.
Таким чином, як дані щодо вірусного навантаження, так і дані електронно-мікроско піч-
ного дослідження свідчать про ефективну трансфекцію клітин МТ-4 ДНК ВПЛ. Транс-
фіковані клітини, які стабільно підтримуються шляхом періодичного додавання неінфіко-
ваних клітин МТ-4, можна розглядати як нову модель репродукції ВПЛ високого концеро-
генного ризику in vitro, що дає можливість досліджувати вплив тих чи інших чинників на
продуктивну інфекцію ВПЛ.
Трансфіковані клітини МТ-4 культивували в присутності Протефлазіду в дозі 4,2 мкг/мл.
Препарат вносили в культуру один раз на тиждень впродовж 4 тижнів. Показником впли-
ву препарату на репродукцію ВПЛ у даній
модельній системі було зниження вірус-
ного навантаження, що визначали ме то дом
ПЛР. Короткотермінове культивування з
Протефлазідом (до 5 діб) не спричиняло до
зменшення вірусного навантаження. Вод-
ночас вірусне навантаження, визначене че-
рез 1 місяць культивування в присутності
Протефлазіду, значно знижувалося, що свід-
чило про пригнічення репродукції вірусу в
Таблиця 1. Вірусне навантаження ВПЛ
у трансфікованих культурах МТ-4
Тип
вірусу
Вірусне
навантаження,
lg/105 клітин
Вірусне навантаження
після інкубування
з Протефлазідом,
lg/105 клітин
16 4,15 3,10
35 3,13 2,21
59 5,25 4,38
Таблиця 2. Мітотичний індекс і патологічні мітози в трансфікованих ДНК ВПЛ клітинах ВНК
Клітини ВНК
Мітотичний індекс, ‰ Патологічні мітози, %
Без обробки
Протефлазідом
Після культивування
з Протефлазідом
Без обробки
Протефлазідом
Після культивування
з Протефлазідом
Контроль 13,0 ± 0,6 14,2 ± 0,4 23,0±0,9 22,1 ± 1,1
ВПЛ тип 16 27,6 ± 0,8 20,0 ± 0,5 40,9±1,9 25,5 ± 0,7
ВПЛ тип 35 40,3 ± 0,9 23,0 ± 0,5 32,2±1,1 23,1 ± 0,6
108 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2018. № 10
М.Я. Співак, С.Л. Рибалко, Д.Б. Старосила, М.П. Завелевич, І.П. Олексієнко, С.Т. Дядюн та ін.
цій системі (див. табл. 1). Вірогідне зниження вірусного навантаження досягалося для усіх
трьох досліджуваних генотипів ВПЛ, що продукувалися в трансфікованих клітинах МТ-4.
Важливим показником інфікування клітин ВПЛ було також збільшення мітотичної
активності та зростання кількості патологічних мітозів у клітинах ВНК, трансфікованих
ДНК ВПЛ типів 16 та 35 (табл. 2). Протефлазід істотно знижує мітотичну активність транс-
фікованих ВПЛ клітин ВНК і зменшує рівень патологічних мітозів у них, “протидіючи”,
таким чином, проліферативній та деструктивній активності ВПЛ. Водночас наведені дані
свідчать про відсутність впливу Протефлазіду на досліджувані показники мітозу в інтак-
тних клітинах ВНК.
Для подальшого з’ясування особливостей дії Протефлазіду як на репродукцію ВПЛ, так
і на параметри, пов’язані із канцерогенними властивостями вірусу та його взаємодією з
клітиною-хазяїном, визначали продукцію в трансфікованих клітинах МТ-4 раннього вірус-
ного білка L1, білка Е7, що є онкопротеїном ВПЛ, та клітинних білків — продуктів генів-
супресорів пухлинного росту р53 та Rb. Продукцію білків визначали імуноферментним ме-
тодом в динаміці впродовж 3 тижнів у трансфікованих клітинах, культивованих у звичайно-
му середовищі або середовищі, до якого періодично (один раз на тиждень) вносили
Протефлазід в концентрації 4,2 мкг/мл. Результати визначення нормалізували по відно-
шенню до відповідних показників, одержаних на ту саму добу, у трансфікованих клітинах,
культивованих без Протефлазіду, які для кожної часової точки приймали за 100 % (рис. 2).
Протефлазід зменшував експресію раннього вірусного білка L1, що опосередковано під-
тверджувало інгібування реплікації вірусу за наведеними вище даними, одержаними за до-
помогою інших методів. Водночас, починаючи з 14-ї доби, відстежували зниження експресії
онкопротеїну Е7. Зменшення експресії онкопротеїну Е7 на 14-ту добу супроводжувалося
збільшенням порівняно з контролем експресії р53 та Rb. Механізми виявленої взаємоза-
лежності експресії зазначених білків потребують подальшого дослідження.
Таким чином, створено нову модель на основі трансфекції ДНК з клітин хворих, ураже-
них папіломавірусною інфекцією, що є пермісивною для репродукції ВПЛ. Реплікацію
ДНК ВПЛ та утворення внутрішньоклітинних вірусоподібних частинок підтверджено ре-
зультатами визначення навантаження вірусної ДНК та електронно-мікроскопічних дослі-
джень трансфікованих клітин. Підтримання репродукції вірусу та утворення вірусоподіб-
них частинок досягається періодичним рекультивуванням з інтактними клітинами лінії, що
була використана для трансфекції. Не виключено інфікування інтактних клітин за рахунок
безпосередніх міжклітинних контактів або через секретовані в середовище клітинні фраг-
менти, що містять віріони та нуклеокапсиди ВПЛ. Нещодавно було виявлено ефективне
інфікування первинних кератиноцитів ВПЛ, частинки якого були зв’язані з позаклітинним
матриксом, секретованим кератиноцитами [10].
Показано, що досліджувана флавоноїдвмісна композиція Протефлазід зменшує вірусне
навантаження і нормалізує показники мітотичної активності трансфікованих клітин, а та-
кож інгібує експресію вірусних білків L1 та Е7 з одночасним збільшенням експресії клітин-
них білків, що є продуктами генів-супресорів пухлинного росту.
Дані, отримані останніми роками, свідчать про те, що речовини класу флавоноїдів є пер-
спективними для застосування з метою хіміопрофілактики у разі передракових процесів,
зокрема дисплазій шийки матки, асоційованих з папіломавірусною інфекцією [11]. У низці
109ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 10
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папіломавірусної інфекції in vitro
робіт показано проапоптотичну дію флавоноїдів in vitro на ВПЛ-позитивні клітини раку
шийки матки [12]. Таким чином, терапевтичний ефект флавоноїдів як полімішеневих аген-
тів на передракові процеси та онкогенез може досягатися завдяки поєднанню антипроліфе-
ративної та проапоптотичної дії цих речовин із безпосередньою антивірусною дією.
ЦИТОВАНА ЛІТЕРАТУРА
1. Zakaryan H., Arabyan E., Oo A., Zandi K. Flavonoids: promising natural compounds against viral infections.
Arch. Virol. 2017. 162, № 9. Р. 2539—2551. doi: https://doi.org/10.1007/s00705-017-3417-y
2. Reddy A.S., Zhang S. Polypharmacology: drug discovery for the future. Exp. Rev. Clin. Pharm. 2013. 6, № 1.
10.1586/ecp.12.74. doi: https://doi.org/10.1586/ecp.12.74
3. Біологічно активна речовина поліфармакологічної дії рослинного походження: пат. 99969 Україна.
МПК A61K 36/00, A61K 36/899, A61P 31/12; заявл. 24.04.2015. Опубл. 25.06.2015.
4. Trokhymchuk T., Zavelevich M., Liulchuk M., Starosyla D., Rybalko S., Rudenko A. In vitro study of anti-
HIV activity of proteflazid herbal composition. Am. J. Fundam. Appl. Exp. Res. 2017. 7, № 4. P. 87—91.
5. Рыбалко С.Л, Старосила Д.Б., Завелевич М.П. Современное состояние химиотерапии и профилактики
гриппа и ОРВИ в Украине. Укр. мед. часопис. 2018. № 1. C. 64—67.
6. Пальчиковська Л. Г., Васильченко О. В., Платонов М. О., Старосила Д. Б., Порва Ю. І., Римар С.Ю.,
Атаманюк В.П., Самійленко С.П., Рибалко С.Л. Антивірусні властивості рослинних флавоноїдів – ін-
гібіторів синтезу ДНК і РНК. Biopolim. Cell. 2013. 29, № 2. С. 150—156. doi: https://doi.org/10.7124/
bc.000813
7. Conger K.L., Liu J.S., Kuo S.R., Chow L.T., Wang T.S. Human papillomavirus DNA replication. Interactions
between the viral E1 protein and two subunits of human DNA polymerase alpha/primase. J. Biol. Chem. 1999.
274. P. 2696—2705.
8. Catanzaro D., Vianello C., Ragazzi E., Caparrotta L., Montopoli M. Cell cycle control by natural phenols in
cisplatin-resistant cell lines. Nat. Prod. Commun. 2014. 9, № 10. P. 1465—1468.
9. Biryukov J., Meyers C. Papillomavirus infectious pathways: A comparison of systems. Viruses. 2015. 7, № 8.
P. 4303—4325. doi: https://doi.org/10.3390/v7082823
10. Bienkowska-Haba M., Luszczek W., Myers J.E., Keiffer T.R., DiGiuseppe S., Polk P., Bodily J.M., Scott R.S.,
Sapp M. A new cell culture model to genetically dissect the complete human papillomavirus life cycle. PLoS
Pathog. 2018. 14, № 3. e1006846. doi: https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006846
11. Moga M.A., Dimienescu O.G., Arvatescu C.A., Mironescu A., Dracea L., Ples L. The role of natural polyphenols
in the prevention and treatment of cervical cancer—an overview. Molecules. 2016. 21, № 8. pii: E1055. doi:
https://doi.org/10.3390/molecules21081055
12. Ham S., Kim K.H., Kwon T.H., Bak Y., Lee D.H., Song Y.S., Park S.H., Park Y.S., Kim M.S., Kang J.W.,
Hong J.T., Yoon D.Y. Luteolin induces intrinsic apoptosis via inhibition of E6/E7 oncogenes and activation
of extrinsic and intrinsic signaling pathways in HPV-18-associated cells. Oncol. Rep. 2014. 31, № 6. P. 2683—
2691. doi: https://doi.org/10.3892/or.2014.3157
Надійшло до редакції 09.07.2018
REFERENCES
1. Zakaryan, H., Arabyan, E., Oo, A. & Zandi, K. (2017). Flavonoids: promising natural compounds against viral
infections. Arch. Virol., 162, No. 9, pp. 2539-2551. doi: https://doi.org/10.1007/s00705-017-3417-y
2. Reddy, A. S. & Zhang, S. (2013). Polypharmacology: drug discovery for the future. Exp. Rev. Clin. Pharm., 6,
No. 1, 10.1586/ecp.12.74. doi: https://doi.org/10.1586/ecp.12.74
3. Pat. 99969 UA, IPC A61K 36/00, A61K 36/899, A61P 31/12, Biologically active plant-derived substance
of polypharmacological activity, Atamaniuk, V. P., Novyk, A. M., Publ. 25.06.2015 (in Ukrainian).
4. Trokhymchuk, T., Zavelevich, M., Liulchuk, M., Starosyla, D., Rybalko, S. & Rudenko, A. (2017). In vitro
study of anti-HIV activity of proteflazid herbal composition. Am. J. Fundam. Appl. & Exp. Res., 7, No. 4,
pp. 87-91.
110 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. akad. nauk Ukr. 2018. № 10
М.Я. Співак, С.Л. Рибалко, Д.Б. Старосила, М.П. Завелевич, І.П. Олексієнко, С.Т. Дядюн та ін.
5. Rybalko, S. L., Starosyla, D. B. & Zavelevich, M. P. (2018). State-of-the-art of chemotherapy and prevention
of influenza in Ukraine. Ukr. med. chasopys., No. 1, pp. 64-67 (in Russian).
6. Palchykovska, L. G., Vasylchenko, O. V., Platonov, M. O., Starosyla, D. B., Porva, J. I., Rymar, S. J., Atamaniuk,
V. P., Samijlenko, S. P. & Rybalko, S. L. (2013). Antiviral properties of herbal flavonoids – inhibitors of the
DNA and RNA synthesis. Biopolym. Cell., 29, No. 2, pp. 150-156 (in Ukrainian). doi: https://doi.org/10.7124/
bc.000813
7. Conger, K. L., Liu, J. S., Kuo, S. R., Chow, L. T. & Wang, T. S. (1999). Human papillomavirus DNA replication.
Interactions between the viral E1 protein and two subunits of human DNA polymerase alpha/primase. J.
Biol. Chem., 274, pp. 2696 &2705.
8. Catanzaro, D., Vianello, C., Ragazzi, E., Caparrotta, L. & Montopoli, M. (2014). Cell cycle control by natural
phenols in cisplatin-resistant cell lines. Nat. Prod. Commun., 9, No. 10, pp. 1465-1468.
9. Biryukov, J. & Meyers, C. (2015). Papillomavirus infectious pathways: A comparison of systems. Viruses, 7,
No. 8, pp. 4303-4325. doi: https://doi.org/10.3390/v7082823
10. Bienkowska-Haba, M., Luszczek, W., Myers, J. E., Keiffer, T. R., DiGiuseppe, S., Polk, P., Bodily, J. M., Scott,
R. S. & Sapp, M. (2018). A new cell culture model to genetically dissect the complete human papillomavirus
life cycle. PLoS Pathog., 14, No. 3, e1006846. doi: https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006846
11. Moga, M. A., Dimienescu, O. G., Arvatescu, C. A., Mironescu, A., Dracea, L. & Ples, L. (2016). The role of
natural polyphenols in the prevention and treatment of cervical cancer-an overview. Molecules, 21, No. 8, pii:
E1055. doi: https://doi.org/10.3390/molecules21081055.
12. Ham, S., Kim, K. H., Kwon, T. H., Bak, Y., Lee, D. H., Song, Y. S., Park, S. H., Park, Y. S., Kim, M. S., Kang, J.
W., Hong, J. T. & Yoon, D.Y. (2014). Luteolin induces intrinsic apoptosis via inhibition of E6/E7 oncogenes
and activation of extrinsic and intrinsic signaling pathways in HPV-18-associated cells. Oncol. Rep., 31,
No. 6, pp. 2683-2691. doi: https://doi.org/10.3892/or.2014.3157
Received 09.07.2018
Н.Я. Спивак 1, С.Л. Рыбалко 2, Д.Б. Старосила 2,
М.П. Завелевич 2, И.П. Алексеенко 2, С.Т. Дядюн 2,
А.В. Руденко 3, В.П. Атаманюк 4
1 Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
2 ГУ “Институт эпидемиологии и инфекционных болезней
им. Л.В. Громашевского НАМН Украины”, Киев
3 ДУ “Институт урологии НАМН Украины”, Киев
4 ОО “НПК “Экофарм”, Киев
E-mail: n.spivak@ukr.net, y_dasha@ukr.net
ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ ФЛАВОНОИДСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА
ПРОТЕФЛАЗИД НА МОДЕЛИ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ IN VITRO
С помощью трансфекции клеток МТ-4 и ВНК ДНК из образцов эпителия шейки матки больных с папил-
ломавирусной инфекцией создана модель, пермиссивная для репродукции вирусов папилломы человека
(ВПЧ). В стабильно трансфицированных клетках поддерживается высокий уровень вирусной нагрузки и
при электронно-микроскопическом исследовании выявляются внутриклеточные вирусные частицы и ну-
клеокапсиды. Отечественный флавоноидсодержащий препарат Протефлазид подавляет репликацию ви-
русной ДНК и нормализует показатели митоза в трансфицированных клетках. Подавление ВПЧ в транс-
фицированных клетках сопровождается увеличением экспрессии клеточных белков, являющихся продук-
тами генов-супрессоров опухолевого роста.
Ключевые слова: вирусы папилломы человека, трансфекция, флавоноиды, противовирусные средства.
111ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2018. № 10
Оцінка впливу флавоноїдвмісного препарату Протефлазід на моделі папіломавірусної інфекції in vitro
M.Ya. Spivak 1, S.L. Rybalko 2, D.B. Starosyla 2,
M.P. Zavelevich 2, I.P. Oleksiienko 2, S.T. Diadiun 2,
A.V. Rudenko 3, V.P. Atamaniuk 4
1 Danylo Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of the NAS of Ukraine, Kiev
2 L. Gromashevsky Institute of Epidemiology and Infectious Diseases
of the NAMS of Ukraine, Kiev
3 Institute of Urology of the NAMS of Ukraine, Kiev
4 Ecopharm Research and Production Company, Kiev
E-mail: n.spivak@ukr.net, y_dasha@ukr.net
STUDY OF THE EFFECTS OF FLAVONOID-CONTAINING COMPOSITION
PROTEFLAZID ON MODELED PAPILLOMAVIRUS INFECTION IN VITRO
A model permissive for the reproduction of human papillomaviruses (HPV) is developed by transfecting MT-4
and BHK cells with DNA isolated from cervical epithelium of the patients with papillomavirus infection. The
steadily transfected cells maintain the high level of viral load. In cell sections, the intracellular viral particles and
nucleocapsids are revealed under electron microscopic studies. The domestic flavonoid-containing composition
Proteflazid inhibits the replication of viral DNA and normalizes the mitotic indices in transfected cells. HPV
inhibition is in line with increased expression of cell proteins, which are products of tumor suppressor genes.
Keywords: human papillomavirus, transfection, flavonoids, antiviral agents.
|