Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови

С использованием метода электронного парамагнитного резонанса проведена оценка связывания (нековалентной сорбции) ряда спиновых зондов, представляющих собой парамагнитные модели липофильных физиологически активных веществ, углеродными нанотрубками различной структуры, а также особенностей перехода (...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2014
Автори:	Иванов, Л.В., Ляпунов, А.Н., Картель, Н.Т., Нардид, О.А., Окотруб, А.В., Кирилюк, И.А., Черкашина, Я.О.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка НАН України 2014
Назва видання:	Поверхность
Теми:	Медико-біологічні проблеми поверхні
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148066
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови / Л.В. Иванов, А.Н. Ляпунов, Н.Т. Картель, О.А. Нардид, А.В. Окотруб, И.А. Кирилюк, Я.О. Черкашина // Поверхность. — 2014. — Вип. 6 (21). — С. 292-304. — Бібліогр.: 16 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-148066
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1480662019-02-17T01:27:09Z Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови Иванов, Л.В. Ляпунов, А.Н. Картель, Н.Т. Нардид, О.А. Окотруб, А.В. Кирилюк, И.А. Черкашина, Я.О. Медико-біологічні проблеми поверхні С использованием метода электронного парамагнитного резонанса проведена оценка связывания (нековалентной сорбции) ряда спиновых зондов, представляющих собой парамагнитные модели липофильных физиологически активных веществ, углеродными нанотрубками различной структуры, а также особенностей перехода (трансдиффузии) зондов с поверхности нанотрубок на белки плазмы и мембраны эритроцитов при контакте (инкубации) с компонентами крови. Показано, что липофильные зонды, не имеющие ионогенных групп, образуют устойчивые комплексы с одно- и многостенными углеродными нанотрубками, тогда как зонд с четвертичной аммониевой группой на трубках практически не сорбируется. При контакте комплексов «зонд-нанотрубка» с плазмой и эритроцитами крови экспериментальных животных в течение нескольких часов наблюдается десорбция зондов (до 15%) за счет их взаимодействия с белками плазмы, а также прогрессирующее проникновение в билипидный слой мембраны эритроцитов. Продемонстрировано, что метод спиновых зондов позволяет оценивать эффективность нанотрубок в качестве средств доставки целевых веществ к клеткам-мишеням и определять локализацию зондов в мембранах и внутриклеточном пространстве. Using the method of electron spin resonance assessed binding (non-covalent adsorption) of several spin probes, which are paramagnetic model lipophilic physiologically active substances, carbon nanotubes with different structures, and features of the transition (transdiffusion) probes with nanotubes on the surface proteins of plasma and erythrocyte membrane in contact (incubation) with blood components. It is shown that the lipophilic probes having no ionic groups form stable complexes with mono- and multi-walled carbon nanotubes, whereas the probe with a quaternary ammonium group on the tubes practically do not adsorbed. Upon contact complexes "nanotube-probe" with the plasma and red blood cells in experimental animals within a few hours there is desorption probes (up to 15%) due to their interaction with plasma proteins as well as progressive penetration into lipid double layer erythrocyte membrane. It is demonstrated that the method of spin probes allows assessing the effectiveness of nanotubes as delivery means of targeted substances to target cells and to determine the localization of the probe in the membranes and intracellular space. З використанням методу електронного парамагнітного резонансу проведена оцінка зв'язування (нековалентної сорбції) ряду спінових зондів, які становлять парамагнітні моделі ліпофільних фізіологічно активних речовин, вуглецевими нанотрубками різної структури, а також особливостей переходу (трансдифузіі) зондів з поверхні нанотрубок на білки плазми і мембрани еритроцитів при контакті (інкубації) з компонентами крові. Показано, що ліпофільні зонди, що не мають іоногенних груп, утворюють стійкі комплекси з одно- і багатостінними вуглецевими нанотрубками, тоді як зонд з четвертинною амонієвою групою на трубках практично не сорбується. При контакті комплексів «зонд-нанотрубка» з плазмою і еритроцитами крові експериментальних тварин протягом декількох годин спостерігається десорбція зондів (до 15%) за рахунок їх взаємодії з білками плазми, а також прогресуюче проникнення в ліпідний подвійний шар мембрани еритроцитів. Продемонстровано, що метод спінових зондів дозволяє оцінювати ефективність нанотрубок як засобів доставки цільових речовин до клітин-мішеней і визначати локалізацію зондів в мембранах і внутрішньоклітинному просторі. 2014 Article Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови / Л.В. Иванов, А.Н. Ляпунов, Н.Т. Картель, О.А. Нардид, А.В. Окотруб, И.А. Кирилюк, Я.О. Черкашина // Поверхность. — 2014. — Вип. 6 (21). — С. 292-304. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 2617-5975 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148066 546.26:615.099.092 ru Поверхность Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Медико-біологічні проблеми поверхні Медико-біологічні проблеми поверхні
spellingShingle	Медико-біологічні проблеми поверхні Медико-біологічні проблеми поверхні Иванов, Л.В. Ляпунов, А.Н. Картель, Н.Т. Нардид, О.А. Окотруб, А.В. Кирилюк, И.А. Черкашина, Я.О. Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови Поверхность
description	С использованием метода электронного парамагнитного резонанса проведена оценка связывания (нековалентной сорбции) ряда спиновых зондов, представляющих собой парамагнитные модели липофильных физиологически активных веществ, углеродными нанотрубками различной структуры, а также особенностей перехода (трансдиффузии) зондов с поверхности нанотрубок на белки плазмы и мембраны эритроцитов при контакте (инкубации) с компонентами крови. Показано, что липофильные зонды, не имеющие ионогенных групп, образуют устойчивые комплексы с одно- и многостенными углеродными нанотрубками, тогда как зонд с четвертичной аммониевой группой на трубках практически не сорбируется. При контакте комплексов «зонд-нанотрубка» с плазмой и эритроцитами крови экспериментальных животных в течение нескольких часов наблюдается десорбция зондов (до 15%) за счет их взаимодействия с белками плазмы, а также прогрессирующее проникновение в билипидный слой мембраны эритроцитов. Продемонстрировано, что метод спиновых зондов позволяет оценивать эффективность нанотрубок в качестве средств доставки целевых веществ к клеткам-мишеням и определять локализацию зондов в мембранах и внутриклеточном пространстве.
format	Article
author	Иванов, Л.В. Ляпунов, А.Н. Картель, Н.Т. Нардид, О.А. Окотруб, А.В. Кирилюк, И.А. Черкашина, Я.О.
author_facet	Иванов, Л.В. Ляпунов, А.Н. Картель, Н.Т. Нардид, О.А. Окотруб, А.В. Кирилюк, И.А. Черкашина, Я.О.
author_sort	Иванов, Л.В.
title	Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови
title_short	Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови
title_full	Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови
title_fullStr	Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови
title_full_unstemmed	Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови
title_sort	доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови
publisher	Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка НАН України
publishDate	2014
topic_facet	Медико-біологічні проблеми поверхні
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148066
citation_txt	Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови / Л.В. Иванов, А.Н. Ляпунов, Н.Т. Картель, О.А. Нардид, А.В. Окотруб, И.А. Кирилюк, Я.О. Черкашина // Поверхность. — 2014. — Вип. 6 (21). — С. 292-304. — Бібліогр.: 16 назв. — рос.
series	Поверхность
work_keys_str_mv	AT ivanovlv dostavkalipofilʹnyhspinovyhzondovuglerodnyminanotrubkamivéritrocityiplazmukrovi AT lâpunovan dostavkalipofilʹnyhspinovyhzondovuglerodnyminanotrubkamivéritrocityiplazmukrovi AT kartelʹnt dostavkalipofilʹnyhspinovyhzondovuglerodnyminanotrubkamivéritrocityiplazmukrovi AT nardidoa dostavkalipofilʹnyhspinovyhzondovuglerodnyminanotrubkamivéritrocityiplazmukrovi AT okotrubav dostavkalipofilʹnyhspinovyhzondovuglerodnyminanotrubkamivéritrocityiplazmukrovi AT kirilûkia dostavkalipofilʹnyhspinovyhzondovuglerodnyminanotrubkamivéritrocityiplazmukrovi AT čerkašinaâo dostavkalipofilʹnyhspinovyhzondovuglerodnyminanotrubkamivéritrocityiplazmukrovi
first_indexed	2025-07-11T03:47:47Z
last_indexed	2025-07-11T03:47:47Z
_version_	1837320815516844032
fulltext	Поверхность. 2014. Вып. 6(21). С. 292–304 292 УДК 546.26:615.099.092 ДОСТАВКА ЛИПОФИЛЬНЫХ СПИНОВЫХ ЗОНДОВ УГЛЕРОДНЫМИ НАНОТРУБКАМИ В ЭРИТРОЦИТЫ И ПЛАЗМУ КРОВИ Л.В. Иванов1, А.Н. Ляпунов2, Н.Т. Картель1, О.А. Нардид5, А.В. Окотруб3, И.А. Кирилюк4, Я.О. Черкашина5 1Институт химии поверхности им. А.А. Чуйко Национальной академии наук Украины, ул. Генерала Наумова, 17, Киев, 03164, Украина; 2Институт монокристаллов НАН Украины, Харьков; 3Институт неорганической химии СО РАН, Новосибирск; 4Новосибирский государственный университет, Новосибирск; 5Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков С использованием метода электронного парамагнитного резонанса проведена оценка связывания (нековалентной сорбции) ряда спиновых зондов, представляющих собой парамаг- нитные модели липофильных физиологически активных веществ, углеродными нанотрубками различной структуры, а также особенностей перехода (трансдиффузии) зондов с поверхно- сти нанотрубок на белки плазмы и мембраны эритроцитов при контакте (инкубации) с ком- понентами крови. Показано, что липофильные зонды, не имеющие ионогенных групп, образуют устойчивые комплексы с одно- и многостенными углеродными нанотрубками, тогда как зонд с четвертичной аммониевой группой на трубках практически не сорбируется. При контакте комплексов «зонд-нанотрубка» с плазмой и эритроцитами крови экспериментальных живот- ных в течение нескольких часов наблюдается десорбция зондов (до 15%) за счет их взаимодей- ствия с белками плазмы, а также прогрессирующее проникновение в билипидный слой мембра- ны эритроцитов. Продемонстрировано, что метод спиновых зондов позволяет оценивать эффективность нанотрубок в качестве средств доставки целевых веществ к клеткам- мишеням и определять локализацию зондов в мембранах и внутриклеточном пространстве. Углеродные нанотрубки (УНТ) рассматриваются как перспективное средство доставки лекарственных препаратов к клеткам-мишеням различных органов и тканей живых организмов. Благодаря химической инертности и стабильности УНТ могут на- ходиться в организме животных и людей без изменений на протяжении длительного времени, а большая удельная поверхность (до 2000 м2/г и более) и возможность их хи- мической модификации обеспечивают способность сорбировать значительные количе- ства веществ различной природы. Важной особенностью углеродных нанотрубок явля- ется их способность проникать внутрь клеток (трансмембранная диффузия), в том чис- ле онкологических новообразований, через систему кровеносных сосудов, снабжающих кровью соответствующие органы [1–5]. Отмеченные свойства предопределяют акту- альность исследования особенностей связывания различных веществ с УНТ, разработ- ки способов их функционализации с целью повышения биосовместимости и уменьше- ния цитотоксичности, определения фармакокинетики физиологически активных ве- ществ (ФАВ), связанных с нанотрубками, а также создания новых систем «адресной» доставки ФАВ на основе УНТ. Анализ литературы по связыванию ФАВ с УНТ показывает, что лишь немногие исследования посвящены изучению взаимодействия их соответствующих комплексов с клетками. Как правило, это были клетки различных опухолей [5–7]. Вместе с тем, при инкубации таких комплексов с клетками органов и тканей in vitro можно оценить время удержания вещества на поверхности нанотрубок в присутствии биообъекта и дать про- гноз относительно эффективности такого комплекса in vivo, как системы адресной дос- тавки лекарственных веществ в организме, избежав проведения дорогих и трудоемких фармакокинетических исследований. Такие исследования требуют применения спек- тральных методов, позволяющих в сложной системе «вещество – нанотрубки – клетки» 293 по каким-либо характеристическим спектрам разделять информацию о веществе, свя- занном и не связанном с нанотрубками, а также находящемся на мембране или в цито- золе клеток. Для изучения сорбции веществ на поверхности УНТ можно использовать метод спиновых зондов [8–10]. В этом методе просто и наглядно фиксируется изменение вращательной броуновской подвижности спин-меченых молекул при сорбции на труб- ках и десорбции с их поверхности, поскольку спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) свободных радикалов очень чувствительны к малейшим изменениям их подвижности в изучаемой среде. Мы предположили возможность использования ме- тода спиновых зондов для оценки удерживания (нековалентной сорбции и десорбции) зондов, являющихся спин-мечеными (парамагнитными) моделями комплексов «УНТ– ФАВ» различной структуры. Метод позволяет по форме линий и параметрам спектров ЭПР не только быстро оценить сам факт сорбции спин-меченых веществ на поверхно- сти нанотрубок, но и различать липофильные зонды, достаточно сильно связанные с гидрофобной поверхностью нанотрубок, а также зонды, находящиеся в воде, плазме или липидном бислое мембран клеток. При этом открывается также возможность изу- чать кинетику процесса трансдиффузии веществ с поверхности УНТ на мембраны кле- ток при их контакте, оценивать время удержания ФАВ нанотрубками в присутствии клеток. Последнее обстоятельство является исключительно важным для характериза- ции УНТ, как системы доставки целевых продуктов в клетки-мишени органов и тканей. Целью работы явилось оценка связывания (нековалентной сорбции) ряда спино- вых зондов, представляющих собою парамагнитные модели ФАВ, поверхностью угле- родных нанотрубок различной структуры, а также особенностей перехода (трансдиф- фузии) зондов с поверхности нанотрубок на белки плазмы и мембраны эритроцитов в условиях контакта (инкубации) с компонентами крови. Материалы и методы В качестве парамагнитных моделей ФАВ, способных связываться с нанотрубка- ми в супрамолекулярные комплексы, использовали зонды 1–3: 1 2 3 Зонды 1 и 2, полученные по описанным ранее методикам [11], являются полно- стью гидрофобными, так как выполнены на основе насыщенной углеводородной цепи пальмитиновой кислоты. Зонд 3, полученный из зонда 2, обладает четвертичным азо- том, положительный заряд которого обеспечивает зонду свойства ионогенного поверх- ностно-активного вещества (ПАВ). Схема и препаративная методика синтеза зонда 3 состоят в следующем: 294 1,5 г (3,66 ммоль) 4-пальмитоиламидо-ТЕМПО (зонд 2) растворяли в 20 мл сухо- го ТГФ, прибавляли по каплям к кипящему раствору 1,35 г (36,6 ммоль) LiAlH4 в 40 мл ТГФ. Реакционную массу кипятили с обратным холодильником 10 ч, после чего избы- ток восстановителя осторожно разлагали этанолом, а затем насыщенным водным рас- твором NaCl (до прекращения экзотермической реакции). Полученную массу упарива- ли досуха при пониженном давлении, остаток растирали с диэтиловым эфиром, осадок отфильтровывали, промывали эфиром. К эфирному раствору прибавляли 3 г диоксида марганца (катализатор), перемешивали 0,5 ч, осадок отфильтровывали, эфир отгоняли при пониженном давлении. Полученный остаток подвергали хроматографическому анализу на колонке с силикагелем, элюент хлороформ – этилацетат (1:1). Продукт идентифицирован как 4-гексадециламино-ТЕМПО, выход 700 мг (48%), представляет собою маслянистую жидкость розового цвета, кристаллизующуюся в холодильнике. В ИК - спектрах характерны следующие полосы, см-1: 3425, 2953, 2924, 2853, 1468, 1370, 1362, 1244, 1180, 1119, 1067, 968, 719. Продукт неустойчив (при комнатной температу- ре постепенно разлагается), поэтому его сразу использовали в следующей стадии. В раствор 400 мг (1 ммоль) полученного продукта в 5 мл сухого хлороформа прибавляли 1 г безводного карбоната натрия и 1 мл (16 ммоль) йодистого метила, а за- тем перемешивали в плотно закупоренном сосуде при комнатной температуре 48 ч. Осадок отфильтровывали, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Образо- вавшийся остаток подвергали хроматографическому анализу на колонке с силикагелем, элюент хлороформ – этанол (5:1). Выход продукта 350 мг (60%). Представляет собой кристаллический порошок розового цвета с температурой плавления 138 °C (с разло- жением). В ИК - спектрах характерны следующие полосы, см-1: 2994, 2954, 2920, 2851, 1470, 1393, 1361, 1339, 1244, 1186, 1103, 983, 893, 719, 671, 570. Элементный состав, % мас.: С - 58,83; H - 10,45; N - 4,90; I - 22,67, что близко к расчетному составу для С27Н56N2OI: C - 58,79; H - 10,23; N - 5.08; I - 23.0 % мас. Продукт идентифицирован как 4-(N,N-диметил-N-гексадециламмонио)-ТЕМПО (зонд 3). Введение зондов 1–3 в водную суспензию УНТ осуществляли добавлением кон- центрированного раствора зонда в ДМСО таким образом, чтобы конечная концентра- ция ДМСО в суспензии составляла не более 0,5–1%. Регистрацию спектров ЭПР осуществляли на радиоспектрометре «ESR Spectrometer CMS8400». Время корреляции спинового зонда определяется из спектров ЭПР по следующим формулам [8]: ])1//[(102/1 010 8 )1( Hhhc   , с-1 (1) ])1//[(106,3/1 010 9 )1( Hhhc   , с-1 (2)  2/1 – величина, условно названная «частотою вращения» радикала. На практике для оценки вращательной подвижности спинового зонда в средах используют парамет- ры 10 / hh и 10 / hh спектров ЭПР (рис. 1), пропорциональные c . 295 Рис. 1. Типичный спектр ЭПР спинового зонда – иминоксильного радикала в водно- глицериновой среде: 0H – ширина центральной компоненты, 0h , 1h и 1h – интенсивности компонентов спектра ЭПР с соответствующим магнитным квантовым числом ядра 14N ( 1,1,0 M ); ИЗОA – изотропная константа. Для оценки локализации и доступности зонда к воде в том случае, когда он свя- зан с нанотрубкой или находится в мембране клеток, в изучаемую водную суспензию вводили парамагнитный «уширитель» спектров ЭПР – К3[Fe(CN)6]. Этот реагент уши- ряет спектр при доступности иминоксильного фрагмента зонда к воде. В работе использованы два типа УНТ. - Одностенные нанотрубки ОСУНТ. Содержание нанотрубок ~70%. Материал полу- чен на катализаторе из металлического железа с добавками иных d- и f- металлов. Де- минерализация не проводилась. Синтез ОСУНТ проведен в Институте неорганической химии СО РАН, Новосибирск [12]. - Многостенные нанотрубки МСУНТ. Содержание нанотрубок >95%. Материал по- лучен методом CVD при пиролизе пропилена на смешанном оксидном Al-Fe-Mo ката- лизаторе аэрозольного типа. Продукт деминерализован, зольность <0,4%. Синтез МСУНТ проведен в Институте химии поверхности им. А.А. Чуйко НАН Украины со- вместно с предприятием «ТМСпецмаш», Киев [13]. Для получения комплексов нанотрубок с липофильными зондами водную сус- пензию исследуемых нанотрубок (концентрация 0,8 – 1,0 мг/мл) с зондом озвучивали ультразвуком в течение 30 мин на установке Ultrasonic Cleaner. Эритроцитарную массу получали из крови крыс самцов путем трехкратной от- мывки физиологическим раствором (0,9% хлорида натрия), приготовленном на натрий- фосфатном буфере (5 ммоль/л, pH 7,2–7,4), с последующим центрифугированием в те- чение 20 мин при скорости 3000 об/мин. Надосадок после первого центрифугирования использовали в качестве плазмы. Для изучения процесса десорбции спиновых зондов с поверхности нанотрубок на биообъекты водную взвесь нанотрубок смешивали с плазмой или эритроцитарной массой в соотношении 1:1. Результаты и обсуждение Спиновые зонды – свободные радикалы иминоксильного типа (торговая марка ТЕМПО), как правило, растворимы в воде и при умеренных концентрациях дают три- плетный спектр ЭПР из узких линий (рис. 1). Зонды не взаимодействуют друг с другом и осуществляют быструю вращательную броуновскую диффузию в воде. Гидрофобные зонды 1 и 2 практически не растворимы в воде, хорошо растворимы в полярных и не- полярных органических растворителях, поэтому растворы этих зондов в заметных кон- центрациях возможны лишь в водно-органических смесях. На рис. 2 приведён спектр ЭПР зонда 1, полученного при добавлении концентрированного раствора зонда в 296 ДМСО в физиологический раствор (концентрация зонда в жидкой фазе составила 2·10-4 мг/л). Уширенный синглет характерен для спектров жидких индивидуальных нитроксильных радикалов или их концентрированных растворов, в которых происхо- дят быстрые обменные взаимодействия между нитроксильными фрагментами. В полу- ченном спектре нет узких линий триплета. Добавление феррицианида не приводит к изменению спектра, что свидетельствует, скорее всего, о выделении радикала в от- дельную фазу эмульсии. Для полного связывания липофильных спиновых зондов 1 и 2 нанотрубками требу- ется определенный избыток нанотрубок в исходной водной суспензии. Эксперименты по- казали, что это происходит при концентрации нанотрубок 0,8–1,0 мг/мл и концентрации зондов 2·10-4 мг/л. Нижняя концентрация зонда лимитировалась качеством записи широ- ких сигналов ЭПР. При концентрациях нанотрубок 0,1–0,2 мкг/мл в водной суспензии на- блюдается неполная сорбция зондов на поверхности УНТ. Использование избытка нанотрубок для полного связывания зонда в водных сус- пензиях позволило по спектрам ЭПР однозначно идентифицировать адсорбированные ли- пофильные зонды 1 и 2 на поверхности УНТ (рис. 2 б, в, г) и изучать кинетику десорбции зондов по появляющимся триплетам с более узкими линиями на фоне широких линий спектра. Для адсорбированного на поверхности УНТ зонда 1, вследствие диполь- дипольных взаимодействий, характерен триплет с очень широкими линиями. Радикальные частицы зонда из кластеров эмульсии переходят на гидрофобную поверхность нанотрубок, где они в определенной мере «индивидуализируются» и между ними уже нет обменного спин-спинового взаимодействия, как это было в кластере. Поскольку в спектре ЭПР исче- зает доминирующий синглет, а в системе, кроме зонда, имеется лишь один гидрофобный объект – поверхность нанотрубок, можно констатировать, что происходит полное связы- вание липофильного зонда с поверхностью УНТ. Дополнительное введение уширителя – феррицианида калия – практически не влияло на спектры ЭПР зондов 1 и 2, связанных с поверхностью нанотрубок, так как зонды в свободном состоянии в водной фазе отсутст- вуют, а линии спектров ЭПР связанных зондов уже достаточно сильно уширены. Спектр ЭПР зонда 2 в водной суспензии ОСУНТ (рис. 2 г) однозначно свиде- тельствует об адсорбционном удерживании зонда на поверхности нанотрубок. Одно- временно наблюдается большое уширение линий (диполь-дипольные взаимодействия) и большое отношение интенсивности центральной и высокополевой компонент (силь- ная заторможенность вращательной подвижности зонда). Спиновый зонд 3 представляет собой ионогенное ПАВ; он содержит в своём со- ставе четвертичный аммониевый фрагмент и липофильную алкильную цепь. Имеет достаточно хорошую растворимость в воде. Спектр ЭПР этого зонда в физиологиче- ском растворе представляет собой триплет с узкими линиями равной интенсивности (рис. 3 а), что соответствует образованию истинного (гомогенного) раствора. Добавка водной суспензии ОСУНТ не влияет на форму спектра ЭПР этого зонда. Добавление раствора феррицианида калия к суспензии нанотрубок с зондом 3 приводит к ушире- нию линий спектра и понижению их интенсивности до нуля, по-видимому, из-за об- менных взаимодействий (рис. 3 б). Одновременно это указывает на практически полное отсутствие удерживания этого зонда на поверхности нанотрубок и локализацию нитро- ксильного фрагмента в водной фазе. По-видимому, наличие высокого заряда в структу- ре этого радикального продукта приводит к формированию устойчивой сольватной оболочки в водном растворе, что препятствует сорбции всего зонда на поверхности на- нотрубок. Полученный результат о незначительной сорбции спин-меченого ионогенного ПАВ (зонд 3) представляется интересным, поскольку в литературе имеются сведения о том, что неионогенные ПАВ подобного строения (например, Твин 80), а также конъю- 297 гаты жирных кислот с полиэтиленгликолем достаточно хорошо связываются с поверх- ностью нанотрубок. При этом алкильный «хвост» кислоты укладывается на поверхно- сти УНТ, а гидрофильные фрагменты направлены в воду [14]. Рис. 2. Спектры ЭПР спинового зонда 1: а – в физиологическом растворе (0,9% NaCl), б – в водной суспензии ОСУНТ, в – в водной суспензии МСУНТ , г – спинового зонда 2 в водной суспензии ОСУНТ. На рис. 2 в представлен спектр ЭПР липофильного зонда 1 в водной суспензии МСУНТ. Суспензия подвергалась дополнительно ультразвуковой обработке в течение 1 ч для получения устойчивых комплексов зонда с нанотрубками. Отметим, что МСУНТ представляет суммарную фракцию трубок различного размера, что, по- видимому, отражается и на спектре ЭПР зонда 1. Спектр ЭПР свидетельствует об им- мобилизации большой части зонда 1 на поверхности нанотрубок, однако сложный ха- рактер этого спектра указывает на неоднородность распределения зонда, возможно не- которой части в виде кластеров. Рис. 3. Спектры ЭПР зонда 3: а – в физиологическом растворе, б – в водной суспензии ОСУНТ в присутствии феррицианида калия (0,1 М). а б в г а б 298 В работе [15] показано, что при введении ОСУНТ или МСУНТ в плазму крови происходит эффективная сорбция белков плазмы на поверхности нанотрубок, в резуль- тате чего смачиваемость и биосовместимость нанотрубок увеличивается. С помощью радиоизотопного метода установлено, что с нанотрубками связываются сывороточный альбумин, фибриноген и несколько аполипопротеинов – AI, ВГП и C-III. Известно так- же, что при внутривенном введении животным комплексов УНТ с липофильными ФАВ наблюдается десорбция иммобилизованных веществ с поверхности нанотрубок в кровь вследствие их взаимодействия с компонентами крови. Рис. 4. Спектры ЭПР комплекса ОСУНТ-зонд 1 в разные промежутки времени инкуба- ции с плазмой при 24 оС: 1 – 15 мин, 2 – 30 мин, 3 – 1 ч, 4 – 2 ч, 5 – 5 ч, 6 – 7 ч , 7 – 24 ч. Для моделирования этого процесса in vitro мы изучали изменения в спектрах ЭПР связанных с УНТ спиновых зондов 1 и 2 во времени при контакте этих комплек- сов с плазмой и эритроцитами крови крыс. На рис. 4 представлены спектры ЭПР ком- 7 299 плекса ОСУНТ– зонд 1 в зависимости от времени его инкубации с плазмой крови. Вид- но, что с первых минут инкубации в спектре, помимо трех широких линий, соответст- вующих связанному с поверхностью зонду, появляется более узкий сигнал, принадле- жащий, по-видимому, «заторможенному» зонду, локализованному в гидрофобных уча- стках белков плазмы. К таким белкам относят сывороточный альбумин и липопротеи- ны. Их способность локализовать в своих гидрофобных полостях спин-меченые жир- ные кислоты экспериментально продемонстрировано в [16]. Примечательно, что, начиная со второго часа после инкубации комплекса ОСУНТ–зонд 1 с плазмой (рис. 4), высокополевая компонента 1h узкого триплета зна- чительно сужается, а её интенсивность возрастает. Через 5 –7 ч «заторможенный» три- плет преобразуется в сигнал из узких линий, что указывает на резкое увеличение вра- щательной диффузии зонда. Через 24 ч после начала инкубации спектр ЭПР полностью представляется узким триплетом. Дополнительное введение в систему феррицианида приводит к полному исчезновению узкого триплета в спектре, что свидетельствует о нахождении зонда в электролитном окружении плазмы. Мы предположили, что зонд 1 в плазме неустойчив и может под влиянием ее ферментов претерпевать гидролиз (по эфирной группе) с высвобождением водораство- римого радикала 4-гидрокси-ТЕМПО (ТЕМПОЛ). Для проверки этого предположения зонд 1 проинкубировали с чистой плазмой в течение 24 ч. Кинетика изменения спек- тров ЭПР зонда 1 в чистой плазме представлена на рис. 5. Рис. 5. Спектры ЭПР зонда 1 в разные промежутки времени инкубации с плазмой при 24 оС: 1 – 1 ч, 2 – 4 ч, 3 – 8 ч, 4 – 24 ч. 300 Контрольный эксперимент с плазмой подтвердил предположение о существовании двух параллельных процессов при контакте комплекса ОСУНТ–зонд 1 с плазмой – про- цесса десорбции зонда в гидрофобные полости белков плазмы и процесса медленного его гидролиза в течение суток с высвобождением водорастворимого радикала ТЕМПОЛ. Сравнительный анализ ширины и интенсивности широкого триплета, соответствующего связанному с нанотрубками зонду, и сравнительно узкого «заторможенного» триплета, со- ответствующего зонду на белках плазмы, показал, что десорбция зонда с поверхности на- нотрубок в плазму в течение первого часа составляет около 15%. Десорбция зонда 2 с поверхности ОСУНТ в плазму имеет свои особенности. В отличие от зонда 1 зонд 2 имеет в качестве связывающего мостика пептидную группу, которая достаточно устойчива к действию гидролитических ферментов. Поэтому зонд 2 устойчив к гидролизу в среде плазмы крови. Десорбция зонда с поверхности нанотру- бок также начинается с первых минут инкубации комплекса с плазмой и нарастает со временем, однако существенно медленнее, чем в случае зонда 1 (рис. 6). Небольшое количество зонда 2 переходит в гидрофобные участки белков плазмы в течение 24 ч, что подтверждается сильно «заторможенным» сигналом ЭПР от зонда в течение длительного времени. Основная часть зонда 2 остается на поверхности ОСУНТ (большая интенсивность низкополевой компоненты широкого триплета). Спектры ЭПР зонда 2 в чистой плазме подтвердили локализацию зонда в белках после его десорбции с поверхности нанотрубок. Рис. 6. Кинетика изменения спектров ЭПР в процессе десорбции зонда 2 при инкуба- ции комплекса ОСУНТ–зонд 2 с плазмой при 24 оС: 1 – 15 мин, 2 – 30 мин, 3 – 1 ч, 4 – 2 ч, 5 - 4 ч, 6 - 24 ч). 301 Из полученных результатов следует, что нанотрубки могут быть эффективной системой доставки липофильных ФАВ при внутривенном введении комплекса «УНТ– ФАВ» в организм, так как подавляющая часть веществ в первые несколько часов, когда происходит распределение основной массы вещества по органам и тканям, находится в комплексе с нанотрубками. Небольшая часть вещества переносится белками плазмы. Процесс десорбции зондов 1 и 2 с поверхности УНТ в присутствии эритроцитов отличается от десорбции этих зондов в плазму. В течение первых часов в спектре ЭПР на фоне трех широких линий от зонда 2, сорбированного на ОСУНТ, в центре спектра появляется «заторможенный» триплет от зонда, находящегося в мембране эритроцитов, который с течением времени практически не меняется (рис. 7 а, б). Интенсивность сиг- нала ЭПР зонда 2 в эритроцитах невелика, а высокополевая компонента спектра 1h зонда в мембране эритроцитов (рис. 7 в) не просматривается из-за наложения широ- ких линий триплета от связанного с нанотрубкой зонда. Таким образом, основная часть зонда 2 находится на поверхности нанотрубок. Рис. 7. Спектры ЭПР: комплекса ОСУНТ–зонд 2 после инкубации во взвеси эритроци- тов в фосфатном буфере при 24 оС в течение 2 ч (а) и 3 ч (б); зонда 2 во взвеси эритроцитов в фосфатном буфере при 24 оС (в); комплекса ОСУНТ–зонд 1 по- сле инкубации во взвеси эритроцитов в фосфатном буфере при 24 оС в течение 3 ч (г). г а б в 302 Похожие спектры ЭПР наблюдаются и в первые часы после инкубации зонда 1 с эритроцитами (см. рис. 7 г). Характер спектра и динамика изменений свидетельствуют о медленной диффузии зонда 1 с поверхности ОСУНТ в липидный бислой мембран эритроцитов. Полученные данные показали, что десорбция липофильных спиновых зондов с поверхности нанотрубок в кровь является медленным процессом, определяемая, глав- ным образом, их трансдиффузией в гидрофобные участки белков плазмы и липидный бислой мембран эритроцитов в начальный период после попадания комплекса «УНТ– зонд» в кровь. При этом скорость перехода липофильных зондов в липидный бислой мембран эритроцитов значительно ниже, чем скорость их десорбции в плазму. Очевид- но, что взаимодействие зондов 1 и 2 с белками плазмы способствует более быстрой де- сорбции их с поверхности нанотрубок. Изучить кинетику десорбции липофильных зондов 1 и 2 с поверхности МСУНТ в плазму или эритроциты не представлялось возможным ввиду неоднородности образ- цов, поэтому получаемые спектры ЭПР для различных состояний зонда не удается од- нозначно интерпретировать. Выводы Липофильные зонды 1 и 2 образуют устойчивые комплексы с одностенными и многостенными нанотрубками. Способность сорбировать липофильные вещества на гидрофобной поверхности выше у одностенных нанотрубок, чем у многостенных. Зонд 3, являющийся одновременно ионогенным ПАВ, несмотря на наличие в структуре ал- кильной цепи не связывается с нанотрубками из-за положительного заряда на атоме азота и образования вокруг него сольватной оболочки. Метод спиновых зондов дает разнообразную информацию о процессах связыва- ния различных липофильных веществ с поверхностью нанотрубок различной структу- ры и может быть полезен для сравнительной оценки новых УНТ или иных наночастиц, как систем доставки липофильных ФАВ. Полезная информация может быть получена и при функционализации УНТ, поскольку спиновые зонды весьма чувствительны к изме- нению заряда и полярности поверхности нанотрубок при их химической модификации. При введении комплексов нанотрубок с липофильными зондами в плазму с пер- вых минут происходит медленная десорбция зондов с поверхности УНТ в гидрофобные полости макромолекул белков плазмы. В первые несколько часов большая часть зондов остается на нанотрубках, а доля десорбированных частиц в плазму составляет около 15%. Десорбция липофильных зондов в присутствии суспензии эритроцитов в буфер- ном растворе происходит медленнее, чем в присутствии плазмы крови, причём концен- трация зондов в мембранах достигает максимума уже через 2–3 часа и со временем не увеличивается. Таким образом, метод спиновых зондов может успешно использоваться для оценки эффективности УНТ различной структуры в качестве средств доставки ФАВ в клетки-мишени органов и тканей. Метод позволяет оценивать не только процессы де- сорбции спин-меченых веществ с поверхности УНТ в присутствии клеток, но и опреде- лять их локализацию в мембранах и внутриклеточном пространстве. Литература 1. Kateb B., Yamamoto V., Alizadeh D., Zhang L., Manohara H.M., Bronikowski M.J., Badie B. Multi-walled carbon nanotube (MWCNT) synthesis, preparation, labeling, and 303 functionalization // Immunotherapy of Cancer, Methods in Molecular Biology. – 2010. – No 651. – P. 307–317. 2. Ting G., Chang C.-H., Wang H. Cancer nanotargeted radiopharmaceutical for tumor imaging and therapy // Anti-Сancer Researches. – 2009. – No 29. – P. 4107–4118. 3. Pastorin G., Wu W., Wieckwski S., Briand J.P., Kostarelos K., Prato M., Bianco A. Double functionalization of carbon nanotubes for multimodal drug delivery // Chem. Commun. – 2006. –No 11. – P. 1182–1184. 4. Mahmood M., Karmakar A., Fejleh A., Mocan T., Iancu C., Mocan L., Iancu D.T., Xu Y., Dervishi E., Li Z., Biris A.R., Agarwal R., Ali N., Galanzha E.I., Biris A.S., Zharov V.P. Synergistic enhancement of cancer therapy using a combination of carbon nano- tubes and anti-tumor drug // Nanomedicine (London). – 2009. – No 4. – P. 883–893. 5. Liu Z., Fan A.C., Rakhra K., Sherlock S., Goodwin A., Chen X., Yang Q., Felsher D.W., Dai H. Supramolecular stacking of doxorubicin on carbon nanotubes for in vivo cancer therapy // Angew. Chem. – 2009. – V. 41, No 48. – P. 7668–7672. 6. Chen J., Chen S., Zhao X., Kuznetsova L.V., Wong S.S., Ojima I. Functionalized sin- gle-walled carbon nanotubes as rationally designed vehicles for tumor-targeted drug de- livery // J. Am. Chem. Soc. – 2008. – V. 49, No 130. – P. 16778–16785. 7. Dolatabadi J.E.N., Jamali A.A., Hasanzadeh M., Yadollah O. Quercetin delivery into cancer cells with single walled carbon nanotubes // Intern. J. Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics. 2011. – V. 1, No 1. – P. 21–25. 8. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. – Москва: Наука, 1974. – 256 c. 9. Кольтовер В.К. Спиновые метки и зонды в исследованиях модельных и биологи- ческих мембран // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Биофизика. – 1979. – Т. II. – С. 10–100. 10. Жданов Р.И. Парамагнитные модели биологически активных соединений. – Мо- сква: Наука, 1981. – 280 с. 11. Розанцев Э.Г. Свободные иминоксильные радикалы. – Москва: Химия, 1970. – 216 с. 12. Bulusheva L.G., Okotrub A.V., Lavskaya Yu.V., Vyalikh D.V., Dettlaff-Weglikowska U., Fonseca A., Hata K. Comparative NEXAFS examination of single-wall carbon nanotubes produced by different methods // Phys. Status Solidi B. – 2009. – V. 246, No 11–12. – P. 2637–2640. 13. Melezhyk A.V., Yanchenko V.V., Sementsov Yu.I. Nanocarbon materials // Hydrogen Materials Science and Chemistry of Carbon Nanomaterials. NATO Security through Science, Series A: Chemistry and Biology. Springer Science+Business Media. – 2007. – P. 529-537. 14. Vlasova I.I., Vakhrusheva T.V., Sokolov A.V., Kostevich V.A., Gusev A.A., Gusev S.A., Melnikova V.I., Lobach A.S. PEGylated single-walled carbon nanotubes activate neutrophils to increase production of hypochlorous acid, the oxidant capable of degrad- ing nanotubes // Toxicology and Applied Pharmacology. – 2012. – V. 264, No 1. – P. 131–142. 15. Salvador-Morales C., Flahaut E., Sim E., Sloan J., Green M.L.H., Sim R.B. Comple- ment activation and protein adsorption by carbon nanotubes // Molecular Immunology. – 2006. – V. 4, No 3. – P. 193-201. 16. Сергеев П.В. Биохимическая фармакология. – Москва: Высшая школа, 1982.– С. 82-93. 304 ДОСТАВКА ЛІПОФІЛЬНИХ СПІНОВИХ ЗОНДІВ ВУГЛЕЦЕВИМИ НАНОТРУБКАМИ В ЕРИТРОЦИТИ ТА ПЛАЗМУ КРОВІ Л.В. Іванов1, О.М. Ляпунов2, М.Т. Картель1, О.А. Нардід5, А.В. Окотруб3, І.А. Кирилюк4, Я.О. Черкашина5. 1Інститут хімії поверхні ім. О.О.Чуйка НАН України, Київ; 2Інститут монокристалів НАН України, Харків; 3Інститут неорганічної хімії СВ РАН, Новосибірськ; 4Новосибірський державний університет, Новосибірськ; 5Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України, Харків З використанням методу електронного парамагнітного резонансу проведена оцінка зв'язування (нековалентної сорбції) ряду спінових зондів, які становлять пара- магнітні моделі ліпофільних фізіологічно активних речовин, вуглецевими нанотрубками різної структури, а також особливостей переходу (трансдифузіі) зондів з поверхні на- нотрубок на білки плазми і мембрани еритроцитів при контакті (інкубації) з компоне- нтами крові. Показано, що ліпофільні зонди, що не мають іоногенних груп, утворюють стійкі комплекси з одно- і багатостінними вуглецевими нанотрубками, тоді як зонд з четвертинною амонієвою групою на трубках практично не сорбується. При контакті комплексів «зонд-нанотрубка» з плазмою і еритроцитами крові експериментальних тварин протягом декількох годин спостерігається десорбція зондів (до 15%) за раху- нок їх взаємодії з білками плазми, а також прогресуюче проникнення в ліпідний подвій- ний шар мембрани еритроцитів. Продемонстровано, що метод спінових зондів дозво- ляє оцінювати ефективність нанотрубок як засобів доставки цільових речовин до клітин-мішеней і визначати локалізацію зондів в мембранах і внутрішньоклітинному просторі. DELIVERY OF SPIN PROBES BY CARBON NANOTUBES IN ERYTHROCYTES AND PLASMA OF BLOOD L.V. Ivanov1, O.M. Lyapunov2, M.Т. Kartel1, О.А. Nardid5, А.V. Оkotrub3, I.А. Kirilyuk4, Ya.О. Cherkashina5. 1Chuiko Institute of Surface Chemistry, NAS of Ukraine, Kyiv; 2Institute of Single Crystals, NAS of Ukraine, Kharkiv; 3Institute of Inorganic Chemistry, SB of RAS, Novosibirsk; 4Novosibirsk State University, Novosibirsk; 5Institute of Problems of Cryobiology and Cryomedicine, Kharkiv Using the method of electron spin resonance assessed binding (non-covalent adsorp- tion) of several spin probes, which are paramagnetic model lipophilic physiologically active substances, carbon nanotubes with different structures, and features of the transition (trans- diffusion) probes with nanotubes on the surface proteins of plasma and erythrocyte membrane in contact (incubation) with blood components. It is shown that the lipophilic probes having no ionic groups form stable complexes with mono- and multi-walled carbon nanotubes, whereas the probe with a quaternary ammonium group on the tubes practically do not ad- sorbed. Upon contact complexes "nanotube-probe" with the plasma and red blood cells in experimental animals within a few hours there is desorption probes (up to 15%) due to their interaction with plasma proteins as well as progressive penetration into lipid double layer erythrocyte membrane. It is demonstrated that the method of spin probes allows assessing the effectiveness of nanotubes as delivery means of targeted substances to target cells and to de- termine the localization of the probe in the membranes and intracellular space.

Доставка липофильных спиновых зондов углеродными нанотрубками в эритро-циты и плазму крови

Репозитарії

Схожі ресурси