Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro

Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro

Хлорпірифос (ХПФ) є фосфорорганічним інсектицидом, який широко використовується в побуті, сільському господарстві та промисловості. Як і всі фосфорорганічні сполуки, ХПФ впливає на нервову систему, інгібуючи ацетилхолінестеразу (АХЕ). Крім того, в організмі ссавців він перетворюється в ХПФ-оксон, я...

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Дата:2013
Автор: Салига, Ю.Т.
Формат: Стаття
Мова:Ukrainian
Опубліковано: Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України 2013
Назва видання:Нейрофизиология
Онлайн доступ:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148096
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro / Ю. Т. Салига // Нейрофизиология. — 2013. — Т. 45, № 3. — С. 221-227. — Бібліогр.: 34 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-148096
record_format dspace
spelling irk-123456789-1480962019-02-17T01:25:44Z Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro Салига, Ю.Т. Хлорпірифос (ХПФ) є фосфорорганічним інсектицидом, який широко використовується в побуті, сільському господарстві та промисловості. Як і всі фосфорорганічні сполуки, ХПФ впливає на нервову систему, інгібуючи ацетилхолінестеразу (АХЕ). Крім того, в організмі ссавців він перетворюється в ХПФ-оксон, який більш ніж у 3000 разів активніший щодо нервової системи, ніж сам ХПФ. Як з’ясувалось останнім часом, дія цього пестициду на АХЕ є далеко не єдиним механізмом його токсичності. Одним із механізмів може бути здатність фосфорорганічних сполук викликати оксидаційний стрес, що призводить до утворення вільних радикалів. Ми досліджували вплив ХПФ на клітини гіпокампа щурів в умовах культури, звертаючи особливу увагу на те, чи опосередковується цитотоксичний ефект впливами активних форм кисню. Використовували трансфекцію культивованих клітин гіпокампа зеленим флуоресцентним білком (GFP). Було визначено дозозалежність ушкодження та загибелі клітин гіпокампа in vitro під дією ХПФ, а також залежність від тривалості його дії. Було також досліджено виживання нервових клітин, які інкубували в середовищі тільки з ХПФ і в тих самих умовах, але з додаванням тролоксу (водорозчинного аналога вітаміну Е) як антиоксидантного фактора. Було встановлено, що нейропротекторна дія тролоксу є очевидною при всіх концентраціях ХПФ, використаних протягом періоду дослідження. Таким чином, слід вважати, що негативний вплив ХПФ на клітини гіпокампа значною мірою зумовлений розвитком у цих умовах оксидаційного стресу. 2013 Article Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro / Ю. Т. Салига // Нейрофизиология. — 2013. — Т. 45, № 3. — С. 221-227. — Бібліогр.: 34 назв. — укр. 0028-2561 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148096 577.15:632.85.02: 612.822:615.099 uk Нейрофизиология Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Ukrainian
description Хлорпірифос (ХПФ) є фосфорорганічним інсектицидом, який широко використовується в побуті, сільському господарстві та промисловості. Як і всі фосфорорганічні сполуки, ХПФ впливає на нервову систему, інгібуючи ацетилхолінестеразу (АХЕ). Крім того, в організмі ссавців він перетворюється в ХПФ-оксон, який більш ніж у 3000 разів активніший щодо нервової системи, ніж сам ХПФ. Як з’ясувалось останнім часом, дія цього пестициду на АХЕ є далеко не єдиним механізмом його токсичності. Одним із механізмів може бути здатність фосфорорганічних сполук викликати оксидаційний стрес, що призводить до утворення вільних радикалів. Ми досліджували вплив ХПФ на клітини гіпокампа щурів в умовах культури, звертаючи особливу увагу на те, чи опосередковується цитотоксичний ефект впливами активних форм кисню. Використовували трансфекцію культивованих клітин гіпокампа зеленим флуоресцентним білком (GFP). Було визначено дозозалежність ушкодження та загибелі клітин гіпокампа in vitro під дією ХПФ, а також залежність від тривалості його дії. Було також досліджено виживання нервових клітин, які інкубували в середовищі тільки з ХПФ і в тих самих умовах, але з додаванням тролоксу (водорозчинного аналога вітаміну Е) як антиоксидантного фактора. Було встановлено, що нейропротекторна дія тролоксу є очевидною при всіх концентраціях ХПФ, використаних протягом періоду дослідження. Таким чином, слід вважати, що негативний вплив ХПФ на клітини гіпокампа значною мірою зумовлений розвитком у цих умовах оксидаційного стресу.
format Article
author Салига, Ю.Т.
spellingShingle Салига, Ю.Т.
Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro
Нейрофизиология
author_facet Салига, Ю.Т.
author_sort Салига, Ю.Т.
title Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro
title_short Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro
title_full Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro
title_fullStr Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro
title_full_unstemmed Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro
title_sort роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro
publisher Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
publishDate 2013
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148096
citation_txt Роль оксидаційного стресу в загибелі клітин гіпокампа під дією хлорпірифосу в умовах in vitro / Ю. Т. Салига // Нейрофизиология. — 2013. — Т. 45, № 3. — С. 221-227. — Бібліогр.: 34 назв. — укр.
series Нейрофизиология
work_keys_str_mv AT saligaût rolʹoksidacíjnogostresuvzagibelíklítingípokampapíddíêûhlorpírifosuvumovahinvitro
first_indexed 2025-07-12T18:19:36Z
last_indexed 2025-07-12T18:19:36Z
_version_ 1837466262291087360
fulltext NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 3 221 УДК 577.15:632.85.02: 612.822:615.099 Ю. Т. САЛИГА1 РОЛЬ ОКСИДАЦІЙНОГО СТРЕСУ В ЗАГИБЕЛІ КЛІТИН ГІПОКАМПА ПІД ДІЄЮ ХЛОРПІРИФОСУ В УМОВАХ IN VITRO Надійшла 12.03.13 Хлорпірифос (ХПФ) є фосфорорганічним інсектицидом, який широко використовуєть- ся в побуті, сільському господарстві та промисловості. Як і всі фосфорорганічні спо- луки, ХПФ впливає на нервову систему, інгібуючи ацетилхолінестеразу (АХЕ). Крім того, в організмі ссавців він перетворюється в ХПФ-оксон, який більш ніж у 3000 ра- зів активніший щодо нервової системи, ніж сам ХПФ. Як з’ясувалось останнім часом, дія цього пестициду на АХЕ є далеко не єдиним механізмом його токсичності. Одним із механізмів може бути здатність фосфорорганічних сполук викликати оксидаційний стрес, що призводить до утворення вільних радикалів. Ми досліджували вплив ХПФ на клітини гіпокампа щурів в умовах культури, звертаючи особливу увагу на те, чи опосе- редковується цитотоксичний ефект впливами активних форм кисню. Використовували трансфекцію культивованих клітин гіпокампа зеленим флуоресцентним білком (GFP). Було визначено дозозалежність ушкодження та загибелі клітин гіпокампа in vitro під дією ХПФ, а також залежність від тривалості його дії. Було також досліджено виживан- ня нервових клітин, які інкубували в середовищі тільки з ХПФ і в тих самих умовах, але з додаванням тролоксу (водорозчинного аналога вітаміну Е) як антиоксидантного фактора. Було встановлено, що нейропротекторна дія тролоксу є очевидною при всіх концентраціях ХПФ, використаних протягом періоду дослідження. Таким чином, слід вважати, що негативний вплив ХПФ на клітини гіпокампа значною мірою зумовлений розвитком у цих умовах оксидаційного стресу. КЛЮЧОВІ СЛОВА: культура клітин, хлорпірифос, гіпокамп, нейрон, нейротоксичність, оксидаційний стрес. 1Інститут біології тварин НААН України, Львів (Україна). Ел. пошта: yursalyha@yahoo.com (Ю. Т. Салига). во-судинну, дихальну та репродуктивну системи, але основною мішенню токсичної дії ХПФ є ЦНС [3–7]. Саме цей аспект, що раніше був недооцінений, сьогодні викликає зростаючий інтерес і вимагає ретельнішого вивчення. Як і інші фосфорорганічні сполуки, ХПФ інгібує ацетилхолінестеразу (АХЕ), котра забезпечує гідроліз ацетилхоліну. Дана властивість ХПФ – його вплив на процеси синаптичної передачі – до недавнього часу роз- глядалася як ключовий і чи не єдиний механізм його токсичності [8]. В останні роки вчені в ба- гатьох країнах активізували дослідження щодо біологічної безпеки ряду пестицидів, у тому числі фосфорорганічних сполук з антихолінестеразними властивостями. Були з’ясовані деякі нові аспек- ти механізмів їх дії на живий організм у цілому і нервову систему зокрема. Було неодноразово про- демонстровано, що механізм токсичності ХПФ не обмежується лише інгібуванням холінестерази, а ВСТУП Хлорпірифос (ХПФ) – один із добре відомих фосфорорганічних інсектицидів, який протя- гом останніх 40 років широко використовується в сільськогосподарських, промислових та побуто- вих цілях приблизно в 100 країнах світу [1, 2]. Не- зважаючи на нещодавно введені істотні обмеження його застосування в домашніх умовах у низці країн (США, 2001; Європейський Союз, 2003), ХПФ залишається дуже широко вживаним пестицидом. Цей агент використовується для знищення широ- кого спектра шкідливих комах і кліщів; водночас він демонструє помітну токсичність для більшості видів інших тварин і людини [2]. ХПФ може зумов- лювати різноманітні токсичні ефекти в багатьох органах та системах ссавців, впливаючи на серце- NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 3222 Ю. Т. САЛИГА може бути пов’язаний із впливами на інші важливі біологічні процеси. Є дані, що ХПФ негативно впливає на розвиток мозку ссавців, оскільки ефек- ти цього агента щодо холінергічної передачі в ЦНС комбінуються із впливом на внутрішньоклітинні сигнальні каскади, задіяні в диференціювання клітин. Накопичуються також свідчення того, що нейротоксичність ХПФ може бути значною мірою пов’язана з феноменом оксидаційного стресу [9–13]. Оксидаційний стрес можна кваліфікувати як дисбаланс окислювально-відновної рівноваги в клітині, пов’язаний або з надмірним утворен- ням активних форм кисню (АФК), або ж з пору- шенням функціонування системи антиоксидант- ного захисту [14]. Нейрони є високочутливими до оксидаційного стресу у зв’язку з тим, що їх енерго- забезпечення особливо істотно (порівняно з таким інших клітин) залежить від окисного фосфорилю- вання [15]. Неодноразово підкреслювався тісний зв’язок між оксидаційним стресом і виникненням низки патологій та розладів нервової системи (хво- роб Альцгеймера, Паркінсона, Хантінгтона, лате- рального аміотрофічного склероза та ін.) [14–23]. Результати наших попередніх досліджень на ла- бораторних тваринах і культурах нервових клітин [2, 24] слугували підтвердженням нейротоксичної дії ХПФ та вказували на те, що інтоксикація організму цією сполукою може призвести до пору- шень оксидаційного балансу. Таким чином, оксидаційний стрес може бути одним із факторів, що зумовлюють загибель нер- вових клітин різних типів у ЦНС. Більшість досліджень нейротоксичності ХПФ в умовах in vitro були проведені на нейронах кори, астроци- тах та олігодендроцитах [11, 25, 26]. Метою нашої роботи було з’ясувати характер впливів ХПФ на первинну культуру нейронів гіпокампа in vitro і перевірити зв’язок між загибеллю таких клітин і оксидаційним стресом. МЕТОДИКА Реагенти. У роботі використовували ХПФ (CAS № 2921-88-2; О,О-діетил-О-3,5,6-трихлор-2- піридилфосфоротіоат (C9H11Cl3NO3PS)) виробницт- ва компанії „Sigma Chemical” (США). Для приго- тування маточного розчину ХПФ його розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО) до концентрації 100 мкM, заморожували і зберігали при температурі –80 °C. Для кожного експерименту використову- вали свіжоприготовані розчини ХПФ необхідних концентрацій. Водорозчинний аналог вітаміну E тролокс (CAS № 53188-07-1; (±)-6-гідрокси-2,5,7,8- тетраметилхроман-2-карбонова кислота) вироб- ництва „Sigma Chemical” (США) застосовували в концентрації 100 мкM. Чистота цього препарату становила не менше 97 %. Первинна культура нейронів гіпокампа щурів і трансфекція нейронів. Нейрони виділяли з гіпо- кампа ембріонів лінії Вістар (18-й день пренаталь- ного розвитку), застосовуючи обробку зразків цієї структури 0.25 %-вим трипсином протягом 15 хв при 37 °C. Після цього нервові клітини висівали на покривні скельця, покриті поліетиленіміном (щіль- ність 70000 клітин на 1 см2). Нейрони культивува- ли в мінімальному поживному середовищі (MEM), до якого додавали 10 % сироватки NU фірми „BD Biosciences” (Франція), 0.45 % глюкози, 1 мМ піру- вату натрію, 1.5 мМ HEPES і 10 МО/мл пеніцилін/ стрептоміцину згідно з описаними методиками [27– 29]. На сьому, 10-ту і 13-ту доби інкубування куль- тури (доби in vitro, DIV) клітин половину пожив- ного середовища замінювали середовищем МEM з додаванням 2 % B27 („Invitrogen”, США). Для трансфекції нейронів зеленим флуоресцент- ним білком (GFP) ми використовували метод маг- нетофекції – новий спосіб перенесення генетичної інформації на основі доставки ДНК на магнітних наночастинках під дією спрямованого магнітно- го поля. Після семи–10 DIV змішані культури клі- тин гіпокампа були трансфековані з використан- ням Magnetofection Kit („OZ Biosciences”, Франція) та ліпофектаміну 2000 [27–29]. Для трансфекції культур, які вирощували в чашках Петрі діаметром 35 мм, 300 мкл середовища Opti-MEM змішували із 7.0 мкл ліпофектаміну 2000 („Invitrogen”, США), 1.0 мкл реагенту Magnetofection CombiMag („OZ Bioscience”, Франція) і 1.0–1.5 мкг pcДНК. Суміш витримували протягом 20 хв при кімнатній темпе- ратурі, а потім акуратно додавали в чашки до куль- тури нейронів. Чашки з культурами вміщували на спеціальні магнітні пластини („OZ Bioscience”, Франція) і витримували так протягом 30–35 хв при 37 °C. Процес трансфекції припиняли, замінюю- чи 90 % інкубаційного розчину свіжим культураль- ним середовищем. Для трансфекції культур, які ін- кубували в планшетах з чотирма лунками діаметром 16 мм, у кожну таку лунку вносили 60 мкл описаної вище суміші. У подальших експериментах використо- вували клітини через дві–п’ять діб після трансфекції. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 3 223 РОЛЬ ОКСИДАЦІЙНОГО СТРЕСУ В ЗАГИБЕЛІ КЛІТИН ГІПОКАМПА Клітини після трансфекції досліджували за до- помогою так званої інтервальної мікроскопії (time lapse-мікроскопія). Культури з низьким рівнем трансфекції (<10 нейронів на покривне скельце) в експериментах не використовували. Мікроскопія живих культур нейронів гіпокампа. Інтервальну мікроскопію нервових клітин у перебігу їх росту і розвитку проводили за допомо- гою інвертованого мікроскопа, який був обладнаний спеціальною CO2-камерою („Princeton Instruments”, США) з безперервним контролем рівня вуглекисло- го газу і температури. Протягом трьох діб поспіль з використанням камери Micro-MAX CCD і програм- ного забезпечення MetaMorph („Roper Scientific”, США) отримували та аналізували зображення од- них і тих самих 20–30 трансфекованих нейронів у кожних окремих умовах експерименту, знаходячи такі одиниці щоразу за системою координат. Одра- зу після мікроскопічного дослідження нейронів чашки з культурами переносили у СО2-інкубатор. Нейрони з нормальним розвитком дендритів, в яких спостерігався рівномірний розподіл GFP, врахову- вали як живі, тоді як нейрони з кластеризованим розподілом GFP або ті клітини, де GFP зникав, вва- жали загиблими. Статистичний аналіз. Усі дані підлягали статис- тичній обробці з використанням t-тесту Ст’юдента. Міжгрупові відмінності отриманих даних з Р < 0.05 вважали статистично вірогідними. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ У першій частині нашої роботи ми досліджували нейротоксичну дію ХПФ на первинні культури нейронів гіпокампа щурів. Порівнювалися впли- ви щодо токсиканта у різних концентраціях на ріст і виживання нейронів гіпокампа в умовах in vitro. З цією метою культури клітин гіпокампа, вік яких становив 7 DIV, трансфекували з використанням GFP для візуалізації морфології нейронів. Через три доби після трансфекції клітин в інкубаційне середовище додавали ХПФ у концентраціях 0, 1, 10, 20, 50 і 100 мкМ. Після цього протягом трьох діб поспіль отримували флуоресцентні зображення одних і тих самих нейронів, що дозволило прово- дити аналіз їх морфологічних змін і рівня виживан- ня. Беручи до уваги те, що як розчинник для ХПФ у роботі використовували ДМСО, перевіряли також можливий вплив останньої хімічної речовини на досліджувані культури. Істотного впливу ДМСО у використаних концентраціях на життєздатність клітин виявлено не було. Дія ХПФ на культури нейронів гіпокампа щурів протягом 24, 48 і 72 год починаючи з третього дня після трансфекції зумовлювала інтенсивні нейро- токсичні ефекти (рис. 1). У переважній більшості випадків додавання до культурального середовища ХПФ у всіх дозах (1, 10, 20, 50 і 100 мкM) призво- дило до значного зменшення кількості живих клітин порівняно з числом нейронів у контролі (інкубація без внесення цієї сполуки в середовище). Водночас, як слід підкреслити, відмінності між кількістю клі- тин, що виживали в умовах дії ХПФ та в контролі, не були прямо пропорційними застосованим кон- центраціям токсину, хоча дозозалежність була оче- видною. ХПФ у відносно високих концентраціях (20, 50 і 100 мкM) викликав істотні негативні зміни вже в перші дні після його внесення в середовище культивування. На відміну від цього ХПФ у дозах 1 і 10 мкM призводив до значного зменшення числа живих клітин тільки після 72 год досліду. Протягом перших 24 і 48 год спостерігалася лише незначна тенденція до зниження цього показника. Внесення до середовища ХПФ у дозах 50 і 100 мкM протягом 72 год спостережень зумовлювало загибель більше 80 % нейронів гіпокампа. За умов відсутності в се- редовищі ХПФ значна більшість (до 80 %) нейро- Р и с. 1. Виживання нейронів протягом 72 год експерименту в умовах культивування клітин при внесенні в інкубаційне середовище хлорпірифосу (ХПФ) у різних дозах (від 1 до 100 мкM). По вертикалі – відносна кількість живих клітин, % (за 100 % прийнята кількість таких клітин на початку культивування). Зірочками позначені випадки вірогідної різниці порівняно з контролем (К), хрестиками – зі значеннями в першу добу експерименту (24 год) з P < 0.05. год10 20 50 100 24 К % 1 48 72 0 20 40 60 80 100 *+*+ *+ +* * * ** *+* NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 3224 Ю. Т. САЛИГА нів нормально розвивалися протягом трьох діб піс- ля початку експерименту. Інша серія експериментів in vitro була прове- дена з використанням тролокса – водорозчинного аналога вітаміну E – як антиоксидантного фактора (рис. 2; 3). Одночасне внесення до інкубаційно- го середовища ХПФ і тролокса в концентрації 100 мкM забезпечувало істотно більший рівень ви- живання нейронів. При всіх концентраціях ХПФ, які були використані в роботі, навіть через три доби експерименту живими звичайно залишалися 60 і більше відсотків нейронів. Далі ми обговоримо ці результати докладніше. Нові методи досліджень, базовані на прижиттє- вій візуалізації клітин різних типів, у тому числі нервових, дають змогу оцінити стан їх життєдіяль- ності в умовах дії будь-яких негативних факторів. Для вивчення впливу ХПФ на нейрони гіпокампа in vitro ми використовували трансфекцію таких клі- тин люмінесцентним протеїном GFP. Це дозволи- ло отримати нові дані про механізми токсичнос- ті ХПФ і загалом фосфорорганічних сполук щодо ЦНС ссавців. Незважаючи на високий інтерес до нейротоксичної дії ХПФ та доцільність вивчення відповідних ефектів in vitro, відомості про впли- ви цього токсиканту на нервові клітини саме гіпо- кампа поки що дуже обмежені. Як уже згадувало- ся вище, аналогічні дослідження проводилися на клітинах ряду інших структур ЦНС. Гіпокамп, як відомо, є дуже чутливим щодо багатьох видів нев- рологічних уражень; зокрема, він є основною мі- шенню при дегенерації нейронів у пацієнтів із хво- робою Альцгеймера [34]. Результати наших експериментів продемон- стрували, що ХПФ викликає дозозалежну заги- бель нейронів гіпокампа in vitro. Беручи до уваги дані наших попередніх досліджень, а також робіт цілої низки авторів, які вивчали токсичну дію ХПФ на інші клітини, цей результат є доволі пе- редбачуваним [2, 25, 26]. Підтвердження цього фе- номену на нервових клітинах іншого типу лише доповнює відому інформацію про токсичність ХПФ, але не наближає до розуміння механізмів за- значеного ефекту. Тому набагато цікавішими ви- глядають результати другої частини нашої роботи. Вони свідчать про те, що нейротоксичність ХПФ може значною мірою базуватися на оксидаційному стресі, індукованому названою сполукою. ХПФ, як і інші фосфорорганічні сполуки, інгібує холінестеразні ензими, але це є не єдиним механізмом його нейротоксичності. Як було вста- новлено, ХПФ впливає на процеси синаптичної передачі, пошкоджує реплікацію в перебігу нейро- генезу, пригнічує ріст нейритів, перешкоджає нор- мальному функціонуванню сигнальних каскадів і транскрипційних подій, що беруть участь у процесі клітинної диференціації нейронів, і (найголовніше) викликає оксидаційний стрес [11, 30–33]. Таким чином, нейротоксичність ХПФ може бути част- ково опосередкована генерацією АФК та актив- них форм азоту (АФА), і такі механізми дії даної сполуки є доволі важливими. У зв’язку з висо- кою реакційною активністю АФК подібні форми кисню хімічно взаємодіють з низкою біологічних молекул, що призводить до істотних змін у функціонуванні клітини, а згодом можуть зу- мовити її загибель [14]. Було неодноразово по- казано, що клітини мозку можуть бути істотно пошкоджені вільними радикалами; при цьому тре- ба мати на увазі, що мозок характеризується над- звичайно високим споживанням кисню. Нейронні мембрани багаті на поліненасичені жирні кислоти, які є значними потенційними мішенями перекис- ного окиснення ліпідів [34]. Оксидаційний стрес – це один із важливих молекулярних механізмів, що призводить до нейродегенерації гіпокампа. Да- ний механізм працює в поєднанні з іншими ток- сичними шляхами, які активуються нейрозапален- ням, ексайтотоксичністю, внутрішньоклітинним надлишком кальцію та/або мітохондріальною дисфункцією; це певною мірою зумовлює вибіркову 24 48 72 0 20 40 60 80 100 * + *+ * + *+ + + ** * *+ + * ** * 10 20 50 100К 1 % год Р и с. 2. Виживання нейронів протягом 72 год експерименту в умовах культивування клітин при внесенні в інкубаційне середовище хлорпірифосу в різних дозах (від 1 до 100 мкМ) і 100 мкM тролоксу. Решта позначень і пояснень ті ж самі, що й на рис. 1. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 3 225 РОЛЬ ОКСИДАЦІЙНОГО СТРЕСУ В ЗАГИБЕЛІ КЛІТИН ГІПОКАМПА загибель нейронів згаданої структури. Ми порівнювали інтенсивність загибелі куль- тивованих нейронів гіпокампа в інкубаційному середовищі за присутності тільки ХПФ, а та- кож в тих самих умовах, але з додаванням ефек- тивного антиоксидантного фактора. Як останній ми обрали тролокс. Даний термін є торговою на- звою французької компанії „Hoffman-La Roche’s” для 6-г ідрокси-2 ,5 ,7 ,8-тетраметилхроман-2- карбонової кислоти – водорозчинного аналога вітаміну Е. Цей антиоксидант, як і вітамін Е, широ- ко використовується в складі біохімічних додатків В Б А Г Д Е Р и с. 3. Виживання нейронів, трансфекованих зеленим флуоресцентним білком, в умовах культивування з додаванням до середовища тільки хлорпірифосу (A–В) і в аналогічних умовах, але з одночасним додаванням тролоксу (Г–Е). A–B і Г–E – зображення одних і тих самих нейронів через 24 (A, Г), 48 (Б, Д) та 72 (В, Е) год після початку експерименту. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 3226 Ю. Т. САЛИГА для зниження впливу оксидаційного стресу і пору- шень, котрі останній може викликати. Tролокс проявляв значну нейропротекторну дію при всіх концентраціях ХПФ, які ми використовува- ли, причому протягом усього періоду дослідження. Через 72 год експерименту з використанням усіх концентрацій ХПФ (до 100 мкM) в інкубаційному середовищі ми спостерігали статистично вірогідні відмінності між кількістю живих клітин у зразках, які інкубували з додаванням тролоксу і без нього. Найбільш істотний вплив тролоксу відмічався у випадках, коли в інкубаційне середовище ХПФ був внесений у високих дозах (20, 50 і 100 мкM). У разі використання ХПФ у середовищі в концентраціях 50 і 100 мкМ вірогідні зміни в кількості живих клітин спостерігалися через 48 і 72 год дослідного періоду. При додаванні в тролоксвмісне інкубаційне середовище ХПФ у концентрації 100 мкM кількість живих клітин була більшою на 46 (24 год), 75 (48 год) і 91.5 (72 год) % порівняно з числом живих клітин у середовищі без тролоксу в межах тих самих часо- вих періодів. Загалом слід зазначити, що додаван- ня до інкубаційного середовища 100 мM тролоксу в усіх умовах експерименту забезпечувало вижи- вання порядку 60 % і більше нейронів гіпокампа навіть через 72 год досліду. Цікаво, що ХПФ у дозі 20 мM проявляв сильніший цитотоксичний ефект порівняно з усіма іншими. Це дозволяє говорити про відсутність прямо пропорційної залежності між концентрацією ХПФ в інкубаційному середовищі і рівнем загибелі клітин, що ним викликається. За- раз ми не готові дати вичерпного пояснення отри- маних результатів, і це має стати завданням наступ- них досліджень у вказаному напрямку. Отримані дані доводять, що ХПФ викликає дозозалежні ефекти токсичності, що призводять до посилення клітинної загибелі. У свою чер- гу тролокс проявляє нейропротекторну дію щодо нейронів, які інкубували в середовищі з додаван- ням ХПФ. Наші висновки вносять свою лепту в зростаюче число доказів того, що оксидаційний стрес бере істотну участь у механізмах клітинної смерті нейронів ссавців. Дослідження було проведено з дотриманням вимог Європейської конвенції щодо роботи з експериментальними тваринами (Страсбург, 1986). Частина дослідження була виконана в лабораторії докт. І. Медини (І. Medina) у Середземноморському інституті не- йробіології (INMED, Марсель, Франція). У зв’язку з цим висловлюю слова щирої подяки докт. І. Медині за надану можливість використовувати устаткування його лабораторії, а також за корисні консультації. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Y. T. Salyha, “Potential neurotoxicity of chlorpyrifos and methods of its investigation,” Med. Chem. [in Ukrainian], 11, No. 4, 69-72 (2009). 2. Y. Salyha, “Biological effects assessment of chlorpyrifos and some aspects of its neurotoxicity,” Visn. Lviv Univ. Biol. Ser. [in Ukrainian], 54, 3-14 (2010). 3. J. E. Aldridge, F. J. Seidler, A. Meyer, et al., “Serotonergic systems targeted by developmental exposure to chlorpyrifos: Eeffects during different critical periods,” Environ. Health Perspect., 111, No. 14, 1736-1743 (2003). 4. K. Dam, F. J. Seidler, and T. A. Slotkin, “Chlorpyrifos exposure during a critical neonatal period elicits gender- selective deficits in the development of coordination skills and locomotor activity,” Brain Res. Dev. Brain Res., 121, 179-187 (2000). 5. J . F laskos , “The developmenta l neuro toxic i ty of organophosphorus insecticides: A direct role for the oxon metabolites,” Toxicol. Lett., 209, No. 1, 86-93 (2012). 6. S. J. Garcia, F. J. Seidler, and T. A. Slotkin, “Developmental neurotoxicity elicited by prenatal or postnatal chlorpyrifos exposure: effects on neurospecific proteins indicate changing vulnerabilities,” Environ. Health Perspect., 111, No. 3, 297-303 (2003). 7. R. C. Gupta, J. K. Malik, and D. Milatovic, “Organophosphate and carbamate pesticides,” in: Reproductive and Developmental Toxicology , R. C. Gupta (ed.), Elsevier Acad. Press, Burlington (2011), pp. 471-486. 8. K. D. Whitney, F. J. Seidler, and T. A. Slotkin, “Developmental neurotoxicity of chlorpyrifos: cellular mechanisms,” Toxicol. Appl. Pharmacol., 134, No. 1, 53-62 (1995). 9. A. Caughlan, K. Newhouse, U. Namgung, et al., “Chlorpyrifos induces apoptosis in rat cortical neurons that is regulated by a balance between p38 and ERK/JNK MAP kinases,” Toxicol. Sci., 78, No. 1, 125-134 (2004). 10. E. H. Delgado, E. L. Streck, J. L. Quevedo, et al., “Mitochondrial respiratory dysfunction and oxidative stress after chronic malathion exposure,” Neyrochem. Res., 31, No. 8, 1021-1025 (2006). 11. M. D. Saulsbury, S. O. Heyliger, K. Wang, et al., “Chlorpyrifos induces oxidative stress in oligodendrocyte progenitor cells,” Toxicolology, 259, No. 1, 1-9 (2009). 12. T. A. Slotkin, C. A. Oliver, F. J. Seidler, et al., “Critical periods for the role of oxidative stress in the developmental neurotoxicity of chlorpyrifos and terbutaline, alone or in combination,” Brain Res. Dev. Brain Res., 157, No. 2, 172-178 (2005). 13. T. A. Slotkin and F. J. Seidler, “Comparative developmental neurotoxicity of organophosphates in vivo: transcriptional responses of pathways for brain cell development, cell signaling, cytotoxicity and neyrotransmitter systems,” Brain Res. Bull., 72, Nos. 4/6, 232-274 (2007). 14. S. Gandhi and A. Y. Abramov, “Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration,” Oxidat. Med. Cell. Longevity, 2012, Article ID 428010, 11 pages, Hindawi Publ. Corp., doi:10.1155/2012/428010 (2012). NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 3 227 РОЛЬ ОКСИДАЦІЙНОГО СТРЕСУ В ЗАГИБЕЛІ КЛІТИН ГІПОКАМПА 15. K. Facecchia, L. A. Fochesato, S. D. Ray, et al., “Oxidative toxicity in neurodegenerative diseases: role of mitochondrial dysfunction and therapeutic strategies,” J. Toxicol., 2011, Article ID 683728, 12 pages, Hindawi Publ. Corp., doi:10.1155/2011/683728 (2011). 16. K. J . Barnham, C. L. Masters , and A. I . Bush, “Neurodegenerative diseases and oxidatives stress,” Nat. Rev. Drug Discov., 3, No. 3, 205-214 (2004). 17. J . T. Coyle and P. Puttfarcken, “Oxidative stress, glutamate, and neyrodegenerative disorders,” Science, 262, No. 5134, 689-695 (1993). 18. M. Dumont, M. T. Lin, and M. F. Beal, “Mitochondria and antioxidant targeted therapeutic strategies for Alzheimer’s disease,” J. Alzheimer’s Dis., 20, No. 2, S633-S643 (2010). 19. J. Emerit, M. Edeas, and F. Bricaire, “Neurodegenerative diseases and oxidative stress,” Biomed. Pharmacother., 58, No. 1, 39-46 (2004). 20. B. Halliwell, “Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now?” J. Neurochem., 97, No. 6, 1634-1658 (2006). 21. M. T. Lin and M. F. Beal, “Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases,” Nature, 443, No. 7113, 787-795 (2006). 22. D. Pratico, “Evidence of oxidative stress in Alzheimer’s disease brain and antioxidant therapy: lights and shadows,” Ann. New York Acad. Sci., 1147, 70-78 (2008). 23. X. Wang and E. K. Michaelis, “Selective neuronal vulner- ability to oxidative stress in the brain,” Front. Aging Neurosci., 2, 12 (2010). 24. Y. Salyha, V. Rosalovsky, and R. Fedyakov “Glutathione system in erythrocytes of rats intoxicated by chlorpyrifos,” Visn. Lviv Univ. Biol . Ser. [ in Ukrainian], Is . 60, 99-104 (2012). 25. A. Caughlan, K. Newhouse, U. Namgung, et al., “Chlorpyrifos induces apoptosis in rat cortical neurons that is regulated by a balance between p38 and ERK/JNK MAP kinases,” Toxicol. Sci., 78. No. 1, 125-134 (2004). 26. S. J. Garcia, F. J. Seidler, D. Qiao, et al., “Chlorpyrifos targets developing glia: effects on glial fibrillary acidic protein,” Brain Res. Dev. Brain Res., 133, 151-161 (2002). 27. T. Buerli, C. Pellegrino, K. Baer, et al., “Efficient transfection of DNA or shRNA vectors into neurons using magnetofection,” Nat. Protocols, 2, 3090-3101 (2007). 28. A. Ivanov, C. Pellegrino, S. Rama, et al., “Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the ERK activity in cultured rat hippocampal neurons,” J. Physiol., 572. No. 3, 789-798 (2006). 29. C. Pellegrino, O. Gubkina, H. Becq, et al., “Knocking-down of the KCC2 in rat hippocampal neurons increases intracellular chloride concentration and compromises neuronal survival,” J. Physiol., 589, Part 10, 2475-2496 (2011). 30. S. M. Mense, A. Sengupta, C. Lan, et al., “The common insecticides cyfluthrin and chlorpyrifos alter the expression of a subset of genes with diverse functions in primary human astrocytes,” Toxicol. Sci., 93, No. 3, 125-135 (2006). 31. W. Li and J. E. Casida, “Organophosphorus neuropathy target asterase inhibitors selectively block outgrowth of neurite-like and cell processes in cultured cells,” Toxicol. Lett., 98, No. 3, 139-146 (1998). 32. D. Qiao, F. J. Seidler, and T. A. Slotkin, “Developmental neurotoxicity of chlorpyrifos modeled in vitro: comparative effects of metabolites and other cholinesterase inhibitors on DNA synthesis in PC12 and C6 cells,” Environ. Health Perspect., 109, No. 9, 900-913 (2001). 33. D. Qiao, F. J. Seidler, T. A. Slotkin, “Oxidative mechanisms contributing to the developmental neurotoxicity of nicotine and chlorpyrifos,” Toxicol . Appl . Pharmacol. , 206 , No. 1, 17-26 (2006). 34. С. Behl, F. Lezoualc’h, T. Trapp, et al., “Glucocorticoids enhance oxidative stress-induced cell death in hippocampal neurons in vitro,” Endocrinology, 138, No. 1, 101-106 (1997).

Схожі ресурси