Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны

Изучали влияния, которые оказывают на латеральное моторное поведение золотых рыбок-амбидекстров, адаптированных к повторяющейся ротационной стимуляции, аппликация агрегированного бета-амилоида на их маутнеровские нейроны (МН) и длительная вестибулярная стимуляция. Затем с помощью трехмерной гистоло...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2015
Hauptverfasser:	Тирас, Н.Р., Пенькова, Н.А., Безгина, Е.Н., Алилова, Г.А., Мошков, Д.А.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України 2015
Schriftenreihe:	Нейрофизиология
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148177
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны / Н.Р. Тирас, Н.А. Пенькова, Е.Н. Безгина, Г.А. Алилова, Д.А. Мошков // Нейрофизиология. — 2015. — Т. 47, № 2. — С. 136-150. — Бібліогр.: 25 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-148177
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1481772019-02-18T01:23:15Z Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны Тирас, Н.Р. Пенькова, Н.А. Безгина, Е.Н. Алилова, Г.А. Мошков, Д.А. Изучали влияния, которые оказывают на латеральное моторное поведение золотых рыбок-амбидекстров, адаптированных к повторяющейся ротационной стимуляции, аппликация агрегированного бета-амилоида на их маутнеровские нейроны (МН) и длительная вестибулярная стимуляция. Затем с помощью трехмерной гистологической реконструкции определяли объемы правых и левых МН, а также исследовали ультраструктуру специализированных компартментов в возбуждающих синапсах, расположенных на поверхности сомы и латерального и вентрального дендритов этих клеток. Контрольные рыбки в ходе исследования оставались амбидекстрами, и средние объемы правых и левых МН у них были близкими. У рыбки данной группы размеры активных зон (АЗ) химических синапсов на латеральном дендрите были значительно бóльшими у правого нейрона, а на вентральном дендрите – у левого. Подопытные рыбки, подвергнутые указанным выше воздействиям, демонстрировали ярко выраженную латерализацию, хотя средние объемы их правых и левых МН практически не различались. Ультраструктурный анализ особенностей МН такой рыбки показал, что размеры АЗ в химических синапсах на соме и латеральном дендрите у левого МН, ставшего функционально гораздо менее активным, значительно превышали аналогичные показатели в синапсах той же локализации на правом, более активном, нейроне. В синапсах на вентральном дендрите МН размеры АЗ, наоборот, существенно увеличивались у правого нейрона. В смешанных синапсах средние размеры щелевых контактов у контрольных и подопытных особей были одинаковыми независимо от локализации. Обсуждается взаимосвязь функциональной асимметрии МН, проявляемой в латерализации поведения рыбок, и размеров синаптических структур на этих клетках. Вивчали впливи, котрі чинять на латеральну моторну поведінку золотих рибок-амбідекстрів, адаптованих до повторюваної ротаційної стимуляції, аплікація агрегованого бета-амілоїду на їх маутнерівські нейрони (МН) і тривала вестибулярна стимуляція. Далі за допомогою тривимірної гістологічної реконструкції визначали обʼєми правих і лівих МН, а також досліджували ультраструктуру спеціалізованих компартментів у збуджуючих синапсах, розташованих на поверхні соми, латерального та вентрального дендритів цих клітин. Контрольні рибки в перебігу дослідження лишалися амбідекстрами, і середні обʼєми правих і лівих МН у них були близькими. У рибки даної групи розміри активних зон (АЗ) хімічних синапсів на латеральному дендриті були значно більшими у правого нейрона, а на вентральному дендриті – у лівого. Піддослідні рибки, яких піддавали вказаним вище діям, демонстрували яскраво виражену латералізацію, хоча середні обʼєми їх правих і лівих МН практично не розрізнялись. Як показав ультраструктурний аналіз особливостей МН у такої рибки, розміри АЗ у хімічних синапсах на сомі і латеральному дендриті у лівого МН, що став функціонально набагато менш активним, значно перевищували аналогічні показники в синапсах тієї ж самої локалізації на правому, більш активному, нейроні. В синапсах на вентральному дендриті МН розміри АЗ, навпаки, істотно збільшувались у правого нейрона. У змішаних синапсах середні розміри щілинових контактів у контрольних і піддослідних особин були однаковими незалежно від локалізації. Обговорюється взаємозв’язок функціональної асиметрії МН, яка проявляється в латералізації поведінки рибок, і розмірів синаптичних структур на цих клітинах. 2015 Article Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны / Н.Р. Тирас, Н.А. Пенькова, Е.Н. Безгина, Г.А. Алилова, Д.А. Мошков // Нейрофизиология. — 2015. — Т. 47, № 2. — С. 136-150. — Бібліогр.: 25 назв. — рос. 0028-2561 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148177 612.822:597:57.012.4:616-003.821:576.523: 612.833.97 ru Нейрофизиология Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
description	Изучали влияния, которые оказывают на латеральное моторное поведение золотых рыбок-амбидекстров, адаптированных к повторяющейся ротационной стимуляции, аппликация агрегированного бета-амилоида на их маутнеровские нейроны (МН) и длительная вестибулярная стимуляция. Затем с помощью трехмерной гистологической реконструкции определяли объемы правых и левых МН, а также исследовали ультраструктуру специализированных компартментов в возбуждающих синапсах, расположенных на поверхности сомы и латерального и вентрального дендритов этих клеток. Контрольные рыбки в ходе исследования оставались амбидекстрами, и средние объемы правых и левых МН у них были близкими. У рыбки данной группы размеры активных зон (АЗ) химических синапсов на латеральном дендрите были значительно бóльшими у правого нейрона, а на вентральном дендрите – у левого. Подопытные рыбки, подвергнутые указанным выше воздействиям, демонстрировали ярко выраженную латерализацию, хотя средние объемы их правых и левых МН практически не различались. Ультраструктурный анализ особенностей МН такой рыбки показал, что размеры АЗ в химических синапсах на соме и латеральном дендрите у левого МН, ставшего функционально гораздо менее активным, значительно превышали аналогичные показатели в синапсах той же локализации на правом, более активном, нейроне. В синапсах на вентральном дендрите МН размеры АЗ, наоборот, существенно увеличивались у правого нейрона. В смешанных синапсах средние размеры щелевых контактов у контрольных и подопытных особей были одинаковыми независимо от локализации. Обсуждается взаимосвязь функциональной асимметрии МН, проявляемой в латерализации поведения рыбок, и размеров синаптических структур на этих клетках.
format	Article
author	Тирас, Н.Р. Пенькова, Н.А. Безгина, Е.Н. Алилова, Г.А. Мошков, Д.А.
spellingShingle	Тирас, Н.Р. Пенькова, Н.А. Безгина, Е.Н. Алилова, Г.А. Мошков, Д.А. Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны Нейрофизиология
author_facet	Тирас, Н.Р. Пенькова, Н.А. Безгина, Е.Н. Алилова, Г.А. Мошков, Д.А.
author_sort	Тирас, Н.Р.
title	Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны
title_short	Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны
title_full	Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны
title_fullStr	Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны
title_full_unstemmed	Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны
title_sort	изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны
publisher	Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
publishDate	2015
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148177
citation_txt	Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны / Н.Р. Тирас, Н.А. Пенькова, Е.Н. Безгина, Г.А. Алилова, Д.А. Мошков // Нейрофизиология. — 2015. — Т. 47, № 2. — С. 136-150. — Бібліогр.: 25 назв. — рос.
series	Нейрофизиология
work_keys_str_mv	AT tirasnr izmeneniâmotornojasimmetriizolotyhryboksvâzannyesadaptaciejkvestibulârnojstimulâciiiapplikaciejbetaamiloidanamautnerovskienejrony AT penʹkovana izmeneniâmotornojasimmetriizolotyhryboksvâzannyesadaptaciejkvestibulârnojstimulâciiiapplikaciejbetaamiloidanamautnerovskienejrony AT bezginaen izmeneniâmotornojasimmetriizolotyhryboksvâzannyesadaptaciejkvestibulârnojstimulâciiiapplikaciejbetaamiloidanamautnerovskienejrony AT alilovaga izmeneniâmotornojasimmetriizolotyhryboksvâzannyesadaptaciejkvestibulârnojstimulâciiiapplikaciejbetaamiloidanamautnerovskienejrony AT moškovda izmeneniâmotornojasimmetriizolotyhryboksvâzannyesadaptaciejkvestibulârnojstimulâciiiapplikaciejbetaamiloidanamautnerovskienejrony
first_indexed	2025-07-12T18:31:41Z
last_indexed	2025-07-12T18:31:41Z
_version_	1837467024259809280
fulltext	NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2136 УДК 612.822:597:57.012.4:616-003.821:576.523: 612.833.97 Н. Р. ТИРАС1,2, Н. А. ПЕНЬКОВА1, Е. Н. БЕЗГИНА1, Г. А. АЛИЛОВА2, Д. А. МОШКОВ1,2 ИЗМЕНЕНИЯ МОТОРНОЙ АСИММЕТРИИ ЗОЛОТЫХ РЫБОК, СВЯЗАННЫЕ С АДАПТАЦИЕЙ К ВЕСТИБУЛЯРНОЙ СТИМУЛЯЦИИ И АППЛИКАЦИЕЙ БЕТА- АМИЛОИДА НА МАУТНЕРОВСКИЕ НЕЙРОНЫ Поступила 01.02.14 Изучали влияния, которые оказывают на латеральное моторное поведение золотых ры- бок-амбидекстров, адаптированных к повторяющейся ротационной стимуляции, аппли- кация агрегированного бета-амилоида на их маутнеровские нейроны (МН) и длительная вестибулярная стимуляция. Затем с помощью трехмерной гистологической реконструк- ции определяли объемы правых и левых МН, а также исследовали ультраструктуру специализированных компартментов в возбуждающих синапсах, расположенных на поверхности сомы и латерального и вентрального дендритов этих клеток. Контроль- ные рыбки в ходе исследования оставались амбидекстрами, и средние объемы правых и левых МН у них были близкими. У рыбки данной группы размеры активных зон (АЗ) химических синапсов на латеральном дендрите были значительно бóльшими у правого нейрона, а на вентральном дендрите – у левого. Подопытные рыбки, подвергнутые ука- занным выше воздействиям, демонстрировали ярко выраженную латерализацию, хотя средние объемы их правых и левых МН практически не различались. Ультраструктур- ный анализ особенностей МН такой рыбки показал, что размеры АЗ в химических си- напсах на соме и латеральном дендрите у левого МН, ставшего функционально гораздо менее активным, значительно превышали аналогичные показатели в синапсах той же локализации на правом, более активном, нейроне. В синапсах на вентральном дендрите МН размеры АЗ, наоборот, существенно увеличивались у правого нейрона. В смешан- ных синапсах средние размеры щелевых контактов у контрольных и подопытных осо- бей были одинаковыми независимо от локализации. Обсуждается взаимосвязь функци- ональной асимметрии МН, проявляемой в латерализации поведения рыбок, и размеров синаптических структур на этих клетках. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: золотая рыбка, маутнеровские нейроны (МН), адаптация, бета-амилоид Aβ25–35, вестибулярная стимуляция, химические и смешанные синап- сы, специализированные синаптические контакты. 1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Моск. обл. (РФ). 2 Федеральное государственное бюджетное общеобразовательное учреждение Пущинский государственный естественнонаучный институт Министерства образования и науки РФ (РФ). Эл. почта: ntiras@rambler.ru (Н. Р. Тирас). ВВЕДЕНИЕ Маутнеровские нейроны (МН) золотой рыбки – хо- рошо идентифицируемые парные нейроны продол- говатого мозга, находящиеся под контролем стато- акустического и зрительного аппаратов и органа боковой линии [1]. Эти клетки представляют со- бой уникальный объект для различных нейробио- логических исследований. Они образуют команд- ный центр, определяющий сенсорно-моторные взаимоотношения и управляющий жизненно важ- ным компонентом поведения рыбок – совершени- ем поворотов во время плавания. Такие повороты являются важнейшим моторным феноменом при выполнении реакций избегания; они, естествен- но, реализуются и в условиях свободного поведе- ния, без воздействия каких-либо внешних стиму- лов [2, 3]. Активация одного из МН в результате унилатеральной сенсорной стимуляции иницииру- ет опосредуемый активностью спинальных мото- нейронов поворот рыбки в сторону, противополож- ную стороне локализации такого активированного МН в мозгу [1, 4]. Данный феномен послужил ос- NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2 137 ИЗМЕНЕНИЯ МОТОРНОЙ АСИММЕТРИИ ЗОЛОТЫХ РЫБОК, СВЯЗАННЫЕ С АДАПТАЦИЕЙ новой для разработки методики косвенной оценки уровня функциональной активности МН по коли- честву поворотов, совершаемых рыбкой в ходе ло- комоции (плавания) [5]. Впоследствии с использо- ванием подобного подхода у рыбок была выявлена моторная асимметрия – предпочтение разных осо- бей поворачиваться в ту или другую сторону в ус- ловиях спонтанного движения [6, 7]. В норме при исследованиях морфологического строения левого и правого МН, их ультраструктуры и, по-видимому, регионального распределения медиаторов [1] и си- напсов разного типа [8] на сегодняшний день фак- тически обнаружено только одно различие между двумя МН, которое может объяснить предпочте- ние совершать повороты в определенную сторону. Функционально доминирующий МН, расположен- ный контралатерально относительно предпочитае- мой стороны поворота, имеет больший объем, чем другой, зеркально расположенный парный нейрон, менее активный в тех или иных условиях. По су- ществующим представлениям, именно более ча- стая спонтанная активация первого из упомянутых МН инициирует повороты рыбки в соответствую- щую сторону [3, 7]. Характерная для нормы прямая корреляция между моторной асимметрией золотой рыбки и структурной асимметрией ее МН сохра- няется и после физиологических воздействий, из- меняющих функциональное состояние этих ней- ронов, в том числе обусловливающих адаптацию к утомляющей сенсорной стимуляции [9]. Известно, что баланс возбудимости нейронов ре- гулируется на синаптическом уровне [10]. Однако вклад размеров специализированных компартмен- тов афферентных возбуждающих синапсов, распо- ложенных на разных отделах правого и левого МН, как фактора, являющегося возможной причиной моторной асимметрии, до настоящего времени не исследовался. Мы предприняли попытку провести такое сравнительное исследование. Для получения однозначных количественных результатов были ис- пользованы МН золотой рыбки, максимально вы- равненные между собой по структуре и функции. Экспериментально это достигалось, во-первых, тем, что среди особей одного выклева были выбра- ны рыбки-амбидекстры с отсутствием предпочте- ния стороны поворота при плавании. Во-вторых, у них предварительно индуцировали состояние адап- тации с помощью ротационной стимуляции, повто- ряющейся в тренировочном режиме. Известно, что в результате подобной адаптации к влияниям рота- ционной стимуляции, воздействующей преимуще- ственно на вестибулярный аппарат [7, 9], моторная асимметрия у рыбок сглаживается, а морфофунк- циональные характеристики правого и левого МН в значительной степени выравниваются [5, 7]. Ин- дивидуальные нейроны претерпевают структурную и химическую реорганизацию и приобретают рези- стентность к воздействию утомляющей стимуляции благодаря укреплению цитоскелета, уменьшению размеров активных зон (А3) в афферентных синап- сах и увеличению количества десмосомоподобных контактов (ДПК) [5, 11, 12]. Что особо существенно в данном контексте, различия между интенсивно- стью функциональной активности правого и лево- го МН и интегральным объемом указанных клеток выравниваются; это и лежит в основе модификации их функций при адаптации [7, 13]. В качестве воздействия, которое обусловливает значительную функциональную асимметрию право- го и левого МН и моторную асимметрию рыбки, но вместе с тем существенно не отражается на трех- мерной морфологии данных клеток, может быть ис- пользована аппликация на МН бета-амилоидного пептида (βА25–35) в сочетании с последующей утом- ляющей стимуляцией [14, 15]. С учетом всего упомянутого выше мы провели сравнительное исследование структурных характе- ристик (размеров) специализированных синаптиче- ских контактов афферентных возбуждающих синап- сов, расположенных на разных отделах правого и левого МН, после аппликации на указанные ней- роны фрагмента 25–35 бета-амилоида и ротацион- ной стимуляции. При этом мы старались выявить ультраструктурные корреляты вызываемой такими воздействиями функциональной асимметрии МН, проявляющейся в виде латерализации поведения рыбок. МЕТОДИКА В работе использовали 22 особи золотых рыбок (Carassius auratus) породы оранда трех–шестиме- сячного возраста (длина около 3 см, масса 2 г). Рыб- ки были приобретены в одном из рыборазводных хозяйств Москвы; они являлись потомками одних и тех же производителей, причем сибсами (особями одного выклева). Каждую рыбку содержали в от- дельных аквариумах объемом 1 л при одинаковых условиях аэрации, освещения и кормления. Для экспериментов на основе результатов тестирования латерализации двигательного поведения в узком NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2138 Н. Р. ТИРАС, Н. А. ПЕНЬКОВА, Е. Н. БЕЗГИНА и др. прямолинейном канале были предварительно ото- браны только рыбки-амбидекстры [6]. К таковым относили особей, которые при спонтанном движе- нии равновероятно поворачивались вправо и вле- во. Значения коэффициента моторной асимметрии (КМА) таких рыбок составляли от 0.45 до 0.55 [6]. В качестве сенсорной стимуляции использова- ли короткие (от 1 до 60 мин) тренировочные еже- суточные и длительные (2 ч) однократные про- верочные вращения рыбок одновременно вокруг длинной и короткой осей тела, что специфически воздействовало преимущественно на рецепторы вестибулярного аппарата и органов боковой линии и неспецифически – на зрительный аппарат [5]. Адаптацию к утомляющей вестибулярной стиму- ляции вырабатывали в течение 15 суток с приме- нением сеансов такой стимуляции дважды в день с постепенным нарастанием длительности каждо- го последующего сеанса на 2 мин. Таким образом, первая тренировочная стимуляция в первый день продолжалась 2 мин, а последняя в 15-й день – 60 мин [7, 11]. Часть рыбок оставляли интактны- ми для проведения контрольных экспериментов. После окончания всего цикла тренировки рыбкам давали пятидневный отдых. К данному времени у них окончательно вырабатывалось состояние адап- тации по отношению к утомляющей стимуляции, в чем удостоверялись по существенному усилению резистентности к сеансу продолжительной (дли- тельность 2 ч) проверочной стимуляции. Это выяв- лялось у некоторых особей, случайно выбранных из группы. В ультраструктуре МН таких рыбок из- менения, связанные с предшествующими длитель- ными стимуляциями, исчезали [5]. На шестой день на МН адаптированных рыбок, не подвергнутых тест-стимуляции, апплицирова- ли бета-амилоид βА25–35 (20 мкг в 4 мкл дистилли- рованной воды; “Sigma”, США) или 4 мкл дистил- лированной воды (контроль) и оставляли на ночь. На седьмой день спустя 17 ч после процедуры ап- пликации рыбок подвергали утомляющей вести- булярной стимуляции длительностью 2 ч (тест- стимуляции). Функциональное состояние правого и левого МН оценивали косвенно, соответственно значениям КМА, вычисленным на основе результа- тов поведенческих тестов [6]. Эти значения опре- деляли, наблюдая латеральное поведение рыбки в узком прямолинейном канале и вычисляя средние отношения числа поворотов рыбки в узком прямо- линейном канале в предпочитаемую сторону за 5 мин к сумме чисел поворотов в обе стороны. Та- кие измерения по каждой рыбке производили мно- гократно в течение недели. Для проведения морфологических и морфоме- трических исследований использовали процеду- ры фиксации, минимизирующие усадку ткани [16]. Для этого участок продолговатого мозга, содержа- щий в себе МН, погружали в формальдегидно-глу- таральдегидный фиксатор на какодилатном буфере и в раствор четырехокиси осмия, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и абсолют- ном ацетоне и заключали в эпон [16]. После трех- мерной реконструкции МН по серийным гистоло- гическим срезам толщиной 3 мкм, выполняемой с помощью специальных компьютерных программ, отбирали МН, у которых были сохранены без су- щественных повреждений основные отделы правой и левой клеток (сома и проксимальные отделы лате- рального и вентрального дендритов) [17]. Результа- ты трехмерной реконструкции нейронов подверга- ли анализу для выявления структурной асимметрии данных клеток. Для этого определяли суммарные объемы правого и левого нейронов как сумму объ- емов стволов латерального и вентрального дендри- тов (до первой бифуркации) и сомы. Затем вычис- ляли коэффициент структурной асимметрии (КСА) как отношение интегрального объема доминант- ного (контралатерального) МН, обеспечивающего инициацию поворотов тела в предпочитаемую сто- рону, к сумме объемов обоих нейронов. Известно, что существует тесная прямая корре- ляция между значениями КМА рыбки и КСА их МН [4]. После проведения процедуры реконструкции целостных клеток (без участков дендритных дере- вьев, образованных мелкими веточками, которые не идентифицировались при используемом методе до- статочно удовлетворительно) индивидуальные ги- стологические срезы отдельных интересующих нас участков каждого из нейронов (сомы, латерального и вентрального дендритов) применяли для ультра- структурных исследований. Для ультраструктурно- го анализа ввиду крайне большого объема работы при использовании техники прицельной электрон- ной микроскопии отбирали случайным образом лишь одну рыбку из трех контрольных и одну из трех подопытных особей. Предполагалось, что вы- бранные особи были типичными по всем критери- ям, характерным для группы в целом. Срезы пере- клеивали на специально приготовленные эпоновые столбики, затачивали последние на пирамидку для получения выбранного участка определенного от- дела нейрона, и изготавливали ультратонкие срезы, NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2 139 ИЗМЕНЕНИЯ МОТОРНОЙ АСИММЕТРИИ ЗОЛОТЫХ РЫБОК, СВЯЗАННЫЕ С АДАПТАЦИЕЙ используя ультрамикротом “Leica EM UC6” (ФРГ). Исследовали ультраструктуру возбуждающих синапсов химического и смешанного типа, распо- ложенных на упомянутых участках нейронов. Со- гласно принятым морфологическим критериям, воз- буждающие химические синапсы содержат в себе одновременно АЗ, место выброса медиатора и ДПК, а смешанные синапсы – щелевой контакт (ЩК) и ДПК [5, 11, 12, 18]. В настоящей работе особен- ности взаимодействия возбуждающих и тормозных афферентных синапсов с вентральным дендритом, обнаруженного недавно [19], не учитывали; иссле- довали только состояние возбуждающих синапсов, надежно идентифицируемых в случайных срезах. Данные, касающиеся тормозных синапсов, не со- бирали по причине того, что такие синапсы, как оказалось, подвержены значительным изменени- ям при выработке адаптации. Это затрудняет полу- чение точных количественных результатов; к тому же тормозные синапсы трудно идентифицируются сами по себе. Размеры их АЗ на данном этапе раз- вития техники электронной микроскопии адекват- но измерить затруднительно, поскольку указанные образования расположены не только на стволе ден- дрита, но и на поверхности гребешков, глубоко ин- вагинированных в синаптический бутон, часто раз- ветвленных и причудливо изогнутых. Ввиду этого случайные сечения АЗ тормозных синапсов досто- верно не отражают истинной протяженности всей АЗ [19–21]. Морфометрические измерения проводили на оцифрованных с помощью сканера Epson V700 (“Seiko”, Япония) электронных микрофотографи- ях, полученных при увеличении ×14000 (микроскоп “Tesla BS-500”, Чехословакия). Для измерений и обработки данных использовали специальную про- грамму морфометрического анализа изображений (“Plana”, разработка А. А. Деева, ИТЭБ РАН), что позволяло оценить с достаточной точностью ли- нейные размеры и площади исследуемых объектов. Помимо измерения длин сечений каждого специ- ализированного контакта определяли площадь и периметр пре- и постсинаптической частей элек- тронноплотного вещества ДПК. Эти данные ис- пользовали для определения фактора формы ДПК. Достоверность различий средних арифметиче- ских значений длин специализированных контактов устанавливали по критерию Стьюдента, сравнивая синапсы, локализованные на соответствующих от- делах правого и левого нейронов. Более подробно методика подготовки материала для проведения исследований была описана ранее [12, 15, 16]. РЕЗУЛЬТАТЫ Результаты исследования моторной асимметрии контрольных рыбок свидетельствовали о том, что показатели КМА меняются после того или иного воздействия на МН поэтапно в относительно не- большом диапазоне (табл. 1; 2). Статистический анализ данных по нескольким рыбкам, имеющим средний исходный КМА 0.56 ± 0.08, выявил, что по- сле адаптации упомянутый показатель если и изме- нялся, то очень незначительно, а после аппликации дистиллированной воды и последующей вестибу- лярной стимуляции сдвиги практически отсутство- вали (0.56 ± 0.10 и 0.54 ± 0.05 соответственно). Та- кие результаты указывают на то, что латеральное поведение рыбок на всем протяжении эксперимен- та практически не изменялось. В таблицах одно- временно приведены значения объемов отдельных частей и суммарных объемов МН индивидуальных рыбок из разных экспериментальных групп. Вид- но, что, несмотря на некоторые индивидуальные вариации полученных морфометрических показа- телей (усредненного объема индивидуальных ча- стей и суммарного объема нейронов), адаптация, аппликация дистиллированной воды и последую- щая длительная вестибулярная стимуляция не при- водят к существенным изменениям. Между кон- тралатеральным и ипсилатеральным нейронами в среднем сохраняется относительная симметрия, свойственная рыбкам-амбидекстрам (КСА = 0.48 ± ± 0.10). У подопытных рыбок аппликация бета-амилои- да на МН изменяла их моторную асимметрию по сравнению с исходным значением. Средний КМА возрастал от 0.52 ± 0.04 до 0.65 ± 0.10, а последую- щая стимуляция дополнительно обостряла данную асимметрию (соответствующее значение увеличи- валось до 0.75 ± 0.10; < 0.05 при сравнении с кон- тролем). Таким образом, поведение рыбок заметно и стойко латерализовалось уже на стадии воздей- ствия бета-амилоида. Важно подчеркнуть, что КСА их МН оставался типичным для рыбок-амбидек- стров (в среднем 0.47 ± 0.08). Для электронномикроскопического исследования (табл. 2), как уже упоминалось, были случайным образом отобраны по одной рыбке из контрольной (рис. 1, А) и подопытной (Б) групп. Каждая из этих NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2140 Н. Р. ТИРАС, Н. А. ПЕНЬКОВА, Е. Н. БЕЗГИНА и др. особей имела характеристики, типичные для своей группы. Так, КМА контрольной рыбки до адаптиру- ющей стимуляции равнялся 0.53, а после нее и по- следующей аппликации дистиллированной воды и длительной стимуляции приобретал значение 0.49. Очевидно, что рыбка оставалась амбидекстром. Проведенное морфометрическое исследование ее МН по результатам трехмерной реконструкции и сопоставление объемов левого и правого нейронов позволили установить следующее. Во-первых, по абсолютным величинам размеры адаптированных МН дó и после стимуляции изменялись, но сохраня- ли значения, близкие к многократно наблюдавшим- ся в экспериментах по адаптации [7]. Это согласо- вывалось с многочисленными данными наблюдений предыдущих лет [13]. Во-вторых, структурная асимметрия МН несколько обострялась; по срав- нению с усредненным контролем среднее значение КСА (0.57) немного превышало величины, обычно наблюдаемые в таких случаях и характерные для рыбок-амбидекстров (0.45–0.55). Это превышение, однако, не было существенным, и упомянутый по- казатель оставался в пределах экспериментально- го разброса. Такие данные подтверждают вывод о Т а б л и ц а 1. Морфофункциональные показатели маутнеровских нейронов (МН) адаптированных к вестибулярной стимуляции рыбок, не подвергавшихся утомляющей вестибулярной стимуляции Т а б л и ц я 1. Морфофункціональні показники маутнерівських нейронів адаптованих до вестибулярної стимуляції рибок, яких не піддавали стомлюючій вестибулярній стимуляції Рыбки согласно моторному поведению МН Объем МН (тыс. мкм3) КМА КСА сома ЛД ВД Σ одного МН Σ двух МН дó аппликации после аппликации Группа контрольных рыбок Левша К 188 30 40 258 550 0.5 0.49 0.47 И 167 68 57 292 Левша К 180 32 31 243 536 0.64 0.66 0.45 И 190 49 54 293 Левша К 170 30 36 236 525 0.63 0.57 0.45 И 172 40 77 289 Правша К 141 40 20 201 441 0.43 0.68 0.46 И 158 45 37 240 Правша К 150 43 33 226 522 0.58 0.52 0.43 И 180 59 57 296 Среднее К 166 ± 17 35 ± 5 32 ± 6* 233 ± 19* 515 ± 137 0.56 ± 0.08 0.58 ± 0.07 0.45 ± 0.01 И 173 ± 10 52 ± 10 56 ± 12 282 ± 21 Группа подопытных рыбок Левша К 271 38 65 374 779 0.5 0.65 0.48 И 261 50 94 405 Левша К 170 59 26 255 624 0.56 0.75 0.41 И 243 51 75 369 Правша К 186 25 43 254 534 0.5 0.55 0.48 И 174 44 62 280 Среднее К 209 ± 61 41 ± 19 45 ± 22 294 ± 78 646 ± 140 0.52 ± 0.04 0.65 ± 0.1 0.45 ± 0.05 И 226 ± 52 48 ± 4 77 ± 18 351 ± 73 П р и м е ч а н и я. К – контралатеральный, И – ипсилатеральный МН; ЛД и ВД – латеральный и вентральный дендриты соответственно. КМА, КСА – коэффициенты моторной и структурной асимметрии соответственно: ΣМН – суммарные объемы исследованных МН. Звездочками отмечены случаи достоверного отличия от соответствующего значения у ипсилатерального нейрона (P< 0.05). NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2 141 ИЗМЕНЕНИЯ МОТОРНОЙ АСИММЕТРИИ ЗОЛОТЫХ РЫБОК, СВЯЗАННЫЕ С АДАПТАЦИЕЙ том, что в результате адаптации и последующих воздействий асимметрия структуры и функции МН контрольных рыбок сохраняется, а сами нейроны приобретают устойчивость к влиянию утомляющей стимуляции. В отличие от контроля функциональное состоя- ние индивидуальной подопытной рыбки (латерали- зация ее моторного поведения) после аппликации бета-амилоида заметно изменялось, и особь стано- вилась ярко выраженной левшой (табл. 1; 2). Значе- ние ее КМА претерпевало определенные изменения по мере проведения экспериментальных воздей- ствий. До адаптирующей стимуляции КМА у этой особи был равен 0.50. После такого воздействия, а затем аппликации на МН бета-амилоида и дли- тельной стимуляции данный показатель становил- ся равным 0.80, т. е. моторная асимметрия рыбки сильно обострялась. В то же время сравнение объ- емов правого и левого МН показало, что они оста- вались структурно и объемно относительно симме- тричными (КСА был равен 0.47). В данном аспекте эти клетки напоминали МН рыбок-амбидекстров, у которых КСА значительно отличались от значений КМА, изменившихся в результате воздействия бе- та-амилоида и стимуляции. В таком несоответствии структуры и функции, по нашему мнению, прояв- ляется типичный для МН золотой рыбки неспеци- фический эффект аппликации бета-амилоида, отме- ченный ранее при исследовании интактных рыбок и рыбок, которых предварительно подвергали некото- рым воздействиям, меняющим морфофункциональ- ный статус нейронов [15]. Следует отметить некоторые особенности изме- нения структуры (в частности, объемов) МН рыбок Т а б л и ц а 2. Морфофункциональные показатели маутнеровских нейронов (МН) адаптированных к вестибулярной стимуляции рыбок после утомляющей вестибулярной стимуляции Т а б л и ц я 2. Морфофункціональні показники маутнерівських нейронів адаптованих до вестибулярної стимуляції рибок після стомлюючої вестибулярної стимуляції Рыбки согласно моторному поведению МН Объем МН (тыс. мкм3) КМА КСА сома ЛД ВД Σ одного МН Σ двух МН дó аппликации и стимуляции после аппликации и стимуляции Группа контрольных рыбок Правша+ К 162 31 27 220 387 0.65 0.49 0.57 И 96 41 30 167 Правша К 119 59 48 226 477 0.48 0.56 0.47 И 139 49 63 251 Левша К 96 43 20 159 410 0.55 0.58 0.39 И 142 48 61 251 Среднее К 126±38 44±16 32±16 201±43 424±53 0.56±0.1 0.54±0.05 0.48±0.1 И 126±29 46±5 51±21 223±55 Группа подопытных рыбок Левша К 89 31 30 150 387 0.55 0.65 0.39 И 89 92 56 237 Левша* К 119 39 49 207 444 0.50 0.80 0.47 И 116 53 68 237 Правша К 165 90 32 287 527 0.59 0.81 0.54 И 152 41 47 240 Среднее К 124±43 53±36 37±12 215±77 453±80 0.55±0.05 0.75±0.10** 0.47±0.08 И 119±36 62±30 57±12 238±2 П р и м е ч а н и я. +Рыбка, отобранная для электронномикроскопического исследования. Остальные обозначения те же, что и в табл. 1. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2142 Н. Р. ТИРАС, Н. А. ПЕНЬКОВА, Е. Н. БЕЗГИНА и др. контрольной и подопытной групп, сопровождаю- щие последовательные экспериментальные воздей- ствия. У рыбок интактной группы суммарный объ- ем МН составлял в среднем (680 ± 81)·103 мкм3 [15]. Видно, что после индуцированных трениро- вок, адаптации, контрольной аппликации дистил- лированной воды (растворителя бета-амилоида) и последующей стимуляции объемы нейронов не- сколько уменьшались (примерно на 25 и 20 % со- ответственно). Эти изменения существенно отли- чались от результатов таких же воздействий на МН интактных рыбок (снижения на 55 % [15]). У рыбок подопытной группы адаптация и последующая ап- пликация на их МН бета-амилоида практически не влияли на структуру указанных клеток, суммарный объем которых оставался близким к “интактным” значениям ((646 ± 140)·103 мкм3; табл. 1), а последу- ющая стимуляция вызывала изменение объемов до контрольных величин ((453 ± 80)·103 мкм3, умень- шение на 30 %). Эти значения были гораздо выше, чем при влияниях таких же воздействий на интакт- ные нейроны. В последнем случае средний объ- ем уменьшался до 180·103 мкм3 (снижение на 75 % [15]). Сравнение контрольных и эксперименталь- ных случаев показывает, что адаптация “укрепля- ет” морфофункциональные характеристики МН. А Б ЛД = 31 ЛД = 53 ЛД = 41 ЛД = 39 С = 162 С = 116С = 96 С = 119 К Ж Ж цМН цМН 1 мкм 0.5 мкмА Б К И И ВД = 27 ВД = 68 ВД = 30 ВД = 49Σк = 220·103 мкм3 Σи = 237·103 мкм3 Σи = 167·103 мкм3 Σк = 207·103 мкм3 Р и с. 1. Маутнеровские нейроны (МН) золотых рыбок, адаптированных к вестибулярной стимуляции, после аппликации бета- амилоида и утомляющей вестибулярной стимуляции (объемная реконструкция по серийным гистологическим срезам). А – контрольные МН после аппликации растворителя (дистиллированной воды); Б – экспериментальные МН после аппликации бета-амилоида. С – сома, ВД и ЛД – вентральный и латеральный дендриты соответственно; К, И – контра- и ипсилатеральный нейроны соответственно. Стрелкой указаны участоки МН; показаны также объемы соответствующего участка (тыс. мкм3). Σк и Σи – суммарные объемы контра- и ипсилатерального МН соответственно. Р и с. 1. Маутнерівські нейрони золотих рибок, адаптованих до вестибулярної стимуляції, після аплікації бета-амілоїду та стомлюючої вестибулярної стимуляції (об’ємна реконструкція за серійними гістологічними зрізами). Р и с. 2. Ультраструктура цитоплазмы маутнеровских нейронов (МН) адаптиро- ванных золотых рыбок после аппликации и длительной ве- стибулярной стимуляции. А – контрольный препарат (после аппликации дистил- лированной воды); Б – экспе- риментальный препарат (по- сле аппликации бета-амилои- да). Ж – «жгуты» актиновых филаментов (указаны стрел- ками); цМН – цитозоль МН. Р и с. 2. Ультраструктура цитоплазми маутнерівських нейронів адаптованих зо- лотих рибок після аплікації і тривалої вестибулярної стимуляції. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2 143 ИЗМЕНЕНИЯ МОТОРНОЙ АСИММЕТРИИ ЗОЛОТЫХ РЫБОК, СВЯЗАННЫЕ С АДАПТАЦИЕЙ Эффект адаптации МН контрольных и подопыт- ных рыбок подтверждался и на ультраструктурном уровне. В обоих нейронах, левом и правом, у обеих исследованных рыбок морфологические корреляты функционального истощения после утомляющей стимуляции отсутствовали. Синаптические бутоны были наполнены везикулами, цитоскелет и другие клеточные структуры имели нормальное строение. Специфическим признаком адаптированного состо- яния нейрона служило наличие в соматической ци- топлазме “жгутов” из пучков филаментов (рис. 2, А, Б). Следует отметить некоторые различия орга- низации цитоскелета МН в контроле и опыте, про- являющиеся на качественном уровне. У подопыт- ной рыбки цитоскелет правого нейрона, ставшего функционально доминантным после воздействия бета-амилоида и стимуляции, характеризовался бо- лее плотной упаковкой элементов и ввиду этого вы- глядел более электронноплотным по сравнению с цитоскелетом левого (функционально субдоминант- ного) “двойника”. Остальные качественные особенности морфоло- гии, такие как образование складок ядерной обо- лочки в виде протяженных выростов, заходящих в цитоплазму, и инвагинаций цитоплазмы внутрь ядра (не иллюстрируется), наличие миелиновых фигур разных размеров, некоторое увеличение раз- меров гладкого эндоплазматического ретикулума, являются, по нашему мнению, следствием струк- турно-химической перестройки нейронов, которая обеспечивает достижение ими типичных для адап- тации характеристик. Эти изменения были неодно- кратно описаны ранее [5, 11, 12]. Все применен- ные экспериментальные воздействия не оказывали влияний на ультраструктуру специализированных синаптических контактов в химических синапсах, расположенных на разных участках правого и ле- вого МН обеих рыбок (рис. 3; 4). Результаты морфометрического исследования специализированных контактов афферентных воз- буждающих аксо-соматических и аксо-дендритных синапсов МН контрольной рыбки представлены в табл. 3. Анализ средних значений показал, что в хи- мических синапсах, локализованных на латераль- ном дендрите левого нейрона, величина АЗ была в среднем на 25 % меньше, а на вентральном ден- дрите – на 50 % больше, чем величина АЗ в си- напсах, локализованных, соответственно, на тех же дендритах правого нейрона. Размеры ДПК в хи- мических синапсах на левом и правом нейронах не отличались друг от друга и не проявляли связи с локализацией этих синапсов. Не было обнаруже- но и различий площади и периметра пре- и пост- синаптических частей электронноплотного веще- ства ДПК, а также фактора формы ДПК (в таблице не представлено). Длины сечения ДПК смешан- Т а б л и ц а 3. Морфометрические показатели специализированных компартментов афферентных синапсов маутнеровских нейронов контрольной рыбки (коэффициенты моторной и структурной асимметрии 0.49 и 0.57 соответственно) Т а б л и ц я 3. Морфометричні показники спеціалізованих компартментів аферентних синапсів маутнерівських нейронів контрольної рибки (коефіцієнти моторної та структурної асиметрії 0.49 і 0.57 відповідно) Отдел нейрона, КСА Синапсы с конкретным нейроном Объем нейрона (тыс. мкм3) Химические синапсы Смешанные синапсы длина сечения АЗ длина сечения ДПК длина сечения ЩК длина сечения ДПК Сома, 0.63 левым 162 117 ± 7 (103) 126 ± 7 (60) 163 ± 8 (88) 149 ± 8 (60) правым 96 122 ± 12 (36) 127 ± 15 (31) 179 ± 17 (20) 112 ± 10* (25) Латеральный дендрит, 0.43 левым 31 103 ± 7* (56) 136 ± 11 (35) 159 ± 8 (61) 142 ± 8 (68) правым 41 127 ± 8 (84) 121 ± 6 (54) 166 ± 9 (55) 144 ± 7 (79) Вентральный дендрит, 0.47 левым 27 154 ± 14* (35) 133 ± 11 (22) 188 ± 10 (86) 152 ± 7 (105) правым 31 101 ± 6 (73) 123 ± 9 (50) 168 ± 8 (97) 131 ± 6* (126) П р и м е ч а н и я. В скобках указано количество исследованных структур. Приведены значения средних арифметических ± ошибка среднего (нм). АЗ – активная зона; ДПК – десмосомоподобный, ЩК – щелевой контакты. Звездочками отмечены случаи достоверного отличия от значения у аналогичной специализированной структуры соответствующего отдела парного нейрона (Р<0.05). NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2144 Н. Р. ТИРАС, Н. А. ПЕНЬКОВА, Е. Н. БЕЗГИНА и др. Р и с. 3. Ультраструктура афферентных синапсов (обозначены фигурными скобками), расположенных на разных дендритах право- го и левого маутнеровских нейронов (МН) адаптированных золотых рыбок, после аппликации дистиллированной воды и длитель- ной вестибулярной стимуляции. А, В – специализированные синаптические контакты на левом, Б, Г – на правом МН. лЛД и пЛД – левый и правый латеральные дендриты; лВД и пВД – левый и правый вентральные дендриты соответственно; АЗ – активная зона; ДПК – десмосомоподобный контакт. Р и с. 3. Ультраструктура аферентних синапсів (позначені фігурними дужками), розташованих на різних дендритах правого та лівого маутнерівських нейронів адаптованих золотих рибок після аплікації дистильованої води і тривалої вестибулярної стимуляції. ДПК ДПК АЗ АЗ лЛД лВД пЛД пВД [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ 0.5 мкмА Б ГВ 0.5 мкм 0.5 мкм0.5 мкм АЗ АЗ ДПК ДПК Т а б л и ц а 3. Морфометрические показатели специализированных компартментов афферентных синапсов маутнеровских нейронов контрольной рыбки (коэффициенты моторной и структурной асимметрии 0.80 и 0.47 соответственно) Т а б л и ц я 4. Морфометричні показники спеціалізованих компартментів аферентних синапсів маутнерівських нейронів піддослідної рибки (коефіцієнти моторної та структурної асиметрії 0.80 і 0.47 відповідно) Отдел нейрона, КСА Синапсы с конкретным нейроном Объем нейрона, (тыс. мкм3) Химические синапсы Смешанные синапсы длина сечения АЗ длина сечения ДПК длина сечения ЩК длина сечения ДПК Сома, 0.51 левым 116 105 ± 7 (65) 113 ± 8 (64) 152±15 (32) 146±10 (44) правым 119 85 ± 3* (146) 110 ± 6 (104) 143±9 (78) 119±6* (90) Латеральный дендрит, 0.42 левым 53 106 ± 5 (95) 148 ± 18 (61) 165±10 (61) 154±10 (81) правым 39 79 ± 4* (42) 106 ± 10* (20) 182±7 (105) 170±8 (118) Вентральный дендрит, 0.42 левым 68 72 ± 3 (49) 107 ± 8 (29) 171±8 (108) 136±7 (129) правым 49 125 ± 9* (47) 101 ± 5 (32) 186±12 (49) 130±8 (49) П р и м е ч а н и е. Обозначения те же, что и в табл. 3. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2 145 ИЗМЕНЕНИЯ МОТОРНОЙ АСИММЕТРИИ ЗОЛОТЫХ РЫБОК, СВЯЗАННЫЕ С АДАПТАЦИЕЙ Р и с. 4. Ультраструктура афферентных синапсов, расположенных на разных ден- дритах правого и левого маутнеровских нейронов (МН) адаптированных золотых рыбок после аппликации бета-амилоида и длительной вестибулярной стимуляции. А, В и Б, Г – специализированные синаптические контакты на левом и правом МН соответственно. Обозначения те же, что и на рис 3. Р и с. 4. Ультраструктура аферентних синапсів, розташованих на різних дендри- тах правого та лівого маутнерівських нейронів адаптованих золотих рибок, після аплікації бета-амілоїду і тривалої вестибулярної стимуляції. [ [ [ [ [[ [ [ [ [ [ [ ] [ [ [ ВБА Г 0.2 мкм 0.2 мкм 0.2 мкм 0.5 мкм АЗ АЗ АЗ АЗ лЛД пЛД лВД ДПК ДПК ДПК ДПК [ [ [ [ АЗ ДПК пВД ных синапсов, локализованных на соме и вентраль- ном дендрите левого нейрона, были достоверно бóльшими, чем длины ДПК в синапсах тех же отде- лов правого нейрона. ЩК имели одинаковую про- тяженность у обоих нейронов независимо от места локализации смешанных синапсов. Морфометрический анализ выявил достоверные различия между длинами АЗ химических синапсов, локализованных на правом и левом нейронах под- опытной рыбки (табл. 4). На соме и латеральном дендрите правого (функционально доминантного) нейрона сечения АЗ оказались существенно короче (на 20 и 25 % соответственно), а сечения АЗ синап- сов, расположенных на вентральном дендрите того же нейрона, – более чем на 70 % длиннее, чем у ле- вого нейрона. Размеры специализированных ДПК также заметно различались. В химических синапсах на латеральном дендрите правого нейрона эти струк- туры были короче почти на 40 %, а в смешанных си- напсах на соме – более чем на 20 % по сравнению с аналогичными значениями у левого нейрона. Так же, как и в контроле, не обнаруживалось различий размеров ЩК в смешанных синапсах, расположен- ных на всех исследованных участках сомы и обоих дендритов правого и левого МН подопытной рыбки. ОБСУЖДЕНИЕ Ранее было установлено, что аппликации фрагмен- та 25–35 бета-амилоида приводят к существенным NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2146 Н. Р. ТИРАС, Н. А. ПЕНЬКОВА, Е. Н. БЕЗГИНА и др. изменениям трехмерной структуры МН и объемных пропорций их отделов [15]. Правомерным пред- ставлялось следующее допущение (подтвердивше- еся позже). Изменения при подобном воздействии отчасти могут быть связаны с деструкцией цито- скелета [22] и в целом могут оказаться неспеци- фической реакцией нейронов на воздействие бета- амилоида. Было также обнаружено, что в данном случае свойственная интактным рыбкам отчетли- вая корреляция между морфологической асиммет- рией правого и левого МН и моторной асимметри- ей у подопытных рыбок перестает проявляться и что эти два показателя изменяются разнонаправ- ленно [22]. Предполагалось, что эффект апплика- ции бета-амилоида на МН вызван механическим повреждением клеточных структур, которые опле- таются жесткими “лентами” амилоидного пептида [22]. Как позже выяснилось, негативное влияние бета-амилоида на объемные характеристики МН можно существенно нивелировать, если данным агентом воздействовать на нейроны рыб, предвари- тельно адаптированных (тренированных) в резуль- тате воздействия градуально увеличивающейся по длительности повторной сенсорной стимуляции. Такие процедуры повышают резистентность ука- занных клеток по отношению к утомляющей сти- муляции; при этом возрастает устойчивость к воз- действию бета-амилоида не только трехмерной морфологии, но и ультраструктуры МН [15, 22]. В случае использования подобного подхода пред- ставляется возможность вычленить из неспеци- фического ответа нейрона на механическую трав- му, вызванную формированием бета-амилоидных “лент”, более специфический компонент, ранее не- доступный наблюдению, и понять механизм соот- ветствующего изменения функции нейрона. В проведенной нами работе впервые были ис- следованы характеристики специализированных компартментов возбуждающих синапсов, образую- щих связи отдельно с каждым МН из пары и с его индивидуальными частями, после выработки по- вышенной резистентности к утомлению (адапта- ции) в результате сенсорных тренировок, а также после аппликации на указанные клетки фрагмента бета-амилоида и последующей утомляющей сти- муляции. Нам представляется, что при этом уста- новлены специфические структурные выражения эффектов, вызываемых в адаптированных нейронах данным пептидом как патогенным фактором. Они представляют собой изменение размеров синапти- ческих контактов в синапсах, от функции которых зависит активность индивидуального нейрона. Та- кие изменения структуры сопровождают изменения двигательного поведения – стойкий сдвиг показате- ля моторной асимметрии рыбки. Поэтому логично предполагать наличие связи упомянутых структур- ных изменений в синапсах с модификацией функ- ционального состояния самих нейронов. Ранее мы с достаточной достоверностью опре- делили вклад разных дендритов и сомы в поддер- жание уровня функциональной активности МН и установили причину реципрокности влияний на указанный уровень, обусловленных изменениями в вентральном дендрите, афферентных синапсах и их синаптических контактах в норме и при адапта- ции [4, 19–21]. Рассматривая в свете этих данных результаты, полученные при исследовании поведе- ния контрольных рыбок и ультраструктуры их МН, можно констатировать хорошую согласованность между функциональными поведенческими прояв- лениями, определяемыми активностью нейронов, и особенностями состояния их афферентных си- напсов на разных участках таких клеток. Согласно полученным данным, функциональная активность правого и левого МН в контроле примерно оди- накова, о чем свидетельствовали значения КМА, свойственные рыбкам-амбидекстрам. Сохраняется и коррелирующая с КМА величина КСА МН ука- занной рыбки, также типичная для амбидекстров. На ультраструктурном уровне видно, что в аксо-со- матических синапсах протяженности сечений АЗ и ДПК равны, поэтому влияния соматических частей двух МН на функциональную активность данных клеток можно считать равными. На латеральных дендритах размеры АЗ в аксо-дендритных синап- сах правого нейрона оказались почти на четверть бóльшими, чем аналогичные размеры у левого. Это четкий признак того, что статоакустический вход, оканчивающийся на латеральном дендрите, обу- словливает повышенную активацию в указанном локусе, обеспечивая, таким образом, бóльшую ак- тивность инициирующего повороты влево правого нейрона, т. е. происходит превращение рыбки в лев- шу. Такой вывод основывается на данных о боль- шей эффективности синапсов с более крупными АЗ [23]. В то же время размеры АЗ на левом вентраль- ном дендрите, наоборот, в полтора раза превыша- ли таковые на правом дендрите. Это предполага- ет больший вклад данного дендрита в обеспечение инициации поворотов вправо. В сумме же, види- мо, происходит некое уравновешивание влияния ла- терального дендрита правого МН и влияния вен- NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2 147 ИЗМЕНЕНИЯ МОТОРНОЙ АСИММЕТРИИ ЗОЛОТЫХ РЫБОК, СВЯЗАННЫЕ С АДАПТАЦИЕЙ трального дендрита левого МН. В результате этого активность обоих нейронов становится примерно равной, что и проявляется в выравнивании их роли и организации эквилатерального поведения рыбки, свойственного амбидекстрам. Конечно, для более точного определения функционального веса синап- сов на обоих упомянутых дендритах требуются до- полнительные исследования, выходящие за рамки настоящей работы. Тем не менее, очевидно, что при том соотношении размерностей их АЗ, определен- ных в опыте, синапсы обеспечивают примерно оди- наковое влияние на активность нейронов. В целом эти данные указывают на то, что обнаруженная ра- нее корреляция между размером МН и интенсивно- стью его функциональной активности прослежива- ется и на ультраструктурном уровне. В свете приведенных выше результатов фак- ты, полученные при исследовании поведения по- допытных рыбок и ультраструктуры их МН, сви- детельствуют о том, что согласованность между функциональными проявлениями активности ней- ронов, отражающимися в поведении, и особенно- стями состояния их афферентных синапсов, лока- лизованных на разных участках, в условиях наших экспериментов определенным образом нарушена. Соответственно приведенным данным, функцио- нальная активность правого и левого МН, относи- тельно симметричная в условиях исходного состо- яния указанной рыбки, начинала после адаптации, аппликации бета-амилоида и длительной вестибу- лярной стимуляции стойко превалировать у одного из нейронов. Об этом можно судить по изменению КМА индивидуальной рыбки, взятой для ультра- структурных исследований; упомянутый индекс достигал значения 0.80. Столь же однообразно, как и случайно выбранная нами для ультраструктур- ных исследований рыбка, ведут себя и другие осо- би данной группы (табл. 1). Объяснением такой вы- раженной однотипной специфичной латерализации функции нейронов под влиянием одинаковых по- следовательно воздействующих возмущающих фак- торов (тренировочных стимуляций, аппликации бе- та-амилоида и длительной стимуляции) может быть врожденная асимметрия влияния нейротрансмит- терных систем, управляющих функцией МН. Дан- ный фактор до настоящего времени не изучен; вы- яснение его природы выходит за рамки настоящей работы и требует дополнительных специальных ис- следований. Единственным значительным отклонением раз- мерности синаптических контактов, способным вы- звать функциональную асимметрию между правым и левым МН (или являться ее исходной причиной), было почти двукратное превышение протяженно- сти АЗ в афферентных синапсах на вентральном дендрите правого нейрона. Согласно нашим пред- ставлениям, именно такая особенность делает этот нейрон функционально доминирующим [4]. Кста- ти, отметим еще одну существенную деталь, ука- зывающую на вовлечение упомянутого дендрита МН данной подопытной рыбки в реакцию на со- четанное воздействие сеансов адаптирующих сти- муляций, аппликации бета-амилоида и длительной вестибулярной стимуляции. Размеры этого дендри- та становились почти в полтора раза меньше, чем у дендрита противоположного зеркально располо- женного МН. Если учесть реципрокный характер отношений между размерами вентрального ден- дрита и функциональной активностью МН, а так- же особенности взаимодействия возбуждающих хи- мических синапсов с вентральным дендритом [4, 7, 21, 24], рыбка согласно указанному признаку долж- на быть левшой, что и наблюдалось в действитель- ности. В то же время следует помнить, что этот дендрит находится под преобладающим влиянием зрительного афферентного входа. Последний в ус- ловиях вестибулярных стимуляций, многократно используемых нами в данной работе, специфиче- ски не затрагивался. Однако следы такой стимуля- ции видны при анализе ультраструктуры синапсов, локализованных на соме и латеральных дендритах, что соответствует расположению статоакустиче- ского афферентного входа к МН (табл. 3). АЗ в си- напсах статоакустического афферентного входа на левом нейроне были соответственно на 20 и 34 % крупнее, чем таковые на правом, доминантном. Это означает, что влияние подобных синапсов на сому, латеральный дендрит и на левый МН в целом долж- но быть более интенсивным, чем влияние таких же синапсов на правом, доминантном, нейроне. Иными словами, влияния статоакустического входа на ле- вый субдоминантный МН должны противодейство- вать последнему влиянию и, казалось бы, сглажи- вать асимметрию, чего не наблюдается. Видимо, здесь мы обнаруживаем структурные свидетельства самонастройки адаптированных нейронов, направленной на противодействие вли- яниям амилоида, с одной стороны, и поддержание гомеостаза возбуждения на фоне длительной сти- муляции – с другой. Мы предполагаем, что у МН это обеспечивается воздействиями через вентраль- ный дендрит, находящийся под контролем зрения, NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2148 Н. Р. ТИРАС, Н. А. ПЕНЬКОВА, Е. Н. БЕЗГИНА и др. и расположенные на нем возбуждающие синапсы. Выявленные структурные перестройки совместно противодействуют неспецифическим изменениям, вызванным в синапсах на латеральном дендрите и соме аппликацией бета-амилоида и последующей стимуляцией данного входа. Это, очевидно, сохра- няет у рыбки нормальное адекватное двигательное поведение. Для изучения химизма соответствую- щих феноменов (а такой химизм в силу специфи- ческой организации возбуждающих и тормозных синапсов на вентральном дендрите [21] весьма не- обычен) требуются дальнейшие исследования, ко- торые выглядят достаточно многообещающими. В результате действия бета-амилоида и длительной вестибулярной стимуляции на адаптированные МН в соответствующих экспериментах возникает об- острение моторной асимметрии. Тем не менее, ввиду наличия эффекта адаптации, в целом стаби- лизирующего состояние нейронов, очевидно, со- храняются базовые соотношения размеров АЗ в воз- буждающих химических синапсах, расположенных на разных отделах клетки. На латеральном дендри- те доминантного нейрона, определяемого соглас- но показателю КМА в контроле (левый нейрон) и в опыте (правый нейрон), размеры АЗ меньше (как и размеры АЗ на соме в опыте), а на вентральном дендрите – больше, чем у субдоминантного нейро- на. Не исключено, что это обусловлено различной нейротрансмиттерной природой синапсов, располо- женных на разных отделах МН. Тем не менее, та- кую особенность, отражающую состояние специ- ализированных контактов, можно рассматривать в качестве ультраструктурного признака и морфоло- гической, и функциональной асимметрии данных МН. Недавно мы обнаружили, что параллельно с изменениями размеров АЗ и ДПК в возбуждаю- щих синапсах вентрального дендрита существенно уменьшаются также размеры АЗ тормозных синап- сов, расположенных на этих же участках [20, 21]. Таким образом, можно ожидать, что тормозные влияния на вентральный дендрит у адаптированных нейронов ослабляются. Оценка состояния тормоз- ных синапсов у адаптированных нейронов при со- четанном воздействии бета-амилоида и длительной стимуляции (что не входило в задачу настоящей ра- боты) может явиться перспективной темой будущих исследований. Относительно изменений размеров ДПК в сме- шанных синапсах следует высказать следующее. Ранее было выдвинуто предположение, что эти спе- циализированные синаптические контакты обес- печивают электротоническую передачу в условиях блокирования ЩК после длительной стимуляции [25]. Такую роль данные контакты играют благо- даря своей “актиновой” природе (наличию актино- вых мостиков в щели [26], характерных только для ДПК смешанных синапсов [27]), и способности ак- тиновых филаментов проводить ионный ток через мембрану [28]. Поэтому можно предположить, что изменчивость размеров ДПК связана с вариациями их электротонической проводимости. Вместе с тем электротоническая сигнализация служит для ини- циации быстрого ответа МН при реализации реф- лекса активного избегания, вызванного испугом [1, 29]. Вряд ли такая сигнализация имеет прямое от- ношение к длительной латерализации функции МН, связанной с инициацией поворотов рыбки в усло- виях свободного движения. Скорее модификация подобной сигнализации является компенсаторной реакцией нейронов, вырабатываемой в процессе адаптации; механизмы последней пока остаются недостаточно изученными. В целом следует признать, что результаты дей- ствия бета-амилоида и длительной стимуляции на ультраструктуру МН адаптированных рыбок оказа- лись не столь драматичными по сравнению с эф- фектами повреждений, обусловленными изолиро- ванной аппликацией бета-амилоида на интактные МН и описанными недавно [22]. Все стадии проведенной работы соответствовали по- ложениям Европейской Конвенции о защите животных, которые используются для исследовательских и иных научных целей (86/609/ЕЕС, 1986, Страсбург) и норма- тивам Комитетов по этике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН и Пущинского государ- ственного естественнонаучного института Министерства образования и науки РФ, В процессе проведения работы отсутствовали конфликты любого рода, касающиеся коммерческих или финансовых отношений, отношений с организациями или лицами, которые каким-либо образом могли быть связаны с иссле- дованием, и взаимоотношений соавторов статьи – Н. Р. Ти- рас, Н. А. Пеньковой, Е. Н. Безгиной, Г. А. Алиловой и Д. А. Мошкова. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2 149 ИЗМЕНЕНИЯ МОТОРНОЙ АСИММЕТРИИ ЗОЛОТЫХ РЫБОК, СВЯЗАННЫЕ С АДАПТАЦИЕЙ Н. Р. Тірас1, Н. А. Пенькова1, Є. Н. Безгіна1, Г. А. Алілова2, Д. А. Мошков1,2 ЗМІНИ МОТОРНОЇ АСИМЕТРІЇ ЗОЛОТИХ РИБОК, ПОВ’ЯЗАНІ З АДАПТАЦІЄЮ ДО ВЕСТИБУЛЯРНОЇ СТИМУЛЯЦІЇ ТА АПЛІКАЦІЄЮ БЕТА-АМІЛОЇДУ НА МАУТНЕРІВСЬКІ НЕЙРОНИ 1 Федеральний державний бюджетний заклад науки Інститут теоретичної та експериментальної біофізики РАН, Пущино, Моск. обл. (РФ). 2 Федеральний державний бюджетний загальноосвітній заклад Пущинський державний природничонауковий інститут Міністерства освіти і науки РФ (РФ). Р е з ю м е Вивчали впливи, котрі чинять на латеральну моторну по- ведінку золотих рибок-амбідекстрів, адаптованих до по- вторюваної ротаційної стимуляції, аплікація агрегованого бета-амілоїду на їх маутнерівські нейрони (МН) і тривала вестибулярна стимуляція. Далі за допомогою тривимірної гістологічної реконструкції визначали обʼєми правих і лі- вих МН, а також досліджували ультраструктуру спеціалізо- ваних компартментів у збуджуючих синапсах, розташованих на поверхні соми, латерального та вентрального дендритів цих клітин. Контрольні рибки в перебігу дослідження ли- шалися амбідекстрами, і середні обʼєми правих і лівих МН у них були близькими. У рибки даної групи розміри актив- них зон (АЗ) хімічних синапсів на латеральному дендриті були значно більшими у правого нейрона, а на вентрально- му дендриті – у лівого. Піддослідні рибки, яких піддавали вказаним вище діям, демонстрували яскраво виражену ла- тералізацію, хоча середні обʼєми їх правих і лівих МН прак- тично не розрізнялись. Як показав ультраструктурний ана- ліз особливостей МН у такої рибки, розміри АЗ у хімічних синапсах на сомі і латеральному дендриті у лівого МН, що став функціонально набагато менш активним, значно пере- вищували аналогічні показники в синапсах тієї ж самої ло- калізації на правому, більш активному, нейроні. В синапсах на вентральному дендриті МН розміри АЗ, навпаки, істот- но збільшувались у правого нейрона. У змішаних синапсах середні розміри щілинових контактів у контрольних і під- дослідних особин були однаковими незалежно від локаліза- ції. Обговорюється взаємозв’язок функціональної асиметрії МН, яка проявляється в латералізації поведінки рибок, і роз- мірів синаптичних структур на цих клітинах. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. H. Korn and D. Faber, “The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making?” Neuron, 47, No. 1, 13-12 (2005). 2. J. G. Canfield, “Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated,” J. Comp. Physiol., 193, 1055-1064 (2007). 3. Г. З. Михайлова, В. Д. Павлик, Н. Р. Тирас, Д. А. Мошков, “Корреляция размеров маутнеровских нейронов с пред- почтением золотых рыбок поворачиваться вправо или влево”, Морфология, 127, № 2, 16-19 (2005). 4. D. A. Moshkov, G. Z. Mikhailova, E. E. Grigorieva, and R. S. Shtanchaev, “Role of different dendrites in the functional activity of the central neuron controlling goldfish behavior,” J. Integrat. Neurosci., 8, No. 4, 441-451 (2009). 5. Д. А. Мошков, Адаптация и ультраструктура нейрона, Наука, Москва (1985). 6. Г. З. Михайлова, А. В. Арутюнян, И. М. Санталова и др., “Асимметрия моторного поведения золотой рыбки в узком канале”, Нейрофизиология / Neurophysiology, 37, № 1, 52-60 (2005). 7. Г. З. Михайлова, Н. Р. Тирас, В. Д. Павлик и др., “Морфологические характеристики маутнеровских нейронов золотых рыбок с измененной асимметрией моторного поведения”, Нейрофизиология/Neurophysiology, 38, № 1, 18-31 (2006). 8. Y. Nakajima and K. Kohno, “Fine structure of the Mauthner cell: synaptic topography and comparative study,” in: Neurobiology of the Mauthner Cell, D. Faber and H. Korn (eds.), Raven Press, New York (1978), pp. 133-166. 9. Г. З. Михайлова, Н. Р. Тирас, Е. Е. Григорьева, Д. А. Мошков, “Изменения моторной асимметрии золотой рыбки при адаптации к эффектам ротационной стимуляции”, Нейрофизиология/Neurophysiology, 37, № 5/6, 432-437 (2005). 10. T. P. Vogels, H. Sprekeler, F. Zenke, et al., “Inhibitory plasticity balances excitation and inhibition in sensory pathways and memory networks,” Science, 334, No. 6062, 1569-1573 (2011). 11. И. Б . Михеева , Н. Р. Тирас , Д . А. Мошков, “Десмосомоподобные контакты как мишени действия яда скорпиона”, Цитология, 42, № 7, 635-646 (2000). 12. Н. Р. Тирас, Г. З. Михайлова, Д. А. Мошков, ”Эф- ф е к т ы , в ы з ы в а е м ы е п о л и м е р и зу ю щ и м а к т и н пептидом в маутнеровских нейронах золотой рыбки”, Нейрофизиология/Neurophysiology, 38, № 5/6, 389-399 (2006). 13. Г. З. Михайлова, Исследование морфологии маутнеровских нейронов в связи с ориентационной асимметрией моторного поведения золотой рыбки, Дис. … канд. биол. наук, Пущино (2006). 14. Н. А. Коканова, Г. З. Михайлова, Р. Ш. Штанчаев и др., “Морфофункциональные изменения маутнеровских нейронов золотой рыбки после аппликации бета- амилоида”, Морфология, 136, № 6, 43-47 (2009). 15. Н. А. Коканова, Г. З. Михайлова, Р. Ш. Штанчаев и др., “Индукция морфологической устойчивости нейронов к β-амилоиду”, Морфология, 141, № 1, 23-28 (2012). 16. Г. З. Михайлова, Н. А. Коканова, Н. Р. Тирас, Д. А. Мошков, Трехмерная реконструкция и определение объема нейрона, Кн. дом «ЛИБРОКОМ», Москва (2012). 17. Е. Е. Григорьева, Р. Ш. Штанчаев, Г. З. Михайлова и др., “Корреляция размеров отдельных частей маутнеровского нейрона золотой рыбки с его интегральной функцией после энуклеации глаза”, Морфология, 138, № 6, 10-15 (2010). 18. Д. А. Мошков, Н. Р. Тирас, “Различия цитоскелета в тормозных и возбуждающих синапсах”, Цитология, 29, № 2, 156-160 (1987). 19. И. Б. Михеева, Е. Е. Григорьева, Г. З. Михайлова и др., “Серотонинергические синапсы на вентральном дендрите маутнеровского нейрона (ультраструктурное исследование с использованием иммунозолотой метки)”, Морфология, NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 2150 Н. Р. ТИРАС, Н. А. ПЕНЬКОВА, Е. Н. БЕЗГИНА и др. 143, № 1, 11-15 (2013). 20. И. Б. Михеева, Р. Ш. Штанчаев, Н. А. Коканова и др., “Ультраструктура афферентных синапсов на вентральном дендрите маутнеровского нейрона при адаптации золотой рыбки к оптокинетической стимуляции”, Морфология, 143, № 2, 18-33 (2013). 21. D. A. Moshkov, R. S. Shtanchaev, I. M. Mikheeva, et al., “Visual input controls the functional activity of gold- fish Mauthner neuron through the reciprocal synaptic mechanism,” J. Integrat. Neurosci., 12, No. 1, 17-33 (2013). 22. Н. А. Коканова, Г. З. Михайлова, Р. Ш. Штанчаев и др., “Морфофункциональные и ультраструктурные последствия аппликации бета-амилоида на маутнеровские нейроны золотой рыбки”, Нейрофизиология/Neurophysiology, 46, № 1, 37-47 (2014). 23. K. S. Liu, M. Siebert, S. Mertel, et al., “RIM-binding protein, a central part of the active zone, is essential for neurotransmitter release,” Science, 334, No. 6062, 1565-1569 (2011). 24. Р. Ш. Штанчаев, Г. З. Михайлова, Н. Ю. Дектярёва и др., “Изменения вентрального дендрита маутнеровского нейрона золотой рыбки под воздействием оптокинетической стимуляции”, Морфология, 132, № 6, 29-34 (2007). 25. Л. Л. Павлик, Е. Н. Безгина, Н. Р. Тирас и др., “Структура смешанных синапсов маутнеровских нейронов при воздействии веществ, изменяющих проводимость щелевых контактов”, Морфология, 125, № 2, 26-31 (2004). 26. Л. Л. Павлик, Н. Р. Тирас, Н. Ф. Мухтасимова и др., “Участие актина в электротонической проводимости смешанных синапсов маутнеровских нейронов золотой рыбки”, Морфология, 123, № 1, 41-47 (2003). 27. Д. А. Мошков, Л. Л. Павлик, Н. Р. Тирас и др., “Ультраструктурные признаки изменений эффективности синаптической передачи через смешанные синапсы маутнеровских нейронов при естественной модификации двигательной функции”, Нейрофизиология/Neurophysiology, 35, № 5, 392-401 (2003). 28. P. A. Grigoriev, Y. S. Tarahovsky, L. L. Pavlik, et al., “Study of F-actin interaction with planar and liposomal bilayer phospholipid membranes,” IUBMB Life, 50, 227-233 (2000). 29. S. A. Weiss, T. Preuss, and D. S. Faber, “Phase encoding in the Mauthner system: Implications in left-right sound source discrimination,” J. Neurosci., 29, No. 11, 3431-3441 (2009).

Изменения моторной асимметрии золотых рыбок, связанные с адаптацией к вестибулярной стимуляции и аппликацией бета-амилоида на маутнеровские нейроны

Institution

Ähnliche Einträge