Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование

Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование

Работа была направлена на поиск подходов, обеспечивающих биофизически обоснованный выбор параметров электростимуляции гладкомышечных клеток (ГМК) детрузора мочевого пузыря (ДМП). Такая стимуляция широко применяется при реабилитации пациентов, оперированных по поводу врожденных пороков развития. Исс...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2015
Hauptverfasser: Коченов, А.В., Поддубная, Е.П., Македонский, И.А., Корогод, С.М.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України 2015
Schriftenreihe:Нейрофизиология
Online Zugang:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148200
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование / А.В. Коченов, Е.П. Поддубная, И.А. Македонский, С.М. Корогод // Нейрофизиология. — 2015. — Т. 47, № 3. — С. 215-226. — Бібліогр.: 24 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-148200
record_format dspace
spelling irk-123456789-1482002019-02-18T01:24:01Z Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование Коченов, А.В. Поддубная, Е.П. Македонский, И.А. Корогод, С.М. Работа была направлена на поиск подходов, обеспечивающих биофизически обоснованный выбор параметров электростимуляции гладкомышечных клеток (ГМК) детрузора мочевого пузыря (ДМП). Такая стимуляция широко применяется при реабилитации пациентов, оперированных по поводу врожденных пороков развития. Исследования были выполнены на компьютерной модели с учетом экспериментальных данных о присущих биологическому прототипу ионных каналах и насосах сарколеммы и механизмах регуляции внутриклеточной концентрации кальция ([Ca²⁺]i ). Изучали сопряженные изменения мембранного потенциала (МП), парциальных трансмембранных токов и [Ca²⁺]i, которые вызывались толчками деполяризующего тока, организованными соответственно протоколам реабилитационной стимуляции (в пачки или «конверты» с постоянной или трапецеидально модулированной амплитудой). Модельная ГМК ДМП отвечала на действие одиночного стимула генерацией потенциала действия (ПД), близкого к таковому у прототипа. Раздражение как пачками, так и «конвертами» одинаковых стимулов приводило к установлению одинаковых вынужденных электрических и концентрационных колебаний с параметрами, зависящими от длительности межстимульных интервалов (МСИ). Такие колебания и регенеративные ответы, вызванные стимуляцией с типичными для реабилитационных протоколов МСИ 5 и 50 мс (сопоставимыми с длительностями абсолютной и относительной рефрактерности модельной ГМК), существенно различались; размах и средний уровень деполяризационных изменений МП и [Ca²⁺]i были более высокими при высокочастотной стимуляции. В случае коротких МСИ [Ca²⁺]i , не успевая возвращаться к базальному уровню, колебалась в диапазоне значений, которые в других возбудимых клетках превышают физиологическую норму. Эти данные подчеркивают необходимость точного устранения кинетических характеристик механизмов, определяющих поступление и экструзию Ca²⁺ в ГМК ДМП, для предотвращения возможных побочных цитотоксических влияний высоких уровней [Ca²⁺]i . Существенным для наблюдавшихся процессов биофизическим параметром ГМК ДМП был также потенциал инверсии (ECl) кальцийзависимого хлорного тока, активирующегося, в частности, парасимпатическими влияниями на М2/М3-холинорецепторы. При периодическом превышении значения ECl высокочастотными колебаниями МП указанный ток изменял свое основное (деполяризующее) направление на противоположное (гиперполяризующее). Робота була спрямована на пошук підходів, які забезпечують біофізично обґрунтований вибір параметрів електростимуляції гладеньком’язових клітин (ГМК) детрузора сечового міхура (ДСМ). Така стимуляція широко застосовується при реабілітації пацієнтів, оперованих з приводу вроджених вад розвитку. Дослідження були виконані на комп’ютерній моделі з урахуванням експериментальних даних щодо притаманних біологічному прототипу іонних каналів і насосів сарколеми та механізмів регуляції внутрішньоклітинної концентрації кальцію ([Ca²⁺]i ). Вивчали сполучені зміни мембранного потенціалу (МП), парціальних трансмембранних струмів та [Ca²⁺]i , котрі викликалися поштовхами деполяризуючого струму, організованими відповідно до протоколів реабілітаційної стимуляції (в пачки або «конверти» з постійною або трапецеїдально модульованою амплітудою). Модельна ГМК ДСМ відповідала на дію поодинокого стимулу генерацією потенціалу дії (ПД), близького до такого у прототипу. Подразнення як пачками, так і «конвертами» однакових стимулів призводило до встановлення однакових вимушених електричних і концентраційних коливань з параметрами, залежними від тривалості міжстимульних інтервалів (МСІ). Такі коливання та регенеративні відповіді, викликані стимуляцією з типовими для реабілітаційних протоколів МСІ 5 і 50 мс (порівнянними з тривалостями абсолютної та відносної рефрактерності модельної ГМК), істотно розрізнялися; розмах і середній рівень деполяризаційних змін МП і [Ca²⁺]i були більш високими при високочастотній стимуляції. В разі коротких МСІ [Ca²⁺]i , не встигаючи повертатися до базального рівня, коливалась у діапазоні значень, які в інших збудливих клітинах перевищують фізіологічну норму. Ці дані підкреслюють необхідність точного встановлення кінетичних характеристик механізмів, що визначають надходження та екструзію Ca²⁺ у ГМК ДСМ для запобігання можливим побічним цитотоксичним впливам високих рівнів [Ca²⁺]i . Істотним для спостережних процесів біофізичним параметром ГМК ДСМ був також потенціал інверсії (ECl) кальційзалежного хлорного струму, що активується, зокрема, парасимпатичними впливами на М2/М3холінорецептори. При періодичному перевищенні значення ECl високочастотними коливаннями МП вказаний струм змінював свій основний (деполяризаційний) напрямок на протилежний (гіперполяризаційний). 2015 Article Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование / А.В. Коченов, Е.П. Поддубная, И.А. Македонский, С.М. Корогод // Нейрофизиология. — 2015. — Т. 47, № 3. — С. 215-226. — Бібліогр.: 24 назв. — рос. 0028-2561 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148200 577.3: 51-76 ru Нейрофизиология Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
description Работа была направлена на поиск подходов, обеспечивающих биофизически обоснованный выбор параметров электростимуляции гладкомышечных клеток (ГМК) детрузора мочевого пузыря (ДМП). Такая стимуляция широко применяется при реабилитации пациентов, оперированных по поводу врожденных пороков развития. Исследования были выполнены на компьютерной модели с учетом экспериментальных данных о присущих биологическому прототипу ионных каналах и насосах сарколеммы и механизмах регуляции внутриклеточной концентрации кальция ([Ca²⁺]i ). Изучали сопряженные изменения мембранного потенциала (МП), парциальных трансмембранных токов и [Ca²⁺]i, которые вызывались толчками деполяризующего тока, организованными соответственно протоколам реабилитационной стимуляции (в пачки или «конверты» с постоянной или трапецеидально модулированной амплитудой). Модельная ГМК ДМП отвечала на действие одиночного стимула генерацией потенциала действия (ПД), близкого к таковому у прототипа. Раздражение как пачками, так и «конвертами» одинаковых стимулов приводило к установлению одинаковых вынужденных электрических и концентрационных колебаний с параметрами, зависящими от длительности межстимульных интервалов (МСИ). Такие колебания и регенеративные ответы, вызванные стимуляцией с типичными для реабилитационных протоколов МСИ 5 и 50 мс (сопоставимыми с длительностями абсолютной и относительной рефрактерности модельной ГМК), существенно различались; размах и средний уровень деполяризационных изменений МП и [Ca²⁺]i были более высокими при высокочастотной стимуляции. В случае коротких МСИ [Ca²⁺]i , не успевая возвращаться к базальному уровню, колебалась в диапазоне значений, которые в других возбудимых клетках превышают физиологическую норму. Эти данные подчеркивают необходимость точного устранения кинетических характеристик механизмов, определяющих поступление и экструзию Ca²⁺ в ГМК ДМП, для предотвращения возможных побочных цитотоксических влияний высоких уровней [Ca²⁺]i . Существенным для наблюдавшихся процессов биофизическим параметром ГМК ДМП был также потенциал инверсии (ECl) кальцийзависимого хлорного тока, активирующегося, в частности, парасимпатическими влияниями на М2/М3-холинорецепторы. При периодическом превышении значения ECl высокочастотными колебаниями МП указанный ток изменял свое основное (деполяризующее) направление на противоположное (гиперполяризующее).
format Article
author Коченов, А.В.
Поддубная, Е.П.
Македонский, И.А.
Корогод, С.М.
spellingShingle Коченов, А.В.
Поддубная, Е.П.
Македонский, И.А.
Корогод, С.М.
Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование
Нейрофизиология
author_facet Коченов, А.В.
Поддубная, Е.П.
Македонский, И.А.
Корогод, С.М.
author_sort Коченов, А.В.
title Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование
title_short Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование
title_full Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование
title_fullStr Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование
title_full_unstemmed Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование
title_sort биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование
publisher Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
publishDate 2015
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148200
citation_txt Биофизические процессы в гладкомышечной клетке детрузора мочевого пузыря при реабилитационной электростимуляции: модельное исследование / А.В. Коченов, Е.П. Поддубная, И.А. Македонский, С.М. Корогод // Нейрофизиология. — 2015. — Т. 47, № 3. — С. 215-226. — Бібліогр.: 24 назв. — рос.
series Нейрофизиология
work_keys_str_mv AT kočenovav biofizičeskieprocessyvgladkomyšečnojkletkedetruzoramočevogopuzyrâprireabilitacionnojélektrostimulâciimodelʹnoeissledovanie
AT poddubnaâep biofizičeskieprocessyvgladkomyšečnojkletkedetruzoramočevogopuzyrâprireabilitacionnojélektrostimulâciimodelʹnoeissledovanie
AT makedonskijia biofizičeskieprocessyvgladkomyšečnojkletkedetruzoramočevogopuzyrâprireabilitacionnojélektrostimulâciimodelʹnoeissledovanie
AT korogodsm biofizičeskieprocessyvgladkomyšečnojkletkedetruzoramočevogopuzyrâprireabilitacionnojélektrostimulâciimodelʹnoeissledovanie
first_indexed 2025-07-12T18:35:49Z
last_indexed 2025-07-12T18:35:49Z
_version_ 1837467281797414912
fulltext NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 3 215 УДК 577.3: 51-76 А. В. КОЧЕНОВ1,3, Е. П. ПОДДУБНАЯ2, 3, И. А. МАКЕДОНСКИЙ2, С. М. КОРОГОД1 БИОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ГЛАДКОМЫШЕЧНОЙ КЛЕТКЕ ДЕТРУЗОРА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ПРИ РЕАБИЛИТАЦИОННОЙ ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИИ: МОДЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Поступила 18.03.2014 Работа была направлена на поиск подходов, обеспечивающих биофизически обоснован­ ный выбор параметров электростимуляции гладкомышечных клеток (ГМК) детрузора мочевого пузыря (ДМП). Такая стимуляция широко применяется при реабилитации па­ циентов, оперированных по поводу врожденных пороков развития. Исследования были выполнены на компьютерной модели с учетом экспериментальных данных о присущих биологическому прототипу ионных каналах и насосах сарколеммы и механизмах регуля­ ции внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]i). Изучали сопряженные изменения мембранного потенциала (МП), парциальных трансмембранных токов и [Ca2+]i, которые вызывались толчками деполяризующего тока, организованными соответственно прото­ колам реабилитационной стимуляции (в пачки или «конверты» с постоянной или трапе­ цеидально модулированной амплитудой). Модельная ГМК ДМП отвечала на действие одиночного стимула генерацией потенциала действия (ПД), близкого к таковому у про­ потенциала действия (ПД), близкого к таковому у про­потенциала действия (ПД), близкого к таковому у про­ тотипа. Раздражение как пачками, так и «конвертами» одинаковых стимулов приводило к установлению одинаковых вынужденных электрических и концентрационных колеба­ вынужденных электрических и концентрационных колеба­вынужденных электрических и концентрационных колеба­ ний с параметрами, зависящими от длительности межстимульных интервалов (МСИ). Такие колебания и регенеративные ответы, вызванные стимуляцией с типичными для реабилитационных протоколов МСИ 5 и 50 мс (сопоставимыми с длительностями абсо­ лютной и относительной рефрактерности модельной ГМК), существенно различались; размах и средний уровень деполяризационных изменений МП и [Ca2+]i были более вы­ сокими при высокочастотной стимуляции. В случае коротких МСИ [Ca2+]i, не успевая возвращаться к базальному уровню, колебалась в диапазоне значений, которые в других возбудимых клетках превышают физиологическую норму. Эти данные подчеркивают необходимость точного устранения кинетических характеристик механизмов, опреде­ ляющих поступление и экструзию Ca2+ в ГМК ДМП, для предотвращения возможных побочных цитотоксических влияний высоких уровней [Ca2+]i. Существенным для на­ блюдавшихся процессов биофизическим параметром ГМК ДМП был также потенциал инверсии (ECl) кальцийзависимого хлорного тока, активирующегося, в частности, пара­ симпатическими влияниями на М2/М3­холинорецепторы. При периодическом превы­ шении значения ECl высокочастотными колебаниями МП указанный ток изменял свое основное (деполяризующее) направление на противоположное (гиперполяризующее). КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: математическая модель, гладкомышечная клетка, детру- зор, электростимуляция, ионные каналы, внутриклеточный кальций. 1 Международный центр молекулярной физиологии (Днепропетровское отделение) НАН Украины (Украина). 2 Днепропетровский областной специализированный клинический медицинский центр матери и ребенка им. проф. М.Ф. Руднева (Украина). 3 Государственное учреждение «Днепропетровская медицинская академия МОЗ Украины» (Украина). Эл. почта: kochenov_artem@yahoo.com (А. В. Коченов); piddubna.olena@gmail.com (Е. П. Поддубная); igor_makedonsky@yahoo.com (И. А. Македонский); dnipro@biph.kiev.ua (С. М. Корогод). ВВЕДЕНИЕ Чрезтканевая электростимуляция мышц тазового дна и детрузора мочевого пузыря (ДМП) как важная со­ ставляющая процедур медицинской реабилитации показала весьма высокую эффективность у пациен­ тов, оперированных в связи с тяжелыми врожденны­ NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2014.—T. 47, № 3216 А. В. КОЧЕНОВ, Е. П. ПОДДУБНАЯ, И. А. МАКЕДОНСКИЙ, С. М. КОРОГОД ми пороками развития органов малого таза (атрезией прямой кишки – АПК и экстрофией мочевого пузы­ ря – тотальной эписпадией – ЭМПТЭ) [1–3�. Распро­1–3�. Распро­�. Распро­ страненность и тяжесть упомянутых пороков обуслов­ ливают необходимость углубленных исследований физиологических и биофизических механизмов функ­ ционирования мускулатуры органов малого таза в норме и при патологии, а также совершенствования соответствующих методов лечения и реабилитации, включая электростимуляцию. Применяемые в кли­ нической практике стандартные протоколы электри­ ческого раздражения предусматривают воздействие на стимулируемые органы стимулами, организован­ ными в пачки или так называемые конверты с регу­ лируемыми амплитудой и частотой следования. Одна­ ко обоснованный выбор параметров электростимулов осложнен неизвестностью характеристик вызванных ими в клетках­мишенях биофизических и физиоло­ гических процессов. К тому же, экспериментальные исследования подобных процессов, порождаемых в гладкомышечных клетках (ГМК) ДМП электрически­ ми и парасимпатическими воздействиями, чрезвычай­ но затруднены из­за ограничений как методическо­ го, так и этического (в случае клинической практики) плана. В таких условиях важным инструментом полу­ чения информации об указанных процессах становит­ ся компьютерное моделирование как важный компле­ ментарный метод, приобретающий все более широкое распространение в клеточной биофизике и физиоло­ гии. Именно этот инструмент использован в данной работе. Возможные клеточные эффекты реабилитаци­ онной электростимуляции исследованы на описанной нами ранее [4, 5� компьютерной модели ГМК ДМП (с небольшими дополнениями, см. ниже). Очевид­ но, при электростимуляции в зависимости от взаим­ ного расположения электрода и ГМК­мишеней воз­ буждение последних может достигаться разными путями – либо действием на мембранные рецепторы ацетилхолина и АТФ – медиаторов, высвобождаемых окончаниями парасимпатических нервных волокон в результате прихода вызванных стимулами потенци­ алов действия (ПД), либо прямым деполяризующим действием стимулирующего тока на мембрану ГМК, либо комбинацией того и другого. Кроме того, элек­ тростимуляция может затрагивать постганглионар­ ные симпатические нервные волокна, выделяющие норадреналин – медиатор торможения ГМК ДМП. В настоящей работе мы ограничились рассмотрением эффектов прямого возбуждающего действия, оказы­ ваемого на ГМК электрическими стимулами, остав­ ляя для дальнейших исследований эффекты парасим­ патических и/или симпатических воздействий и их комбинаций с прямыми электрическими воздействия­ ми. Полученные нами данные впервые иллюстрируют электрические и концентрационные процессы в ГМК ДМП при разных применяемых в клинике протоколах электростимуляции, позволяют выделить характер­ ные особенности этих процессов, а также определя­ ющие их параметры и кинетические характеристики клеточных механизмов. Выделены требующие углу­ бленного исследования характеристики, существен­ ные для биофизически обоснованной оптимизации параметров клинической электростимуляции, в част­ ности такой, которая предотвращала бы возможность развития кальциевых цитотоксических эффектов в ус­ ловиях высоких частот следования электростимулов. ОПИСАНИЕ МОДЕЛИ Исследования были выполнены на разработанной нами в программной среде «НЕЙРОН» и подробно описанной ранее [4–6� модели ГМК ДМП, в кото­ рую были дополнительно включены каналы каль­ цийзависимого калиевого тока двух типов – ВК и SK. Каналы типа ВК [7� обладали дополнитель­ ной регулировочной субъединицей [8, 9�, а свой­ ства каналов типа SK соответствовали опублико­ ванным экспериментальным данным [10–12�. ГМК была представлена мембранным цилиндром, раз­ меры которого (длина 100, диаметр 5 мкм) были фиксированы, что соответствовало изометрическо­ му режиму исследования [13, 14�. Модель включа­ ла в себя характерные для прототипа ионные кана­ лы, насосы, а также механизмы регуляции уровня внутриклеточного кальция. В мембране присут­ ствовали каналы пассивной утечки, кальциевые каналы типов L и Т, неинактивирующиеся натри­ евые каналы, калиевые каналы четырех типов (за­ держанного выпрямления и относящиеся к подсе­ мейству Kir2.1 и упомянутым выше типам BK и SK). Имелись также каналы, активируемые пара­ симпатическими воздействиями на метаботропные М2/М3­холинорецепторы, и ионотропные пури­и ионотропные пури­ионотропные пури­ норецепторы – кальцийзависимые хлорные кана­ лы и Р2Х­рецепторные каналы неспецифического входящего тока соответственно. Регуляц ию вну­ соответственно. Регуляц ию вну­соответственно. Регуляцию вну­ триклеточной концентрации кальция ([Ca2+]i) обес­ печивали насосы сарколеммы и эндосаркоплазма­ тического ретикулума, а также внутриклеточные буферы; учитывали также диффузию Ca2+ из при­ мембранного слоя в глубинные слои цитозоля. Си­ NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 3 217 БИОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ГЛАДКОМЫШЕЧНОЙ КЛЕТКЕ стема уравнений модели, представленная ранее [4�, была дополнена уравнениями ВК­ и SK­токов: ІBK = gBK·m·(V­EK); gBK = 6 мСм/см2; dm/dt = (m–m¥)/tm, m¥ = 1/(1 + exp(Vh – V)/(25/1.6))), Vh = –56.449 + + 104.52·exp(–0.22964·[Ca2+]i·1000) + 295.68·exp(– –2.1571·[Ca2+]i·1000), tm = (p(Ca) – 1)·(f(V) – 0.2)/ /0.8) + 11, p(Ca) = 13.7 + 234·exp(–0.72·[Ca2+]i · ·1000), f(V) = 1/((10 – (exp(–V/63.6) + exp(–(150 – V)/ /63.6))) – 5.2); ІSK = gSK·m2·(V – EK); gSK = 0.6 мСм/см2; dm/dt = (m – m¥)/tm, m¥= 1/(1 + (0.0005/[Ca2+]i) 1.3), tm = 48 мс. Исследовали реакции модельной ГМК на предъ­ явление прямоугольных толчков деполяризующе­ го тока [5�. Применяли также протоколы стиму­ ляции, которые соответствовали используемым в процедурах реабилитации пациентов с урологиче­ скими и аноректальными дисфункциями [15�, при­ чем множественные толчки деполяризующего тока были организованы в пачки или «конверты» (см. со­ ответственно рис. 2, А, Б или В, Г). Варьировались амплитуда, длительность (0.2–0.5 мс) и частота сле­ дования стимулов внутри пачек (5–200 с–1, что со­ ответствовало межстимульным интервалам (МСИ) 200–5 мс), длительность пачек (до 65 с) и дли­ тельности фаз нарастания, постоянства и сниже­ ния амплитуды импульсов в «конверте» (до 10, 65 и 10 с соответственно); при этом изменения амплитуды следовали линейному закону. РЕЗУЛЬТАТЫ Ответы модельной ГМК на стимуляцию импуль­ сом тока пороговой амплитуды. В ответ на сти­ муляцию прямоугольным толчком тока пороговой интенсивности (длительность 0.2 мс, амплитуда 140.6 мкА/мкФ) модельная клетка генерировала ПД амплитудой 64.35 мВ (относительно потенци­ ала покоя (ПП), равного –54.6 мВ) с последующи­ ми следовыми гиперполяризацией и деполяризаци­ ей, отклонявшимися от уровня ПП на –9 и 1.3 мВ соответственно (рис. 1, А). Генерация ПД сопрово­ ждалась значительным (до 262 мкМ) преходящим А Б В Г 10 мВ мкМ 200 100 0 0 –0.15 –0.30 –0.45 0.25 5 мкА/см2 40 мс мА/см2 мА/см2 0.20 0.15 0.10 0.05 0 0 –15 –40 –65 40 мс 5 мВ 100 мс Р и с. 1. Реакция модельной гладкомышечной клетки на воздействие одиночного прямоугольного стимула. А – Г – изменения во времени мембранного потенциала (мВ; на вставке – та же реакция в увеличенном масштабе для более наглядной демонстрации следовых процессов), внутриклеточной концентрации кальция (мкМ), а также плотности парциальных токов (мА/см2) – входящих INa, ICl(Ca), ICaT и ICaL и выходящих ILeak, IBK, ISK, IKir2.1 и IKv. На вставке в увеличенном масштабе представлены IKir2.1 и ISK; стрелками (слева направо) отмечены начало стимула и момент максимума потенциала действия. На В ICl(Ca) – знакопеременный. Калибровка времени 40 мс общая для всех записей, кроме таковых на вставках. Р и с. 1. Реакція модельної гладеньком’язової клітини на дію поодинокого прямокутного стимулу. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2014.—T. 47, № 3218 А. В. КОЧЕНОВ, Е. П. ПОДДУБНАЯ, И. А. МАКЕДОНСКИЙ, С. М. КОРОГОД повышением примембранной концентрации [Ca2+]i (Б), обусловленным входящими кальциевыми токами (В). На пике развития ПД компоненты L­ и Т­типов (ICaL и ICaT) в общем кальциевом токе составляли 71.41 и 28.59 % соответственно. Это соотношение близко к экспериментальным данным, согласно которым в клетках ДМП вклад тока Т­типа в суммарный каль­ циевый ток составляет 20–30 % [16�. Среди выходя­ щих токов (Г) преобладал ток IKv через потенциалза­ висимые калиевые каналы. Вторым по величине был ток IBK через кальцийзависимые калиевые каналы типа BK, максимум которого практически совпадал с пиком [Ca2+]i. Третьим по величине был ток утечки Ileak, динамика которого соответствовала форме ПД. Гораздо меньшими были токи через калиевые каналы 0 А 1 1 2 2 3 3 Б В Г мВ мВ 10 мВ 10 мВ9.65 мВ–20 –20 –35 –35 –50 –50 –65 0 0 0.5 0.5 1.0 мкМ мВ мВ 9.65 мВ мкМ мкМ мкМ 500 мс 1.0 –65 мкА/мкФ мкА/мкФ 140.625 140.625 0 262 мкМ 262 мкМ 16.1 мкМ 15.95 мкМ мкА/мкФ мкА/мкФ 140.625 140.625 0 0 –20 –20 –35 –35 –50 –50 –65 0 2 4 6 8 –65 0 0.5 1.0 Р и с. 2. Типичные реакции модельной глад­ комышечной клетки на стимуляцию пачкой (А, Б) и «конвертом» (В, Г) деполяризующих стимулов разной амплитуды и частоты следо­ вания. Длительность стимулов 0.2 мс, частота следо­ вания 200 (А, В) или 20 (Б, Г) с–1, амплитуда постоянная – 140.6 мкА/мкФ (А, Б) или линей­ но изменяющаяся от 0 до 140.6 мкА/мкФ (В, Г). Длительность пачки 2 с (А, Б); длительно­ сти фаз нарастания, постоянства и спада ам­ плитуды стимулов в «конверте» (В и Г) – соот­ ветственно 0.5, 1.2 и 0.5 с. 1–3 на А–Г – соот­ ветственно стимулы (мкА/мкФ), мембранный потенциал (мВ) и кальциевые транзиенты (мкМ). Фрагменты записей на А, В слева, ограниченные прямоугольниками, представ­ лены на вставках справа в увеличенном мас­ штабе. Калибровки времени 500 и 1000 мс для А, Б и В, Г общие. Р и с. 2. Типові реакції модельної гладень­ ком’язової клітини на стимуляцію пачкою (А, Б) та „конвертом” (В, Г) деполяризуючих сти­ мулів різної амплітуди та частоти слідування. типов Kir2.1 и SK – IKir2.1 и ISK. Развивающиеся после ПД следовые процессы, также присущие прототипу, были приурочены к интервалам доминирования со­ ответствующих токов – кальцийзависимого хлорного ICl(Ca), направленного внутрь во время развития следо­ вой деполяризации (В, указано тонкой сплошной ли­ нией), и многокомпонентного калиевого, направлен­ ного в пределах фазы гиперполяризации наружу (Г). Таким образом, набор ионных каналов модельной ГМК позволял воспроизвести как генерацию ПД, ха­ рактерного для клеток­прототипов, так и необходи­ мое для мышечного сокращения существенное по­ вышение внутриклеточной концентрации кальция в ответ на стимуляцию деполяризующим толчком тока. Подобно тому, что было описано в предыдущей 1000 мс NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 3 219 БИОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ГЛАДКОМЫШЕЧНОЙ КЛЕТКЕ работе (см. [5�, рис. 1), в данной модификации мо­ дели ГМК ДМП тоническое повышение проводи­ мости Р2Х­рецепторных каналов, которое может рассматриваться как имитация действия пурино­ миметиков, также приводило к снижению порога электрической возбудимости (не иллюстрируется). Ответы модельной ГМК на множественную сти­ муляцию. Множественную стимуляцию (рис. 2; 3) осуществляли толчками тока с такими же параме­ трами (140.6 мкА/мкФ, 0.2 мс), как и у одиночного стимула, порогового для вызова полномасштабного одиночного ПД (рис. 1). Сравнивали процессы, раз­ вивавшиеся в модельной ГМК при такой стимуля­ ции в четырех вариантах, которые соответствовали стандартным протоколам реабилитационной сти­ муляции (см. [15�, а также руководство к аппарату «Urostym» («Laborie Medical Technologies», Кана­Кана­ да)). Для краткости подобные последовательности стимулов будут обозначены как высоко­ или низко­ частотные пачки (ВП или НП) и высоко­ или низ­ кочастотные «конверты» (ВК или НК). Амплитуда стимулов в пачках (ВП; рис. 2, А и НП; Б) была по­ стоянной, а в «конвертах» (ВК; В и НК; Г) – трапе­ цеидально модулированной. В таких «конвертах» амплитуда импульсов вначале в течение 0.5 с ли­ нейно нарастала от 0 до 140.6 мкА/мкФ (кроме не­ которых специально оговоренных случаев), далее удерживалась на этом уровне в течение 2.0 с и ли­ нейно спадала до нуля за 0.5 с. Отдельные стиму­ лы следовали с частотой 200 с–1 в составе ВП и ВК или 20 с–1 – в составе НП и НК, что соответствова­ ло МСИ 5 или 50 мс. Для процессов, наблюдавших­ ся при всех вышеуказанных вариантах стимуляции, общим было то, что после некоторого переходного процесса ответы на предъявление идентичных по­ следовательных стимулов становились одинаковы­ ми, причем вынужденные колебания МП и внутри­ клеточной концентрации кальция (соответственно верхние и нижние записи на А–Г) следовало счи­ тать стационарными. Наблюдавшиеся переходные процессы можно рассматривать как комбинации вынужденного колебательного процесса и затуха­ ющего собственного процесса, что, вообще говоря, типично для (био)физических систем разной при­ роды. Установившиеся колебания, наблюдаемые в мо­ дельной ГМК, характеризовались следующими осо­ бенностями. Параметры этих колебаний были прак­ тически одинаковыми в условиях стимуляции как пачкой, так и «конвертом» одинаковой частоты (ср. ВП и ВК на рис. 2, А и В и НП и НК на Б и Г). Они, однако, заметно различались при разной ча­ стоте стимулов в пачке или «конверте» (ср., напр., ВП и НП на рис. 1, А и Б или ВК и НК на В и Г). На это указывали такие параметры колебаний МП и внутриклеточной концентрации кальция [Ca2+]i, как размах (диапазон) изменений и средний уровень. МП колебался с размахом 22.86 мВ (от –51.13 до –28.27 мВ) и средним значением –44.47 мВ при сти­ муляции ВП. В условиях стимуляции ВК размах со­ ставлял 22.86 мВ (от –51.13 до –28.27 мВ), а сред­ нее значение равнялось –44.47 мВ. Иными словами, различия размаха и среднего уровня МП составля­ ли всего 0.0004 и 0.00045 % соответственно. При низкочастотной стимуляции упомянутые параметры имели следующие значения. Размах в условиях сти­ муляции НП был несколько больше (24.43 мВ, диа­ пазон от –52.57 до –28.13 мВ), а средний уровень со­ ответствовал меньшей деполяризации (–48.44 мВ). То же было характерно и для эффектов стимуля­ ции НК: размах составлял 24.43 мВ (от –52.57 до –28.13 мВ), а средний уровень соответствовал –48.44 мВ. Иными словами, колебания, вызванные низкочастотной стимуляцией в формах НП и НК, практически не различались по размаху и средне­ му уровню. Следует отметить, что процесс перехо­ да колебаний [Ca2+]i в установившийся режим был существенно продолжительнее процесса становле­ ния стационарных электрических колебаний. Уста­ новившиеся высокочастотные вынужденные коле­ бания [Ca2+]i происходили с амплитудой (размахом) 0.2 мкМ (от 0.59 до 0.79 мкМ) и средним уровнем 0.71 мкМ при стимуляции в виде ВП, а при стимуля­ ции в виде ВК размах составлял 0.2 мкМ (от 0.59 до 0.79 мкМ) со средним уровнем 0.71 мкМ, т. е. раз­ мах был практически одинаков, а средние уровни различались всего на 0.004 %. Соответствующие вы­ нужденные колебания в условиях низкой частоты в пределах НП характеризовались бóльшим размахом (1.8 мкМ, от 0.2 до 2.01 мкМ) и меньшим средним значением (0.51 мкМ). Параметры колебаний при стимуляции в виде НК отличались всего на 0.00019 и 0.0002 % по среднему уровню и размаху соот­ ветственно. Подобные результаты представляют особый интерес, поскольку в случае раздражения и пачками, и «конвертами» интенсивность стиму­ лов постоянна в пределах длительных (10–20 с) ин­ тервалов времени, а отрезки непостоянства ампли­ туды (нарастания и спада) в условиях стимуляции «конвертами» короче в несколько раз – 0.5–1.0 с (см. описание протоколов стимуляции, упомянутых выше). NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2014.—T. 47, № 3220 А. В. КОЧЕНОВ, Е. П. ПОДДУБНАЯ, И. А. МАКЕДОНСКИЙ, С. М. КОРОГОД Переходные процессы, ведущие к становлению стационарных вынужденных колебаний потенциа­ лов и концентраций, были примечательны следую­ щим. Длительность переходного процесса при низ­ кочастотной стимуляции была значительно меньше (около 1.6 с), чем при высокочастотной (около 5 с). В случае одной и той же частоты переходной про­ цесс для концентрационных колебаний был поч­ ти на порядок длительнее, чем для электрических. Переходной процесс в условиях стимуляции «кон­ вертом» имел особенность, указывавшую на адап­ тационное повышение порога генерации полно­ ценного ПД в интервале постепенного нарастания амплитуды стимулов. Так, интенсивность стимула 140.625 мкА/мкФ (при неизменной длительности 0.2 мс), которая была пороговой для генерации пол­ номасштабного ПД в условиях стимуляции пачкой (рис. 1, А), становилась подпороговой в пределах фазы нарастания в случае стимуляции «конвертом». Для того чтобы последний стимул в данной фазе (он же – первый стимул в фазе постоянства ампли­ туды) стал пороговым (т. е. вызывал ПД амплиту­ дой 61.33 мВ), необходимо было увеличивать его интенсивность до 625 мкА/мкФ (не иллюстрирует­ ся). Это означает, что в пределах полусекундного линейного нарастания интенсивности при стиму­ ляции «конвертом» с частотой следования внутри последнего 200 с–1 (МСИ 5 мс) происходило адап­ тационное повышение порога генерации ПД в 4.45 раза. В случае же стимуляции с низкой часто­ той (20 с–1, МСИ 50 мс) ПД с амплитудой 62.14 мВ возникал лишь с увеличением интенсивности сти­ мула до 200.89 мкА/мкФ (что соответствовало по­ вышению порога в 1.43 раза). Парциальные токи при генерации ответов ГМК в установившемся режиме. Чтобы получить пред­ ставление о биофизических механизмах, опреде­ ляющих возникновение в модельной ГМК устано­ вившихся вынужденных колебаний МП и [Ca2+] i, выделяли ответ на предъявление одного из множе­ ства стимулов, следующих с той или иной частотой в составе пачек или «конвертов» (рис. 2), и опре­ деляли сопровождающие такой ответ парциальные ионные токи (рис. 3). Данные, представленные на рис. 3, характеризуют ответы, зарегистрированные через 20 с после начала раздражения пачкой с вы­ сокой (А) или низкой (Б) частотой следования сти­ мулов, т. е. после завершения всех переходных про­ цессов, когда вынужденные колебания становились стационарными. Стационарные вынужденные коле­ бания потенциала, концентрации и токов при сти­ мВ А 1 2 3 5 4 Б мкМ мкА/см2 мА/см2 мА/см2 –20 1 2 4 мс ECl ECl 20 мс 2 0.75 0 0 1.5 0.5 –2 –5 1 0.25 –6 –15 0.5 0 –10 –0.025 0.05 0.05 0.04 0.04 0.03 0.03 0.02 0.02 0.01 0.01 0 0 –0.025 –0.05 –0.05 –0.075 –0.075 0 0 –25 0 –20 –35 –35 –50 –50 Р и с. 3. Сопряженные электрические и концентрационные процессы в модельной гладкомышечной клетке (в режиме установившихся вынужденных колебаний) при генерации ответа, вызванного предъявлением отдельного деполяризующего стимула, который подавался с частотой следования 200 (А) и 20 (Б) с­1 в составе пачки или «конверта» (А, Б). Представлены изменения во времени мембранного потенциала, мВ (1), внутриклеточной концентрации кальция, мкМ, а также плотности парциальных токов – входящих INa, мА/см2, ICl(Ca), ICaT, ICaL, мкА/см2 и выходящих IKv, IKir2.1, IBK, ISK и ILeak, мА/см2 (3–5). На В и Г ток ICl(Ca) знакопеременный. Калибровки времени 5 (А, В) и 10 (Б, Г) мс, потенциала – 10 мВ (А–Г). Р и с. 3. Сполучені електричні та концентраційні процеси в модельній гладеньком’язовій клітині (в режимі сталих вимушених коливань) при генерації відповіді, викликаної пред’явленням окремого деполяризуючого стимулу, що подавався з частотою слідування 200 (А) та 20 (Б) с–1 у складі пачки або «конверта» (А, Б). NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 3 221 БИОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ГЛАДКОМЫШЕЧНОЙ КЛЕТКЕ муляции «конвертами» соответствующей частоты практически не отличались от тех, которые пред­ ставлены на рис. 2. Поэтому они не иллюстрируют­ ся, а дальнейшее описание результатов относится к обоим протоколам стимуляции. При высокочастотной стимуляции, будь то ВП или ВК (рис. 2, А или В), стимулы следовали с ин­ тервалами 5 мс, т. е. меньшими, чем длительности абсолютной рефрактерности (см. [5�, рис. 2, Б), ко­ торую связывают с инактивацией каналов деполяри­ зационного тока. Вызванный в этих условиях элек­ трический ответ представлял собой быстрый (время нарастания 0.2 мс, равное длительности стиму­ ла) всплеск деполяризации относительно исходно­ го уровня –51.13 мВ. Он имел амплитуду 22.87 мВ и сопровождался спадом, вначале (за первую мил­ лисекунду) более крутым, затем более пологим, почти линейным (рис. 3, А, 1). Чем больше было такое деполяризационное смещение, тем более МП приближался к потенциалам равновесия кальци­ евых и натриевых токов (их движущие потенци­ алы становились меньше). Соответственно, МП все более удалялся от потенциалов равновесия вы­ ходящих токов (кальциевых и утечки, движущие потенциалы которых при этом увеличивались). Траектория МП (1) дважды, по восходящей и нисхо­нисхо­исхо­ дящей, пересекала уровень равновесия (инверсии) кальцийзависимого хлорного тока (ECl = –32 мВ). Соответственно, знакопеременными оказывались и движущий потенциал, и сам этот ток (3). Упомяну­ тый ток уменьшался по абсолютной величине до нуля; далее, сменив знак на противоположный, он увеличивался, достигал максимума в момент окон­ чания действия стимула, после чего претерпевал обратные изменения с меньшей скоростью. Таким образом, данный ток, будучи в основном деполя­ ризационным, на короткое время (в интервале от 0.2 до 0.4 мс после начала стимула) становился ги­ перполяризационным. Среди входящих токов до­ минировал натриевый (4, INa), почти вчетверо пре­ восходивший второй по величине кальциевый ток Т­типа (3, ICaT), а кальциевый ток L­типа (ICaL) был пренебрежимо мал. Для всех входящих токов харак­ терным было двухфазное изменение относительно соответствующего исходного уровня (того, кото­ рый наблюдался на момент начала действия сти­ мула). Первая фаза уменьшения абсолютной вели­ чины входящего тока начиналась в момент начала действия стимула и не превосходила последний по длительности; минимумы токов INa, ICaT и ICaL дости­ гались спустя 0.025, 0.125 и 0.15 мс (3 и 4). Вслед за этим наступала фаза роста абсолютных вели­ чин парциальных токов, продолжавшаяся и после завершения стимула. Максимумы вышеназванных токов достигались соответственно через 0.55, 1.0 и 1.35 мс после начала действия 0.2­миллисекундно­ го стимула, что соответствовало различной кинети­ ке потенциалзависимой активации каналов – самой быстрой у натриевых, более медленной у кальцие­ вых Т­типа и самой медленной у кальциевых кана­ лов L­типа. Далее, до поступления очередного сти­ мула, токи возвращались к исходному уровню. В то же время динамика выходящего тока утечки Ileak че­ рез постоянную пассивную мембранную проводи­ мость (5) практически повторяла траекторию МП (1), что было вполне закономерным ввиду постоян­ ства его равновесного потенциала. Приблизитель­ но на 20 % меньший ток через потенциалзависимые калиевые каналы (IKv, 5) изменялся аналогично, от­ личаясь несколько более медленным спадом. Сле­ дующими по величине были токи через калиевые каналы типов SK и Kir2.1 (ISK и IKir2.1), пиковая ам­ плитуда отмечалась в момент окончания стимула (5). При этом ток через калиевые каналы типа ВK (IK(SK)) был пренебрежимо мал. В аспекте важного функционального значения кальциевого транзиента не только для электроге­ неза в ГМК, но и для сократительной активности указанной клетки данный транзиент представляет особый интерес (рис. 3, А, 2). Значение [Ca2+]i по­ сле кратковременного падения, наблюдавшегося в фазе начального уменьшения входящих кальциевых токов (на фоне продолжающейся экструзии кальция насосами и т. п.), нарастало и достигало максиму­ ма 0.793 мкМ через 1.2 мс после начала действия стимула. За время, оставшееся до начала действия очередного стимула, [Ca2+] i спадала до исходного уровня (0.628 мкМ). Последнее значение много­ кратно превышало базальный уровень (34.28 нМ), наблюдавшийся перед началом стимуляции. Сле­ дует отметить, что максимум [Ca2+]i достигался не­ сколько позже максимумов кальциевых токов (ср. 1 и 2), т. е. спад концентрации начинался при таком уменьшении названных токов, когда связанный с ними приток кальция в цитозоль становился мень­ ше экструзионного оттока. В условиях низкочастотной стимуляции в виде как НП (рис. 2, Б), так и НК (Г), когда МСИ = 50 мс соответствовали ранней фазе периода относитель­ ной рефрактерности (см. [5�, рис. 2, Б, В), устано­ вившиеся ответы (рис. 3, Б) существенно отлича­ лись от описанных выше (А). Общей чертой было NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2014.—T. 47, № 3222 А. В. КОЧЕНОВ, Е. П. ПОДДУБНАЯ, И. А. МАКЕДОНСКИЙ, С. М. КОРОГОД лишь почти линейное нарастание степени деполяри­ зации мембраны. МП достигал значения –28.13 мВ (т. е. смещался на 24.43 мВ от более низкого ис­ е. смещался на 24.43 мВ от более низкого ис­е. смещался на 24.43 мВ от более низкого ис­ ходного уровня –52.56 мВ) в пределах длительно­ сти действия стимула, после чего деполяризация спадала (Б, 1). Однако этот спад был неглубоким и коротким, после чего мембранная деполяриза­ ция возобновляла рост; МП достигал значения –30.28 мВ через 1.4 мс после окончания стимула. Далее деполяризация спадала, причем на нисхо­ дящей фазе наблюдалось короткое плато, которое могло рассматриваться как второй редуцирован­ ный пик (–47.1 мВ через 8.9 мс после окончания действия стимула). Выходящий ток утечки (Ileak; Б, 5), как и при высокочастотной стимуляции, повто­ рял траекторию МП. Другой выходящий ток, че­ Другой выходящий ток, че­Другой выходящий ток, че­ рез потенциалзависимые калиевые каналы (IKv; Б, 5), демонстрировал медленную активацию, дости­ гая максимума через 3.2 мс, т. е. практически одно­ временно с максимумом [Ca2+]i (ср. 2). Следующи­ ми по величине были токи через калиевые каналы типов SK и Kir2.1. Пиковая амплитуда IKir2.1 при­ ходилась на момент окончания стимула (5), тогда как ток ISK достигал максимума через 12.6 мс по­ сле окончания стимула. Ток через калиевые кана­ лы типа ВK (IBK) был существенно больше, чем при высокочастотной стимуляции, и достигал максиму­ ма спустя 5 мс после окончания стимула. Входя­ щие токи (в том числе кальцийзависимый хлорный ток ICl(Ca), практически не менявший данное направ­ ление в случае низкочастотной стимуляции) после окончания стимула демонстрировали выраженную активацию с характерной для каждого из них ско­ ростью (Б, 3). Так, наиболее высокоамплитудный натриевый ток INa достигал пика (максимума абсо­ лютной величины) через 1.6 мс, кальциевые токи ICaТ и ICaL (последний – намного больший, чем при высокочастотной стимуляции) – через 2.9 и 3.4 мс соответственно, а ICl(Ca) – через 8.5 мс после оконча­ ния стимула. Как следует отметить, соответствен­ но медленной активации каналов (максимум че­ рез 8.5 мс) кальцийзависимый хлорный ток ICl(Ca) был наибольшим в интервалах времени, совпадав­ ших с плато (вторым пиком) мембранной деполя­ ризации (Б, 1), когда деполяризующие кальциевые токи спадали до 52.6–57.29 % (2), а натриевый – до 55.03 (4) % своих пиковых значений. Это обстоя­ тельство указывает на возможную важную роль именно данного тока (ICl(Ca)) в формировании уста­ новившихся ответов на низкочастотную стимуля­ цию. ОБСУЖДЕНИЕ Основные клеточные эффекты при реабилита­ ционной электростимуляции. Электрическая сти­ муляция органов и тканей, мишенью которой яв­ ляются электровозбудимые нервные и мышечные клетки, давно и широко применяется в медицине. В частности, при хирургических вмешательствах электростимуляция позволяет выявить в оперируе­ мой ткани те участки, где залегают нервные волок­ на, и предотвратить нежелательную денервацию органов и связанные с этим тяжелые функциональ­ ные последствия. Такого рода превентивная зон­ дирующая интраоперационная электростимуляция нервов (ИЭСН) используется в органо­ и нервосох­ раняющей (nerve­sparing) простаэктомии [17�, хи­ рургии рака прямой кишки [18–21� и матки [22�, а в последние годы успешно применяется также в ходе хирургической коррекции таких врожденных аноректальных и урологических пороков у детей, как АПК и ЭМПТЭ [23, 24�. Широкое использование электростимуляции при хирургических вмешатель­ ствах и послеоперационной реабилитации ставит на повестку дня вопрос о биофизическом и физиологи­ ческом обосновании выбора адекватных протоколов и параметров воздействий этого вида. Для этого необ­ ходимы ясные представления о вызываемых подобной стимуляцией биофизических и физиологических про­ цессах в клетках­мишенях, в частности в ГМК ДМП. В нашей работе была предпринята попытка внести вклад в построение данных представлений с помощью ком­ пьютерного моделирования реакций ГМК на электро­ стимуляцию, осуществляемую согласно протоколам, которые применяются в процессе реабилитации детей, прооперированных по поводу АПК и ЭМПТЭ [1�. Результаты наших модельных исследований (рис. 2; 3) показали следующие наиболее существенные черты ответов ГМК на характерную для реабилита­ ционных протоколов стимуляцию множественными толчками тока, организованными в пачки или «кон­ верты». Во­первых, через большее или меньшее время после начала стимуляции вынужденные колебания МП и [Ca2+] i, частота которых равна частоте сле­ дования стимулов, становятся стационарными. Эти колебания одинаковы при стимуляции как пачка­ ми, так и «конвертами» равной частоты, хотя в пач­ ках амплитуда стимулов постоянна изначально, а в «конвертах» достигается постепенно за некое ко­ нечное время. Во­вторых, параметры установившихся ответов NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 3 223 БИОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ГЛАДКОМЫШЕЧНОЙ КЛЕТКЕ проявляют характерную зависимость от частоты следования стимулов в пачке или «конверте». Чем больше частота (т. е. короче МСИ), тем меньше раз­ мах колебаний и больше деполяризационное сме­ щение среднего уровня МП относительно ПП (Er = = –54.7 мВ). Этот размах в условиях нашей модели составлял 6.26 и 10.23 мВ при частотах 20 и 200 с­1 соответственно. В­третьих, длительность переходных процессов в ГМК различна. Электрические колебания стано­ вятся стационарными многократно быстрее, чем концентрационные. Переход в установившийся ре­ жим и тех, и других процессов реализуется более быстро при меньшей частоте стимуляции. В­четвертых, порог возбуждения ГМК на началь­ ном этапе стимуляции «конвертом» проявляет адап­ тационное повышение. В долговременном плане это, однако, не сказывалось на параметрах устано­ вившихся колебаний. Рассчитанные для каждого случая парциальные токи и кальциевые транзиенты, сопровождающие вызванные электростимуляцией изменения МП, по­ зволяют охарактеризовать природу наблюдавших­ ся реакций ГМК. Как и любое модельное исследо­ вание, данная работа вызывает ряд естественных вопросов. Насколько адекватна модель? Каковы ее ограничения и возможности в плане отображения процессов, реально происходящих в клетках­про­ тотипах? Какие особенности изучаемых процес­ сов выявляются с помощью модели? Как можно использовать полученные результаты для совер­ шенствования процедур реабилитационной элек­ тростимуляции? Адекватность, возможности и ограничения мо­ дели. Использованная в данном исследовании мо­ дель ГМК ДМП, несмотря на ряд неизбежных упрощений и ограничений, способна адекватно воспроизводить характерные для клеток­прототи­ пов ПД, генерируемые в ответ на приложение оди­ ночных электрических стимулов (см. [5�, рис. 1). На этом основании можно полагать, что и полу­ ченные характеристики ответов модельной ГМК на множественную стимуляцию с параметрами, соот­ ветствующими протоколам реабилитационной сти­ муляции (рис. 2; 3), также адекватно отображают особенности реакций клеток­прототипов. Поскольку нам не удалось обнаружить в лите­ ратуре точных данных о концентрации Са2+ в ГМК ДМП при возбуждении, трудно оценить, насколь­ ко близки к прототипу пиковые и средние уровни [Ca2+] i, наблюдавшиеся в нашей модельной ГМК в условиях стимуляции. Если, однако, учесть до­ ступные данные относительно клеток других типов (нервных и мышечных), наблюдавшиеся нами вы­ нужденные колебания концентрации несколько пре­ вышают физиологический уровень, особенно в слу­ чае высокочастотной стимуляции (рис. 2, Б, Г; 3, А). Это обстоятельство требует отнестись с особым вниманием как к параметрам, определяющим по­ ступление в цитозоль и экструзию кальция, так и к протоколам стимуляции. Последнее важно в плане выбора таких параметров реабилитационной элек­ тростимуляции, которые исключали бы длительное чрезмерное повышение уровня свободного Са2+, способное привести к нежелательным побочным цитотоксическим эффектам. Другим принципиальным ограничением было рассмотрение в данной работе только тех процес­ сов, которые вызывались в модельной ГМК исклю­ чительно прямым электрическим воздействием приложенного извне деполяризующего тока. При чрезтканевой электростимуляции, однако, клетка может испытывать и воздействия нейромедиато­ ров/трансмиттеров, выделяемых из окончаний воз­ бужденных теми же стимулами парасимпатических и/или симпатических нервных волокон. Эффекты парасимпатических и симпатических воздействий, прилагаемых изолированно или в комбинации с прямыми электрическими стимулами являются предметом наших дальнейших исследований, вы­ ходящих за рамки настоящей работы. С учетом отмеченных ограничений модель ГМК ДМП открывает, однако, пока недоступную для экс­ периментальных и клинических исследований воз­ можность одновременного наблюдения вызванных стимуляцией изменений МП, парциальных токов и внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+] i). Сопоставление этих электрических и концентра­ ционных процессов позволяет охарактеризовать механизмы реагирования клеток на стимуляцию, определить роли, которые в функционировании данных механизмов играют токи через ионные ка­ налы разных типов, потоки поступления и экстру­ зии кальция – важнейшего фактора, влияющего как на возбудимость, так и на сократимость ГМК. По­ лученные результаты (рис. 1) позволяют высказать следующие суждения о функциях разных парциаль­ ных ионных токов. Неинактивурующийся натрие­ вый ток, первым реагируя на деполяризационный толчок и достигая своего максимума, обеспечива­ ет первичную регенеративную деполяризацию, ко­ торая активирует кальциевые каналы Т­типа. Ток NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2014.—T. 47, № 3224 А. В. КОЧЕНОВ, Е. П. ПОДДУБНАЯ, И. А. МАКЕДОНСКИЙ, С. М. КОРОГОД через Т­каналы поддерживает смещение МП до уровня активации кальциевых каналов L­типа. Ак­L­типа. Ак­­типа. Ак­. Ак­ тивация последних вместе с эффектами вышена­ званных токов приводит к формированию полно­ ценного ПД, во время которого кальций поступает в клетку; связанное с этим продолжительное повы­ шение [Ca2+]i приводит к активации кальцийзависи­ мых хлорных каналов. Деполяризационный хлор­ ный ток на пике ПД меняет своё направление на гиперполяризационное и тем самым ограничивает амплитуду ПД. По окончании деполяризационного максимума, обусловленного генерацией ПД, кон­ центрация Са2+ некоторое время остается достаточ­ ной для активации кальцийзависимых хлорных ка­ налов, вследствие чего ток через эти каналы вновь меняет своё направление. Становясь деполяриза­ ционным, он формирует продолжительную следо­ вую деполяризацию. Роль токов через потенциалза­ висимые калиевые каналы и калиевые каналы типа Kir2.1 заключается в формировании ПП и ограни­ чении амплитуды ПД, тогда как ток через кальций­ зависимые калиевые каналы типа BK (активация которых происходит несколько позже) также огра­ ничивает амплитуду ПД и определяет его продол­ жительность, а также амплитуду следовой гиперпо­ ляризации. Ток через кальцийзависимые калиевые каналы типа SK, которые активируются наиболее поздно (спустя ~42.8 мс после пика ПД), опреде­ ляет продолжительность следовой гиперполяриза­ ции (см. вставку на рис. 1, Г). Благодаря тому, что мы включили в модель SK­ток и подвергли адекват­SK­ток и подвергли адекват­K­ток и подвергли адекват­ ной модификации ВК­ток, в условиях данной мо­ дели следовая гиперполяризация была более дли­ тельной и глубокой, чем наблюдавшаяся на модели ГМК ДМП в нашей предыдущей работе [5�. Таким образом, следовые процессы находились в лучшем соответствии с характерными для прототипа. Биофизические основы для анализа и выбора протоколов реабилитационной электростимуля­ ции ДМП. Как отмечалось выше, электростимуля­ ция ДМП является важной составляющей проце­ дур реабилитации у детей, прооперированных по поводу врожденных пороков (АПК и ЭМПТЭ), ко­ торые часто сопровождаются дефицитом М2/М3­ холинорецепторов [1�. Протоколы и параметры та­ кой электростимуляции устанавливаются более или менее жестко в используемых для данных целей ап­ паратно­программных комплексах, например таком, как «Urostym» («Laborie Medical Technologies», Ка­ нада), который широко используется в медицин­), который широко используется в медицин­ ской практике, в том числе и нами [1�. При этом в соответствующей документации не раскрываются медико­биологические обоснования тех или иных параметров. В настоящей работе мы попытались найти подход к обоснованию выбора таких пара­ метров реабилитационной электростимуляции с ис­ пользованием модельных расчетов электрических и концентрационных процессов, вызываемых в клет­ ках­мишенях. В нашем случае процессы в ГМК ДМП рассмотрены с учетом особенностей выше­ упомянутых патологий, а параметры стимуляции приближены к применяемым для этого контингента реабилитационным протоколам. Именно такая осо­ бенность, как дефицит М2/М3­холинорецепторов, обусловила то обстоятельство, что в данной работе внимание было сосредоточено на эффектах прямо­ го воздействия электрических импульсов на клет­ ки. Полагали, что даже если стимуляция возбуж­ дает парасимпатические нервные волокна, то при упомянутой молекулярной патологии функциони­ рование метаботропного холинергического пути возбуждения ГМК ослаблено или отсутствует. Вме­ сте с тем особенности дефицита пуринергических рецепторов в условиях рассматриваемой патологии пока не описаны. Поэтому нельзя исключить воз­ можность ионотропного действия выделяемой воз­ бужденными парасимпатическими окончаниями АТФ на Р2Х­рецепторные каналы, а следователь­ но, и возможность вклада токов через указанные каналы в формирование деполяризации и возбуди­ мость ГМК. Анализ процессов, развивающихся в ГМК ДМП в случае электростимуляции используемыми в упо­ мянутых реабилитационных процедурах пачками и «конвертами» деполяризующих стимулов с разны­ ми частотами следования (рис. 2; 3), показал сле­ дующее. Как оказалось при стимуляции как пачками, так и «конвертами» одинаковых стимулов с одинаковы­ ми частотами следования, по окончании переход­ ного процесса, длительность которого (сотни мил­ лисекунд) намного меньше общей длительности стимуляции (минуты или десятки минут), ответы ГМК становятся практически одинаковыми. Поэто­ му проблема альтернативного выбора между дву­ мя названными протоколами фактически отпадает. По нашему мнению, стимуляция пачками предпо­ чтительнее, поскольку она не требует задания до­ полнительных параметров (таких, как длительность фаз нарастания и спада амплитуды стимулов при раздражении «конвертами»). Характерные для высокочастотной стимуляции в NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 3 225 БИОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ГЛАДКОМЫШЕЧНОЙ КЛЕТКЕ установившемся режиме (рис. 2, А, В; 3, А) весь­ ма высокие уровни [Ca2+] i заставляют учитывать возможность развития существенных побочных цитотоксических эффектов, если чрезмерно высо­ кая концентрация поддерживается чрезмерно дол­ го. Очевидно, что возникает вопрос о предельных частотах и длительности электростимуляции. Для решения этого вопроса необходимо более точное, чем существует на сегодня, знание величин, от ко­ торых зависят количества и скорости поступления кальция в цитозоль (вход из внешней среды через потенциалзависимые кальциевые каналы мембра­ ны, высвобождение из депо, дебуферизация) и его экструзии и демобилизации («выкачка» насосами, депонирование, буферизация). Практическая по­ требность в таких сведениях указывает на перспек­ тивность и востребованность соответствующих экспериментальных исследований. В нашей модели при заданных параметрах перечисленных механиз­ мов, подробно описанных в ранее опубликованных работах [4, 5�, [Ca2+]i может возвращаться к низко­ му (практически базальному) уровню (<100 нМ) лишь в условиях частот следования стимулов ме­ нее 3.57 с­1 (МСИ >280 мс). Эта оценка может быть скорректирована по мере уточнения параметров, характеризующих свойства механизмов экструзии кальция (кальциевых насосов и обменников сарко­ леммы и депо, внутриклеточных буферов и т. п). Снижение порога генерации ПД в случае пря­ мого действия электрического стимула в услови­ ях повышенной проводимости Р2Х­рецепторных каналов (данные не иллюстрируются; см. [5�, рис. 1), пропускающих входящий ток, привлекает вни­ мание к возможности функционально равноэф­ фективной реабилитационной стимуляции при по­ ниженной (соответственно, скорее всего, менее дискомфортной) интенсивности стимулов на фоне премедикации пуриномиметиками. Соответствую­ щие биофизические предпосылки явятся предме­ том нашего дальнейшего модельного исследования реакций ГМК на парасимпатическое возбуждение, включая комбинацию последнего с прямым элек­ трическим возбуждением. Настоящее исследование не было связано с какими­либо экспериментами на животных или тестами с участием лю­ дей; ввиду этого подтверждения соответствия существую­ щим этическим стандартам научных публикаций в данном аспекте не требуется. А. В. Коченов, Е. П. Поддубная, И. А. Македонский и С. М. Корогод подтверждают, что в процессе работы отсут­ ствовали конфликты любого рода, касающиеся коммерческих или финансовых отношений, отношений с организациями или лицами, которые каким­либо образом могли быть связа­ ны с исследованием, и взаимоотношений соавторов статьи. А. В. Коченов1,3, О. П. Піддубна2,3, І. О. Македонський2 , С. М. Корогод1 БІОФІЗИЧНІ ПРОЦЕСИ В ГЛАДЕНЬКОМ’ЯЗОВІЙ КЛІТИНІ ДЕТРУЗОРА СЕЧОВОГО МІХУРА ПРИ РЕАБІЛІТАЦІЙНІЙ ЕЛЕКТРОСТИМУЛЯЦІЇ: МОДЕЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ 1Міжнародний центр молекулярної фізіології (Дніпропетровське відділення) НАН України (Україна). 2Дніпропетровський обласний спеціалізований клінічний медичний центр матері та дитини ім. проф. М. Ф. Руднєва (Україна). 3Державний заклад «Дніпропетровська медична академія МОЗ України» (Україна). Р е з ю м е Робота була спрямована на пошук підходів, які забезпечу­ ють біофізично обґрунтований вибір параметрів електро­ стимуляції гладеньком’язових клітин (ГМК) детрузора сечо­ вого міхура (ДСМ). Така стимуляція широко застосовується при реабілітації пацієнтів, оперованих з приводу вроджених вад розвитку. Дослідження були виконані на комп’ютерній моделі з урахуванням експериментальних даних щодо при­ таманних біологічному прототипу іонних каналів і насо­ сів сарколеми та механізмів регуляції внутрішньоклітин­ ної концентрації кальцію ([Ca2+]i). Вивчали сполучені зміни мембранного потенціалу (МП), парціальних трансмембран­ них струмів та [Ca2+]i, котрі викликалися поштовхами депо­ ляризуючого струму, організованими відповідно до прото­ колів реабілітаційної стимуляції (в пачки або «конверти» з постійною або трапецеїдально модульованою амплітудою). Модельна ГМК ДСМ відповідала на дію поодинокого сти­ мулу генерацією потенціалу дії (ПД), близького до такого у прототипу. Подразнення як пачками, так і «конвертами» однакових стимулів призводило до встановлення однако­ вих вимушених електричних і концентраційних коливань з параметрами, залежними від тривалості міжстимульних ін­ тервалів (МСІ). Такі коливання та регенеративні відповіді, викликані стимуляцією з типовими для реабілітаційних про­ токолів МСІ 5 і 50 мс (порівнянними з тривалостями абсо­ лютної та відносної рефрактерності модельної ГМК), істот­ но розрізнялися; розмах і середній рівень деполяризаційних змін МП і [Ca2+]i були більш високими при високочастотній стимуляції. В разі коротких МСІ [Ca2+]i, не встигаючи по­ вертатися до базального рівня, коливалась у діапазоні зна­ чень, які в інших збудливих клітинах перевищують фізіо­ логічну норму. Ці дані підкреслюють необхідність точного встановлення кінетичних характеристик механізмів, що ви­ значають надходження та екструзію Ca2+ у ГМК ДСМ для запобігання можливим побічним цитотоксичним впливам NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2014.—T. 47, № 3226 А. В. КОЧЕНОВ, Е. П. ПОДДУБНАЯ, И. А. МАКЕДОНСКИЙ, С. М. КОРОГОД високих рівнів [Ca2+] i. Істотним для спостережних проце­ сів біофізичним параметром ГМК ДСМ був також потенціал інверсії (ECl) кальційзалежного хлорного струму, що акти­ вується, зокрема, парасимпатичними впливами на М2/М3­ холінорецептори. При періодичному перевищенні значення ECl високочастотними коливаннями МП вказаний струм змі­ нював свій основний (деполяризаційний) напрямок на про­ тилежний (гіперполяризаційний). СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. І. О. Македонський, О. П. Піддубна, “Клінічні можливості систем з біологічним зворотним зв’язком у лікуванні нетримання сечі у дітей з екстрофією сечового міхура”, Мед. перспективи, 16, № 2, 59­65 (2011). 2. I. A. Makedonsky, “Immunohystochemical investigation of the M2 and M3 muscarinic receptors in patients with bladder exstrophy,” Eur. Urol., 4, No. 2, 182 (2004). 3. І. О. Македонський, “Морфологічні та функціональні властивості сечового міхура у дітей з аноректальними аномалiями”, Хірургія дит. віку, 4, № 4, 46­52 (2007). 4. S. M. Korogod, A. V. Kochenov, and I. A. Makedonsky, “Biophysical mechanism of parasympathetic excitation of urinary bladder smooth muscle cells: a simulation study,” Neurophysiology, 46, No. 4, 199­205 (2014). 5. А. В. Коченов, Е. П. Поддубная, И. А. Македонский, С. М. Корогод, “Характеристики возбудимости гладко­ мышечной клетки детрузора мочевого пузыря как основа выбора параметров реабилитационной электростимуляции: модельное исследование”, Neuro physiology/Нейро физио­ логия, 47, № 2, 114­122 (2015). 6. M. L. Hines and N. T. Carnevale, “The NEURON simulation environment,” Neural Comput., 9, No. 6, 1179­1209 (1997). 7. D. B. Jaffe, B. Wang, and R. Brenner, “Shaping of action potentials by type I and type II large­conductance Ca2+­ activated K+ channels,” Neuroscience, 192, 205­218 (2011). 8. G. V. Petkov, “Role of potassium ion channels in detrusor smooth muscle function and dysfunction,” Nat. Rev. Urol., 9, No. 1, 30­40 (2011). 9. G. V. Petkov, “Central role of the BK channel in urinary bladder smooth muscle physiology and pathophysiology,” Am. J. Physiol. Regulat. Integr. Comp. Physiol., 307, No. 6, R571­R584 (2014). 10. N. Bronstein­Sitton, “Ca2+­dependent K+ channels at the crossroads of cell metabolism,” Modulator, No. 5, 10­14 (2005). 11. G. M. Herrera and M. T. Nelson, “Differential regulation of SK and BK channels by Ca(2+) signals from Ca(2+) channels and ryanodine receptors in guinea­pig urinary bladder myocytes,” J. Physiol., 541, Part 2, 483­492 (2002). 12. F. Vogalis and R. K. Goyal, “Activation of small conductance Ca(2+)­dependent K+ channels by purinergic agonists in smooth muscle cells of the mouse ileum,” J. Physiol., 502, Part 3, 497­ 508 (1997). 13. J. Laforet, D. Guiraud, D. Andreu, et al., “Smooth muscle modeling and experimental identification: application to bladder isometric contraction,” J. Neural Eng., 8, No. 3, 1­13 (2011). 14. R. S. White, B. G. Zemen, Z. Khan, et al., “Evaluation of mouse urinary bladder smooth muscle for diurnal differences in contractile properties,” Front. Pharmacol., 5, No. 293, 1­8 (2015). 15. J. Haslam and J. Laycock, Therapeutic Management of Incontinence and Pelvic Pain. Pelvic Organ Disorders , Springer­Verlag, London (2008). 16. C. H. Fry, G. Sui, and C. Wu, “T­type Ca2+channels in non­ vascular smooth muscles,” Cell Calcium, 40, No. 2, 231­239 (2006). 17. T. F. Lue, C. A. Gleason, G. B. Brock, et al., “Intraoperative electrostimulation of the cavernous nerve: technique, results and limitations,” J. Urol., 154, No. 4, 1426­1428 (1995). 18. N. N. Hanna, J. Guillem, A. Dosoretz, et al., “Intraoperative parasympathetic nerve stimulation with tumescence monitoring during total mesorectal excision for rectal cancer,” J. Am. Coll. Surg., 195, No. 4, 506­512 (2002). 19. G. M. da Silva, O. Zmora, L. Borjesson, et al., “The efficacy of a nerve stimulator (CaverMap) to enhance autonomic nerve identification and confirm nerve preservation during total mesorectal excision,” Dis. Colon. Rectum, 47, No. 12, 2032­ 2038 (2004). 20. W. Kneist, A. Heintz, and T. Junginger, “Intraoperative identification and neurophysiologic parameters to verify pelvic autonomic nerve function during total mesorectal excision for rectal cancer,” J. Am. Coll. Surg., 198, No. 1, 59­66 (2004). 21. W. Kneist and T. Junginger, “Validity of pelvic autonomic nerve stimulation with intraoperative monitoring of bladder function following to talmesorectal excision for rectal cancer,” Dis. Colon. Rectum., 48, No. 2, 262­269 (2005). 22. A. Katahira, H. Niikura, Y. Kaiho, et al., “Intraoperative electrical stimulation of the pelvic splanchnic nerves during nerve­sparing radical hysterectomy,” Gynecol. Oncol., 98, No. 3, 462­466 (2005). 23. І. О. Македонський, “Профілактика ураження органів сечостатевої системи під час хірургічної корекції аноректальних вад у дітей”, Урологія, 15, № 2 (57), 28­31 (2011). 24. Пат. 63684 Україна, МПК (2011.01) A61B 17/00, Спосіб лікування аноректальних вад розвитку, І. О. Македонський, опубл. 10.10.11, Бюл. № 19.

Ähnliche Einträge