Влияние индуцированного валиномицином входа калия на образование активных форм кислорода в митохондриях мозга крыс

Влияние индуцированного валиномицином входа калия на образование активных форм кислорода в митохондриях мозга крыс

Изучено влияние потенциалзависимого входа калия, индуцированного валиномицином, на образование активных форм кислорода (АФК) в препаратах изолированных митохондрий мозга крыс. В присутствии валиномицина с повышением концентрации K⁺ в среде стационарная скорость образования АФК снижалась. Сделан вы...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Date:2013
Main Authors: Акопова, О.В., Колчинская, Л.И, Носарь, В.И., Бурый, В.А., Маньковская, И.Н., Сагач, В.Ф.
Format: Article
Language:Russian
Published: Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України 2013
Series:Нейрофизиология
Online Access:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148237
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Вплив індукованого валіноміцином входу калію на утворення активних форм кисню в мітохондріях мозку щурів / О.В. Акопова, Л.И. Колчинская, В.И. Носарь, В.А. Бурый, И.Н. Маньковская, В.Ф. Сагач // Нейрофизиология. — 2013. — Т. 45, № 5. — С. 436-444. — Бібліогр.: 32 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-148237
record_format dspace
spelling irk-123456789-1482372019-02-18T01:25:02Z Влияние индуцированного валиномицином входа калия на образование активных форм кислорода в митохондриях мозга крыс Акопова, О.В. Колчинская, Л.И Носарь, В.И. Бурый, В.А. Маньковская, И.Н. Сагач, В.Ф. Изучено влияние потенциалзависимого входа калия, индуцированного валиномицином, на образование активных форм кислорода (АФК) в препаратах изолированных митохондрий мозга крыс. В присутствии валиномицина с повышением концентрации K⁺ в среде стационарная скорость образования АФК снижалась. Сделан вывод, что снижение продукции АФК в митохондриях мозга обусловлено деполяризующим эффектом потенциалзависимого входа K⁺. Результаты экспериментов указывают на потенциалзависимый механизм регуляции образования АФК в условиях калийиндуцированной деполяризации мембраны валиномицином в митохондриях ткани мозга. Досліджено вплив потенціалзалежного входу калію, індукованого валіноміцином, на утворення активних форм кисню (АФК) у препаратах ізольованих мітохондрій мозку щурів. У присутності валіноміцину з підвищенням концентрації K⁺ стаціонарна швидкість утворення АФК знижувалася. Зроблено висновок, що зниження продукції АФК у мітохондріях мозку зумовлено деполяризуючим ефектом потенціалзалежного входу K⁺. Результати експериментів вказують на потенціалзалежний механізм регуляції утворення АФК в умовах калійіндукованої деполяризації мембрани валіноміцином у мітохондріях тканини мозку 2013 Article Вплив індукованого валіноміцином входу калію на утворення активних форм кисню в мітохондріях мозку щурів / О.В. Акопова, Л.И. Колчинская, В.И. Носарь, В.А. Бурый, И.Н. Маньковская, В.Ф. Сагач // Нейрофизиология. — 2013. — Т. 45, № 5. — С. 436-444. — Бібліогр.: 32 назв. — рос. 0028-2561 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148237 577.352.3 ru Нейрофизиология Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
description Изучено влияние потенциалзависимого входа калия, индуцированного валиномицином, на образование активных форм кислорода (АФК) в препаратах изолированных митохондрий мозга крыс. В присутствии валиномицина с повышением концентрации K⁺ в среде стационарная скорость образования АФК снижалась. Сделан вывод, что снижение продукции АФК в митохондриях мозга обусловлено деполяризующим эффектом потенциалзависимого входа K⁺. Результаты экспериментов указывают на потенциалзависимый механизм регуляции образования АФК в условиях калийиндуцированной деполяризации мембраны валиномицином в митохондриях ткани мозга.
format Article
author Акопова, О.В.
Колчинская, Л.И
Носарь, В.И.
Бурый, В.А.
Маньковская, И.Н.
Сагач, В.Ф.
spellingShingle Акопова, О.В.
Колчинская, Л.И
Носарь, В.И.
Бурый, В.А.
Маньковская, И.Н.
Сагач, В.Ф.
Влияние индуцированного валиномицином входа калия на образование активных форм кислорода в митохондриях мозга крыс
Нейрофизиология
author_facet Акопова, О.В.
Колчинская, Л.И
Носарь, В.И.
Бурый, В.А.
Маньковская, И.Н.
Сагач, В.Ф.
author_sort Акопова, О.В.
title Влияние индуцированного валиномицином входа калия на образование активных форм кислорода в митохондриях мозга крыс
title_short Влияние индуцированного валиномицином входа калия на образование активных форм кислорода в митохондриях мозга крыс
title_full Влияние индуцированного валиномицином входа калия на образование активных форм кислорода в митохондриях мозга крыс
title_fullStr Влияние индуцированного валиномицином входа калия на образование активных форм кислорода в митохондриях мозга крыс
title_full_unstemmed Влияние индуцированного валиномицином входа калия на образование активных форм кислорода в митохондриях мозга крыс
title_sort влияние индуцированного валиномицином входа калия на образование активных форм кислорода в митохондриях мозга крыс
publisher Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
publishDate 2013
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148237
citation_txt Вплив індукованого валіноміцином входу калію на утворення активних форм кисню в мітохондріях мозку щурів / О.В. Акопова, Л.И. Колчинская, В.И. Носарь, В.А. Бурый, И.Н. Маньковская, В.Ф. Сагач // Нейрофизиология. — 2013. — Т. 45, № 5. — С. 436-444. — Бібліогр.: 32 назв. — рос.
series Нейрофизиология
work_keys_str_mv AT akopovaov vliânieinducirovannogovalinomicinomvhodakaliânaobrazovanieaktivnyhformkislorodavmitohondriâhmozgakrys
AT kolčinskaâli vliânieinducirovannogovalinomicinomvhodakaliânaobrazovanieaktivnyhformkislorodavmitohondriâhmozgakrys
AT nosarʹvi vliânieinducirovannogovalinomicinomvhodakaliânaobrazovanieaktivnyhformkislorodavmitohondriâhmozgakrys
AT buryjva vliânieinducirovannogovalinomicinomvhodakaliânaobrazovanieaktivnyhformkislorodavmitohondriâhmozgakrys
AT manʹkovskaâin vliânieinducirovannogovalinomicinomvhodakaliânaobrazovanieaktivnyhformkislorodavmitohondriâhmozgakrys
AT sagačvf vliânieinducirovannogovalinomicinomvhodakaliânaobrazovanieaktivnyhformkislorodavmitohondriâhmozgakrys
first_indexed 2025-07-12T18:41:24Z
last_indexed 2025-07-12T18:41:24Z
_version_ 1837467672697110528
fulltext NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 5436 УДК 577.352.3 О. В. АКОПОВА1, Л. И. КОЛЧИНСКАЯ1, В. И. НОСАРЬ1, В. А. БУРЫЙ1, И. Н. МАНЬКОВСКАЯ1, В. Ф. САГАЧ1 ВЛИЯНИЕ ИНДУЦИРОВАННОГО ВАЛИНОМИЦИНОМ ВХОДА КАЛИЯ НА ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В МИТОХОНДРИЯХ МОЗГА КРЫС Поступила 05.08.13 Изучено влияние потенциалзависимого входа калия, индуцированного валиномицином, на образование активных форм кислорода (АФК) в препаратах изолированных митохон- дрий мозга крыс. В присутствии валиномицина с повышением концентрации K+ в среде стационарная скорость образования АФК снижалась. Сделан вывод, что снижение про- дукции АФК в митохондриях мозга обусловлено деполяризующим эффектом потенци- алзависимого входа K+. Результаты экспериментов указывают на потенциалзависимый механизм регуляции образования АФК в условиях калийиндуцированной деполяриза- ции мембраны валиномицином в митохондриях ткани мозга. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: калий, мембранный потенциал, активные формы кислоро- да (АФК), митохондрии мозга. 1 Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев (Украина). Эл. почта: a-dubensky@mail.ru (О. В. Акопова). ВВЕДЕНИЕ Потенциалзависимый вход ионов калия является универсальным процессом, обеспечивающим мо- дуляцию функций митохондрий. Всё возрастаю- щее число экспериментальных работ, публикуемых в последние годы, свидетельствует о значительном интересе, который вызывает названный феномен. Результаты этих работ, как и наших собственных исследований, указывают на то, что потенциалза- висимый вход калия в матрикс митохондрий, опо- средуемый митохондриальными калиевыми кана- лами, регулирует потребление кислорода [1–4], объем матрикса [1], мембранный потенциал [3, 5] и основные энергозависимые процессы в митохон- дриях – синтез АТФ [3, 6, 7] и транспорт Са2+ [5, 8]. Вход К+ также существенно влияет на образование активных форм кислорода – АФК [9, 10]. К настоящему времени идентифицированы четы- ре типа калиевых каналов во внутренней мембра- не митохондрий – АТФ-зависимые калиевые кана- лы (K+ ATP-каналы), кальцийактивируемые калиевые каналы высокой проводимости (ВKCa-каналы), по- тенциалзависимые калиевые каналы (Kv 1.1 и Kv 1.3) и калийпроводящие твин-поры TASK-3 [11]. Однако, как известно, в митохондриальной мем- бране присутствуют множество калиевых каналов еще не идентифицированных типов [11], физио- логическая роль которых неясна. По имеющимся данным, АТФ-зависимый вход K+ физиологически более значим, чем другие типы калиевой проводи- мости, и его биоэнергетические аспекты наиболее изучены [1, 12]. Полагают, что хорошо известные кардио- и нейропротекторные эффекты активато- ров K+ ATP-каналов, близкие к таковым ишемической адаптации (preconditioning) [13, 14], базируются на регуляции образования АФК, триггеров открывания митохондриальной поры [15] и индукции клеточно- го апоптоза [16]. Митохондрии являются основными производите- лями АФК в клетке [17, 18]. Известно, что интен- сивность образования АФК зависит от метаболиче- ского и функционального состояния митохондрий и в значительной мере обусловлена работой дыха- тельной цепи [17, 19]. Установлено, что основная доля продукции супероксида – первичного свобод- норадикального продукта восстановления кисло- рода, образуемого в митохондриях, – приходится на комплексы I и III дыхательной цепи. Высокий мембранный потенциал и восстановленное состоя- ние пулов пиридиновых нуклеотидов и убихинона, NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 5 437 ВЛИЯНИЕ ИНДУЦИРОВАННОГО ВАЛИНОМИЦИНОМ ВХОДА КАЛИЯ а также цитохрома b в комплексе III способствуют высокой продукции АФК [17, 19–21]. В условиях гиперполяризации мембраны транспорт электронов по градиенту редокс-потенциала в определенных участках дыхательной цепи становится термодина- мически невыгодным. Это ведет к «утечке электро- нов» к кислороду в редокс-активных сайтах – FMN- связывающем сайте I комплекса [22] и наружном сайте связывания убихинона Qo в комплексе III, где супероксид образуется вследствие аутоокисления убисемихинона, CoQ× –(предполагаемого свободно- радикального интермедиата Q-цикла) [18, 23]. Хотя, по мнению большинства исследователей, цитопротекторные эффекты фармакологических активаторов калиевых каналов во многом обуслов- лены регуляцией уровня митохондриальной про- дукции АФК [9, 10], изучение непосредственного влияния таких активаторов на образование АФК в изолированных митохондриях привело к неод- нозначным результатам. Сообщалось, что в мито- хондриях сердца может наблюдаться как снижение [10], так и повышение выхода АФК [9] под дей- ствием активаторов K+ ATP-каналов. Активация ВKCa- каналов вызывала снижение продукции АФК в ми- тохондриях мозга [24], но в митохондриях сердца образование АФК усиливалось [25]. Цитопротек- торные эффекты активаторов калиевых каналов, обусловленные подавлением активности мито- хондриальных пор, интерпретировали как резуль- тат либо уменьшения [10], либо усиления продук- ции АФК [9]. В первом случае механизм защиты объясняли непосредственным уменьшением веро- ятности открывания поры вследствие снижения продукции АФК [10]. Во втором же случае предпо- лагалось, что защитный механизм основан на ак- тивации митохондриальной изоформы протеинки- назы С, а это также в итоге ведет к блокированию поры в митохондриях [26]. Очевидно, однако, что вопрос о роли калиевых каналов в регуляции об- разования АФК в митохондриях в настоящее время еще не решен. Противоречивость эксперименталь- ных данных, приведенных в литературе, может объ- ясняться как существенной спецификой биоэнерге- тических эффектов транспорта K+ в клетках разных типов, так и неспецифичностью влияний фармако- логических активаторов калиевых каналов [11]. Все это затрудняет идентификацию регуляторных меха- низмов влияния потенциалзависимого входа K+ на продукцию АФК в митохондриях. Согласно данным литературы [3, 9, 27], био- энергетические эффекты потенциалзависимого вхо- да K+ в митохондрии хорошо воспроизводятся K+- ионофором валиномицином. При концентрациях, обеспечивающих существенное повышение калие- вой проводимости мембраны, какого-либо неспеци- фического действия валиномицина на митохондрии не выявлено. Это дает возможность использовать валиномицин для изучения непосредственных вли- яний модуляции транспорта K+ на митохондриаль- ные функции. В нашей работе мы изучали влияние потенциалзависимого входа K+, индуцированного валиномицином, на образование АФК в митохон- дриях мозга крыс. МЕТОДИКА В опытах использовали белых крыс линии Вистар с массой тела 200–250 г. После декапитации го- ловной мозг изымали, промывали охлажденным (4 °C) 0.9 %-ным раствором KCl, измельчали и го- могенизировали в пятикратном объеме среды, со- держащей в себе 250 мМ сахарозы, 20 мМ Tris- НCl-буфера, 1 мМ ЭДТА и 1 мг/мл БСА (рН 7.4). Для выделения митохондрий гомогенат центрифу- гировали 7 мин при 1000g и температуре 4 °C, по- лученный супернатант – 15 мин при 12000g и той же температуре. Осадок суспендировали в неболь- шом объеме среды без добавления ЭДТА и БСА и хранили на льду (4 °C). Содержание белка опреде- ляли по методу Лоури. Образование АФК оценивали по изменению флуо- ресценции дихлорофлуоресцеина, как было опи- сано нами ранее [28]. Для этого митохондрии за- гружали нефлуоресцирующим проникающим зон- дом 2',7'-дигидродихлорофлуоресцеина диацетатом (DCFH-DA), который затем гидролизуется в матрик- се до непроникающего производного (дигидрофлу- оресцеина) и, после окисления митохондриальными АФК, образует дихлорофлуоресцеин (DCF). Су- спензию митохондрий загружали DCFH-DA (конеч- ная концентрация 200 мкМ) в течение 20 мин при 37 °C; после загрузки пробы и отмывания внешнего зонда путем переосаждения митохондрий суспен- зию хранили на льду. Аликвоты суспензии с коли- чеством белка 1 мг/мл вносили в среду инкубации (300 мМ сахарозы, 2 мМ Tris-НCl-буфера (рН 7.4), 5 мМ Na-сукцината, 1 мМ NaH2PO4, 1 мкМ цикло- спорина А, 15 мкМ CaCl2). KCl вводили до необхо- димых концентраций, поддерживая осмолярность на уровне 300 мосмоль/л путем добавления саха- розы в соответствующих количествах. Интенсив- NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 5438 О. В. АКОПОВА, Л. И. КОЛЧИНСКАЯ, В. И. НОСАРЬ и др. ность флуоресценции DCF измеряли при длинах волн возбуждения и эмиссии 504 и 525 нм соответ- ственно. Из величины флуоресцентного сигнала (F) вычитали интенсивность базальной флуоресценции (F0), обусловленной внесением митохондрий в сре- ду инкубации. Базальное значение находили путем экстраполяции кинетических кривых к нулевому моменту времени. Мембранный потенциал митохондрий (количе- ство белка в пробах 1 мг/мл) измеряли в присут- ствии 10 мкМ сафранина при длинах волн воз- буждения и эмиссии 495 и 586 нм соответственно [3]. Находили разность между величинами флуо- ресцентного сигнала и базальной флуоресценции деполяризованных митохондрий после внесения 5∙10-6 М ротенона и 10-6 М СССР. Для определения изменений рН матрикса, обу- словленных транспортом K+, митохондрии за- гружали рН-чувствительным зондом 2’7’-бис- (2-карбоксиэтил)-5(6)-карбоксифлуоресцеином (BCECF, конечная концентрация 10 мкМ), как было описано нами ранее [5]. Пробы инкубирова- ли 10 мин при 37 °С, после чего отмывали от зон- да. Аликвоты (0.5 мг/мл белка) вносили в среду ин- кубации и измеряли интенсивность флуоресценции BCECF; длины волн возбуждения и эмиссии со- ставляли соответственно 509 и 535 нм. Находили разность между интенсивностями флуоресценции зонда (F) и базальной флуоресценции (F0), которую определяли путем экстраполяции кинетических кривых к нулевому моменту времени. Изменения рН и транспорта протонов количественно оценива- ли с помощью калибровочных кривых, полученных с применением потенциометрического титрования аликвот суспензии митохондрий путем добавления HCl в присутствии 5∙10-6 М ротенона и 10-6 М СССР (использовали стеклянный микроэлектрод) при па- раллельной регистрации флуоресценции BCECF в тех же условиях. Потребление кислорода изучали в стандарт- ных условиях с применением полярографическо- го метода в закрытой ячейке объемом 1 мл с пла- тиновым электродом (температура 26 °С, конечная концентрация белка 1.5 мг/мл). Для регистрации мембранного потенциала, рН и интенсивности ды- хания использовали среду следующего состава (в миллимолях на 1 л): сахароза – 300, Tris-НCl-буфер (рН 7.4) – 2, Na-сукцинат – 5, NaH2PO4 – 1 и ЭДТА – 0.01 мМ. KCl доводили до необходимых концен- траций, поддерживая осмолярность на уровне 300 мосмоль/л. В работе использовали Na-сукцинат, Tris- основание, циклоспорин А («Fluka», Швей- цария) , 2 ’ ,7 ’ -дигидродихлорофлуоре сцеина диацетат (DCFH-DA), 2’7’-бис-(2-карбоксиэтил)- 5(6)-карбоксифлуоресцеин (BCECF), сафранин, ЭДТА, ротенон, малонат, карбонилцианид-m- хлорфенилгидразон – СССР («Sigma», США) и дру- гие реактивы (степень чистоты – ч. д. а.). Растворы готовили на бидистиллированной воде. Достовер- ность межгрупповых различий оценивали с помо- щью t-критерия Стьюдента; Р < 0.05 считали свиде- тельством статистической значимости. В тексте и подписях к рисункам приведены значения средних ± ± ошибка среднего. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Образование АФК в митохондриях мозга (рис. 1) регистрировали после установления стационар- ной скорости дыхания в состоянии 4 в присутствии субстрата окисления и в отсутствие АДФ. Уста- новление и поддержание стационарного состояния контролировали полярографически в параллель- ных экспериментах, как описывалось ранее [28]. В Р и с. 1. Изменения интенсивности флуоресценции дихлоро- флуоресцеина (F504/525, усл. ед.) во времени (мин) в присутствии (1) и в отсутствие (2) субстрата окисления (типичный пример). Достоверность линейной аппроксимации значений для кривой 1 R2 = 0.9995. n = 4. Р и с. 1. Зміни інтенсивності флуоресценції дихлорофлуо- ресцеїну (ум. од.) в часі в присутності (1) та за відсутності (2) субстрату окиснення (типовий приклад). 0 15 30 45 60 0 2 4 6 мин 1 2 NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 5 439 ВЛИЯНИЕ ИНДУЦИРОВАННОГО ВАЛИНОМИЦИНОМ ВХОДА КАЛИЯ отсутствие Са2+ величина флуоресцентного сигна- ла в препаратах митохондрий мозга была близка к нулю. Поэтому флуоресценцию DCF регистриро- вали после добавления в среду 15 мкМ Са2+ в от- сутствие ЭДТА и в присутствии циклоспорина А. Добавление Са2+ в условиях блокирования мито- хондриальной поры не влияло на мембранный по- тенциал митохондрий. Как показали полученные данные, окисление субстрата в состоянии 4 сопровождается повыше- нием флуоресценции DCF с постоянной (стацио- нарной) скоростью (рис. 1, 1), что свидетельствует об образовании АФК в митохондриях. Из литера- туры известно, что в матриксе и межмембранном пространстве митохондрий функционирует слож- ная система метаболизма АФК, в которую входят супероксид-дисмутазы (Mn- и Cu,Zn-SOD), катала- за, глутатион и ряд других физиологически значи- мых антиоксидантных и прооксидантных факторов [17, 21]. Образование АФК в дыхательной цепи со- провождается их дальнейшим превращением в ми- тохондриях. В то же время в отсутствие субстрата окисления и при блокировании транспорта электро- нов скорость образования АФК близка к нулю (2), что позволяет связать образование АФК, наблюда- емое в условиях нашего эксперимента, с работой дыхательной цепи. Постоянная скорость накопле- ния флуоресцирующего продукта (DCF) свидетель- ствует о том, что образование АФК поддерживается на определенном стационарном уровне, обеспечи- ваемом одновременной работой дыхательной цепи 1 мин CCCP CCCP CCCP CCCP CCCP 1 2 3 4 5 10 А Б В Р и с. 2. Влияние валиномицина на мембранный потенциал (А, Б) и скорость образования активных форм кислорода – АФК (В) в митохондриях мозга в присутствии калия. KCl вводили в концентрациях, указанных на оси абсцисс (мМ), валиномицин – в концентрации 10-7 М. А – типичные зависимости изменения флуоресценции сафранина (усл. ед.) после внесения валиномицина в среду; стрелками указано внесение 10-6 М СССР. Концентрации K+ 1 (1), 1.5 (2), 3 (3), 5 (4) и 120 (5) мМ. Б – зависимость нормированного мембранного потенциала митохондрий (%) от концентрации K+ (мМ) в присутствии валиномицина. В – влияние валиномицина на нормированную скорость образования АФК (%) в присутствии калия (мМ). n = 6 (Б, В). Р и с. 2. Вплив валіноміцину на мембранний потенціал (А, Б) та швидкість утворення активних форм кисню (В) у мітохондріях мозку в присутності калію. 0 25 50 75 100 % 0 2 4 6 8 10 мМ 0 25 50 75 100 0 2 4 6 8 10 мМ % NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 5440 О. В. АКОПОВА, Л. И. КОЛЧИНСКАЯ, В. И. НОСАРЬ и др. и митохондриальных систем метаболизма АФК [17, 21]. Таким образом, использование DCF как флуо- ресцентного маркера АФК [9, 10] позволяет реги- стрировать изменения их стационарного уровня в ходе окисления субстрата дыхания. Влияние потенциалзависимого транспорта K+ на образование АФК в митохондриях мозга изучали в условиях валиномицининдуцированного входа ука- занных ионов в матрикс энергизованных митохон- дрий. Известно, что в физиологических условиях концентрации калия в митохондриях и цитозоле примерно равны, составляя порядка 120–150 мМ [29]. Валиномицин обеспечивает диффузию K+ по градиенту концентрации данного катиона. Направ- ление транспорта K+ (в матрикс либо, наоборот, в среду) в присутствии валиномицина зависит от величины мембранного потенциала митохондрий [30]. Сказанное справедливо и для калиевых кана- лов клеточных мембран [30]. Поэтому концентра- ции K+ в среде подбирали таким образом, чтобы обеспечить потенциалзависимый вход этих ионов в матрикс при внесении валиномицина в суспензию митохондрий. Параллельно регистрировали измене- ния рН матрикса (pHi), сопутствующие транспорту K+ в матрикс либо высвобождению калия из мито- хондрий. Внесение валиномицина в среду инкубации, со- держащую в себе калий в разных концентрациях, приводило к усилению флуоресценции сафранина, что свидетельствует о снижении ΔΨm (рис. 2, А). Для оценки деполяризующего эффекта валиноми- цина определяли скорость изменения флуоресцен- ции сафранина после внесения валиномицина в среду. Степень деполяризации нормировали отно- сительно максимального эффекта, регистрируемого после внесения 10-6 М СССР либо валиномицина в присутствии 120 мМ K+ (А, 5). При низких концен- трациях добавленного K+ внесение валиномицина в среду практически не приводило к деполяризации (А, 1, 2). Деполяризующий эффект усиливался по мере повышения концентрации K+ в среде (А, 3–5, Б). Известно, что в митохондриях транспорт K+ в ма- трикс приводит к эквивалентному высвобожде- нию протонов из внутримитохондриальной среды [31], а это, в свою очередь, вызывает защелачива- ние последней. Повышение pH i свидетельствова- ло об аккумуляции K+ в митохондриях. Поэтому в присутствии валиномицина высвобождение прото- А Б нмоль Н+•мин–1•мг–1 –0.08 –0.03 0.02 0.07 0.12 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 10 20 30 40 50 120 мМ Р и с. 3. Влияние потенциалзависимого входа K+ на рН матрикса (pHi) и начальную скорость выхода протонов в митохондриях мозга. Показаны относительные изменения pHi (А) и V0 выхода Н + (нмоль Н+ ∙ мин–1 ∙ мг–1; Б) в присутствии (1) и в отсутствие (2) валиномицина за вычетом показателей в контроле (среда без калия). KCl вводили в концентрациях, указанных на оси абсцисс (мМ), валиномицин – в концентрации 10-7 М. n = 6. Р и с. 3. Вплив потенціалзалежного входу K+ на рН матриксу (pHi) та початкову швидкість виходу протонів у мітохондріях мозку. –80 –30 20 70 120 0 20 40 60 120 мМ 1 2 NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 5 441 ВЛИЯНИЕ ИНДУЦИРОВАННОГО ВАЛИНОМИЦИНОМ ВХОДА КАЛИЯ отсутствие валиномицина (Б, 1, 2), как и снижение pHi (А, 1), свидетельствуют о высвобождении K + из матрикса. Это, несмотря на наличие мембранного потенциала, может происходить вследствие высо- кого трансмембранного градиента концентраций K+ [30]. Повышение концентрации K+ приводит к вхо- ду данных катионов в матрикс (А, 1), зависящему от величины ΔΨm [30]. Таким образом, обеспечи- ваемый валиномицином вход K+ обусловливает де- поляризацию митохондрий, зависящую от значений ΔΨm и концентрации K + в среде (рис. 2, Б). Проведенная параллельно с оценкой влияния валиномицина на ΔΨm (рис. 2, Б) регистрация ин- тенсивности флуоресценции DCF показала, что скорость окисления зонда в присутствии валино- мицина снижается при том же диапазоне концен- траций K+, при котором наблюдается снижение ΔΨm (В). Полученные данные свидетельствуют о том, что деполяризация мембраны митохондрий в при- сутствии валиномицина приводит к снижению ста- нг-ат.О∙мин–1∙мг–1 А В Б Р и с. 4. Влияние малоната на скорость потребления кислорода (нг-ат.О∙мин–1∙мг–1; А), нормированный мембранный потен- циал (%; Б) и нормированную скорость образования активных форм кислорода (%; В) в митохондриях мозга. Показатели регистрировали в отсутствие K+. Малонат вводили в концентрациях, указанных на оси абсцисс (мМ). За 100 % приняты показатели в отсутствие малоната. n = 4. Р и с. 4. Вплив малонату на швидкість споживання кисню (нг-ат.О∙хв–1∙мг–1; А), нормований мембранний потенціал (%; Б) і нормовану швидкість утворення активних форм кисню (%; В) у мітохондріях мозку. нов и повышение pHi при деполяризующих концен- трациях K+ являются следствием валиномицинин- дуцированного входа K+ в матрикс митохондрий (рис. 3, А, Б, 1), что согласуется с литературными данными [9]. В отсутствие валиномицина повыше- ние pHi и выход Н + обусловлены входом K+ через калийпроводящие структуры мембраны (А, 2, Б, 2). В отсутствие K+ внесение валиномицина в среду приводило к закислению матрикса по сравнению с контролем (рис. 3, А, 1). «Отрицательная» скорость транспорта Н+ в отличие от контрольных значений в 0 5 10 15 20 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 мМ 0 25 50 75 100 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 мМ % 0 25 50 75 100 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 мМ % NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 5442 О. В. АКОПОВА, Л. И. КОЛЧИНСКАЯ, В. И. НОСАРЬ и др. ционарной скорости образования АФК (Б, В). Справедливость этого вывода подтверждается также результатами, полученными в условиях де- поляризации мембраны под действием малоната. Согласно результатам такого эксперимента, ин- гибирование сукцинат-дегидрогеназы (рис. 4, А) сопровождается деполяризацией мембраны ми- тохондрий (Б). Снижение ΔΨm, как и в случае по- тенциалзависимого входа K+, ведет к снижению скорости образования АФК в метаболическом со- стоянии 4 (В). Различают потенциалзависимые и потенциалне- зависимые механизмы образования АФК в мито- хондриях [21]. Относительно слабую зависимость от значений ΔΨm обнаруживают процессы образо- вания АФК, обусловленные восстановлением пула NADH/NAD+ либо образованием убисемихино- на (CoQ∙−) в Q-цикле [17, 21]. Известно, что при использовании сукцината как субстрата дыхания высокий выход АФК возможен вследствие обрат- ного транспорта электронов от сукцината к FMN- связывающему сайту I комплекса с соответствую- щим восстановлением пиридиновых нуклеотидов [17, 21, 22]. Обратный транспорт электронов тер- модинамически невыгоден, поскольку требует вы- соких величин электрохимического потенциала протонов ΔμН+, генерируемого дыхательной цепью митохондрий. Поэтому образование АФК вслед- ствие обратного транспорта электронов обнаружи- вает сильную зависимость от ΔΨm и подавляется ротеноном, который связывается в убихинонсвя- зывающем сайте I комплекса, тем самым блокируя последний [22]. Однако в условиях проведенного нами эксперимента внесение ротенона в среду ин- кубации не приводило к уменьшению уровня про- дукции АФК в митохондриях мозга. Поэтому на- блюдаемое уменьшение выхода АФК (рис. 2, В) не обусловлено подавлением обратного транспорта электронов, которое должно происходить при сни- жении мембранного потенциала митохондрий. Следует отметить, что в условиях прямого транс- порта электронов продукция АФК также зависит от ΔΨm, поскольку образование супероксида (с уче- том редокс-потенциала пары О2/О2∙−) определяет- ся величиной редокс-потенциала сайтов дыхатель- ной цепи, участвующих в образовании АФК [17]. В частности, показана зависимость редокс-потен- циала цитохрома b и степени восстановления пула убихинона (CoQH2/CoQ) от ΔΨm и ΔμН+ в митохон- дриях [20, 32]. Результаты нашего определения влияния потен- циалзависимого входа K+ и малоната на митохон- дриальную продукцию АФК свидетельствуют о близких зависимостях скорости образования АФК от величины деполяризующего эффекта (рис. 5). Это указывает на зависимость механизма продук- ции АФК от ΔΨm в условиях калийиндуцированной деполяризации митохондрий. Некоторое расхожде- ние результатов, наблюдаемое в области низких по- тенциалов в условиях деполяризации малонатом и валиномицином, может объясняться значительной разностью pHi при равных уровнях деполяризую- щих эффектов. Подавление активности дыхатель- ной цепи малонатом должно приводить к снижению pHi по сравнению с контролем по мере торможения процесса транспорта электронов, тогда как повы- шение входа K+ в присутствии валиномицина вы- зывает защелачивание матрикса (рис. 3, А, 1). Это уже само по себе способствует протеканию реакции с образованием супероксида [20]. Таким образом, регуляция интенсивности об- разования АФК в условиях валиномицининду- цированного входа K+ в митохондриях мозга реа- Р и с. 5. Влияние деполяризующего эффекта валиномицина (1) и ингибирования дыхания малонатом (2) на скорость образования активных форм кислорода (АФК) в митохондриях мозга. Нормированные значения деполяризации (%) определяли как разность нормированного потенциала в контроле и в присутствии валиномицина и малоната соответственно. За 100 % приняты мембранный потенциал и скорость образования АФК в отсутствие валиномицина и малоната (контроль). n = 6. Р и с. 5. Вплив деполяризуючого ефекту валіноміцину (1) і малонату (2) на утворення активних форм кисню в мітохондріях мозку. 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 % % 1 2 NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 5 443 ВЛИЯНИЕ ИНДУЦИРОВАННОГО ВАЛИНОМИЦИНОМ ВХОДА КАЛИЯ лизуется путем модуляции уровня мембранного потенциала последних. Деполяризация митохон- дрий вследствие потенциалзависимого входа K+ яв- ляется основной причиной снижения продукции АФК в условиях прямого транспорта электронов в дыхательной цепи. Результаты наших эксперимен- тов позволяют сделать вывод, что потенциалзави- симый вход K+, равным образом наблюдаемый и в физиологических условиях, может предотвращать гиперпродукцию АФК и оказывать нейропротектор- ное влияние при состояниях, связанных с наруше- нием окислительного метаболизма в митохондриях нейронов мозга. Исследования проводились в соответствии с положе- ниями Международной конвенции по защите животных, используемых в экспериментальных и других научных це- лях (Страсбург, 1985), а также в соответствии с положе- ниями Комитета по биоэтике Института физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины. Авторы настоящей статьи – О. В. Акопова, Л. И. Кол- чинская, В. И. Носарь, В. А. Бурый, И. Н. Маньковская и В. Ф. Сагач – подтверждают отсутствие у них конфликта интересов. Роботу частково виконано за фінансової підтримки комплексної міждисциплінарної програми наукових дослід- жень НАН України “Фундаментальні основи молекулярних та клітинних біотехнологій”. О. В. Акопова1, Л. І. Колчинська1, В. І. Носар1, В. О. Бурий1, І. М. Маньковська1, В. Ф. Сагач1 ВПЛИВ ІНДУКОВАНОГО ВАЛІНОМІЦИНОМ ВХОДУ КАЛІЮ НА УТВОРЕННЯ АКТИВНИХ ФОРМ КИСНЮ В МІТОХОНДРІЯХ МОЗКУ ЩУРІВ 1 Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ (Україна). Р е з ю м е Досліджено вплив потенціалзалежного входу калію, індуко- ваного валіноміцином, на утворення активних форм кисню (АФК) у препаратах ізольованих мітохондрій мозку щурів. У присутності валіноміцину з підвищенням концентрації K+ стаціонарна швидкість утворення АФК знижувалася. Зроб- лено висновок, що зниження продукції АФК у мітохондрі- ях мозку зумовлено деполяризуючим ефектом потенціал- залежного входу K+. Результати експериментів вказують на потенціалзалежний механізм регуляції утворення АФК в умовах калійіндукованої деполяризації мембрани валіномі- цином у мітохондріях тканини мозку. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. A. D. T. Costa, C. L. Quinlan, A. Andrukhiv, et al., “The direct physiological effects of mitoKATP opening on heart mitochondria,” Am. J. Physiol., 290, H406-H415 (2006). 2. A. J. Kowaltowski, S. Seetharaman, P. Paucek, et al., “Bioenergetic consequences of opening ATP-sensitive K+- channel of heart mitochondria,” Am. J. Physiol., 280, H649-H657 (2001). 3. D. Cancherini, L. G. Trabuco, N. A. Reboucas, et al., “ATP- sensitive K+ channels in renal mitochondria,” Am. J. Physiol., 285, F1291-F1296 (2003). 4. О. В. Акопова, В. И. Носарь, В. А. Бурый и др., “Влияние активатора АТР-зависимого K+-канала на потребление кислорода и K+-цикл в митохондриях печени крыс”, Биохимия, 75, № 9, 1273-1283 (2010). 5. О. В. Акопова, Л. И. Колчинская, В. И. Носарь и др., “Влияние потенциалзависимого входа калия на аккумуляцию кальция в митохондриях мозга крыс”, Биохимия, 78, № 1, 106-117 (2013). 6. D. M. Kopustinskiene, J. Liobikas, K. Skemiene, et al., “Direct effects of KATP channel openers pinacidil and diazoxide on oxidative phosphorylation of mitochondria in situ,” Cell Physiol. Biochem., 25, 181-186 (2010). 7. О. В. Акопова, В. И. Носарь, В. А. Бурый и др., “Влияние активатора АТР-зависимого K+-канала на функциональное состояние и открывание циклоспоринчувствительной поры в митохондриях печени крыс”, Укр. біохім. журн., 85, № 3, 38-51 (2013). 8. M. Murata, M. Akao, B. O’Rourke, et al., “Mitochondrial ATP-sensitive potassium channels attenuate matrix Ca2+ overload during simulated ischemia and reperfusion: possible mechanism of cardioprotection,” Circ. Res., 89, 891-898 (2001). 9. A. Andrukhiv, A. D. Costa, I. C. West, et al., “Opening mitoKATP increases superoxide generation from complex I of the electron transport chain,” Am. J. Physiol., 291, H2067-H2074 (2006). 10. H. T. F. Facundo, J. G. de Paula, and A. J. Kowaltowski, “Mitochondrial ATP-sensitive K+ channels prevent oxidative stress, permeability transition and cell death,” J. Bioenerg. Biomembranes, 37, 75-82 (2005). 11. A. Szewczyk, W. Jarmuszkiewicz , and W. Kunz, “Mitochondrial potassium channels,” IUBMB Life , 61 , 134-143 (2009). 12. H. T. F. Facundo, M. Fornazari, and A. J. Kowaltowski, “Tissue protection mediated by mitochondrial K+ channels,” Biochim. Biophys. Acta, 1762, 202-212 (2006). 13. D. W. Busija, Zs. Lacza, N. Rajapakse, et al., “Targeting mitochondrial ATP-sensitive potassium channels – a novel approach to neuroprotection,” Brain Res. Rev., 46, 282-294 (2004). 14. Г. Д. Миронова, Е. В. Качаева, И. Б. Крылова и др., “Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал. Роль канала в защите сердца от ишемии”, Вестн. РАМН, № 2, 44-50 (2007). 15. D. B. Zorov, M. Juhaszova, and S. J. Sollott, “Mitochondrial ROS-induced ROS release: An update and review,” Biochim. Biophys. Acta, 1757, 509-517 (2006). 16. G. Kroemer, L. Galuzzi, and C. Brenner, “Mitochondrial membrane permeabilization in cell death,” Physiol. Rev., 87, 99-163 (2007). 17. M. P. Murphy, “How mitochondria produce reactive oxygen NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2013.—T. 45, № 5444 О. В. АКОПОВА, Л. И. КОЛЧИНСКАЯ, В. И. НОСАРЬ и др. species,” Biochem. J., 417, 1-13 (2009). 18. J. F. Turrens, “Mitochondrial formation of reactive oxygen species,” J. Physiol., 552, 335-344 (2003). 19. S. S. Korshunov, V. P. Skulachev, and A. A. Starkov, “High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria,” FEBS Lett., 416, 15-18 (1997). 20. Shu-sen Liu, “Cooperation of a “reactive oxygen cycle” with the Q cycle and the proton cycle in the respiratory chain-superoxide generating and cycling mechanisms in mitochondria,” J. Bioenerg. Biomembranes, 31, 367-376 (1999). 21. А. Ю. Андреев, Ю. Е. Кушнарева, А. А. Старков, “Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях”, Биохимия, 70, № 2, 246-264 (2005). 22. V. G. Grivennikova and A. D. Vinogradov, “Generation of superoxide by the mitochondrial complex I,” Biochim. Biophys. Acta, 1757, 553-561 (2006). 23. D. Han, E. Williams, and E. Cadenas, “Mitochondrial respiratory chain-dependent generation of superoxide anion and its release into the intermembrane space,” Biochem. J., 353, 411-416 (2001). 24. B. Kulawiak, A. P. Kudin, A. Szewczyk, et al., “BK channel openers inhibit ROS production of isolated rat brain mitochondria,” Exp. Neurol., 212, 543-547 (2008). 25. A. Heinen, A. K. S. Camara, M. Aldakkak, et al . , “Mitochondrial Ca2+-induced K+ influx increases respiration and enhances ROS production while maintaining membrane potential,” Am. J. Physiol., 292, C148-C156 (2006). 26. A. D. T. Costa and K. D. Garlid, “Intramitochondrial signaling: interactions among mitoKATP, PKCε, ROS, and MPT,” Am. J. Physiol., 295, H874-H882 (2008). 27. G. Debska, A. Kicinska, J. Skalska, et al., “Opening of potassium channels modulates mitochondrial function in rat skeletal muscle,” Biochim. Biophys. Acta, 1556, 97-105 (2002). 28. O. V. Akopova, L. I. Kolchinskaya, V. I. Nosar, et al., “The effect of mitochondrial permeability transition pore opening on reactive oxygen species production in rat brain mitochondria,” Укр. біохім. журн., 83, № 6, 46-55 (2011). 29. K. E. O. Akerman and M. K. F. Wikstrom, “Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential,” FEBS Lett., 68, 191-197 (1976). 30. Мембраны: ионные каналы, под ред. Ю. А. Чизмаджева, Мир, Москва (1981). 31. S. Massari and G. F. Azzone, “The mechanism of ion translocation in mitochondria. Coupling of K+ and H+ fluxes,” Eur. J. Biochem., 12, 301-309 (1970). 32. A. Swida-Barteczka, A. Woyda-Ploszczyca, F. E. Sluse, et al., “Uncoupling protein 1 inhibition by purine nucleotides is under control of the endogenous ubiquinone redox state,” Biochem. J., 424, 297-306 (2009).

Similar Items