Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C₆₀-фулерену

Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C₆₀-фулерену

Реактивний гліоз є ключовим патогенетичним фактором виникнення ретинопатії у пацієнтів із цукровим діабетом; ця патологія індукується метаболічними розладами та розвитком окисного стресу в сітківці. Фулерен С₆₀ та деякі його водорозчинні похідні відомі як виключно потужні антиоксиданти, здатні про...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2016
Hauptverfasser: Недзвецький, В.С., Прищепа, І.В., Тихомиров, А.О., Байдаш, Г.
Format: Artikel
Sprache:Ukrainian
Veröffentlicht: Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України 2016
Schriftenreihe:Нейрофизиология
Online Zugang:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148342
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C60-фулерену / В.С. Недзвецький, І.В. Прищепа, А.О. Тихомиров, Г. Байдаш // Нейрофизиология. — 2016. — Т. 48, № 2. — С. 142-152. — Бібліогр.: 55 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-148342
record_format dspace
spelling irk-123456789-1483422019-02-19T01:25:33Z Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C₆₀-фулерену Недзвецький, В.С. Прищепа, І.В. Тихомиров, А.О. Байдаш, Г. Реактивний гліоз є ключовим патогенетичним фактором виникнення ретинопатії у пацієнтів із цукровим діабетом; ця патологія індукується метаболічними розладами та розвитком окисного стресу в сітківці. Фулерен С₆₀ та деякі його водорозчинні похідні відомі як виключно потужні антиоксиданти, здатні проявляти нейропротекторні властивості при наявності широкого спектра патологій та несприятливих впливів. Ми вперше досліджували вплив уведення гідратованої форми фулерену С₆₀ (C₆₀HyFn) на вміст і поліпептидний склад гліального фібрилярного кислого протеїну (ГФКП) у сітківці щурів з експериментальним діабетом, індукованим стрептозотоцином (СТЗ). Застосування методики імуноблотингу дозволило виявити, що рівень ГФКП у сітківці щурів із діабетом перевищує контрольні значення більш ніж у два рази (P < 0.01). Це вказувало на реактивацію ретинальних гліальних клітин в умовах гіперглікемії. Підвищення ГФКП-імунореактивності, пов’язане з розвитком реактивного гліозу в сітківці щурів із діабетом, було також підтверджено імуногістохімічно. Споживання діабетичними щурами розчину C₆₀HyFn (60 нМ) з питною водою протягом 12 тижнів призводило до істотної нормалізації вмісту ГФКП (зниження на 42 %; P < 0.05). Крім того, дія C₆₀HyFn зумовлювала вірогідне (майже на 37 %) зниження концентрації глікозильованого гемоглобіну в сироватці крові щурів із СТЗ-діабетом, не змінюючи при цьому рівень інсуліну та глюкози в крові діабетичних тварин. Отримані результати свідчать про те, що протекторна дія гідратованого фулерену в умовах діабетичної ретинопатії на початкових стадіях її розвитку реалізується через пригнічення ним надмірної активації гліоцитів сітківки. 2016 Article Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C60-фулерену / В.С. Недзвецький, І.В. Прищепа, А.О. Тихомиров, Г. Байдаш // Нейрофизиология. — 2016. — Т. 48, № 2. — С. 142-152. — Бібліогр.: 55 назв. — укр. 0028-2561 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148342 577.112 : 612.8 + 576.311 uk Нейрофизиология Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Ukrainian
description Реактивний гліоз є ключовим патогенетичним фактором виникнення ретинопатії у пацієнтів із цукровим діабетом; ця патологія індукується метаболічними розладами та розвитком окисного стресу в сітківці. Фулерен С₆₀ та деякі його водорозчинні похідні відомі як виключно потужні антиоксиданти, здатні проявляти нейропротекторні властивості при наявності широкого спектра патологій та несприятливих впливів. Ми вперше досліджували вплив уведення гідратованої форми фулерену С₆₀ (C₆₀HyFn) на вміст і поліпептидний склад гліального фібрилярного кислого протеїну (ГФКП) у сітківці щурів з експериментальним діабетом, індукованим стрептозотоцином (СТЗ). Застосування методики імуноблотингу дозволило виявити, що рівень ГФКП у сітківці щурів із діабетом перевищує контрольні значення більш ніж у два рази (P < 0.01). Це вказувало на реактивацію ретинальних гліальних клітин в умовах гіперглікемії. Підвищення ГФКП-імунореактивності, пов’язане з розвитком реактивного гліозу в сітківці щурів із діабетом, було також підтверджено імуногістохімічно. Споживання діабетичними щурами розчину C₆₀HyFn (60 нМ) з питною водою протягом 12 тижнів призводило до істотної нормалізації вмісту ГФКП (зниження на 42 %; P < 0.05). Крім того, дія C₆₀HyFn зумовлювала вірогідне (майже на 37 %) зниження концентрації глікозильованого гемоглобіну в сироватці крові щурів із СТЗ-діабетом, не змінюючи при цьому рівень інсуліну та глюкози в крові діабетичних тварин. Отримані результати свідчать про те, що протекторна дія гідратованого фулерену в умовах діабетичної ретинопатії на початкових стадіях її розвитку реалізується через пригнічення ним надмірної активації гліоцитів сітківки.
format Article
author Недзвецький, В.С.
Прищепа, І.В.
Тихомиров, А.О.
Байдаш, Г.
spellingShingle Недзвецький, В.С.
Прищепа, І.В.
Тихомиров, А.О.
Байдаш, Г.
Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C₆₀-фулерену
Нейрофизиология
author_facet Недзвецький, В.С.
Прищепа, І.В.
Тихомиров, А.О.
Байдаш, Г.
author_sort Недзвецький, В.С.
title Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C₆₀-фулерену
title_short Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C₆₀-фулерену
title_full Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C₆₀-фулерену
title_fullStr Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C₆₀-фулерену
title_full_unstemmed Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C₆₀-фулерену
title_sort інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого c₆₀-фулерену
publisher Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
publishDate 2016
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148342
citation_txt Інгібування реактивного гліозу в сітківці щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом під дією гідратованого C60-фулерену / В.С. Недзвецький, І.В. Прищепа, А.О. Тихомиров, Г. Байдаш // Нейрофизиология. — 2016. — Т. 48, № 2. — С. 142-152. — Бібліогр.: 55 назв. — укр.
series Нейрофизиология
work_keys_str_mv AT nedzvecʹkijvs íngíbuvannâreaktivnogoglíozuvsítkívcíŝurívízstreptozotociníndukovanimdíabetompíddíêûgídratovanogoc60fulerenu
AT priŝepaív íngíbuvannâreaktivnogoglíozuvsítkívcíŝurívízstreptozotociníndukovanimdíabetompíddíêûgídratovanogoc60fulerenu
AT tihomirovao íngíbuvannâreaktivnogoglíozuvsítkívcíŝurívízstreptozotociníndukovanimdíabetompíddíêûgídratovanogoc60fulerenu
AT bajdašg íngíbuvannâreaktivnogoglíozuvsítkívcíŝurívízstreptozotociníndukovanimdíabetompíddíêûgídratovanogoc60fulerenu
first_indexed 2025-07-12T18:46:18Z
last_indexed 2025-07-12T18:46:18Z
_version_ 1837467944602304512
fulltext NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2142 УДК 577.112 : 612.8 + 576.311 В. С. НЕДЗВЕЦЬКИЙ1, І. В. ПРИЩЕПА1, А. О. ТИХОМИРОВ2, Г. БАЙДАШ2 ІНГІБУВАННЯ РЕАКТИВНОГО ГЛІОЗУ В СІТКІВЦІ ЩУРІВ ІЗ СТРЕПТОЗОТОЦИНІНДУКОВАНИМ ДІАБЕТОМ ПІД ДІЄЮ ГІДРАТОВАНОГО С60-ФУЛЕРЕНУ Надійшла 21.10.15 Реактивний гліоз є ключовим патогенетичним фактором виникнення ретинопатії у пацієнтів із цукровим діабетом; ця патологія індукується метаболічними розлада- ми та розвитком окисного стресу в сітківці. Фулерен С60 та деякі його водорозчинні похідні відомі як виключно потужні антиоксиданти, здатні проявляти нейропротекторні властивості при наявності широкого спектра патологій та несприятливих впливів. Ми вперше досліджували вплив уведення гідратованої форми фулерену С60 (C60HyFn) на вміст і поліпептидний склад гліального фібрилярного кислого протеїну (ГФКП) у сітківці щурів з експериментальним діабетом, індукованим стрептозотоцином (СТЗ). Застосу- вання методики імуноблотингу дозволило виявити, що рівень ГФКП у сітківці щурів із діабетом перевищує контрольні значення більш ніж у два рази (P < 0.01). Це вказу- вало на реактивацію ретинальних гліальних клітин в умовах гіперглікемії. Підвищення ГФКП-імунореактивності, пов’язане з розвитком реактивного гліозу в сітківці щурів із діабетом, було також підтверджено імуногістохімічно. Споживання діабетичними щура- ми розчину C60HyFn (60 нМ) з питною водою протягом 12 тижнів призводило до істотної нормалізації вмісту ГФКП (зниження на 42 %; P < 0.05). Крім того, дія C60HyFn зумов- лювала вірогідне (майже на 37 %) зниження концентрації глікозильованого гемоглобіну в сироватці крові щурів із СТЗ-діабетом, не змінюючи при цьому рівень інсуліну та глю- кози в крові діабетичних тварин. Отримані результати свідчать про те, що протекторна дія гідратованого фулерену в умовах діабетичної ретинопатії на початкових стадіях її розвитку реалізується через пригнічення ним надмірної активації гліоцитів сітківки. КЛЮЧОВІ СЛОВА: цукровий діабет, діабетична ретинопатія, реактивний гліоз, гліальний фібрилярний кислий протеїн (ГФКП), глікозильований гемоглобін, гідратований С60-фулерен. 1Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара (Україна). 2 Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ (Україна). 3Бінгол університет, Бінгол (Туреччина). Ел. пошта: nedzvetskyvictor@ukr.net (В. С. Недзвецький); prishepka89@mail.ru (І. В.Прищепа); gbaydas@bingol.edu.tr (Г. Байдаш). ВСТУП Діабетична ретинопатія (ДР) – це комплекс- не мікроциркуляторне захворювання сітківки; вона розвивається внаслідок порушень мета- болізму, індукованих гіперглікемією в умовах як інсулінзалежного, так і інсуліннезалежного діабету. ДР призводить до швидкого розвитку дегенераційних процесів у сітківці. Ретинальна нейродегенерація проявляється ще до того, як мо- жуть бути визначені мікроциркуляторні порушен- ня при офтальмологічному обстеженні [1]. Тому виявлення механізмів, що призводять до нейроде- генеративних змін у сітківці на ранній стадії ДР, є важливим для розробки відповідних терапевтич- них підходів. У наш час відбувається істотне зростання захворюваності на цукровий діабет. За оцінками Всесвітньої організації охорони здоров’я (ВООЗ), кількість пацієнтів у світі, що страждають на діабет різних типів, у 2025 р. сягне 380 мільйонів [2]. Ретинопатії є найбільш поширеними ускладнення- ми цукрового діабету; ризик розвитку ушкоджень сітківки різного ступеня важкості за 10 років після діагностування діабету виявляється більш ніж у 60 % обстежених пацієнтів [3]. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2 143 ІНГІБУВАННЯ РЕАКТИВНОГО ГЛІОЗУ В СІТКІВЦІ ЩУРІВ Ранні діабетичні порушення в сітківці можуть бути результатом активації різних патологічних процесів, які модулюють характеристики загаль- них видів клітинних відповідей – апоптозу, за- палення та окисного стресу [1]. Окисний стрес впливає на широке коло біохімічних процесів, регуляцію активності метаболічних шляхів та ба- гато клітинних функцій. Слід чекати, що комплекс- ний аналіз патогенетичних феноменів в умовах ушкоджень клітин сітківки допоможе розкрити молекулярні механізми патології таких порушень та сприяє розробці відповідних нейропротектор- них засобів. Одним із головних феноменів при ДР є розви- ток окисного стресу та пов’язаних з ним метабо- лічних порушень. Високий рівень аеробного ме- таболізму в нервових клітинах зумовлює значну вірогідність анормальної інтенсифікації процесу генерації вільних радикалів. Зокрема, це відбува- ється в умовах гіперглікемії. Клітини нервової тка- нини дуже чутливі до ушкоджуючої дії вільних ра- дикалів, оскільки в даних клітинах наявна велика кількість поліненасичених жирних кислот, а систе- ма антиокислювального захисту є відносно слаб- кою. Дослідження патологічних змін при розвитку ДР тривалий час були зосереджені на мікроваску- ляторному та нейронному аспектах цього захворю- вання [4]. Незважаючи на численні дані щодо про- відної ролі змін у гліальних клітинах у патогенезі ДР, механізми анормальної активації гліоцитів, ін- дукованої гіпер глікемією, а також порушення ней- рон-гліальних та гліально-судинних взаємодій у відповідних умовах залишаються поки що до кінця не розкритими. Відомо, що гліальні клітини забезпечують струк- турну та метаболічну підтримку нейронів та крово- носних судин сітківки ока. Встановлено, що деякі дегенеративні процеси в нервовій тканині сітківки запускаються майже відразу після початку розвит- ку діабету, проте реактивність астроцитів та клі- тин Мюллера сітківки у щурів істотно підвищуєть- ся лише приблизно через три місяці після індукції експериментального діабету [1]. Одним із найбільш визнаних маркерів функціонального стану гліаль- них клітин (насамперед астроцитів) є гліальний фібрилярний кислий протеїн (ГФКП). Мономер- ні субодиниці проміжних філаментів цитоскелета астроцитів складаються з фібрилізованої водоне- розчинної форми цього білка. Відповідь гліальних клітин на впливи різних за природою чинників про- являється у проліферації та гіпертрофії астроцитів, що пов’язано зі зростанням експресії ГФКП. Такі прояви є типовою реактивною відповіддю; вони отримали назву «астрогліоз». Деякі ушкоджуючі фактори, проте, викликають зміни в астроцитах, істотно відмінні від таких стереотипної відповіді [5]. Зміни функцій глії можуть являти собою істот- ну причину нейродегенерації та порушення функ- цій кровоносних судин сітківки на ранніх стадіях розвитку ДР. Гліальні клітини виконують трофічну функцію щодо нейронів та гангліозних клітин, відіграючи роль посередника між ними та клітинами ендотелію судин. Крім того, ретиноглія в умовах розвитку різних нейропатологій та дії ушкоджую- чих чинників є значною мірою відповідальною за репаративні процеси. Клітини астроглії експре- сують широкий спектр нейротропних факторів та цитокінів, що забезпечує певний ступінь захи- сту нейронів від нейротоксичного впливу вільних радикалів. На сьогодні відомо, що антиоксидантні спроможності астроцитів значно потужніші, ніж такі у нейронів [6]. З урахуванням цих фактів саме астроцити розглядають як головні протекто- ри нейронів від ушкоджуючої дії оксидативного стресу. ДР є основною причиною втрати зору серед лю- дей віком від 20 до 74 років; отже, пошук ефек- тивних неінвазивних підходів, спрямованих на корекцію даного ускладнення, є актуальним медико-соціальним завданням. Для попереджен- ня та обмеження нейродегенеративних змін у разі ДР було запропоновано використання низки різних за природою агентів, що мають антиоксидантні властивості. Протекторна дія таких антиоксидантів сприяє виживанню астроцитів, стабілізації їх морфології та частковому відновленню порушеної діяльності нервових елементів [7]. Протягом останніх років активно досліджуються цитопротекторні ефекти гідратованої форми фу- лерену С60 (C60HyFn) в умовах різних нейроде- генеративних станів, у тому числі асоційованих із діабетом [8]. Фулерени є третьою алотропною формою вуглецю. Їх наночастки мають унікальну структуру та характеризуються особливими біологічними властивостями. Зокрема, показа- но, що C60HyFn здатний ефективно пригнічувати запальні процеси [9]. Існують непрямі, але досить переконливі вказівки на те, що дослідження антиоксидантів, спромож- них гальмувати відповідні ушкодження і запаль- ну реакцію, є перспективними для пошуку шляхів NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2144 В. С. НЕДЗВЕЦЬКИЙ, І. В. ПРИЩЕПА, А. О. ТИХОМИРОВ, Г. БАЙДАШ попередження розвитку діабетичних ушкоджень сітківки. У щурів з експериментально індукованим діабетом була продемонстрована ефективність фу- лерену С60 щодо збереження статевих функцій у самців [10]. Виявилося, що фулерен має високий терапевтичний потенціал в умовах гіперпродукції вільних радикалів та мітохондріальних ушкоджень [11]. У разі інтоксикації щурів тетрахлоридом вуг- лецю пероральне введення розчину С60 у значній мірі запобігало розвитку жирової дистрофії печінки та подовжувало тривалість життя тварин [12]. У той же час можливість використання фулерену та його похідних для корекції пошкоджень сітківки, індукованих діабетом, поки що залишалася поза увагою і не піддавалася прямому дослідженню. У нашій роботі ми визначали впливи розчи- ну гідратованого С60-фулерену на стан гліальних клітин сітківки та ключові біохімічні показники ретинальної тканини в умовах експериментально- го діабету у щурів. МЕТОДИКА Стрептозотоциніндукований діабет (СТЗД) широко використовується як адекватна модель для вивчен- ня нейродегенеративних змін в умовах порушення механізмів утилізації глюкози. Наші експерименти було проведено на щурах лі- нії Вістар (статевозрілих самцях віком 11–12 тиж- нів), отриманих із віварію ДНУ ім. Олеся Гончара. Тварин утримували в умовах постійної температу- ри (22 ± 2.0 °С) і контрольованої тривалості світ- лового дня (12/12-годинний цикл). Вода та їжа були доступні тваринам ad libitum. Після семи діб акліматизації тварини були рандо- мізовано поділені на чотири групи (n = 6 у кожній групі) – контрольну інтактну (К), контрольну «фу- леренову» (тварини отримували розчин C60HyFn), групу щурів із СТЗД та групу тварин із діабетом, які отримували розчин C60HyFn (СТЗД+С60). Щу- рам третьої та четвертої груп одноразово інтра- перитонеально вводили 60 мг/кг СТЗ («Sigma», США), розчиненого в натрій-цитратному буфері (0.1 М, рН 4.5), що забезпечувало індукцію експе- риментального діабету. Тваринам контрольних груп ін’єкували розчинник у відповідному об’ємі. Щури другої та четвертої груп отримували розчин С60 (40 нг/мл, що відповідає концентрації С60 60 нМ) у питній воді протягом 12 тижнів (з моменту індукції діабету в четвертій групі до декапітації). Щурів зважували кожного тижня від початку до закінчення досліду. Рівень глюкози у венозній кро- ві вимірювали за допомогою глюкометра («ACCU- Check Active»; «Roche Diagnostics», ФРН) за три доби до введення СТЗ та кожного тижня після та- кої ін’єкції. Виражений діабет ідентифікували згідно з концентрацією глюкози в крові не менше 20 мМ. Через 12 тижнів із моменту індукції діа- бету в третій та четвертій групах щурів усіх груп декапітували під ефірним наркозом. Зразки крові тварин центрифугували при 3000g протягом 10 хв та відбирали сироватку. У сироватці визначали кон- центрацію глюкози, інсуліну (Rat Insulin Kit; «Linco Research», США), проводили імуноензимний ана- ліз (ELISA, Elx-800; «BioTek Instruments», США) та визначали вміст глікозильованого гемоглобіну (HbA1c; «Alfabiotech», Італія). Сітківку обох очей відокремлювали для отриман- ня протеїнових екстрактів та виготовлення фіксо- ваних зразків для імуногістохімічних досліджень. Гомогенат сітківки (10 %, маса/об’єм) готували в трис-буфері (50 мМ, рН 7.6) із доданням 0.5 %-вого розчину додецилсульфату Na (DSN) у 0.15 M NaCl, 1.0 мМ EGTA, 2.5 мM EDTA, 6.5 мкМ апротині- ну, 1.5 мкМ пепстатину A, 23 мкМ лейпептину, 1.0 мM фенилметилсульфонілу фториду (PMSF) та 5 мкг/мл соєвого інгібітору трипсину. Гомогенати обробляли ультразвуком тричі по 30 с за допомогою соніфікатора Labsonic M («Sartorius AG», ФРН) та центрифугували при 16 000g протягом 30 хв за тем- ператури 4 °C. Вміст загального протеїну в пробах визначали за методом Бредфорд [13]. В отриманих супернатантах визначали вміст ГФКП і склад його поліпептидних фрагментів з використанням мето- ду імуноблотингу. Зразки протеїнових екстрактів (50 мкг/трек) розділяли електрофорезом у градієнті поліакриламідного геля (ПААГ, 7–17 %) за методи- кою, описаною раніше [14]. Ділянки поліпептидних зон переносили за допомогою електроблоту про- тягом 90 хв з ПААГ на нітроцелюлозну мембрану (RPN 203D, GE Healthcare, «Amersham Bioscience», США) з діаметром пор 0.45 мкм. Після перено- су мембрани піддавали блокуванню у 5 %-вому (маса/об’єм) розчині знежиреного сухого молока протягом 90 хв за температури 37 °C. Інкубація з первинними антитілами до ГФКП (sc-9065, 1:1000; «Santa Cruz», США) або до β-aктину (ab20272, 1:5000, Abcam, Велика Британія), розведеними в сольовому фосфатному буфері (СФБ), який вміщу- вав 0.05 % Тритону X-100, тривала 12–14 год при 4 °C. Після інкубації мембрани п’ять разів відмива- NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2 145 ІНГІБУВАННЯ РЕАКТИВНОГО ГЛІОЗУ В СІТКІВЦІ ЩУРІВ ли від антитіл, що зв’язалися неспецифічно, у СФБ із 0.05 % Тритону X-100. Відмиті мембрани інку- бували зі вторинними антитілами (SAB3700848, 1:10000; «Sigma-Aldrich», США), кон’югованими з пероксидазою хрону (60 хв при 37 °C), після цього аналогічним чином п’ятиразово відмиваю- чи їх у СФБ з 0.05 % Тритону X-100. Виявлення імунореактивних поліпептидних зон проводили в 50 мМ трис-НСІ-буфері (рН 7.4), який вміщував 0.01 % діамінобензидину (ДАБ) та 0.2 % H2O2. Чис- лові дані нанесених проб за кількістю протеїну до- датково нормували щодо інтенсивності забарвлен- ня зон β-актину у відповідних зразках. Антигени з різною молекулярною масою були ідентифіковані за допомогою маркерів з відомим значенням цьо- го показника (PageRuler Prestained Protein Ladder; «Fermentas», ФРН). Скановані результати імуно- блотингу піддавали денситометричному аналізу з використанням програмного забезпечення TotalLab TL120 («Nonlinear Inc.», США). Імуногістохімічне визначення ГФКП прово- дили у фіксованих зрізах сітківки. Свіжі зраз- ки тканини фіксували у 4 %-вому розчині параформальдегіду протягом 2 год. Парафінові блоки виготовляли за загальноприйнятою мето- дикою [15]. Після депарафінізації зрізи завтовш- ки 5 мкм інкубували в розчині, який вміщував 10 % метанолу й 0.5 % пероксиду водню, протягом 15–20 хв при кімнатній температурі (для блокуван- ня ендогенної пероксидазної активності). Блоку- вання неспецифічного зв’язування антитіл прово- дили із використанням 3 %-вого розчину бичачого сироваткового альбуміну (БСА) у СФБ (60 хв при кімнатній температурі). Інкубацію з антитілами до ГФКП (1/200) здійснювали протягом 10 год при 4 °C. Після промивання зрізи інкубували із вто- ринними антитілами, кон’югованими з пероксида- зою хрону (розведення 1/200, протягом 60 хв при 37 °C), промивали та проявляли у 0.05 %-вому розчині ДАБ+0.03 % H2O2 у трис-буфері (0.1 М, рН 7.4). Після цього зрізи промивали водою та до- датково забарвлювали гематоксиліном Майєра, ви- сушували і заводили в бальзам. Імунореактивні зони спостерігали та фотографували за допомогою мікроскопа Olympus CX41 («Olympus Europa SE and Co.», ФРН). Усі процедури дослідження про- водили в стандартизованих умовах. Електронні файли зображень формували за допомогою Adobe PhotoShop 7.0 (США). Маніпуляції з файлами зоб- ражень були обмежені лише установкою порогових значень яскравості. Водний розчин фулерену C60HyFn («MER Corporation», США) готували зі зразків із чистотою не менш 99.5 % без використання солюбілізаторів або будь-якої хімічної модифікації. Метод переве- дення фулерену з органічного розчинника у водну фазу за допомогою обробки ультразвуком дозволяє отримати розчин C60HyFn із концентрацією до 5.5∙10–3 М. Залежно від концентрації C60HyFn роз- чин вміщує як окремі молекули фулерену, так і їх лабільні нанокластери з розмірами 3–36 нм [16]. У даній роботі ми використовували вихідний розчин із концентрацією 8.88∙10–4 М, з якого готували ро- бочий розчин (60 нм, ~40 нг/мл). Статистичну обробку числових даних вико- нували із застосуванням стандартних методів математичної статистики для малих виборок; вико- ристовували пакети прикладних програм «Microsoft Excel 2000» (Microsoft, США) та «STATISTICA for Windows 6.0» (StatSoft Inc., США). Для нормовано- го вмісту ГФКП наведені середні значення ± похиб- ка середнього. Вірогідність міжгрупових різниць оцінювали за допомогою t-критерію Ст’юдента (Р < 0 .05) після перевірки г іпотези про нормальність розподілень числових даних. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Результати визначення концентрації глюкози в сироватці крові тварин третьої та четвертої груп до введення СТЗ та через 12 тижнів після індукції СТЗД показали наявність значних відмінностей щодо відповідних величин у першій (інтактній) контрольній групі та другій групі контролю (С60); це свідчило про розвиток стійкої гіперглікемії у щурів третьої та четвертої груп (рис. 1). Якихось вірогідних різниць за вмістом глюкози в крові протягом розвитку гіперглікемії (12 тижнів) у третій та четвертій групах тварин (СТЗД та СТЗД+С60) не виявилося. Таким чи- ном, споживання C60HyFn не впливає на рівень глю- кози в крові щурів з експериментальним діабетом. Рівень же інсуліну в крові тварин третьої (СТЗД) та четвертої (СТЗД+С60) груп був помітно нижчим, ніж у контрольних групах (59 та 69 % відповідно, P > 0.05). Різниця між цими значенями була статис- тично невірогідною (що, скоріш за все, зумовлено високою варіабельністю індивідуальних значень), але вона досить чітко відображує тенденцію частко- вого відновлення β-клітин островків Лангерганса в умовах дії C60HyFn. Очевидно, що це спостереження потребує подальшої експериментальної перевірки. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2146 В. С. НЕДЗВЕЦЬКИЙ, І. В. ПРИЩЕПА, А. О. ТИХОМИРОВ, Г. БАЙДАШ ________________________________ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 мМ вих. 12 вих. 12 вих. 12 вих. 12 К С60 СТЗД СТЗД+С60 ** ** Р и с. 1. Концентрація глюкози у сироватці крові експериментальних щурів. К – контрольна група; C60 – група щурів, які отримували розчин С60 у питній воді (40 нг/мл); СТЗД – група щурів із стрептозотоциніндукованим діабетом; СТЗД+С60 – група щурів із СТЗД, які отримували згаданий розчин С60 у питній воді. Вірогідність різниць показників у відповідних групах на дванадцятий тиждень індукції СТЗД щодо вихідного значення (вих.): **P < 0.01. Вміст глікозильованого гемоглобіну є визнаним показником ступеню порушення шляхів утилізації глюкози. Величина цього показника використову- валась як додатковий критерій адекватності ство- реної моделі СТЗД. У крові щурів СТЗД-групи середнє значення вмісту глікозильованого гемогло- біну (2.17 ± 2.4 мМ) було вірогідно вищим порів- няно з таким у контрольних групах (1.0 – 1.12 мМ) (P < 0.05). У крові ж щурів четвертої групи (СТЗД+С60) вміст глікозильованого гемоглобіну (1.27 ± 0.18 мМ) складав лише 60 % відповідного показника у групі СТЗД-тварин (P < 0.05). Таким чином, тривале споживання C60HyFn може частко- во, але досить істотно попереджати метаболічні по- рушення утилізації глюкози. Результати імуногістохімічного забарвлювання ГФКП у зрізах сітківки щурів усіх чотирьох груп свідчили про значну активацію астроцитів та клі- тин Мюллера у внутрішньому шарі «діабетичної» групи порівняно з відповідною картиною в першій та другій контрольних групах (рис. 2). Якихось від- мінностей між інтенсивністю імунозабарвлення в зрізах сітківки тварин останніх груп (контрольної інтактної та групи щурів, які отримували C60HyFn 50 мкм 50 мкм 50 мкм 50 мкм А Б В Г Р и с. 2. Результати імуногістохімічного забарвлювання зрізів сітківки при використанні антитіл до гліального фібрилярного кислого протеїну. А – Г – групи щурів, аналогічні вказаним на рис. 1. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2 147 ІНГІБУВАННЯ РЕАКТИВНОГО ГЛІОЗУ В СІТКІВЦІ ЩУРІВ у питній воді протягом 12 тижнів) не спостерігало- ся. Істотне зменшення рівня ГФКП-позитивного за- барвлення на зрізах сітківки діабетичних щурів, що споживали C60HyFn ( СТЗД+С60), порівняно з цим показником у групі нелікованих тварин із діабетом (СТЗД) свідчить про значне зменшення ступеня ак- тивації ретиноглії, зумовлене споживанням гідра- тованого фулерену щурами з експериментальним діабетом. У протеїнових пробах сітківки контрольних щу- рів, а також тварин, які отримували C60HyFn із пит- ною водою, ГФКП був представлений виключ- но поліпептидом із молекулярною масою 49 кДа (рис. 3). У сітківці ж щурів третьої групи (СТЗД) виявлялася присутність, окрім інтактного поліпеп- тиду ГФКП-49 кДа, також його фрагментів із мен- шою молекулярною масою (в діапазоні 47–45 кДа). Вплив C60HyFn значною мірою запобігав деградації ГФКП у сітківці щурів четвертої групи з діабетом. Це (разом із даними щодо зниження рівня зазначе- ного цитоскелетного протеїну) вказує на знижен- ня ступеня активації ретиноглії в умовах розвитку діабету. Наявність продуктів обмеженої протеолі- тичної деградації ГФКП є додатковим маркером ре- активного гліозу в ЦНС та сітківці [17, 18]. При цьому слід визнати, що потенційна роль фрагмен- тів цитоскелетних протеїнів у регуляції клітинних функцій поки що залишається невідомою. Обме- жений протеоліз ГФКП може здійснюватися каспа- зами, які активуються в клітинах реактивної глії в умовах діабету [19]. Наявність поліпептидних фрагментів протеїну гліальних проміжних філаментів (що мають меншу молекулярну масу, ніж «інтактний» білок) у сітківці свідчить про надмірну активацію протеолітичних ензимів у даній тканині. Враховуючи той факт, що проміжні філаменти є стійкими до дії проте- аз, а також попередні результати щодо протеолізу ГФКП калпаїнами [6], можна вважати, що в стані гіперглікемії відбувається активна перебудова ци- тоскелета гліальних клітин; це є очевидним факто- ром, відповідальним (в усякому разі частково) за морфологічні зміни реактивних клітин. Отримані результати вказують на те, що спожи- вання C60HyFn із питною водою протягом 12 тижнів значною мірою запобігає розвитку астрогліальної активації в сітківці, а також обмежує протеоліз проміжних філаментів у клітинах глії у щурів із СТЗ-індукованим діабетом. Особливої уваги заслуговує той факт, що споживання C60HyFn здо- ровими щурами не викликало змін досліджуваних параметрів порівняно з тим, що спостерігалося в контрольній інтактній групі. Це є свідченням того, що застосований препарат в обраній дозі та режимі введення є нетоксичним та безпечним. Результати визначення вмісту ГФКП із викори- станням денситометричного аналізу блотограм (рис. 4) узгоджуються з даними імуногістохімічних досліджень, описаними вище. Вміст ГФКП у тва- рин групи СТЗД був більш ніж у два рази вищим порівняно з таким у контролі (P < 0.01). Споживан- ня розчину C60HyFn щурами з індукованим СТЗД зумовлювало значно менший вміст маркера реак- тивного гліозу (58 %) порівняно з відповідним показником у групі СТЗД (P < 0.05). При цьо- му відмінність рівня ГФКП у групі СТЗД+С60 від аналогічного показника в групі контрольних інтактних тварин була нижча рівня статистичної 49 кДа 45 кДа 42 кДа А Б К С60 СТЗД СТЗД + + С60 Р и с. 3. Результати імуноблотингу екстрактів сітківки при використанні антитіл до гліального фібрилярного кислого протеїну (А) та актину (Б). Позначення груп тварин аналогічні таким на рис. 1. 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 К С60 СТЗД СТЗД+С60 ** + Р и с. 4. Нормований вміст гліального фібрилярного кислого протеїну згідно з результатами денситометричного аналізу картин імуноблотингу екстрактів сітківки. Вірогідність різниць щодо контрольної групи – **P < 0.01; щодо групи із стрептозотоциніндукованим діабетом – +P < 0.05. Позначення груп тварин аналогічні таким на рис. 1. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2148 В. С. НЕДЗВЕЦЬКИЙ, І. В. ПРИЩЕПА, А. О. ТИХОМИРОВ, Г. БАЙДАШ вірогідності. Споживання C60HyFn у питній воді протягом 12 тижнів також не викликало якихось істотних змін експресії ГФКП порівняно з такою в інтактних щурів. На сьогодні молекулярні та клітинні механізми роз- витку ДР до кінця не з’ясовані, а питання щодо за- лучення клітин глії до патогенезу цього захворю- вання, що часто супроводжує діабет, залишається дискутивним. Вважається, що провідну роль у патогенезі ДР відіграють порушення активації протеїнкіназ [20], дисбаланс клітинних факторів росту [21], гемодинамічні зміни [22], розвиток окисного стресу та утворення кінцевих продуктів глікозилювання [23], розвиток запалення та по- ява мікроциркуляторних аномалій [24]. Відомо, що гліальні клітини є відповідальними за збережен- ня структури і метаболічну підтримку нейронів та гангліозних клітин сітківки. В сітківці діабетичних щурів порушення метаболізму глутамату супровод- жуються інтенсивною активацією як астроцитів, так і клітин мюллерівської глії, причому це відбувається вже в перші місяці розвитку діабету. Вірогідне підвищення реактивності глії у зрізах сітківки спостерігалося стабільно. Цей феномен візуалізувався як зростання імуногістохімічного забарвлення щодо ГФКП у шарі гангліозних клітин та клітин Мюллера. У таких самих зраз- ках сітківки було показано драматичне знижен- ня швидкості конвертації глутамату в глутамін (на 65 % порівняно з контрольним рівнем), що приз- водило до значного зростання концентрації да- ного нейротрансмітера в «діабетичній» сітківці [25]. Підвищений рівень глутамату та надмірна експресія компонентів ренін-ангіотензинової систе- ми відіграють важливу роль у розвитку патологій сітківки, пов’язаних із діабетом [26]. Астроци- ти є головними клітинами, які відповідають за рециклінг глутамату – процес, що захищає нейрони від ексайтотоксичності цього трансмітера [27]. По- казано, що гліколітичні процеси в гліальних клітинах тісно пов’язані з вивільненням глутамату з нейронів та його поглинанням глією [28]. Гіперглікемія викликає в астроцитах порушення гліколітичного розщеп- лення глюкози [29]. Через зниження активності гліцеральдегід-3-фосфатази та піруваткінази й од- ночасну активацію фосфофруктокінази при цьо- му з’являється надлишок глюкозо-6-фосфату, який утилізується через поліольний шлях [30]. Відомо, що лактат є важливим енергетичним субстратом, який постачається астроцитами до нейронів [31]. Відповідно, послаблення утворення лактату приз- водить до того, що забезпечення нейронів АТФ стає недостатнім та розвивається енергетичний дефіцит. Слід мати на увазі, що наслідки гліальної активації в сітківці можуть бути різними залеж- но від тривалості та інтенсивності цього проце- су. З одного боку, астрогліоз призводить до певної стимуляції нейронів через підвищення синте- зу нейротрофічних факторів, тобто він виконує певну цитопротективну функцію. З іншого боку, надмірний гліоз сприяє нейродегенерації та розвит- ку ретинопатії [32]. Порушення гліколітичного шляху в умовах гіпер- глікемії зумовлює зростання синтезу de novo діа- цилгліцеролу, який є ключовим активатором проте- їнкінази С [33, 34]. У свою чергу, через активацію протеїнкінази С запускаються каскадні процеси, що впливають на проникність ендотелію, експре- сію фактора росту ендотелію судин (VEGF) [21], ретинальну гемодинаміку [22] та активність та ад- гезію лейкоцитів [20]. Слід мати на увазі, що взаємозалежність сиг- нальних шляхів між клітинами судин, гліоцитами та нейронами є досить складною. Тому гіперглік- емія може викликати істотні порушення одночасно в клітинах усіх цих типів. В умовах гіперглікемії високий рівень глюкози в тканині сітківки корелює зі зростанням вивільнення глутамату та розвитком окисного стресу [35, 36]. Аналогічним чином гіпер- глікемія індукує розвиток окисного стресу та астро- цитозу в клітинах мозку, що є однією з поширених причин нейродегенерації та погіршення функцій ЦНС при захворюванні на діабет [37]. Інтенсифі- кація окисного стресу в сітківці діабетичних щу- рів супроводжується значним зниженням експресії транспортерів глюкози GLUT1 та GLUT3, а також критичним зростанням вмісту кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів [38]. Зважаючи на вказаний комплекс причин, саме гліальні клітини можуть розглядатись як ключовий об’єкт, на котрий має бути спрямована дія нейропротекторних засобів з метою корекції ДР. Виглядає вірогідним, що ви- явлена в нашому дослідженні значна нормалізація вмісту ГФКП у сітківці діабетичних щурів є опосе- редкованою саме антиоксидантними властивостями фулерену [8]. Отримані дані щодо поліпшення ста- ну глії в сітківці при розглянутій патології узгоджу- ються з результатами попередніх досліджень. В них було показано, що саме гідратована форма хімічно немодифікованого С60 здатна реалізувати протек- тивні ефекти щодо глії в головному мозку ссавців у разі хронічного впливу етилового спирту [39] та NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2 149 ІНГІБУВАННЯ РЕАКТИВНОГО ГЛІОЗУ В СІТКІВЦІ ЩУРІВ експериментального СТЗ-діабету [7]. На сьогодні вже накопичився значний об’єм свідчень стосовно нейрозахисних ефектів різних водорозчинних по- хідних фулерену. Зокрема, такі ефекти виявляються в умовах індукованої мітохондріальної дисфункції [40], запалення, ішемії та гіпоксії [41, 42], експери- ментального паркінсонізму [43] та амілоїдозу [44]. В перебігу нашого дослідження вперше було отримано експериментальні докази ефективнос- ті використання C60HyFn з метою запобігання над- мірного гліозу в сітківці. Виявлені ефекти гідрато- ваного C60 фулерену щодо реактивності ретиноглії, інтенсивності деградації ГФКП, перебудов ци- тоскелета та вмісту глікозильованого гемоглобіну, очевидно, вказують на те, що дія досліджуваного препарату в організмі діабетичних щурів є мульти- факторіальною. C60HyFn представляє собою ефективний антиок- сидант, який за механізмами антирадикальної дії кардинально відрізняється від усіх інших відомих антиоксидантів. Доведено, що фулерен у гідрато- ваному стані каталізує реакції дисмутації та зне- шкодження вільних радикалів завдяки унікальним властивостям водної фази, яка оточує поверхні як окремих молекул С60, так і їх нанорозмірних класте- рів [8, 45]. Кумулятивний розвиток окисного стресу в ендотеліальних, гліальних клітинах та нейронах сітківки призводить до дисбалансу між продукці- єю широкого кола регуляторів клітинної активнос- ті та прозапальних факторів. Це індукує локальні ушкодження окремих клітинних шарів сітківки та негативно відбивається на їх функціонуванні. Існу- ють вагомі причини вважати, що зміни балансу між нейротоксичними та нейропротекторними факто- рами зумовлюють здатність до кращого виживан- ня та збереження функцій ретинальних нейронів. Існують дані про зв’язок між показниками ішеміч- ного синдрому в очах та сегментованої неоваскуля- ризації сітківки у пацієнтів із діабетом. Більш ніж у 50 % пацієнтів з ДР, яка супроводжується сте- нозом каротидних артерій і зниженням швидко- сті кровотоку в судинах, в сітківці діагностують розвиток неоваскуляції. Як відомо, активація глі- альних клітин, що формують гемато-ретинальний бар’єр, індукує анормальний ангіогенез у сітківці [46]. Ішемічні ушкодження виступають як ініціатор проліферації ендотеліальних і гліальних клітин у сітківці при діабеті. Встановлено, що у відповідь на пошкодження активовані гліоцити індукують та підтримують у сітківці проангіогенний стан завдя- ки посиленому синтезу та секреції низки цитокі- нів та мітогенів, зокрема VEGF [47, 48]. Наслідком гіперактивації ендотеліоцитів та запуску ангіоген- них процесів стає утворення надмірної кількості капілярів, що характеризуються підвищеними лам- кістю та проникністю. Патологічна картина, яку провокують реактивні гліоцити в сітківці, супровод- жується розвитком запальних процесів, набряків, крововиливів, порушенням цілісності гемато-рети- нального бар’єра. Встановлено, що аномальний ан- гіогенез є головною причиною розвитку відшару- вання сітківки та, як наслідок, порушень та втрати зору у хворих на діабет [49]. Враховуючи критичні щодо забезпечення життєздатності нейронів функ- ції гліальних клітин, саме останні, вірогідно, слід розглядати як головну мішень для терапевтичних засобів в умовах широкого кола патогенетичних по- рушень у нервовій системі [50]. Той факт, що ре- активний гліоз у сітківці, на розвиток якого вка- зує посилення експресії ГФКП, досить ефективно запобігається споживанням С60HyFn, свідчить про доцільність використання цього препарату з метою корекції ретинопатії при цукровому діабеті. Отри- мані нами дані узгоджуються з результатами інших авторів, які показали ефективність таких антиокси- дантів, як ебселен [51], вітамін Е [52] і мелатонін [53], у відповідних ситуаціях. Вказані агенти від- новлюють нормальне функціонування глії в умо- вах діабетіндукованого окисного стресу в сітківці. Нещодавно був встановлений протективний ефект гістидинату хрому (СrHis) у сітківці щурів із СТЗ- діабетом, який визначали згідно з оцінкою гісто- патологічних показників морфології ретинальних клітинних шарів. Були виявлені виражені антидіа- бетичні ефекти щоденного споживання СrHis у дозі 110 мкг/кг щодо показників окисного стресу, екс- пресії транспортерів глюкози (GLUT1 і GLUT3), вмісту глікозильованого гемоглобіну та загального холестеролу [38]. Слід, проте, при цьому зауважи- ти, що гідратований фулерен, на відміну від біль- шості з відомих антиоксидантів, є нетоксичною та біосумісною речовиною з високою біологічною ак- тивністю навіть за наднизьких доз [8, 54]. Ці об- ставини відкривають широкі перспективи для ви- користання С60HyFn як безпечного й ефективного агента для профілактики та терапії таких усклад- нень діабету, як ретинопатії. Одним із важливих ефектів гіперглікемії, що призводить до нейродегенерації, є неензиматичне глікозилювання. Хронічна гіперглікемія створює умови для реакцій неензиматичної конденсації між відновленою глюкозою та амінними залиш- NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2150 В. С. НЕДЗВЕЦЬКИЙ, І. В. ПРИЩЕПА, А. О. ТИХОМИРОВ, Г. БАЙДАШ ками протеїнів, нуклеїновими основами, а також ліпідами. Це призводить до незворотного форму- вання комплексів, що отримали назву кінцевих продуктів глікозилювання. Такі речовини активу- ють фактор NF-κB та NADPH-оксидазу, що додат- ково сприяє генерації реактивних форм кисню та розвитку апоптозу в ретинальних нейронах. Про- дукти глікозилювання акумулюються в періцитах, викликають ушкодження ендотеліальних клітин та впливають на функції гемато-ретинального бар’єра [55]. Виявлені в нашому дослідженні відмінності вмісту глікозильованого гемоглобіну в експери- ментальних групах вказують на істотну активацію глікозилювання у тварин із діабетом. Споживан- ня розчину С60 щурами групи СТЗД+С60 протягом 12 тижнів сприяло вираженому зниженню рівня глікозильованого гемоглобіну в сироватці тва- рин із СТЗ-індукованим діабетом (див. таблицю). Такий результат може бути зумовлений певною нормалізацією окисно-відновлювального балансу в тканинах щурів в умовах гіперглікемії під впли- вом наночасток фулерену [8]. Отже, на підставі отриманих даних мож- на дійти висновку, що хімічно немодифікований г ідратований фулерен (C 60HyFn) ефектив- но попереджує негативні зміни в гліальному цитоскелеті та надмірну активацію ретиноглії у щурів при діабеті. C60HyFn може бути вико- ристаний як молекулярний інструмент для по- дальшого дослідження механізмів реципрокної регуляції відносин між ендотеліальними клітинами, клітинами макроглії та гангліозними клітинами сітківки в умовах гіперглікемії. Автори вдячні канд. хім. наук Г. В. Андрієвському за люб’язне надання препарату гідратованої форми фулерену С60 для проведення досліджень. Усі стадії дослідження відповідали положенням Євро- пейської Конвенції щодо захисту тварин, які використову- ються в експериментах (86/609 ЄЄС, 1986, Страсбург), і нормативам національних і місцевих Комітетів із біоетики. Автори даної роботи – В. С. Недзвецький, І. В. Прищепа, А. О. Тихомиров та Г. Байдаш – підтверджують відсутність будь-яких конфліктів щодо комерційних або фінансових від- носин, відносин з організаціями або особами, котрі будь- яким чином могли бути пов’язані з дослідженням, а також взаємовідносин співавторів статті. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. E. Rungger-Brändle, A. A. Dosso, and P. M. Leuenberger, “Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy,” Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 41, No. 7, 1971-1980 (2000). 2. A. Ebneter and M. S. Zinkernagel, “Novelties in diabetic retinopathy,” Endocrinol. Dev., 31, 84–96 (2016). 3. R. Klein, B. E. K. Klein, and S. E. Moss, “Epidemiology of proliferative diabetic retinopathy,” Diabetes Care, 15, No. 12, 1875-1891 (1992). 4. B. Liu, X. Ma, D. Guo, et al., “Neuroprotective effect of alpha-lipoic acid on hydrostatic pressure-induced damage of retinal ganglion cells in vitro,” Neurosci. Lett., 526, No. 1, 24-28 (2012). 5. В. С. Недзвецкий, Г. А. Ушакова, С. Г. Бусыгина и др., “Влияние малых доз ионизирующей радиации на промежуточные филаменты и Са-активируемую систему протеолиза головного мозга крысы”, Радиобиология, 31, № 3, 333-339 (1991). 6. R. Dringen, P. G. Pawlowski, and J. Hirrlinger, “Peroxide detoxification by brain cells,” J. Neurosci. Res., 79, Nos. 1/2, 157-165 (2005). 7. V. Nedzvetsky, G. Andrievsky, T. Chachibaia, and A. Tykhomyrov, “Differences in antioxidant/protective efficacy of hydrated C60 fullerene nanostructures in liver and brain of rats with streptozotocin-induced diabetes,” J. Diabetes Metabolism, 3, No. 8, 1-9 (2012). 8. G. Andrievsky , V. I. Bruskov, A. A. Tykhomyrov, and S. V. Gudkov, “Peculiarities of the antioxidant and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene nanostuctures in vitro and in vivo,” Free Radical Biol. Med., 47, No. 6, 786-793 (2009). 9. J. Ryan, H. R. Bateman, A. Stover, et al., “Fullerene nanomaterials inhibit the allergic response,” J. Immunol., 179, No. 1, 665-672 (2007). 10. E. O. Etem, R. Bal, A. E. Akağaç, et al., “The effects of hydrated C(60) fullerene on gene expression profile of TRPM2 and TRPM7 in hyperhomocysteinemic mice,” J. Recept. Signal Transduct. Res., 34, No. 4, 317-324 (2014). 11. T. Mori, S. Ito, M. Namiki, et al., “Involvement of free radicals followed by the activation of phospholipase A2 in the mechanism that underlies the combined effects of methamphetamine and morphine on subacute toxicity or lethality in mice: Comparison of the therapeutic potential of fullerene, mepacrine, and cooling,” Toxicology, 236, No. 3, 149-157 (2007). 12. T. Baati, F. Bourasset, N. Gharbi, et al., “The prolongation of the lifespan of rats by repeated oral administration of [60] fullerene,” Biomaterials, 33, No. 19, 4936-4946 (2012). 13. M. M. Bradford, “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding,” Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976). 14. U. K. Laemmli, “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4,” Nature, 227, No. 5259, 680-685 (1970). 15. K. Canene-Adams, “Preparation of formalin-fixed paraffin- embedded tissue for immunohistochemistry,” Meth. Enzymol., 533, 225-233 (2013). NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2 151 ІНГІБУВАННЯ РЕАКТИВНОГО ГЛІОЗУ В СІТКІВЦІ ЩУРІВ 16. G. V. Andrievsky, V. K. Klochkov, E. L. Karyakina, and N. O. Mchedlov-Petrossyan, “Studies of aqueous colloidal solutions of fullerene C60 by electron microscopy,” Chem. Phys. Lett., 300, Nos. 3/4, 392-396 (1999). 17. A. Tura, F. Schuettauf, P. P. Monnier, et al., “Efficacy of Rho- kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in the rodent retina,” Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 50, No. 1, 452-461 (2009). 18. M. Sugaya-Fukasawa, T. Watanabe, M. Tamura, et al., “Glial fibrillary acidic protein is one of the key factors underlying neuron-like elongation in PC12 cells,” Exp. Ther. Med., 2, No. 1, 85-87 (2011). 19. A. M. Joussen, S. Doehmen, M. L. Le, et al., “TNF-α mediated apoptosis plays an important role in the development of early diabetic retinopathy and long-term histopathological alterations,” Mol. Vis., 15, 1418-1428 (2009). 20. L. P. Aiello, A. Clermont, V. Arora, et al., “Inhibition of PKC by oral administration of ruboxistaurin is well tolerated and ameliorates diabetes-induced retinal hemodynamic abnormalities in patients,” Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 47, No. 1, 86-92 (2006). 21. V. Haurigot, P. Villacampa, A. Ribera, et al., “Increased intraocular insulin-like growth factor-I triggers blood- retinal barrier breakdown,” J. Biol. Chem., 284, No. 34, 22961-22969 (2009). 22. A. Hennis, S. Y. Wu, B. Nemesure, et al., “Hypertension, dia- betes, and longitudinal changes in intraocular pressure,” Oph­ thalmology, 110, No. 5, 908-914 (2003). 23. H. Zong, M. Ward, and A. W. Stitt, “AGEs, RAGE, and diabetic retinopathy,” Current Diabet. Rep., 11, No. 4, 244-252 (2011). 24. B. E. K. Klein, M. D. Knudtson, M. Y. Tsai, and R. Klein, “The relation of markers of inflammation and endothelial dysfunction to the prevalence and progression of diabetic retinopathy: Wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy,” Arch. Ophthalmol., 127, No. 9, 1175-1182 (2009). 25. E. Lieth, A. J. Barber, B. Xu, et al., “Glial reactivity and impaired flutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy,” Diabetes, 47, No. 5, 815-820 (1998). 26. J. L. Wilkinson-Berka, “Angiotensin and diabetic retinopathy,” Int. J. Biochem. Cell Biol., 38, Nos. 5/6, 752-765 (2006). 27. W.-K. Ju, K.-Y. Kim, Y. H. Noh, et al, “Increased mitochondrial fission and volume density by blocking glutamate excitotoxicity protect glaucomatous optic nerve head astrocytes,” Glia, 63, No. 5, 736-753 (2015). 28. P. Mamczur, B. Borsuk, J. Paszko, et al., “Astrocyte-neuron crosstalk regulates the expression and subcellular localization of carbohydrate metabolism enzymes,” Glia, 63, No. 2, 328-340 (2015). 29. B. S. Ganesh and S. K. Chintala, “Inhibition of reactive gliosis attenuates excitotoxicity-mediated death of retinal ganglion cells,” PLoS One, 6, No. 3, e18305 (2011). 30. K. R. Hegde, S. Kovtun, and S. D. Varma, “Inhibition of glycolysis in the retina by oxidative stress: prevention by pyruvate,” Mol. Cell Biochem., 343, Nos. 1/2, 101-105 (2010). 31. L. Pellerin and P. J. Magistretti, “Sweet sixteen for ANLS,” J. Cerebr. Blood Flow Metab., 32, No. 7, 1152-1166 (2012). 32. M. V. Sofroniew, “Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation,” Trends Neurosci., 32, No. 12, 638-647 (2009). 33. Q. J. Wang, “PKD at the crossroads of DAG and PKC signaling,” Trends Pharmacol. Sci., 27, No. 6, 317-323 (2006). 34. D. Koya and G. L. King, “Protein kinase C activation and the development of diabetic сomplications,” Diabetes, 47, No. 6, 859-866 (1998). 35. L. P. Aiello, S. E. Bursell, A. Clermont, et al., “Vascular endothelial growth factor-induced retinal permeability is mediated by protein kinase C in vivo and suppressed by an orally ejective β-isoform-selective inhibitor,” Diabetes, 46, No. 9, 1473-1480 (1997). 36. Q. Li and D. G. Puro, “Diabetes-induced dysfunction of the glutamate transporter in retinal Muller cells,” Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 43, No. 9, 3109-3116 (2002). 37. G. Baydas, V. S. Nedzvetskii, S. V. Kirichenko, and P. A. Nerush, “Astrogliosis in the hippocampus and cortex and cognitive deficits in rats with streptozotocin-induced diabetes: effects of melatonin,” Neurophysiology, 40, No. 2, 91-97 (2008). 38. M. Ulas, C. Orhan, M. Tuzcu, et al., “Anti-diabetic potential of chromium histidinate in diabetic retinopathy rats,” BMC Complement. Alternat. Med., 15/16, 1-8 (2015). 39. A. A. Tykhomyrov, V. S. Nedzvetsky, V. K. Klochkov, and G. V. Andrievsky, “Nanostructures of hydrated C60 fullerene (C60HyFn) protect rat brain against alcohol impact and attenuate behavioral impairments of alcoholized animals,” Toxicology, 246, Nos. 2/3, 158-165 (2008). 40. S. Ye, T. Zhou, K. Cheng, et al., “Carboxylic acid fullerene (C60) derivatives attenuated neuroinflammatory responses by modulating mitochondrial dynamics,” Nanoscale Res. Lett., 10, No. 1, 953 (2015). 41. F. Fluri, D. Grünstein, E. Cam, et al., “Fullerenols and glucosamine fullerenes reduce infarct volume and cerebral inflammation after ischemic stroke in normotensive and hypertensive rats,” Exp. Neurol., 265, 142-151 (2015). 42. D. Giust, T. Da Ros, M. Martín, and J. L. Albasanz, “[60] Fullerene derivative modulates adenosine and metabotropic glutamate receptors gene expression: a possible protective effect against hypoxia,” J. Nanobiotechnol., 12, 27 (2014). 43. L. L. Dugan, L. Tian, K. L. Quick, et al., “Carboxyfullerene neuroprotection postinjury in Parkinsonian nonhuman primates,” Ann. Neurol., 76, No. 3, 393-402 (2014). 44. E. G. Makarova, R. Y. Gordon, and I. Y. Podolski, “Fullerene C60 prevents neurotoxicity induced by intrahippocampal microinjection of amyloid-beta peptide,”J. Nanosci . Nanotechnol., 12, No. 1, 119-126 (2012). 45. A. G. Bobylev, N. V. Pen’kov, P. A. Troshin, and S. V. Gudkov, “Effect of dilution on aggregation of nanoparticles of polycarboxylic derivative of fullerene C60,” Biofizika, 60, No. 1, 38-43 (2015). 46. Y. Cheng, J. Qu, Y. Chen, et al., “Anterior segment neovascularization in diabetic retinopathy: a masquerade,” PLos One, 10, No. 6, e0123627 (2015). 47. I. Suárez, G. Bodega, M. Rubio, et al., “Astroglial induction of in vivo angiogenesis,” J. Neural. Transplant. Plast., 5, No. 1, 1-10 (1994). 48. N. J. Coorey, W. Shen, S. H. Chung, et al., “The role of glia in retinal vascular disease,” Clin. Exp. Optom., 95, No. 3, 266- 281 (2012). 49. D. A. Antonetti, R. Klein, and T. W. Gardner, “Diabetic retinopathy,” New Engl. J. Med., 366, No. 13, 1227-1239 (2012). NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2016.—T. 48, № 2152 В. С. НЕДЗВЕЦЬКИЙ, І. В. ПРИЩЕПА, А. О. ТИХОМИРОВ, Г. БАЙДАШ 50. B. A. Barres, “The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease,” Neuron, 60, No. 3, 430-440 (2008). 51. S. M. Tan, D. Deliyanti, W. A. Figgett, et al., “Ebselen by modulating oxidative stress improves hypoxia-induced macroglial Müller cell and vascular injury in the retina,” Exp. Eye Res., 136, 1-8 (2015). 52. R. Pazdro and J. R. Burgess, “The role of vitamin E and oxidative stress in diabetes complications,” Mech. Ageing Dev., 131, No. 4, 276-286 (2010). 53. T. Jiang, Q. Chang, Z. Zhao, et al., “Melatonin-mediated cytoprotection against hyperglycemic injury in Müller cells,” PLoS One, 7, No. 12, e50661 (2012). 54. N. Gharbi, M. Pressac, M. Hadchouel, et al., “[60]Fullerene is a powerful antioxidant in vivo with no acute or subacute toxicity,” Nano Lett., 5, No. 12, 2578-2585 (2005). 55. S. Yamagishi, S. Maeda, T. Matsui, et al., “Role of advanced glycation end products (AGEs) and oxidative stress in vascular complications in diabetes,” Biochim. Biophys. Acta, 1820, No. 5, 663-671 (2012).

Ähnliche Einträge