Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu

Получены рекомбинантные плазмиды RP4 :: Mu cts62. Плазмида переносится с частотой 10⁻³-10⁻⁴ от E. coli в таксономически далекую бактерию Azotobacter chroococcum. Получен штам Azotobacter , в котором Mu cts62 ДНК фага была получена около 10⁵ бляшкообразующих единиц на мл⁻¹. Штамм Azotobacter chroococ...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1985
Автори:	Расчинкина, А.С., Троицкий, Н.А., Окулич, Л.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1985
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Генно-инженерная биотехнология
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152317
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu / А.С. Расчинкина, Н.А. Троицкий, Л.А. Окулич // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 4. — С. 219-224. — Бібліогр.: 15 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-152317
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1523172019-06-10T01:25:37Z Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu Расчинкина, А.С. Троицкий, Н.А. Окулич, Л.А. Генно-инженерная биотехнология Получены рекомбинантные плазмиды RP4 :: Mu cts62. Плазмида переносится с частотой 10⁻³-10⁻⁴ от E. coli в таксономически далекую бактерию Azotobacter chroococcum. Получен штам Azotobacter , в котором Mu cts62 ДНК фага была получена около 10⁵ бляшкообразующих единиц на мл⁻¹. Штамм Azotobacter chroococcum 31/8 (RP4 :: Mu cts62) используется в качестве донора хромосомных генов в межродовых взаимодействиях E. coli и AB1157 . RP4 :: Mu cts62 плазмид-опосредованной передачи thr и his маркеров не найдено. Отримано рекомбінантні плазміди RP4 :: Mu cts62. Плазміда переноситься з частотою 10⁻³-10⁻⁴ від E. coli в таксономічно далеку бактерію Azotobacter chroococcum. Отримано штам Azotobacter, у якому Mu cts62 ДНК фага отримано приблизно 10⁵ бляшкоутворювальних одиниць на 1 мл⁻¹. Штам A. chroococcum 31/8 (RP4 :: Mu cts62) використано як донор хромосомних генів у міжродових взаємодіях E. coli і AB1157. RP4 :: Mu cts62 плазмід-опосередкованої передачі thr і his маркерів не знайдено. Recombinant plasmid of RP4:: Mu cts62 is constructed. The plasmid is transferred by conjugation with the 10⁻³-10⁻⁴ frequency from E. coli to taxonomically nonrelated bacterium of Azotobacter chroococcum. Azotobacter strains are revealed where Mu cts62 phage DNA was replicated and about 10⁵ plaque-forming units per ml⁻¹ was produced. The strain of A. chroococcum 31/8 (RP4 :: Mu cts62) is used as a donor of chromosomal genes in intergeneric mating with E. coli AB1157 recipient. The RP4 :: Mu cts62 plasmid-mediated transfer of thr and his markers is found. 1985 Article Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu / А.С. Расчинкина, Н.А. Троицкий, Л.А. Окулич // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 4. — С. 219-224. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000186 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152317 579.25 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Генно-инженерная биотехнология Генно-инженерная биотехнология
spellingShingle	Генно-инженерная биотехнология Генно-инженерная биотехнология Расчинкина, А.С. Троицкий, Н.А. Окулич, Л.А. Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu Биополимеры и клетка
description	Получены рекомбинантные плазмиды RP4 :: Mu cts62. Плазмида переносится с частотой 10⁻³-10⁻⁴ от E. coli в таксономически далекую бактерию Azotobacter chroococcum. Получен штам Azotobacter , в котором Mu cts62 ДНК фага была получена около 10⁵ бляшкообразующих единиц на мл⁻¹. Штамм Azotobacter chroococcum 31/8 (RP4 :: Mu cts62) используется в качестве донора хромосомных генов в межродовых взаимодействиях E. coli и AB1157 . RP4 :: Mu cts62 плазмид-опосредованной передачи thr и his маркеров не найдено.
format	Article
author	Расчинкина, А.С. Троицкий, Н.А. Окулич, Л.А.
author_facet	Расчинкина, А.С. Троицкий, Н.А. Окулич, Л.А.
author_sort	Расчинкина, А.С.
title	Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu
title_short	Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu
title_full	Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu
title_fullStr	Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu
title_full_unstemmed	Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu
title_sort	введение бактериофага mu в azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1985
topic_facet	Генно-инженерная биотехнология
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152317
citation_txt	Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu / А.С. Расчинкина, Н.А. Троицкий, Л.А. Окулич // Биополимеры и клетка. — 1985. — Т. 1, № 4. — С. 219-224. — Бібліогр.: 15 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT rasčinkinaas vvedeniebakteriofagamuvazotobacterchroococcumimežrodovojperenosgenovobuslovlennyjplazmidojrp4mu AT troickijna vvedeniebakteriofagamuvazotobacterchroococcumimežrodovojperenosgenovobuslovlennyjplazmidojrp4mu AT okuličla vvedeniebakteriofagamuvazotobacterchroococcumimežrodovojperenosgenovobuslovlennyjplazmidojrp4mu
first_indexed	2025-07-13T02:49:08Z
last_indexed	2025-07-13T02:49:08Z
_version_	1837498322223366144
fulltext	Генноинженерная биотехнология УДК 579.25 ВВЕДЕНИЕ БАКТЕРИОФАГА MU В AZOTOBACTER CHROOCOCCUM И МЕЖРОДОВОЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ, ОБУСЛОВЛЕННЫЙ ПЛАЗМИДОЙ RP4 : : MU А. С. Расчинкина, Н. А. Троицкий, Л. А. Окулич Бактериофаг Ми, внесенный в клетки устойчивых к нему грамотрица- тельных бактерий в составе трансмиссибельных плазмид, способен хорошо экспрессироваться во многих новых хозяевах [1—4]. Благодаря этому стало возможным его применение для создания эффективной системы конъюгационного переноса хромосомных генов [1, 2, 4—8]. Цель настоящей работы — введение бактериофага Ми в Azotobac- ter chroococcum и изучение донорных свойств полученного штамма в гетероспецифическом скрещивании с Escherichia coli. Материалы и методы. Ш т а м м ы . Характеристика штаммов бактерий и бактерио- фагов представлена в табл. 1. Р е а к т и в ы . Минеральные соли, глюкоза и сахароза («Реахим», СССР), амино- кислоты («Reanal», Венгрия), дрожжевой экстракт («Serva», ФРГ) , гидролизат казеи- на («Calbiochem», США), антибиотики — стрептомицина сульфат, тетрациклина гидро- хлорид, ампициллина натриевая соль, канамицина сульфат — производства СССР. С р е д ы . Для выращивания A. chroococcum использовали агаризованную (1 ,5%) среду Берка [9], жидкую и агаризованную среду Берка, обогащенную дрожжевым экс- трактом, 1 г/л, и гидролизатом казеина, 1 г/л, (БДЭГК) . Для выращивания Е. coli применяли мясо-пептонный бульон (МПБ), 1,5- и 0,7 %-й мясо-пептонный агар (ΜΠΑ) и минимальную агаризованную среду М9, обогащенную необходимыми факторами рос- та. Растворы антибиотиков готовили непосредственно перед опытом и вносили в се- лективные среды в следующих конечных концентрациях, мкг/мл: тетрациклин — 20, ка- намицин— 100, ампициллин— 100 для Е. coli и соответственно 10, 5 и 100 для A. chro- ococcum. В ΜΠΑ, используемый для титрования фага Ми, вносили 2,5· Ю - 3 Μ СаС12 и Ю- 3 Μ MgSO/. Для разведения бактериальной суспензии Е. coli применяли буфер- ные растворы М9 и Берка для Azotobacter, т. е. соответствующие среды, лишенные углеводов. Л и з о г е н и з а ц и я ф а г о м Ми cts6 2 Ε. coli С 60 0 (RP4). Клетки Ε. coli лизогенизировали по методу [10] фагом Ми cts62, полученным после термоин- дукции Е. coli АВ2463. П р о д у ц и р о в а н и е ф а г а Ми с t s 6 2 к л е т к а м и A. chroococcum. Свежую культуру трансконъюганта, содержащего плазмиду RP4 :: Ми cts62, высевали в среду БДЭГК и растили с аэрацией в течение суток при 30 °С. Затем культуру де- лили на две части. Первую подвергали термоиндукции при 42 °С в течение 15—20 мин с последующим выращиванием 24 ч при 30 °С. Вторую часть культуры продолжали растить то же время в прежних условиях. Далее обе культуры хлороформировали, центрифугировали. Надосадочную жидкость титровали в чашках с ΜΠΑ, содержащих индикаторную культуру Е. coli. Чашки инкубировали при 42 °С. Подсчет негативных колоний производили на следующий день. С к р е щ и в а н и е . Смесь донорных и реципиентных клеток в соотношении 1 : 1 , содержащую по 109 клеток каждой культуры в экспоненциальной фазе роста (Е. coli — 2,5 ч в МПБ, A.chroococcum — 24 ч в среде Берка), наносили на бактериальный фильтр, который помещали на 0,7 %-й ΜΠΑ и инкубировали при 30 °С. Длительность инкуба- 219 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 ции составила 1 ч в скрещивании Е. colixE. coli, З ч в скрещивании Е. colixA. chroococ- сит и 20 ч в опытах по передаче хромосомных маркеров при скрещивании A. chroococ- cumxE. coli. В последнем случае перед приготовлением конъюгационной смеси произ- водили термоиндукцию профага Ми cts62 в клетках азотобактера, как указано выше. Клетки после смыва с фильтра высевали на селективные для реципиента среды. В ка- честве селективного признака при передаче плазмид использовали устойчивость к те- трациклину. Д л я определения передачи хромосомных маркеров в Е. coli применяли сре- Т а б л и ц а 1 Бактериальные штаммы и бактериофаги Bacterial Strains and Bacteriophages Штамм Характеристика Источник получения Escherichia coli К12 С600 (RP4) С600 (RP4 :: Ми cts62) C600 5K AB1157 AB1157 Mur AB1157 (Ми cts62) AB2463 (Ми cts62) Azotobacter chroococcum 93/56 3/53 9/21 10016 31/8 93/56 (RP4 : : Ми cis62) 3/53 (RP4 : : Ми cts62) 9/21 (RP4 : : Ми cts62) 100/6 (RP4 :: Ми cts62) 31/8 (RP4 : : Ми cts62) Бактериофаги Ми cts62 PRR1 thr leu thi (AprKmrTcr) thr leu thi (AprKmrTcr Ми cts62) thr leu thi rK~mK+, чувст вителен к фагу Ми F~thr leu pro arg his thi lac gal ara xyl mtl str, чувствителен к фагу Ми Устойчив к инфекции фа- гом Ми, по другим свойст- вам аналогичен АВ1157 Лизоген по фагу Ми cts62, по другим свойствам ана- логичен АВ1157 Лизоген по фагу Ми cts62, гесА, по другим свойствам аналогичен АВ1157 Дикий тип, устойчив к ин- фекции фагом Ми, прото троф То же Содержит плазмиду RP4 :: Ми cts62 То же Термоиндуцибельный му- тант Ми Специфичен для штаммов с плазмидами группы не- совместимости Р1 Коллекция Опорного пункта ВНИИгенетика, Минск Данная работа, получен пу- тем лизогенизации С600 (RP4) фагом Ми cts62 Коллекция ИХФ АН СССР, Москва Коллекция Политехнического ин-та, Ленинград Данная работа, получен как спонтанный мутант АВ1157 Д а н н а я работа, получен пу- тем лизогенизации АВ1157 фагом Ми cts62 Коллекция Политехнического ин-та, Ленинград Коллекция В Н И И с.-х. микро- биологии, Ленинград То же Данная работа, Е. coli С600 (RP4 :: Ми cts62)XA. chro- ococcum 93/56 Данная работа, Е. coli С600 (RP4 :: Ми cts62)XA. chro- ococcum 3/53 Данная работа, Е. coli С600 (RP4 : : Ми cts62)ХА. chro- ococcum 9/21 Данная работа, Ε. coli С600 (RP4 :: Ми cts62)XA. chro- ococcum 100/6 Данная работа, Ε. coli C600 (RP4 :: Ми cts62)XA. chro- ococcum 31/8 Д а н н а я работа, получен путем термоиндукции АВ2463 (Ми cts62) Коллекция Опорного пункта ВНИИгенетика, Минск 220 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 ду М9, лишенную одной из необходимых аминокислот, с тетрациклином. Контрселек- ция донора в скрещиваниях Е. colixE. coli и A. chroococcumxE. coli обеспечивалась внесением в селективную среду стрептомицина в концентрации 200 и 20 мкг/мл соот- ветственно, в скрещивании Е. colixA. chroococcum — использованием безазотной среды Берка. Посевы инкубировали при 30 °С. Подсчет трансконъюгантов Е. coli производили через 2 сут, A. chroococcum — через 3—4 сут. Передачу хромосомных маркеров учиты- вали через 4—5 сут. Результаты и обсуждение. П е р е н о с п л а з м и д ы RP4: :Ми cts62 от Е. coli в к л е т к и A. chroococcum. Рекомбинант- ная плазмида RP4::Mu cts62 получена нами -по методу [11] путем ли- зогенизации фагом Ми cts62 штамма Е. coli С600 (RP4). Интеграция профага в RP4 продемонстрирована явлением зиготной индукции при переносе плазмиды в нелизогенный Ми-резистентный реципиент Е. coli АВ1157 (ее передача снижалась ~ в 1000 раз по сравнению с RP4) и 100%-й совместной передачей антибиотикоустойчивости и профага в скрещивании с тем же реципиентом. Т а б л и ц а 2 Частота переноса плазмид RP4:: Ми cts62 и RP4 из Ε coli С600 в A. chroococcum Frequencies of Transfer of Plasmid RP4:: Ми cts62 and RP4 from E. coli C600 to Strains of A. chroococcum Пл; Штамм- Частота Пл; ;ізмида реципиент переноса RP4 : : Ми cts62 9/21 1,7-Ю-4 RP4 9/21 1,9· 10~4 RP4 : : Ми cts62 31/8 6 ,9-Ю- 4 RP4 31/8 1 ,7 .Ю- 3 RP4 : : Ми cts62 100/6 8,0-Ю- 4 RP4 100/6 4,2. Ю- 3 RP4 : : Ми cts62 93/56 1,9· Ю- 4 RP4 93/56 3 ,7-Ю- 3 RP4 : : Ми cts62 3/53 5 ,7 .10- 4 RP4 3/53 1,5. Ю- 3 П р и м е ч а н и е . Частоту переноса оп- ределяли, как отношение числа транс- конъюгантов к числу жизнеспособных клеток донора в начале скрещивания. Т а б л и ц а 3 Титр фага Ми cts62 в культурах разных штаммов A. chroococcum по сравнению с Е. coli А В2463 (Ми cts62) The Phage Ми cts62 Titer in the Cultures of Different Strains of A. chroococcum in Comparison with E. coli AB2463 (Ми cts62) Штамм, продуцирующий фаг Число негативных колоний на 1 мл A. chroococcum 31/8 (RP4 : : Ми cts62) 4,4.10 s 100/6 (RP4 : : Ми cts62) 3,1-10 s 9/21 (RP4 : : Ми cls62) 1,3.10s Ε. coli** АВ2463 (Ми cts62) 3,5.108 * Титр клеток в культуре 3-Ю8 . ** Куль- тура росла до экспоненциальной фазы при 30 °С, затем индуцировалась 1 ч при 42 °С. К началу термоиндукции в культуре было 1,2· 108 клеток в 1 мл. Штамм Е. coli С600 (RP4: :Ми cts62) использован в качестве до- нора для переноса плазмиды RP4: :Ми в A. chroococcum. Одновременно для контроля и сравнения проводили опыты по переносу плазмиды RP4 от донора С600 (RP4). Ранее нами показано, что плазмида RP4 переносится из Е. coli в клетки A. chroococcum и стабильно наследу- ется ими, все гены антибиотикоустойчивости RP4 экспрессируются в новом хозяине [12]. Как видно из данных табл. 2, плазмиды RP4: :Ми cts62 и RP4 передаются в пять штаммов азотобактера почти с одинаковой частотой Ю-4—10-3. Сходство частот переноса обеих плазмид свидетельствует об отсутствии значительной зиготной индукции профага Ми в клетках A. chroococcum. Согласно данным литературы, зиготная индукция зависит от ре- ципиентных бактерий. В одни бактерии плазмида с фагом Ми переда- ется с более низкой частотой, чем плазмида без Ми [3, И, 13], в дру- гие— с той же частотой, т. е. без зиготной индукции [4, 14]. Отсутствие зиготной индукции при передаче плазмиды RP4: :Ми рассматривается как один из важных факторов, определяющих перспективность ее 221 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 использования для разработки методов конъюгационного генетического анализа у бактерий [4]. Трансконъюганты азотобактера, получившие плазмиду с фагом Ми, имеют фенотипическую особенность — замедленный рост на селек- тивной среде и гораздо более мелкие колонии по сравнению с получив- шими плазмиду RP4. Подобное явление у R. meliloti, получивших фаг Ми с плазмидой RP4, авторы объясняют проявлением некоторых генов Ми или увеличением плазмиды [11]. Т а б л и ц а 4 Передача хромосомных маркеров от A. chroococcutn 31/8 в Е. coli АВ1157, обусловленная плазмидами RP4 :: Ми cts62 и RP4 Transfer of Chromosomal Markers from A. chroococcum 31/8 ίο Ε. coli AB1157 by Plasmids RP4 :: Ми cts62 and RP4 * Частоту определяли, как отношение числа трансконъюгантов к числу жизнеспособ- ных клеток донора в начале скрещивания. Приведены данные трех опытов. П р о д у ц и р о в а н и е ф а г а Ми с t s 6 2 к л е т к а м и A. chroo- coccum. Фагопродукціия исследована в культурах отдельных клонов (до 16) пяти штаммов азотобактера, получивших плазмиду RP4: :Ми cts62. В качестве индикаторной культуры использовали штамм Е. coli С600 5К. Спонтанный выход фага выявлен в культурах пяти клонов штамма 31/8, трех клонов штамма 9/21 и двух клонов штамма 100/6. В культурах трансконъюгантов штаммов 93/56 и 3/53 фаг не был об- наружен. По титру фага фагопродуцирующие культуры существенно не различались (табл. 3). Фаг, выделенный из этих культур, обладает специфичностью, характерной для Ми, поскольку он формировал нега- тивные колонии только на Λία-чувствительных и нелизогенных по Ми штаммах Е. coli и не формировал их на Ми-резистентных и лизоген- ных по Ми штаммах. Интересно отметить, что применение термоиндук- ции (20 мин при 42 °С) у всех исследованных культур азотобактера не способствовало значительному повышению выхода фага по сравне- нию со спонтанным. П е р е н о с х р о м о с о м н ы х м а р к е р о в а з о т о б а к т е р а п л а з м и д о й R Р4: :М и с t s62. Обнаруженная нами экспрессия фага Ми в клетках азотобактера дает основание предположить возможность транспозиции его генов на плазмиду и их конъюгационного переноса в другие бактерии-реципиенты. В качестве реципиента был взят штамм Е. coli АВ1157, устойчивый к фагу Ми. Донором служил штамм A. chroococcum 31/8, несущий плазмиду RP4: :Ми cts62. Для сравнения в тех же экспериментах использовали донорный штамм A. chroococcum 31/8 с плазмидой RP4. Мы исследовали способность генов азотобактера, перенесенных в Е. coli АВ1157, восстанавливать прототрофность по генам thr, his и pro. Для одновременной селекции генов азотобактера и плазмидных маркеров устойчивости в качестве селективных сред при- меняли среды на основе М9 с тетрациклином без одной из аминокислот (треонина, гистидина или пролина), необходимых для штамма АВ1157. Для контрселекции донора использовали стрептомицин. 222 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 На селективных средах без треонина и гистидина с тетрациклином трансконъюганты появлялись с высокой частотой — 10~3—10~4 на клет- ку донора с плазмидой RP4: :Ми, в 100 раз превышающей частоту трансконъюгантов в опытах с использованием донора с плазмидой RP4 (табл. 4). Трансконъюгантов с фенотипом Рго+Тс' в обоих случаях не обнаружено. Для Thr+Tcr-трансконъюгантов, полученных в скре- щивании с донором RP4: :Ми cts62, характерен медленный рост и мелкие колонии. При рассеве их на селективной среде выявлена сегре- гация быстро растущих клонов ( ~ 1 % ) . Трансконъюганты Thr+Tcr получили от донора также плазмидные гены и профаг Ми cts62, так как они были устойчивы к соответствующим антибиотикам, чувстви- тельны к фагу PRR1 и продуцировали после термоиндукции бактерио- фаг Ми. Стабильность ТЛг+Гсг-трансконъюгантов Е. coli изучали после 40 генераций в неселективных условиях (выращивание в МПБ с по- следующим высевом на полную среду М9 для получения изолирован- ных клонов). Чтобы выявить наличие маркеров thr и устойчивость к трем антибиотикам, исследовано по 100 клонов десяти трансконъюган- тов из каждого опыта. При этом выявлено, что до 20 % клонов теряли признак Thr+, сохраняя все плазмидные маркеры. Эти данные свиде- тельствуют о том, что хромосомные маркеры азотобактера сегрегируют в новом хозяине легче, чем плазмидные. Стабильные клоны Thr+Tcr- трансконъюгантов Е. coli обладали донорными свойствами и переда- вали совместно плазмиду и thr-маркер в скрещиваниях с реципиентами Е. coli АВ1157 Мит и Е. coli АВ2463 (Ми cts). Оба реципиента — спонтанные ревертанты по мар.керу arg. Контрселекция донора в этих опытах достигалась отсутствием в среде аргинина. Такой характер передачи предполагает включение /йг-маркера в плазмиду. Трансконъю- ганты His+Tcr также образовывали на селективной среде мелкие колонии. Эти трансконъюганты утрачивали Яі5+-признак в 100 % случаев уже при первом пересеве на селективную среду без предварительного выращивания в неселективных условиях. В конъюгацжшной системе A. chroococcum 31/8У^Е. coli АВ1157 Mw при использовании донора с RP4: :Ми cts62 создается возмож- ность транспозиции хромосомных маркеров азотобактера на плазмиду, которая осуществляет их передачу в клетки реципиента с большей частотой, чем RP4 без Ми. Как видно из данных табл. 4, плазмида RP4: :Ми cts62 передается -в Е. coli с меньшей частотой, чем RP4, в то время как частота передачи маркеров thr и his, обусловленная ею, в среднем в 105—104 раз выше (в расчете на переданную плазмиду). Передача хромосомных маркеров плазмидой RP4: :Ми при других меж- родовых скрещиваниях осуществлялась с более низкой частотой [2, 6, 8]. Сходство частот передачи маркеров thr и his может свидетель- ствовать о равной вероятности включения Ми в различные участки хромосомы азотобактера и транспозиции генов на введенную плазмиду. Судьба этих генов в клетках Е. coli неодинакова. Ген thr частично восстанавливает функцию аналогичного мутантного гена Е. coli АВ1157, о чем свидетельствует формирование мелких колоний трансконъюгантов на селективной среде. Как уже отмечалось, этот ген довольно стабиль- но поддерживается в составе плазмиды. Сегрегация клонов с полным восстановлением Thr+-фенотипа (быстро растущие клоны), возможно, объясняется гомологией отдельных сегментов ДНК A. chroococcum и Е. coli, как это показано для arg Η-гена дрожжей, клонированного в клетках Е. coli [15]. Ген his азотобактера экспрессируется в Е. coli слабее thr-гена и полностью элиминируется из клеток нового хозяина. Недостаточная экспрессия и нестабильность чужеродной ДНК при гетероспецифиче- ском переносе известна [8, 15]. Однако причины спонтанной элимина- ции his-маркера из His+Tcг-трансконъюганто!В и отсутствия передачи 223 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4 рго-маркера, обнаруженные нами, остаются неясными и требуют изу- чения. Дальнейшие генетические исследования на A. chroococcum с при- менением плазмиды RP4: :Ми, на наш взгляд, необходимо проводить как в направлении стабилизации плазмид, несущих фрагменты его ДНК, так и в направлении создания возможности мобилизации хромо- сомы этой бактерии в конъюгационных скрещиваниях. INTRODUCTION OF MU BACTERIOPHAGE INTO AZOTOBACTER CHROOCOCCUM AND INTERGENERIC RP4 :: Ми PLASMID-MEDIATED TRANSFER OF GENES A. S. Raschinkina, N. A. Troitsky, L. A. Okulich Institute of Genetics and Cytology, Academy of Sciences of the Byelorussian SSR, Minsk S u m m a r y Recombinant plasmid of RP4 :: Ми cis62 is constructed. The plasmid is transferred by conjugat ion with the 10 - 3 -10 - 4 frequency from E. coli to taxonomically nonrelated bacte- rium of Azotobactcr chroococcum. Azotobacter strains are revealed where Ми cts62 phage DNA was replicated and about 105 plaque-forming units per mln 1 was produced. The strain of A.chroococcum 31/8 (RP4 :: Ми cts62) is used as a donor of chromosomal genes in intergcneric mat ing with E. coli AB1157 recipient. The RP4 :: Ми cts62 plasmid-me- diated t ransfer of thr and his markers is found. 1. Potential of RP4:: Ми plasmids for in vivo genetic engineering of gram-negative bacteria / J. Denarie, C. Rosenberg, B. Bergeron et al.— In: DNA insertion elements, plasmids and episomes. N. Y.: Cold Spring Harbor, 1977, p. 507—520. 2. Murooka Y., Takizawa N., Harada T. Introduction of bacteriophage Ми into bacteria of various genera and intergeneric gene t ransfer by RP4:: Ми.— J. Bacter id. , 1981, 145, N 1, p. 358—368. 3. Beacham J. R., Garrett S. Transfer of RP4:: Ми to Salmonella typhimurium.— J. Gen. Microbiol., 1981, 124, N 1, p. 225—228. 4. Конъюгация у Rhodopseudomonas sphaeroides, обусловленная /?-плазмидами / С. В. Каменева, Т. П. Поливцева, А. В. Коптева, Ε. М. Муронец.— Генетика, 1982, 18, № 9, с. 1433—1441. 5. Perombelon Μ. С. Μ., Boucher С. Developing of mat ing system in Erwinia carotovo- ra.— In: Proc. 4th Int. Conf. P lant Pathog. Bact. Angers, 1978, v. 1, p. 47—52. 6. Oijsegem F. Van., Toussaint A. Chromosome transfer and R-prime formation by an RP4 :: mini-Ми derivative in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae and Proteus mirabilis.— Plasmid, 1982, 7, N 1, p. 30—44. 7. Schoonejans E., Toussaint A. Utilization of plasmid pULB113 (RP4:: mini-Ми) to construct a linkage map of Erwinia carotovora subsp. chrysanthemi.— J. Bacteriol., 1983, 154, N 3, p. 1489—1492. 8. Chromosome t ransfer and R-prime plasmid formation by plasmid pULB113 (RP4 :: mini-Ми) in Alcaligenes eutrophus CH34 and Pseudomonas fluorescens 6.2 j P. Lej- eune, M. Mergeay, van F. Gijsegem et al —Ibid , 155, N 3, p. 1015—1026. 9. Sadoff H. LShimei В., Ellis S. Characterization of Azotobacter vinelandii deoxyri- bonucleic acid and folded chromosomes.—Ibid, 1979, 138, N 3, p. 871—877. 10. Taylor A. L. Bacteriophage-induced mutation in Escherichia coli.— Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1963, 50, N 6, p. 1043—1051. 11. Introduction of bacteriophage Ми into Pseudomonas solanacearum and Rhizobium meliloti using the R factor RP4 / C. Boucher, B. Bergeron, de Μ. B. Bartalmio, J. De- narie .—J. Gen. Microbiol., 1977, 98, N 2, p. 253—263. 12. Расчьінкіна A. C., Троіцкі Μ. Α., Акуліч JI. А. Перанос плазмідьі RP4 пры канъюга- цьіі і выражэння яе генау у Azotobacter chroococcum.— Весці Акад. навук БССР, сер. біял. навук, 1981, № 3, с. 64—68. 13. Transfer of RP4 :: Ми plasmids to Agrobacterium tumefaciens / Van F. Vliet, B. Sil- va, van M. Montagu, J. Schell .—Plasmid, 1978, 1, N 4, p. 446—455. 14. Tucker W. ΤPemberton J. M. The introduction of RP4 :: Ми cts62 into Rhodopseu- domonas sphaeroides.— FEMS Microbiol. Lett., 1979, 5, N 3, p. 215—217. 15. Clarke L., Carbon J. Functional expression of cloned yeast DNA in Escherichia coli: specific complementation of argininosuccinate lyase (arg H) mutations.— J. Мої. Biol., 1978, 120, N 4, p. 517—532. Ин-т генетики и цитологии АН БССР, Получено 17.08.84 Минск 224 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1985, т. 1, № 4

Введение бактериофага mu в Azotobacter chroococcum и межродовой перенос генов, обусловленный плазмидой rp4 : : mu

Репозитарії

Схожі ресурси