Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок
Подобраны условия гидролиза фрагмента К 1—3 молекулы плазминогена пепсином, при котором образуются изолированный первый крингл и структура, содержащая второй и третий кринглы (фрагмент К 2—3). Показано, что фрагмент К 2—3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок....
Gespeichert in:
| Datum: | 1986 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1986
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152422 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок / В.В. Новохатний, Ю.В. Мацука, С.А. Кудинов // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 1. — С. 19-23. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-152422 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1524222019-06-12T01:25:30Z Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок Новохатний, В.В. Мацука, Ю.В. Кудинов, С.А. Структура и функции биополимеров Подобраны условия гидролиза фрагмента К 1—3 молекулы плазминогена пепсином, при котором образуются изолированный первый крингл и структура, содержащая второй и третий кринглы (фрагмент К 2—3). Показано, что фрагмент К 2—3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок. Підібрано умови гідролізу фрагмента К 1–3 молекули плазміногену пепсином, при якому утворюються ізольований перший крингл і структура, що містить другий і третій крингли (фрагмент К 2–3). Показано, що фрагмент К 2–3 молекули плазміногену містить лізинзв’язувальну ділянку. Limited pepsin digestion of plasminogen fragment K 1—3 leads to the formation of the first kringle and structure which contains the second and third kringles (fragment K 2—3). The isolated fragments are characterized according to molecular masses and amino acid composition. Fragment K 2—3 is shown to be able of binding with lysine-Sepharose, which indicates the existence of a lysine-binding site in its structure. 1986 Article Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок / В.В. Новохатний, Ю.В. Мацука, С.А. Кудинов // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 1. — С. 19-23. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000104 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152422 577.1 12.853.083 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Новохатний, В.В. Мацука, Ю.В. Кудинов, С.А. Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок Биополимеры и клетка |
| description |
Подобраны условия гидролиза фрагмента К 1—3 молекулы плазминогена пепсином, при котором образуются изолированный первый крингл и структура, содержащая второй и третий кринглы (фрагмент К 2—3). Показано, что фрагмент К 2—3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок. |
| format |
Article |
| author |
Новохатний, В.В. Мацука, Ю.В. Кудинов, С.А. |
| author_facet |
Новохатний, В.В. Мацука, Ю.В. Кудинов, С.А. |
| author_sort |
Новохатний, В.В. |
| title |
Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок |
| title_short |
Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок |
| title_full |
Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок |
| title_fullStr |
Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок |
| title_full_unstemmed |
Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок |
| title_sort |
фрагмент к 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1986 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152422 |
| citation_txt |
Фрагмент К 2–3 молекулы плазминогена содержит лизинсвязывающий участок / В.В. Новохатний, Ю.В. Мацука, С.А. Кудинов // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 1. — С. 19-23. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT novohatnijvv fragmentk23molekulyplazminogenasoderžitlizinsvâzyvaûŝijučastok AT macukaûv fragmentk23molekulyplazminogenasoderžitlizinsvâzyvaûŝijučastok AT kudinovsa fragmentk23molekulyplazminogenasoderžitlizinsvâzyvaûŝijučastok |
| first_indexed |
2025-07-13T03:04:43Z |
| last_indexed |
2025-07-13T03:04:43Z |
| _version_ |
1837499296544456704 |
| fulltext |
17. Freist W., Wlender H., Cramer F. Chemically modified ATP derivatives for the study
of aminoacyl-tRNA synthetases from Baker's yeast: ATP analogs with fixed conforma-
tions or modified triphosphate chains in the aminoacylation reac t ion / /Bioorg . Chem.—
1980.—9, N 4 .—P. 491—504.
18. Marytzky R., Flossdorf J., Kula M.-R. ATP analogs as substrates for the leucyl-
tRNA synthetase from Escherichia coli MRE 600 / / Nucl. Acids Res.—1976.—3, N 8 —
P. 2067—2077.
19. Led J. /., Switon W. КJensen K. F. Phosphorolytic activity of Escherichia coli gly-
cyl-tRNA synthetase towards its cognate aminoacyl adenylate detected by 31P-NMR
spectroscopy and thin-laver ch romatography / /Eur . J. Biochem.—1983.—136, N 3.—
P. 469—479.
20. Ковалева Г. К., Дегтярев С. X., Фаворова О. О. Аффинная модификация триптофа-
нил-тРНК-синтетазы алкилирующим аналогом триптофана / /Молекуляр . биология.—
1979.—13, № 6.—С. 1237—1246.
Ин-т молекуляр. биологии АН СССР, Получено 25.07.85
Москва
УДК 577.1 12.853.083
ФРАГМЕНТ К 2—3 МОЛЕКУЛЫ ПЛАЗМИНОГЕНА
СОДЕРЖИТ ЛИЗИНСВЯЗЫВАЮЩИЙ УЧАСТОК
В. В. Новохатний, Ю. В. Мацука, С. А. Кудинов
Введение. Плазминоген, неактивный предшественник фибринолитиче-
ского фермента плазмина, представляет собой одноцепочечный глико-
протеид с молекулярной массой 92 000. Его единственная полипептид-
ная цепь состоит из 790 аминокислотных остатков с известной первич-
ной последовательностью [1]. При активации плазминогена в плазмин
образуются тяжелая и легкая цепи, соединенные между собой двумя
дисульфидными связями [1—3]. Легкая цепь плазмина содержит актив-
ный центр и гомологична трипсину и другим сериновым протеазам [2].
В составе тяжелой цепи плазмина имеется пять гомологичных трехпет-
левых структур (кринглов) [4], имеющих молекулярную массу около
і 0 000 и состоящих примерно из 80 аминокислотных остатков. Стабиль -
ность этих структур обеспечивается тремя дисульфидными связями.
Кринглы ответственны за способность плазминогена и плазмина специ-
фически связывать лизин и некоторые другие ω-аминокарбоновые кис-
лоты [5]. Согласно современным представлениям лизинсвязывающие
участки играют решающую роль в регуляции физиологического фибри-
нолиза [6]. Ими опосредуется взаимодействие плазминогена и плаз-
мина с фибрином и а2-антиплазмином.
Несмотря на интенсивное изучение лизинсвязывающих свойств
плазминогена, до настоящего времени строго не установлено количе-
ство связывающих участков в его молекуле. С помощью ограниченного
протеолиза плазминогена показано [4, 7], что лизинсвязывающие уча-
стки имеются в первом и четвертом кринглах. На основании изучения
химической природы лизинсвязывающего участка четвертого крингла и
гомологичности крингловых структур Трекслер и соавт. [8] предполо-
жили существование участка со слабым сродством к лизину во втором
крингле. Экспериментальным подтверждением этого предположения
явились данные по плавлению плазминогена и его фрагментов [9].
В этой работе нами было показано, что ε-аминокапроновая кислота
оказывает специфическое стабилизирующее действие на структуру пер-
вого, второго и четвертого кринглов. Однако строгое доказательство
присутствия лизинсвязывающего участка во втором крингле можно по-
лучить лишь имея эту структуру в изолированном виде.
В настоящем сообщении приводятся результаты экспериментов,
указывающих на присутствие лизинсвязывающего участка во фрагмен-
те К 2—3 молекулы плазминогена.
БИОПОЛ ИМЕРЬІ II КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 1 19
Материалы и методы. Лиз-плазминоген человека (модифицированная форма, со-
держащая в N-концевом положении преимущественно лизин) выделяли из фракции III
по Кону методом аффинной хроматографии на лизин-сефарозе [10]. Смесь двух форм
фрагмента К 1—3 (Тир 79 — Вал 337 и Тир 79 — Вал 353), содержащего три первые
крингловые структуры, получали путем ограниченного протеолиза плазминогена эласта-
зой с последующим разделением продуктов гидролиза аффинной хроматографией на ли-
зин-сефарозе и гель-фильтрацией на сефадексе Г-75 [9]. При гидролизе фрагмента
К 1—3 в качестве протеолитического фермента использовали пепсин с активностью
2585 ед./мг («Worthington», США). Гидролиз фрагмента К 1—3 и разделение образую-
щихся при этом продуктов проводили следующим образом. Фрагмент К 1—3 растворяли
в 50 мМ глициновом буфере, рН 2,7, до конечной концентрации 10 мг/мл. В этот раст-
вор прибавляли пепсин в количестве, обеспечивающем отношение фермента к субстрату
1 : 100 (по массе). Гидролиз протекал при 18°С 3 ч, после чего его останавливали пе-
реводом реакционной смеси в щелочную среду, прибавляя к гидролизату 1 Μ трис-
НС1, рН 9,0. При определении лизинсвязывающей способности гидролизат переводили в
50 мМ трис-HCl, рН 8,5, 50 мМ NaCl, на колонке с сефадексом Г-25. Электрофорез
проводили в присутствии DS-Na в трис-боратной системе [11]. Аминокислотный анализ
продуктов гидролиза фрагмента К 1—3 проводили на анализаторе аминокислот ААА-881
(ЧССР). Молекулярные массы полученных фрагментов определяли методом электрофо-
реза в полиакриламидном геле в присутствии DS-Na.
Результаты и обсуждение. На рис. 1 приведена электрофореграм-
ма, представляющая кинетику гидролиза фрагмента К 1—3 пепсином
при рН 2,7. Как видно из рисунка, в результате протеолитической ата-
ки пепсином фрагмента К 1—3 образуются три продукта с молекуляр-
ными массами 23 000, 19 000 и 12 000. При этом продукты протеолиза
Рис. 1. Электрофореграмма, представляющая кинетику гидролиза фрагмента К 1—3
пепсином.
Fig. 1. Sodium dodecyl sulphate / polyacrylamide gel electrophoretic patterns of timed
pepsin digest of plasminogen f ragment К 1-3
Рис. 2. Разделение пепсинового гидролизата фрагмента К 1—3 на колонке с лизин-се-
фарозой (2,5X20 см), уравновешенной 50 мМ трис-HCl буфером, рН 8,5, 50 мМ NaCl.
Объем фракции 5 мл. Пики 1 и 2 — несвязавшийся и связавшийся белковый материал
соответственно.
Fig. 2. Separation of a pepsin digest of f ragment К 1-3 on the lysine-Sepharose column
(2.5X20 cm) equilibrated with 50 mM tris-HCl buffer, pH 8.5, 50 mM NaCl. Fraction vo-
lume— 5 ml. Peaks 1 and 2 — unadsorbed and adsorbed protein material, respectively.
появляются уже через 10 мин и сохраняют относительную резистент-
ность к гидролизу в течение всего исследуемого времени, что свидетель-
ствует об их достаточно компактной структуре.
Для выяснения вопроса о наличии лизинсвязывающего участка во
фрагменте К 2—3 продукты гидролиза К 1 — 3 наносили на колонку с
лизин-сефарозой. При этом часть гидролизата не взаимодействовала с
2 0 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 1
аффинным сорбентом, в то время как другая часть белкового материа-
ла связывалась с лизин-сефарозой и элюировалась 200 мМ ε-амино-
капроновой кислотой (рис. 2). В дальнейшем и ту, и другую части гид-
ролизата разделяли гель-фильтрацией на сефадексе Г-75 (рис. 3).
В обоих случаях в первом пике выходили фрагменты, представленные
на электрофореграммах дублетными полосами с молекулярными мас-
сами 23 000 и 19 000, а во втором пике — фрагмент с молекулярной мае-
Рис. 3. Разделение пепсинового гидролизата фрагмента К 1—3 на колонке с сефадек-
сом Г-75 (1,5X90 см), уравновешенной 50 мМ трис-HCl буфером, рН 8,5, 100 мМ NaCl.
Объем фракции 4 мл. Электрофореграммы даны рядом. 1 — несвязавшийся и 2 — свя-
завшийся с лизин-сефарозой гидролизаты.
Fig. 3. Separation of a pepsin digest of f ragment К 1-3 on the Sephadex G-75 column
(1.5X90 cm) equilibrated with 50 mM tris-HCl buffer, pH 8.5, 100 mM NaCl. Fraction vo-
lume— 4 ml. Sodium dodecyl sulphate / polyacrylamide gel electrophoretic pat terns of
the material from each peak are given. 1 — hydrolyzate unadsorbed by lysine-Sepharose
2—'hydrolyzate adsorbed by lysine-Sepharose.
сой 12 000. Очевидно, различие между связавшимися и несвязавшими-
ся продуктами пепсинолиза фрагмента К 1—3 состоит лишь в глубине
протеолиза. Скорее всего у фрагментов, не взаимодействующих с аф-
финным сорбентом, расщеплены некоторые важные для лизинсвязыва-
ющей способности пептидные связи. Однако эти связи, видимо, не су-
щественны для поддержания целостности их структуры, с чем и связано
отсутствие изменений на электрофореграмме.
Возникает вопрос, каким структурам соответствуют полученные
продукты пепсинолиза фрагмента К1—3? На рис. 4 дано схематичес-
кое изображение структуры фрагмента К 1—3 молекулы плазминогена.
Единственным местом гидролиза фрагмента К 1—3 пепсином может
быть участок Глу 162 — Глу 163 — Глу 164 между первым и вторым
кринглами. Это следует из характерного расположения дисульфидных
мостиков в первых трех кринглах, при котором продукты с указанными
выше молекулярными массами можно получить и разделить без восста-
новления дисульфидных связей только разрезав полипептидную цепь в
данном месте.
Результаты аминокислотного анализа полученных фрагментов хо-
рошо согласуются с аминокислотным составом соответствующих струк-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, tfe 1 4 - 5 - 7 2 2 21
тур, определенным из известной первичной последовательности плазми-
ногена (таблица). Таким образом, мы можем утверждать, что при пеп-
синолизе фрагмента К 1—3 образуются изолированный первый крингл
(М г =12 000) и фрагмент, содержащий второй и третий кринглы —
К 2—3 (Мг = 19 ООО и 23 000). Существование фрагмента К 2—3 в двух
формах неудивительно, поскольку исходный фрагмент К 1—3 также со-
стоит из двух молекулярных форм—Тир 79 — Вал 337 и Тир 79 —
Вал 353. Видимо, С-концевая часть
фрагмента К 1—3 недоступна для
протеолиза пепсином. Это подтверж-
дается тем, что пепсин при гидролизе
целой молекулы плазминогена рас-
щепляет полипептидную цепь между
четвертым и пятым кринглами и не
затрагивает участок первичной струк-
Рис. 4. Схематическое изображение структуры
фрагмента· К 1—3 молекулы плазминогена: а —
дисульфидные связи.
Fig. 4. Scheme of the structure of plasminogen
f ragment К 1-3: a — disulphide cross-links.
туры между третьим и четвертым кринглами [12], т. е. две формы
фрагмента К 2—3 различаются, по всей вероятности, только своей С-
концевой частью.
Аминокислотный состав фрагментов К 1 и К 2—3
Amino acid composition of fragments К 1 and К 2—З
К1 К 2 :—3
Аминокислота
Теорет.* Эксперим. Теорет. Эксперим.
Лиз 5
Гис 2
Apr 5
Асх (Асн+Асп) 11
Тре 8
Сер 7
Глх (Глу+Глн) 11
Про 8
Гли 6
Ала 1
Цис 6
Вал 0
Мет 1
Иле 2
Лей 3
Тир 6
Фен 1
4,20 12 11,13
1,80 7 5,22
5,31 10 8,98
11,66 21 23,86
6 ,75 15 14,52
7 ,29 14 16,10
7,38 15 20,19
9,80 18 18,60
4,59 8 11,86
1,17 5 4 ,52
3 ,87 14 10,98
0 ,32 5 4,21
0,60 2 0 ,81
1,47 4 2 ,33
1,50 6 5,46
5,40 7 8 ,92
1,44 3 2,51
* Определены из известной первичной структуры плазминогена.
Таким образом, взаимодействие фрагмента К 2—3 с лизин-сефаро-
зой прямо указывает на присутствие в нем лизинсвязывающего участ-
ка. Скорее всего (на основании работ [8, 9]) этот участок расположен
во втором крингле.
22 БИОПОЛ ИМЕРЬІ II КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 1 22
FRAGMENT К 2-3 OF PLASMINOGEN MOLECULE
CARRIES A LYSINE-BINDING SITE
V. V. Novokhatny, Yu. V. Matsuka, S. A. Kudinov
Α. V. Pal ladin Institute of Biochemistry,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
Limited pepsin digestion of plasminogen f ragment К 1-3 leads to the formation of the
first kringle and structure which contains the second and third kringles ( f ragment
К 2-3). The isolated f ragments are characterized according to molecular masses and ami-
no acid composition. Fragment К 2-3 is shown to be able of binding with lysine-Sepha-
rose, which indicates the existence of a lysine-binding site in its structure.
1. Colleti D. On the regulation and control of f ibr inolysis / /Thromb. Haemostas.—
1980.—43, N 1.—P. 77—89-.
2. Wiman B. Pr imary structure of the B-chain of human plasmin [] Eur. J. Biochem.—
1977.—76, N 1.—P. 129—137.
3. Wiman В., Wallen P. Activation of human plasminogen by insoluble derivative of
urokinase. Structural changes of plasminogen in the course of activation to plasmin
and demonstration of possible intermediate compound//Ibid.—1973.—36, N 1.—
P. 25—31.
4. The primary structure of human plasminogen : isolation of two lysine-binding f r a g -
ments and one «Mini-plasminogen» (M. W. 38000) by elastase catalyzed specific li-
mited proteolysis / L. Sottrup-Jensen, H. Clayes, M. Zajdel et al. / / Progress in che-
mical fibrinolysis and thrombolysis / Eds. J. F. Davidson, R. H. Roman, Μ. M. Sama-
ma, P. S. Desnoyers .—New York : Raven press, 1978, v. 3.— P. 191—209.
5. Castellino F. J. Recent advances in the chemistry of the fibrinolytic s y s t e m / / C h e m .
Rev.—1981.—81, N 5 .—P. 431—446.
6. Wiman В., Collen D. Molecular mechanism of physiological f ibr inolysis . / /Nature .—
1978.—272, N 5653.—P. 549—550.*
7. Wiman В., Wallen P. The specific interaction between plasminogen and fibrin. A phy-
siological role of the lysine binding site in p lasminogen/ /Thromb. Res.—1977.—10»
N 2 .—P. 213—222.
8. Trexler ΜVali Z., Patthy L. Structure of the ω-aminocarboxylic acid — binding sites
of human plasminogen. Arginine 70 and aspartic acid 56 are essential for binding of
ligand by kringle 4 / / J . Biol. Chem.—1982.—257, N 13.—P. 7401—7406.
9. Novokhatny V. V.f Kudinov S. Α., Privalov P. L. Domains in human plasminogen / /
J. Мої. Biol.—1984.—179, N 2 .—P. 215—232.
10. Deutsch D. G., Mertz Ε. T. Plasminogen : purification from human plasma by affini-
ty c h r o m a t o g r a p h y / / S c i e n c e — 1970.—170, N 3962.—P. 1095—1096.
11. Cummins P., Perry S. V. The subunits and biological activity of polymorphic forms
of t ropomyosine/ / Biochem. J.—1973.—133, N 4 .—P. 765—777.
12. Новохатний В. В., Кудинов С. А. Получение миниплазминогена и фрагмента К 1—4
пепсиновым протеолизом плазминогена ч е л о в е к а / / Д о к л . АН УССР.—1984.—№ 5.—
С. 62—65.
Ин-т биохимии им. А. В. Палладина АН УССР, Получено 3.07.85
Киев
УДК 535.339.047
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИДИСПЕРСНЫХ РАСТВОРОВ АКТИНА
МЕТОДАМИ КВАЗИУПРУГОГО СВЕТОРАССЕЯНИЯ
П. Д. Добычин, А. В. Ломакин, Н. Г. Мевх,
В. А. Носкин, С. М. Балабонов
Введение. Метод квазиупругого светорассеяния (КС) давно использу-
ют для изучения полимерного актина в растворе [1—4]. Основное вни-
мание было уделено обсуждению конформационной жесткости (вну-
тренней динамики) F-актина и комплексов на его основе. Использова-
БИОПОЛ ИМЕРЬІ II КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 1 23
|