Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК

Эукариотический фактор элонгации 1A (eEF-1A) играет важную роль в трансляции, катализируя GTP-зависимое связывание аминоацил-тРНК (аа-тРНК) с акцепторным (А) сайтом рибосомы. Классическая схема биосинтеза белка предусматривает существование комплекса eEF-1A в GTP-связанной форме с аа-тРНК. Однако не...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2000
Автори:	Будкевич, Т.В., Негруцкий, Б.С, Сердюк, И.Н., Ельская, А.В.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2000
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Структура и функции биополимеров
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152600
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК / Т.В. Будкевич, Б.С. Негруцкий, И.Н. Сердюк, А.В. Ельская // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 4. — С. 281-283. — Бібліогр.: 8 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-152600
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1526002019-06-13T01:26:28Z Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК Будкевич, Т.В. Негруцкий, Б.С, Сердюк, И.Н. Ельская, А.В. Структура и функции биополимеров Эукариотический фактор элонгации 1A (eEF-1A) играет важную роль в трансляции, катализируя GTP-зависимое связывание аминоацил-тРНК (аа-тРНК) с акцепторным (А) сайтом рибосомы. Классическая схема биосинтеза белка предусматривает существование комплекса eEF-1A в GTP-связанной форме с аа-тРНК. Однако несколькими независимыми методами было показано формирование в условиях in vitro необычного тройного комплекса [eEF-1A·GDP-тРНК]. Выдвинуто предположение о роли неканонического комплекса в цикле каналирования (channeling) тРНК в ходе элонгации трансляции у высших эукариот Задачей представленного исследования было определение константы диссоциации [eEF-1A·GDP-mPHK] комплекса методом стационарной флюоресцентной поляризации, а также радиуса инерции комплекса [eEF-1A·GDPmPHK] методом малоуглового нейтронного рассеяния (small angle neutron scattering – SANS). Вперше за допомогою методу стаціонарної флюоресцентної поляризації визначено константу дисоціації [eEF-1A·GDP] з вільною тРНК. Отримане значення – 20 нМ, дозволяє припустити фізіологічну важливість досліджуваного неканонічного комплексу. При використанні методу малокутового нейтронного розсіювання вивчали форму [eEF-1A·GDP] комплексу. При порівнянні отриманого радіуса інерції для еукаріотичного фактора елонгації з аналогічним параметром для EF-1A було зроблено висновок щодо існування розгорнутої просторової структури eEF-1A, яка набуває глобулярності при взаємодії з деацильованою тРНК. For the first time the KA of [eEF-1A·GDP] with free tRNA was determined by steady state fluorescence polarization. The obtained value – 20 nM is allowed to suppose a physiological significance of the complex investigated. For the first time the solution conformation of rabbit liver [eEF-1A·GDP] and its complex with tRNA has been studied by small-angle neutron scattering (SANS). The shape of the [eEF-1A·GDP] molecule in solution is demonstrated to be rather relaxed and to undergo rather substantial changes upon formation of the complex with tRNA. The complex has a more compact structure than free [eEF-1A · GDP]. 2000 Article Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК / Т.В. Будкевич, Б.С. Негруцкий, И.Н. Сердюк, А.В. Ельская // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 4. — С. 281-283. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000572 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152600 577.152.611 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Будкевич, Т.В. Негруцкий, Б.С, Сердюк, И.Н. Ельская, А.В. Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК Биополимеры и клетка
description	Эукариотический фактор элонгации 1A (eEF-1A) играет важную роль в трансляции, катализируя GTP-зависимое связывание аминоацил-тРНК (аа-тРНК) с акцепторным (А) сайтом рибосомы. Классическая схема биосинтеза белка предусматривает существование комплекса eEF-1A в GTP-связанной форме с аа-тРНК. Однако несколькими независимыми методами было показано формирование в условиях in vitro необычного тройного комплекса [eEF-1A·GDP-тРНК]. Выдвинуто предположение о роли неканонического комплекса в цикле каналирования (channeling) тРНК в ходе элонгации трансляции у высших эукариот Задачей представленного исследования было определение константы диссоциации [eEF-1A·GDP-mPHK] комплекса методом стационарной флюоресцентной поляризации, а также радиуса инерции комплекса [eEF-1A·GDPmPHK] методом малоуглового нейтронного рассеяния (small angle neutron scattering – SANS).
format	Article
author	Будкевич, Т.В. Негруцкий, Б.С, Сердюк, И.Н. Ельская, А.В.
author_facet	Будкевич, Т.В. Негруцкий, Б.С, Сердюк, И.Н. Ельская, А.В.
author_sort	Будкевич, Т.В.
title	Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК
title_short	Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК
title_full	Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК
title_fullStr	Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК
title_full_unstemmed	Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК
title_sort	изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eef-la с деацилированной трнк
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2000
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152600
citation_txt	Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК / Т.В. Будкевич, Б.С. Негруцкий, И.Н. Сердюк, А.В. Ельская // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 4. — С. 281-283. — Бібліогр.: 8 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT budkevičtv izučenierazličnyhfizikohimičeskihharakteristiknekanoničeskogokompleksaéukariotičeskogofaktoraélongaciieeflasdeacilirovannojtrnk AT negruckijbs izučenierazličnyhfizikohimičeskihharakteristiknekanoničeskogokompleksaéukariotičeskogofaktoraélongaciieeflasdeacilirovannojtrnk AT serdûkin izučenierazličnyhfizikohimičeskihharakteristiknekanoničeskogokompleksaéukariotičeskogofaktoraélongaciieeflasdeacilirovannojtrnk AT elʹskaâav izučenierazličnyhfizikohimičeskihharakteristiknekanoničeskogokompleksaéukariotičeskogofaktoraélongaciieeflasdeacilirovannojtrnk
first_indexed	2025-07-14T04:03:34Z
last_indexed	2025-07-14T04:03:34Z
_version_	1837593594746109952
fulltext	ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 2000. Т. 16. № 4 Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК Т. В. Будкевич, Б. С. Негруцкий, И. Н. Сердюк1, А- В. Ельская Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина Институт белка РАН Пущино, Московская обл., Россия Эукариотический фактор элонгации J A (eEF-lA) играет важную роль в трансляции, катализируя GTP-зависимое связывание аминоацил-тРНК (аа-тРНК) с акцепторным (А) сайтом рибосомы. Классическая схема биосинтеза белка предусматривает существование комплекса eEF-lA в GTP-связанной форме с аа-тРНК. Однако несколькими независимыми методами было показано формирование в условиях in vitro необычного тройного комплекса [eEF-lAGDP-тРНК]. Выдвину то предположение о роли неканонического комплекса в цикле каналирования (channeling) тРНК в ходе элонгации трансляции у высших эукариот Задачей представленного исследования было определение константы диссоциации [eEF-lAGDP-mPHK] комплекса методом стационарной флюоресцентной поляризации, а также радиуса инерции комплекса [eEF-JAGDPmPHK] мето дом малоуглового нейтронного рассеяния (small angle neutron scattering — SANS). Введение. Характерной особенностью аппарата белкового синтеза высших эукариот является высо кий уровень структурной организации, обеспечива ющий его эффективное функционирование. Имен но пространственная и функциональная компарт- ментализация всех компонентов, участвующих в осуществлении последовательных биохимических реакций на данном метаболическом пути, позволя ет избежать неспецифических влияний других ме таболических процессов, происходящих в эукарио- тической клетке. Одним из механизмов, который способен реализовать потенциальные преимущест ва компартментализации компонентов аппарата трансляции высших эукариот, является каналиро- вание (channeling) аминоацил-тРНК (аа-тРНК). Каналирование в ходе белкового синтеза было под тверждено экспериментально в условиях in vivo [2], и предполагает прямой перенос «из рук в © Т. В. БУДКЕВИЧ, Б. С. НЕГРУЦКИЙ, И. Н. СЕРДЮК, А. В. ЕЛЬСКАЯ, 2000 руки» аа-тРНК от места синтеза (аминоацил-тРНК синтетаза) к месту использования (рибосома) и обратно. Основным претендентом на роль посред ника в этом процессе является фактор элонгации 1А. Идея об участии фактора элонгации 1А в каналировании тРНК в ходе белкового синтеза подразумевает формирование ряда необычных, не канонических комплексов данного белка с другими компонентами аппарата трансляции, в частности, с деацилированной тРНК. Материалы и методы. GDP-связанную форму eEF-lA получали, как описано в [3]. Препараты суммарной тРНК получали согласно [4 ]. Процеду ру модификации eEF-lA флюоресцеин-изотиоциа- натом (FITC, изомер I) проводили по стандартной методике [5] с небольшими изменениями, позволя ющими сохранить максимум активности белка в функциональных тестах и добиться степени моди фикации 1 молекула красителя/1 молекула белка. Стационарную поляризацию измеряли в «^-фор мате на спектрофлюориметре «Hitachi Sci. Instrs.» 281 БУДКЕВИЧ Т. В. И ДР. (Япония), оснащенном поляризаторами, в режиме «Time scan». Длина волны возбуждения равна 495 нм, длина волны испускания — 525 нм. Изменение состояния поляризации определяли по формуле P = ( / n a p - G - / n e p ) / ( / n a p + G - / n e p ) , где / п а р — интенсивность параллельной компонен ты, / п е р — интенсивность перпендикулярной компо ненты, G— фактор, представляющий собой соот ношение чувствительностей детектирующей систе мы для вертикально и горизонтально поляризован ного света. В нашем случае G= 1,22. Для оценки К6 была выбрана / п е р , изменения которой подчиня ются линейному закону [6 ]. Значения интенсивно- стей скорректированы с учетом разведения и нор мированы по формуле где / н о р м — нормированная интенсивность испуска ния, / 0 — интенсивность флюоресценции в начале эксперимента (без добавления тРНК), / т Р Н К — ин тенсивность при определенной концентрации тРНК. Полученные значения трех независимых экспериментов были аппроксимированы гипербо лой с помощью метода наименьших квадратов: Аюрм = ^кон ' С / Kd + С, где / к о н — нормированная интенсивность в конеч ной точке титрования, С — концентрация тРНК, Kd — константа диссоциации. Эксперименты по ма лоугловому нейтронному рассеянию проводили в тесном сотрудничестве с проф. И. Н. Сердюком в SANS камере Института Поля Шреррера (Швейца рия). Разрешение 6—10 %, диапазон векторов рассеяния 5 = 0,1—2,5 нм"1. Длина волны нейтро нов 0,6 нм. Образцы помещали в термостатирован ную кварцевую кювету толщиной 0,1 см и объемом 150 мкл, где поддерживали температуру 4 °С. Время измерения в расчете на один образец состав ляло 1—2 ч. Исходные данные корректировали на чувствительность детектора и пересчитывали на абсолютную шкалу путем калибровки на рассеяние легкой воды, измеренное в тех же условиях. Результаты и обсуждение. Связывание FITC- eEF-lA-GDP с тРНК изучали, измеряя стационар ную флюоресцентную поляризацию FITC-произ- водных белка в присутствии деацилированной тРНК. Фиксированную концентрацию FITC-eEF- 1A-GDP (0,2 мкМ) титровали, добавляя аликвоты тРНК в диапазоне 1-Ю"8— 1-Ю"6 М (конечная концентрация 0,5 мкМ), определяя состояние поля ризации после каждого добавления. Зависимость изменения состояния поляризации при возрастании концентрации тРНК представлена на рисунке (а). Наблюдаемое возрастание Р от 0,25 для свободного FITC-eEF-1А • GDP до 0,352 в присутствии макси мальной концентрации тРНК является следствием различий во вращательной диффузии свободного белка по сравнению с тРНК-белковым комплексом. Полученные экспериментальные данные были про анализированы, как описано в «Материалах и ме тодах», и аппроксимированы гиперболой (рисунок, б). Kd для комплекса [FITC-eEF-lAGDP-тРНК] составила 20 нМ. Ранее нами было высказано предположение [1] о том, что eEF-lA, находясь в GDP-связанной форме после гидролиза GTP при взаимодействии аа-тРНК с А-сайтом рибосомы, способен связывать деацилированную тРНК, диссоциировать из Е-сай- та в виде неканонического тройного комплекса [eEF-lA-GDP-тРНК] и переносить тРНК на ами- ноацил-тРНК синтетазу, замыкая, таким образом, цикл каналирования тРНК. Высокая стабильность неканонического комплекса [eEF- lAGDP-тРНК], оцененная в равновесных условиях флюоресцент ных экспериментов, свидетельствует в пользу фун кциональной значимости подобного комплекса. Та кая стабильность хорошо согласуется с нашим предположением о возможной роли этого комплек са в процессе передачи деацилированной тРНК от Е-сайта рибосом к аминоацил-тРНК синтетазе. По скольку Kd между деацилированной тРНК и Е-сай- том рибосом в 30 раз выше (590 нМ) [7 ], чем для комплекса [eEF-lA-GDP-тРНК], можно предполо жить, что перенос тРНК от Е-сайта к eEF-lA происходит благодаря градиенту сродства тРНК к различным последовательным участникам процесса биосинтеза белка. Для глобулярных белков существует прямая зависимость между логарифмом их молекулярной массы (Мг) и lg Rg, где Rg — радиус инерции. При изучении структурных параметров eEF-1А • GDP методом SANS был определен Rg двойного комп лекса — 5,16 нм. Rg для EF-1A (Мг 45 кДа) состав ляет 2,25 нм [8]. Следовательно, определенный нами Rg для свободного белка значительно превы шает цифру, ожидаемую для глобулярного белка с Мт 50 кДа. Данный факт свидетельствует о развер нутости пространственной структуры eEF-lA-GDP. Согласно полученным результатам, при взаимодей ствии с деацилированной тРНК белок структуриру ется, приобретая глобулярность. Таким образом, при формировании комплекса в молекуле белка наблюдаются значительные кон- формационные изменения, в результате которых необычный тройной комплекс имеет более компак тную структуру, чем свободный белок. Одним из возможных объяснений наблюдаемого эффекта 282 ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСА eEF-lA С ДЕАЦИЛИРОВАННОЙ тРНК Изучение связывания тРНК с FYTC-eEF-lAGDP методом ста ционарной флюоресцентной поляризации: а — типичная кривая изменения состояния поляризации FITC-e2£F-lA-GDP при до бавлении возрастающих концентраций тРНК; б — гиперболиче ская зависимость нормированных значений интенсивностей пер пендикулярной компоненты ( / п е р ) тРНК на форму двойного комплекса eEF- lAGDP может быть предположение о том, что в результате связывания с отрицательно заряженной молекулой нуклеиновой кислоты нейтрализуется положитель ный заряд поверхности белковой молекулы (pi 9,1), что приводит к точной укладке последней. Т. В. Будкевич, Б. С. Негруцький, I. Н. Сердюк, Г. В. Єльська Вивчення різних фізико-хімічних характеристик неканонічного комплексу еукаріотичного фактора елонгації eEF-lA з деацильованою тРНК Резюме Вперше за допомогою методу стаціонарної флюоресцентної поляризації визначено константу дисоціації [eEF-lAGDP] з вільною тРНК. Отримане значення — 20 нМ, дозволяє припу стити фізіологічну важливість досліджуваного неканонічного комплексу. При використанні методу малокутового нейтрон- ного розсіювання вивчали форму [eEF-lAGDP] комплексу. При порівнянні отриманого радіуса інерції для еукаріотичного фактора елонгації з аналогічним параметром для EF-1A було зроблено висновок щодо існування розгорнутої просторової структури eEF-lA, яка набуває глобулярності при взаємодії з деацильованою тРНК. Т. V. Budkevich, В. S. Negrutskii, І. N. Serdyuk, А. V. Etskaya Study of different physical and chemical parameters of non-canonical complex of eukaryotic translation elongation factor 1A with deacylated tRNA Summary For the first time the K6 of [eEF-lAGDP] with free tRNA was determined by steady state fluorescence polarization The obtained value — 20 nM is allowed to suppose a physiological significance of the complex investigated. For the first time the solution con formation of rabbit liver [eEF-lAGDP] and its complex with tRNA has been studied by small-angle neutron scattering (SANS). The shape of the [eEF-lAGDP] molecule in solution is de monstrated to be rather relaxed and to undergo rather substantial changes upon formation of the complex with tRNA. The complex has a more compact structure than free [eEF-lAGDP]. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Petrushenko Z. M., Negrutskii B. S.f Ladokhin A. S., Bud kevich Т. V., Shalak V. F, Etskaya A. V. Evidence for the formation of an unusual complex of rabbit liver EF-la with GDP and deacylated tRNA / / FEBS Lett.—1997.—407.— P. 13—17. 2. Negrutskii B. S., Deutscher M. P. Channeling of aminoacyl- tRNA for protein synthesis in vivo II Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1991.—88.—P. 4991—4995. 3. Shalak К F.t Budkevich Т. V., Negrutskii B. S., Etskaya A. V. Fast and effective method for purification of EF-la from rabbit liver / / Укр. биохим. журн.—1997.—69.—С. 104— 109. (In English.) 4. Brungraber E. F. A simplified procedure for the preparation of •soluble* RNA from rat liver / / Biochem. and Biophys. Res. Communs.—1962.—8.—P. 1—3. 5. Weiel J. у Hershey J. W. B. Fluorescence polarization studies of the interaction of Escherichia coli protein synthesis initiation factor 3 with 30S ribosomal subunits / / Biochemistry.— 1981.—4, N 20.—P. 5859—5865. 6. Jameson D. M., Seifried S. E. Quantification of protein- protein interactions using fluorescence polarization / / Met hods.—1999.—19.—P. 222—233. 7. Graifer D. M., Nekhai S. Y.t Mundus D. M.f Fedorova O. F, Karpova G. G. Interaction of human and Escherichia coli tRNA P h e with human 80S ribosomes in the presence of oligo- and polyuridylate templates / / Biochim. et biophys. acta.— 1992.—1171.—P. 56—67. 8. Bilgin N.t Ehrenberg M., Ebel C, Zaccai G., Sayers Z., Koch M. H. /., Svergun D., Barberato C , Volkov V., Nissen P., Nyborg J. Solution structure of the ternary complex between aminoacyl-tRNA, elongation factor Tuy and guanosine triphos phate / / Biochemistry.—1998.—37.—P. 8163—8172. УДК 577.152.611 Поступила в редакцию 07.08.2000 283

Изучение различных физико-химических характеристик неканонического комплекса эукариотического фактора элонгации eEF-lA с деацилированной тРНК

Репозитарії

Схожі ресурси