Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза
В работе представлены результаты исследования аллельного полиморфизма локусов, сцепленных с геном муковисцидоза (кистозного фиброза поджелудочной оюелезы, КФ) в популяциях здоровых людей-доноров Ленинграда (D7S8, Met, D7S23), Москвы (D7S8) и Киева (Met). Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДН...
Збережено в:
| Дата: | 1990 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1990
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152740 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза / О.В. Воронина, В.С. Гайцхоки, Т.Э. Иващенко, В.С. Баранов, В.Н. Горбунова, В.М. Калинин, Л.А. Лившиц // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 2. — С. 65-71. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-152740 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1527402019-06-13T01:27:27Z Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза Воронина, О.В. Гайцхоки, В.С. Иващенко, Т.Э. Баранов, В.С. Горбунова, В.Н. Калинин, В.М. Лившиц, Л.А. В работе представлены результаты исследования аллельного полиморфизма локусов, сцепленных с геном муковисцидоза (кистозного фиброза поджелудочной оюелезы, КФ) в популяциях здоровых людей-доноров Ленинграда (D7S8, Met, D7S23), Москвы (D7S8) и Киева (Met). Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ) .в ленинградской и киевской популяциях соответствует ПДРФ, описанному для стран Северной Европы. В московской популяции отмечается некоторый сдвиг в распределении частот аллелей локуса D7S8, что связано, по-видимому, с наличием в группе московских доноров лиц монголоидной расы, имеющей чрезвычайно низкий уровень КФ в популяции. Выраженное неравновесие сцепления мутации КФ с определенными аллелями в системах KM.19 и XV-2с локуса D7S23 обнаружено в семьях больных муковисцидозом. Этот факт позволяет осуществлять пренатальную диагностику КФ в семьях, утративших больного ребенка, но имеющих высокий риск повторных случаев муковисцидоза. Результаты ПДРФ-анализа изученных локусов свидетельствуют о генетической однородности мутации КФ в Европейской части СССР и Западной Европе и являются основой для применения ДНК-зондов КМ.19 и XV-2с в пренатальной диагностике, подтверждения диагноза КФ и поиска гетерозиготных носителей мутации в популяции. Представлено результати дослідження алельного поліморфізму локусів, зчеплених з геном муковісцидозу (кістозного фіброзу підшлункової залози, КФ) у популяціях здорових людей-донорів Ленінграда (D7S8, Met, D7S23), Москви (D7S8) та Києва (Met). Поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів ДНК (ПДРФ) у ленінградській та київській популяціях відповідає ПДРФ, описаному для країн Північної Європи. У московській популяції відзначається деякий зсув у розподілі частот алелів локусу D7S8, що пов’язано, можливо, з наявністю у групі московських донорів осіб монголоїдної раси, що має надзвичайно низький рівень КФ у популяції. Виражену нерівноважність зчеплення мутації КФ з певними алелями в системах KM.19 і XV- 2с локусу D7S23 виявлено в сім’ях хворих на муковісцидоз. Цей факт дозволяє здійснювати пренатальну діагностику КФ у сім’ях, які втратили хвору дитину, але мають високий ризик повторних випадків муковісцидозу. Результати ПДРФ-аналізу вивчених локусів свідчать про генетичну однорідність мутації КФ у Європейській частині СРСР та Західній Європі і є основою для застосування ДНК-зондів КМ.19 і XV- 2с у пренатальній діагностиці, підтвердження діагнозу КФ і пошуку гетерозиготних носіїв мутації в популяції. The allelic polymorphism of human DNA loci linked to cystic fibrosis gene (D7S8, Met and D7S23) was studied using blot hybridization and polymerase chain reaction in the populations of healthy donors in Leningrad and in donors from Moscow (D7S8) and Kiev (Met). The restriction fragment length polymorphism (RELP) in Leningrad and Kiev populations corresponds to RELP found in Northern Europe countries while in Moscow population a shift in the allele frequencies is observed, that appears to depend upon the contribution of mongoloids having very low frequency of cystic fibrosis. The marked, linkage disequilibrium between cystic fibrosis mutation and particular RELP alleles in D7S23 locus (KM.19 and XV-2c probes) is found in the affected families. 1990 Article Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза / О.В. Воронина, В.С. Гайцхоки, Т.Э. Иващенко, В.С. Баранов, В.Н. Горбунова, В.М. Калинин, Л.А. Лившиц // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 2. — С. 65-71. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00025D http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152740 577.213.3 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| description |
В работе представлены результаты исследования аллельного полиморфизма локусов, сцепленных с геном муковисцидоза (кистозного фиброза поджелудочной оюелезы, КФ) в популяциях здоровых людей-доноров Ленинграда (D7S8, Met, D7S23), Москвы (D7S8) и Киева (Met). Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ) .в ленинградской и киевской популяциях соответствует ПДРФ, описанному для стран Северной Европы. В московской популяции отмечается некоторый сдвиг в распределении частот аллелей локуса D7S8, что связано, по-видимому, с наличием в группе московских доноров лиц монголоидной расы, имеющей чрезвычайно низкий уровень КФ в популяции. Выраженное неравновесие сцепления мутации КФ с определенными аллелями в системах KM.19 и XV-2с локуса D7S23 обнаружено в семьях больных муковисцидозом. Этот факт позволяет осуществлять пренатальную диагностику КФ в семьях, утративших больного ребенка, но имеющих высокий риск повторных случаев муковисцидоза. Результаты ПДРФ-анализа изученных локусов свидетельствуют о генетической однородности мутации КФ в Европейской части СССР и Западной Европе и являются основой для применения ДНК-зондов КМ.19 и XV-2с в пренатальной диагностике, подтверждения диагноза КФ и поиска гетерозиготных носителей мутации в популяции. |
| format |
Article |
| author |
Воронина, О.В. Гайцхоки, В.С. Иващенко, Т.Э. Баранов, В.С. Горбунова, В.Н. Калинин, В.М. Лившиц, Л.А. |
| spellingShingle |
Воронина, О.В. Гайцхоки, В.С. Иващенко, Т.Э. Баранов, В.С. Горбунова, В.Н. Калинин, В.М. Лившиц, Л.А. Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза Биополимеры и клетка |
| author_facet |
Воронина, О.В. Гайцхоки, В.С. Иващенко, Т.Э. Баранов, В.С. Горбунова, В.Н. Калинин, В.М. Лившиц, Л.А. |
| author_sort |
Воронина, О.В. |
| title |
Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза |
| title_short |
Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза |
| title_full |
Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза |
| title_fullStr |
Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза |
| title_full_unstemmed |
Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза |
| title_sort |
популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей днк, сцепленных с геном муковисцидоза |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1990 |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152740 |
| citation_txt |
Популяционный и семейный анализ полиморфизма последовательностей ДНК, сцепленных с геном муковисцидоза / О.В. Воронина, В.С. Гайцхоки, Т.Э. Иващенко, В.С. Баранов, В.Н. Горбунова, В.М. Калинин, Л.А. Лившиц // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 2. — С. 65-71. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT voroninaov populâcionnyjisemejnyjanalizpolimorfizmaposledovatelʹnostejdnksceplennyhsgenommukoviscidoza AT gajchokivs populâcionnyjisemejnyjanalizpolimorfizmaposledovatelʹnostejdnksceplennyhsgenommukoviscidoza AT ivaŝenkoté populâcionnyjisemejnyjanalizpolimorfizmaposledovatelʹnostejdnksceplennyhsgenommukoviscidoza AT baranovvs populâcionnyjisemejnyjanalizpolimorfizmaposledovatelʹnostejdnksceplennyhsgenommukoviscidoza AT gorbunovavn populâcionnyjisemejnyjanalizpolimorfizmaposledovatelʹnostejdnksceplennyhsgenommukoviscidoza AT kalininvm populâcionnyjisemejnyjanalizpolimorfizmaposledovatelʹnostejdnksceplennyhsgenommukoviscidoza AT livšicla populâcionnyjisemejnyjanalizpolimorfizmaposledovatelʹnostejdnksceplennyhsgenommukoviscidoza |
| first_indexed |
2025-07-14T04:09:52Z |
| last_indexed |
2025-07-14T04:09:52Z |
| _version_ |
1837593991095255040 |
| fulltext |
УДК 577.213.3
О. В. Воронина, В. С. Гайцхоки, Т. Э. Иващеико, В. С. Баранов,
В. Н. Горбунова, В. М. Калинин, Л. А. Лившиц, М. Т. Веножинскис
ПОПУЛЯЦИОННЫЙ И СЕМЕЙНЫЙ АНАЛИЗ
ПОЛИМОРФИЗМА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК,
СЦЕПЛЕННЫХ С ГЕНОМ МУКОВИСЦИДОЗА
В работе представлены результаты исследования аллельного полиморфизма локусов,
сцепленных с геном муковисцидоза (кистозного фиброза поджелудочной оюелезы, КФ)
в популяциях здоровых людей-доноров Ленинграда (D7S8, Met, D7S23), Москвы
(D7S8) и Киева (Met). Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ)
.в ленинградской и киевской популяциях соответствует ПДРФ, описанному для стран
Северной Европы. В московской популяции отмечается некоторый сдвиг в распреде-
лении частот аллелей локуса D7S8, что связано, по-видимому, с наличием в группе
московских доноров лиц монголоидной расы, имеющей чрезвычайно низкий уровень КФ
в популяции.
Выраженное неравновесие сцепления мутации КФ с определенными аллелями в
системах KM.19 и XV-2с локуса D7S23 обнаружено в семьях больных муковисцидозом.
Этот факт позволяет осуществлять пренатальную диагностику КФ в семьях, утратив-
ших больного ребенка, но имеющих высокий риск повторных случаев муковисцидоза.
Результаты ПДРФ-анализа изученных локусов свидетельствуют о генетической
однородности мутации КФ в Европейской части СССР и Западной Европе и явля-
ются основой для применения ДНК-зондов КМ.19 и XV-2с в пренатальной диагнос-
тике, подтверждения диагноза КФ и поиска гетерозиготных носителей мутации в
популяции.
Введение. Муковисцидоз является одним из самых распространенных
аутосомно-рецессивных моногенных заболеваний человека. По литера-
турным данным [1], для представителей белой расы частота КФ со-
ставляет 1 :2000 новорожденных, а каждый 20-й европеец является
гетерозиготным носителем мутантного аллеля. В ходе работ по иденти-
фикации гена КФ были выделены геномные клоны, маркирующие бла-
годаря наличию полиморфных сайтов рестрикции локусы длинного
плеча хромосомы 7 ( M e t и D7S8) и фланкирующие ген КФ [2]. Впо-
следствии внутри фрагмента хромосомы, ограниченного указанными
локусами, был картирован локус D7S23, включающий пробы XV-2с и
КМ.19 и находящийся в непосредственной близости к гену КФ [3].
Наличие во всех этих локусах полиморфных сайтов, доступных для
ПДРФ-анализа, а также достаточно тесное их сцепление с геном КФ,
позволяют использовать их, с одной стороны, для молекулярного кло-
нирования гена КФ, с другой — для ранней, в том числе пренаталь-
ной, диагностики муковисцидоза [2—4].
Известно, что диагностическая значимость сцепленного ПДРФ
Д Н К при семейном анализе с целью выявления гомо- и гетерозиготного
посительства КФ определяется двумя параметрами: частотой встреча-
емости аллелей в популяции и степенью их аллельного сцепления с
геном КФ. Известно также, что в различных популяциях эти парамет-
ры варьируют. Так, имеются данные о расовых отличиях полиморфиз-
ма локуса Met в Северной Америке [5], отличаются результаты иссле-
дования ПДРФ локуса D7S8 (зонд J3.ll) в ФРГ [6] и Великобрита-
нии [14]. Есть сведения о наличии случаев нестандартного типа
сцепления локуса КФ с локусом D7S23 в Италии [7].
Учитывая национальную гетерогенность популяции СССР, приме-
нению ДНК-зондов для пренатальной диагностики должно предшест-
вовать обязательное изучение ПДРФ Д Н К в популяции здоровых лю-
дей-доноров исследуемого региона.
Целью нашей работы было изучение ПДРФ ДНК, сцепленных с
локусом КФ в семьях с муковисцидозом, а также в группах здоровых
людей-доноров — жителей Ленинграда, Москвы и Киева. ДНК-пробы,
использованные для анализа, охарактеризованы в табл. 1. Все клони-
рованные ДНК-пробы на полиморфные локусы, сцепленные с геном КФ,
были любезно предоставлены нам д-ром Р. Вильямсоном (госпиталь
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р и КЛЕТКА. 1990. т. G. X* 2 5 — 9-923 65
Св. Марии, Лондон, Великобритания). Олигонуклеотидныс пробы-прай-
меры для реакции специфической амплификации в системе КМ.19 бы-
ли получены от д-ра Ч. Кутеля (Центр, ин-т молекуляр. биологии,
Берлин, ГДР) .
Т а б л и ц а 1
Характеристика ДНК-зондов, сцепленных с геном муковисци-
доза и использованных для анализа методом б лот-гибридиза-
ции (БГ) и реакции специфической амплификации (PCA) ДНК
DNA probes closely linked with cystic fibrosis gene and used
for blot-analysis and polymerase chain reaction in the present
study
Л о к у с Д Н К - з о н д
Рсстрик-
таза
Метод
анализа
Обозначе-
ние аллели
Размеры,
Т. II. II.
Met
D7S8
DS23
MelIi
J 3.11
КМ.19
XV-2с
MspI БГ 1 6,5
2 2,3
3 1,8
TaqI БГ 1 7,5
2 4,0
MspI БГ 1 4,2
2 1,8
TaqI БГ 1 6,0
2 3,2
PslI PCA Kl 0,95
К2 0,65
КЗ 0,30
БГ Kl 7,8
К 2 6,6
TaqI Б Г Xl 2,1
Х2 1,4
Материалы и методы. Плазмидную Д Н К выделяли из клеток Е. coli методом
очищенного лизата [8] с последующим равновесным центрифугированием в градиенте
плотности хлористого цезия с бромистым этидием.
Д Н К клеток крови получали с помощью протеиназы К по методу [9]. Д Н К хра-
нили в виде водного раствора при — 20 °С. Рестрикционный анализ Д Н К проводили
с использованием эндонуклеаз рестрикции HindIII, TaqI, MspI и PstI производства
Н П О «Фермент» (Вильнюс). Д Н К (10 мкг) инкубировали с ферментом (30—200 ед.
активности в объеме 50 мкл) в соответствующих условиях [8] . Время инкубации 12—
16 ч. Полноту гидролиза Д Н К контролировали электрофорезом аликвоты инкубацион-
ной пробы (5 мкл) в 0,8—1,0 %-ном горизонтальном агарозном геле с бромистым эти-
дием в течение 1—2 ч.
Электрофоретическое разделение рестрикционных фрагментов проводили в гори-
зонтальном агарозном геле той ж е концентрации (агароза типа V фирмы «S igma» .
США) в течение 16—20 ч при градиенте потенциала 2—10 В/см в электродном буфере
следующего состава: 40 мМ трис-HCl, р Н 8, 3, 20 мМ ацетат натрия, 0,2 мМ ЭДТА.
В качестве маркера д л я определения молекулярной массы фрагментов использовали
HindIII-фрагменты Д Н К фага λ.
Перенос Д Н К на нейлоновые фильтры Hybond t m - N («Amersham», Великобрита-
ния) осуществляли по методу [10].
Плазмидные Д Н К - з о н д ы метили, используя [ a - 3 2 P ] d N T P и наборы для ник-транс-
ляции фирмы «Amersham» до удельной радиоактивности 5 - Ю 7 — 1 - Ю 8 имп/мин на
1 мкг Д Н К . Фильтры, содержащие денатурированные фрагменты геномной Д Н К , пре-
гибридизовали в течение 4 ч при 65 °С в запаянных полиэтиленовых мешках в среде
(0,9 M хлорид натрия, 0,09 M цитрат натрия, 0,5 % DS-Na, 0,1 % фиколл, 0,1 % поли-
винилпирролидон и 0,1 % бычьего сывороточного альбумина, 100 м к г / м л денатуриро-
ванной Д Н К спермы лосося, 100 м к г / м л т Р Н К ) . Затем в среду добавляли IO6 имп/мин
плазмидной 3 2 Р - Д Н К и гибридизовали в течение 16—20 ч при 65 °С. Под контролем
счета радиоактивности фильтры отмывали последовательно по следующей схеме:
0,3 M хлорид натрия, 0,03 M цитрат натрия (65 °С, 2 раза по 15 мин); 2) 0,3 M хлорид
натрия , 0,03 M цитрат натрия, 0,1 % DS-Na (65 °С, 30 мин); 3) 0,015 M хлорид натрия,
66 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 5* 67
0,0015 M цитрат натрия, 0,1 % DS-Na (65°С, 1—10 мин). Фильтры радиоавтографи-
ровали с рентгеновской пленкой в течение 3—10 сут при —70 °С.
Реакцию специфической амплификации (PCA) Д Н К для П Д Р Ф - а н а л и з а зонд;!
КМ.19 проводили с использованием набора фирмы «Amersham». Д Н К денатурировали при
98 °С в течение 10 мин, о х л а ж д а л и в ледяной бане, добавляли 2 ед. активности Д Н К —
полимеразы Thertnus thermophilus на 0,5 нг Д Н К и инкубировали по следующей схеме:
д е н а т у р а ц и я — 1 мин при 95 °С, отжиг п р а й м е р о в — 1 мин при 58 °С и синтез Д Н К —
3 мин при 68 °С. П о окончании 25—30 циклов амплификации пробы выдерживали в
течение 10 мин при 78 °С для завершения элонгации, после чего проверяли степень
амплификации электрофорезом аликвогы реакционной смеси (10 мкл) в 1 %-ной
агарозе с бромистым этидием. Д л я рестрикции отбирали 20 мкл реакционной смеси и
в течение 1 ч фрагмент гидролизовали при 37 °С в присутствии 3—30 ед. фермента
PslI. После рестрикции материал фракционировали в 1 %-ной агарозе с бромистым
этидием.
Данные обрабатывали по правилам вариационной статистики. Величину аллель-
ной ассоциации оценивали по коэффициенту стандартного неравновесия Ast [6] :
Ast^ (p—q)f\(p+q)(2—p—q)4
где ρ и q—частоты аллелей нормальной (р) и мутантной по гену КФ (q) хромосомы 7.
Результаты и обсуждение. Как упоминалось выше, диагностическая
ценность ДНК-проб для ПДРФ-анализа определяется частотой поли-
морфных аллелей и степенью их сцеплеппости с геном КФ. Эти пара-
Т а б л и ц а 2
Частота аллелей локусов Mct (зонд Me(Ii) и D7S8 (зонд J3.11) в различных
популяциях и в семьях с КФ
Attelic frequencies for the loci Met (probe MetII) and D7S8 (probe J3.ll) in different
populations and in cystic fibrosis families
Частота аллелей (всего гаплотипов)
Ленинград
Зонд Рестриктаза Аллель Москва ,
Киев, доноры
Доноры Семьи с КФ доноры Киев, доноры
Metll MspI 1 0 , 0 6 + 0 , 0 5 0 ,02+0 ,01 MspI
2 0 ,45+0 ,05 0 , 7 4 + 0 , 0 3
3 0 ,49+0 ,05 0 ,24+0 ,03
(34) (59) — —
TaqI 1 0 ,53+0 ,05 0 , 6 5 + 0 , 0 3 . — 0 , 5 3 + 0 , 0 6
2 0 ,47+0 ,05 0 , 3 5 + 0 , 0 3 — 0 , 4 7 + 0 , 0 6
(36) (106) — (28)
J 3.11 MspI 1 0 , 3 7 + 0 , 0 5 — 0 , 2 4 + 0 , 0 5 —
2 0 , 6 3 + 0 , 0 5 — 0 , 7 6 + 0 , 0 5 —
(46) — (62) —
TaqI 1 0 ,95+0 ,02 •—• — —
2 0 ,05+0 ,02 — —
(56)
метры были нами исследованы в популяциях здоровых людей-доноров,
в семьях которых не обнаруживалось больных КФ, жителей Ленингра-
да, Москвы и Киева. Из данных, представленных в табл. 2, видно, что
частота полиморфных аллелей в системе MetH/TaqI в ленинградской
и киевской популяциях практически идентична, и аллельные формы
ПДРФ встречаются в популяциях с высокой частотой (0,53-—0,47). Об-
наружено отличие в распределении аллелей в популяциях Москвы и
Ленинграда. В то время как в Ленинграде частоты аллелей 1
(4,2 т. н. п.) и 2 (1,8 т. н. п.) в системе J3.ll/Mspl составляют 0,37 и
0,63 соответственно, в группе московских доноров наблюдается смеще-
ние в сторону преобладания аллеля 2, частота которого составила 0,76.
Различие это связано, возможно, с присутствием в этой группе лйц
монголоидной расы, у которых можно предполагать низкую частоту
КФ [11].
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 5 * 67
При сопоставлении данных исследования ПДРФ-локуса Met груп-
пы доноров и семей с КФ Ленинграда (табл. 2) обращает на себя вни-
мание отличие в частоте аллелей. В это же время в донорской популя-
ции основные аллели локуса Met (2 и 3 — MspI и 1 и 2 — TaqI) встре-
чались примерно с равной частотой, в семьях с КФ было заметное пре-
обладание аллеля, характеризующегося отсутствием сайта рестрикции
по обеим рестриктазам. Так, в системе MetH/MspI частота аллеля 3
(1,8 т.н.п.) была в 3 раза меньше, чем аллеля 2 (2,3 т.н. п.). В систе-
ме MetH/TaqI низкомолекулярный аллельный фрагмент 2 (4,0 т. н. п.)
встречался вдвое реже высокомолекулярного фрагмента 1 (7,5 т.н. п.).
Различия аллельного полиморфизма донорской популяции и семей с
КФ высокодостоверны для системы MetH/MspI (χ2 = 8,2) и вероятност-
ны для системы MetHJTaqI ( χ 2 = 1,5).
Т а б л и ц а 3
Частота генотипов полиморфных локусов XV-2с и КМ.19 у здоровых доноров,
облигатных гетерозигот по КФ и больных КФ
Genotype frequencies for the alleles of polymorphic loci XV-2c and KM. 19 in donors,
obligatory heterozygotes and in cystic fibrosis families
Частоты генотипов
• ДНК-зонд Рестриктаза Генотип
Доноры Гетерозиготы Больные КФ
X V-2 с Taql Xl-Xl 0,21 0,35 0,64
X 1-Х 2 0,55 0,51 0,36
Х2—Х2 0,24 0,i 4 0
η = 33 η = 3 5 / і = 1 1
КМ.19 PstI Kl-Kl 0,65 0,03 0
Kl-К 2 0,35 0,76 0,17
К2-К2 0 0,21 0,83
η = 33 п = 28 η = 12
Особый интерес представляют исследования ПДРФ локуса D7S23
(пробы КМ.19 и XV-2c). Это связано с выраженным неравновесным
сцеплением аллелей К2 (6,6 т. н. п.) и Xl (2,1 т. н. п.) с мутацией КФ
[12, 13]. Результаты определения частот генотипов этих локусов для
групп здоровых людей-доноров, облигатных носителей гена КФ (ро-
дителей больных детей) и гомозиготных больных с фенотипом КФ сум-
мированы в табл. 3. Из нее следует, что в системе XV-2c/TaqI гомо-
зиготный генотип Х2—Х2 у облигатных носителей КФ встречается су-
щественно реже ( 1 4 % ) , чем у контрольной группы доноров ( 2 4 % ) ,
а у больных КФ он вообще не обнаруживается. В то же время частота
гомозигот типа Xl—Xl в группе больных была в 3 раза выше (64 %),
чем в контрольной группе (21 %). Еще более четкое неравновесие по
сцеплению выявилось в системе КМ.19/PstI. Так, большая часть до-
норов имела гомозиготный генотип Kl—Kl ( 6 5 % ) , а 3 5 % являлись
гетерозиготами типа Kl—К2, тогда как гомозиготное состояние К2—К2
в этой группе не было обнаружено вовсе. У облигатных носителей му-
тантного аллеля преобладающий в группе доноров генотип Kl—Kl
был обнаружен лишь в 3 % случаев, а частота гетерозигот типа Kl—К2
была в 2 раза выше, чем в контрольной группе и составляла 76 %.
.Среди больных КФ явно преобладал гомозиготный тип К2—К2 (83 %),
лишь 17 % были гетерозиготами типа Kl—К2, а гомозиготы Kl—Kl
,не встречались. Таким образом, полученные результаты позволяют сде-
лать заключение о статистически достоверной неравновесности сцепле-
. нця локуса КФ с аллелями Xl в системе XV-2с/TaqI и К2 в системе
KM.19/PstI в популяции Ленинграда (χ2 = 8,5 и 60,8 соответственно).
. Степень ассоциации аллелей с мутацией характеризуется стандарт-
ным коэффициентом неравновесия Ast. Его анализ доказывает наибо-
л е е тесное сцепление с мутацией КФ аллеля К2 (Ast = 0,674~) и алле-
ля Xl (Ast= 0,273-).
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 5* 67
На рисунке представлены результаты типичного распределения ал-
лелей у облигатиых носителей (родители больного КФ) и больного КФ
в системах XV-2c/TaqI (рисунок, а) и KMA9/PstI (рисунок, б, в). Из .
рисунка видно, что семья А. является полностью информативной в обе-
их системах. Облигатные носители имеют стандартный генотип
Анализ ГТДРФ, сцепленных с геном муковисцидоза в семье А. с больным ребенком ме,-
тодом блот-гибридизации: а — система XV-2c; б — система КМ.19; в — методом PCA
(система КМ.19). 1, 5, 7 — Д Н К матери; 3, 6, 8 — Д Н К отца; 2, 4, 9 — Д Н К больного
ребенка. Масса фрагментов указана в т. н. п.
R F L P ana lys i s in the family A with cystic f ibrosis child by means of blot-hybridizat ion
(the probes XV-2c (α) and KM-19 (6) as well as by means of polymerase chain reaction-
(KM-19, в) : 1, 5, 7 — ma te rna l DNA samples; 3, 6, 8 — pa ternal DNA samples; 2, 4, 9 —
CF-child 's DNA samples. DNA f r agmen t size in kb
Xl—X2/K1—K2, а больной ребенок является гомозиготой типа'
Xl—Х1/К2—К2. Сравнительные исследования П Д Р Ф этой семьи в сис-
теме КМ.19/PstI методами блот-гибридизации (рисунок, б) и PCA (ри-
сунок, в) демонстрируют идентичные результаты.
В табл. 4 суммированы данные сцепления мутации КФ с гаплоти-
пами, выявленными в двухзондовой системе. Из таблицы следует, что'
T а б л и ц а 4
Частота гаплотшюв полиморфных аллелей КМ. 19 и XV-2с в различных популяциях
групп здоровых доноров и больных КФ
IIaploiype frequencies for the polymorphic sites of KM. 19 and XV-2c loci in different
populations and in cystic fibrosis families
Гаплотин Частота, °0
Наши данные Северная Европа [12] Италия [13]
КМ. 19 XV-2с
Доноры КФ Доноры КФ Доноры КФ
K2 X2
K 2 Xl
Kl Xl
κι X 2
7 ,3 —
12,0 7 3 , 3
3 4 , 7 13,3
4 6 , 0 13,4
10,7 3 ,4
16,4 8 4 , 7
28 ,9 5,1
4 4 , 0 6 ,8
6 , 8 9 , 3
2 3 , 4 72 .7
29 ,9 8,(3
3 9 , 2 9 ,4
в обследованных нами семьях с КФ гаплотип К2—Xl маркировал хро-
мосомы, несущие мутантный локус КФ в 73,3 % от общего числа про-
анализированных хромосом этой группы. Частота этого гаплотигіа для
нормальных хромосом составляла лишь 12 %. Таким образом, наблю-
далось значительное аллельное сцепление мутации КФ с гаплотипом
Xl—К2. Хорошее соответствие результатов, полученных нами и други-
ми авторами по Северной Европе и Италии (табл. 4), свидетельствует
о том, что указанный тип сцепления является преобладающим во всех
трех регионах. В нашем распоряжении имеется маркерный локус, ко-
ISSN 0233-7(157. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. П. № 2
торый можно использовать: для верификации диагноза КФ; для опре-
деления носительства мутантного аллеля в популяции; а также для
пренатальной диагностики КФ на ранних стадиях беременности. На-
дежность и высокая информативность метода (70—80 % семей явля-
ются полностью информативными хотя бы в одной из изученных сис-
т е м ) позволяют не только своевременно начать симптоматическое ле-
чение КФ, но также и предупредить рождение гомозигот, больных КФ.
Работа частично финансируется Всемирной организацией здраво-
охранения (гранты №№> 3/181/38 и 3/181/139) .
POPULATION AND FAMILY ANALYSIS OF P O L Y M O R P H I S M O F DNA S E Q U E N C E S
LINKED TO THE CYSTIC F IBROSIS GENE
О. V. Voronina, V. S. Gaitskhoki, Т. E. Ivashchenko, V. S. Baranov,
V. N. Gorbunova, V. M. Kalinin, L. A. Livshitz, M. T. Venozhinskas
Inst i tute of Experimental Medicine,
Academy of Medical Sciences of the USSR, Leningrad
Inst i tute of Obstetr ics and Gynecology,
Academy of Medical Sciences of the USSR, Leningrad
Inst i tute of Medical Genetics,
Academy of Medical Sciences of the USSR, Moscow
Inst i tu te of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences, of the Ukrainian SSR, Kiev
Ins t i tu te for Protect ion of Mothers and Children,
Ministry of Public Heal th of the Li thuanian SSR, Vilnius
S u m m a r у
The allelic polymorphism of human DNA loci linked to cystic fibrosis gene (D7S8, Met
and D7S'23) was studied us ing blot hybridization and polymerase chain reaction in the
populat ions of healthy donors in Leningrad and in donors from Moscow (D7S8) and Kiev
(Met) . The restriction f r agmen t length polymorphism (RELP) in Leningrad and Kiev
populat ions corresponds to R E L P found in Northern Europe countries while in Moscow
population a shift in the allele frequencies is observed, that appears to depend upon the
contribution of mongoloids having very low frequency of cystic fibrosis. The marked,
l inkage disequilibrium between cystic fibrosis muta t ion and part icular RELP alleles in
D7S23 locus (KM.19 and XV-2c probes) is found in the affected families.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Harris Α., Super Μ. Cystic fibrosis. The f ac t .—Oxford : Univ. press, 1987.— 133 p.
2. Construction of a general h u m a n chromosome j u m p i n g library with application to
cystic f i b r o s i s / F . Collins, M. L. Drumm, C. L. Ef fe ry et a l . / / S c i e n c e . — 1987.—235,
N 4792,— P. 1046—1049.
3. Linkage disequilibrium and the origins of cystic f i b r o s i s / X . Estivill, P. Frederick,
B. Wainwr ight et a l . / / E x c e r t a med. Int . Congr . S e r . - 1988.— 74.— P. 9—10.
4. Schmidtke /., Krawczak M., Schwartz M. L inkage relat ionships and allelic association
of the cystic fibrosis locus and four marker l o c i / / H u m . Genet.— 1987.— 76, N 4.—
P. 337—343.
о Cystic f ibrosis DNA markers in Alabama blacks / R. K. Mart in, G. C. Kaplan,
T. W. Hodge, P. E. B a r k e r / / G e n o m i c s . — 1988 — N 3 . — P . 385—388.
6. Allelic associat ion of the cystic fibrosis locus and two DNA markers , XV-2c and
KM. 19 in 55 German families / M. Krawczak, D. S. Konecki, J. Schmidtke et a l . / /
Hum. Genet.— 1988.—80, N 1 .—P. 78—80.
7. Pattern of polymorphism and l inkage disequilibrium for cystic f ibrosis / X. Estivill,
P. J. Scambler, B. C. Wainwr igh t et a l . / / G e n o m i c s . — 1987.—N 1.—P. 257—263.
8. Maniatis T., Fritsch E. E., Sambrook / . Molecular c loning A laboratory manual .—
New York: Cold Spr ing Harbor Lab, 1982.—477 p.
9. Bell G. /., Karam Τ. HRutter W. F. Polymorphic DNA region ad jacent to the 5 '
end of the human insulin g e n e / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1981.—78, N 9.—
P. 5759—5763.
10. Southern E. Detection of specific sequences a m o n g DNA f r a g m e n t s separated by gel
e l e c t r o p h o r e s i s / / J . Мої. Biol.— 1975,—98, N 3 . — P . 503.
11. Goodchild M. C., Dodge J. A. Cystic fibrosis. Manua l of diagnosis and t r e a t m e n t -
London : Bailleire Tindel!, 1985 — 212 p.
12. Use of l inkage disequilibrium data in prenatal d iagnosis of cystic f i b r o s i s / L . Stra in ,
A. Curtis, M. Mennil et a l . / / H u m . Genet.— 1988.—80, N 1 ,—P. 75—77.
70 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1990. т.) 6. .Nb 2
ІЗ. Linkage disequil ibr ium between cystic f ibrosis and linked DNA polymorphism in
I ta l ian famil ies: a co l labora t ive s t u d y / X . Estivil l , M. Far ra l l , R. Wi l l i amson et a l / /
Amer. J. Hum. Genet .— 198-8.— 43, N 1.— P. 23—28.
Н И И эксперим. медицины А М Н СССР, Ленинград Получено 23.06.89
Ин-т акушерства и гинекологии А М Н СССР, Ленинград
Ин-т мед. генетики А М Н СССР, Москва
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев
Н И И охраны материнства и детства М З Л и т С С Р , Вильнюс
УДК 577.21
В. Н. Шульженко, С. IL Новикова, И. Е. Костецкии,
Л. II. Богацкая, В. В. Фролышс, В. А. Кордюм
ИМПЛАНТАЦИЯ КЛОНИРОВАННОГО ГЕНА AitoAl ЧЕЛОВЕКА
ВЗРОСЛЫМ И СТАРЫМ КРОЛИКАМ
Сконструирована рекомбинантная ДНК, содержащая Аіи-повтор человека и клониро-
ванный нами ген AnoAl человека. Инъекция заключенного в липосомы генетического
материала взрослым и старым кроликам приводит к появлению в крови эксперимен-
тальных животных белкового продукта гена AnoAl человека, который обнаруживается
иммцноэлектрофорезом в агарозном геле со специфической антисывороткой к этому
белку. У экспериментальных животных происходит суіцественная перестройка содер-
жания холестерина (XC) и различных классов липопротеидов.
Введение. В соответствии с современными представлениями о роли на-
рушений липидного и липопротеидного метаболизма в развитии атеро-
склероза многочисленные клинические и экспериментальные попытки
профилактики и лечения этого заболевания основываются па исполь-
зовании средств, снижающих уровень липидов в крови [1, 2]. Вместе
с тем известно, что развитие атеросклероза сопряжено с изменениями
не только липидной, по и белковой части липопротеидов—апопротеи-
нов [3]. Аполипопротеин A l — г л а в н ы й компонент ( 7 0 % ) белковой
фракции липопротеидов высокой плотности ( Л П В П ) , которые облада-
ют способностью регулировать уровень XC в крови и удалять его из
клеток сосудов. Важная антиатерогенная роль этой фракции липопро-
теидов подтверждается большим количеством эпидемиологических ис-
следований, показывающих, что представители человеческой популя-
ции, имеющие высокий уровень Л П В П , не болеют атеросклерозом, а
дефициты данной фракции липопротеидов коррелируют с риском воз-
никновения сердечно-сосудистых патологий [4—6]. Это определяет но-
вые подходы к поиску антисклеротических препаратов среди веществ,
влияющих на синтез ЛПВП.
Исходя из вышеизложенного, перспективной представляется по-
пытка в случаях дефицита повысить уровень Л П В П с помощью гено-
терапевтической коррекции. Данные литературы свидетельствуют о
проведении большого числа исследований по клонированию Апо-генов
человека и АпоАІ-гена в частности [7, 8]. Показана экспрессия гена
AnoAl человека в культуре клеток человека и животных [9—11]. Вмес-
те с тем характер экспрессии в культуре клеток и на уровне интакт-
ного организма, как можно ожидать, будет существенно отличаться.
В этой связи нами поставлена задача — осуществить имплантацию ге-
на Al в клетки разных тканей модельных животных и изучить их функ-
ционирование на уровне интактных организмов. Настоящая работа яв-
ляется первым этапом данного исследования и посвящена определению
принципиальной возможности экспрессии клонированного нами гена
ArioAl человека на экспериментальных животных in vivo.
Материалы и методы. Д л я клонирования гена AnoAl человека была использова-
на библиотека генов человека, сконструированная па основе λ-вектора Харон. 4А.
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 5* 67
|