Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы

Фосфонатные аналоги Ар₄А–АрсрррА (I), АррсррА (II) и АрсррсрА (III) ингибируют активность бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы; при этом I взаимодействует с ферментом по участкам связывания АТР и РРi, III – в основном по участку связывания РРi, а II слабо взаимодействует с каждым из этих участков. Инги...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1986
Автори:	Меркулова, Т.И., Нурбеков, М.К., Тарусова, Н.Б., Ковалева, Г.К.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1986
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Структура и функции биополимеров
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152778
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы / Т.И. Меркулова, М.К. Нурбеков, Н.Б. Тарусова, Г.К. Ковалева // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 4. — С. 179-185. — Бібліогр.: 14 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-152778
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1527782019-07-02T18:40:52Z Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы Меркулова, Т.И. Нурбеков, М.К. Тарусова, Н.Б. Ковалева, Г.К. Структура и функции биополимеров Фосфонатные аналоги Ар₄А–АрсрррА (I), АррсррА (II) и АрсррсрА (III) ингибируют активность бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы; при этом I взаимодействует с ферментом по участкам связывания АТР и РРi, III – в основном по участку связывания РРi, а II слабо взаимодействует с каждым из этих участков. Ингибиторное действие фосфонатных аналогов АР₄А вызвано удалением с фермента существенного для активности иона цинка. На основании полученных результатов высказана гипотеза, что ион Zn²⁺ в активном центре фермента локализован вблизи от РРi связывающего участка или непосредственно в нем. Фосфонатні аналоги Ар₄А-АрсрррА (I), АррсррА (II) і АрсррсрА (III) інгібують активність бичачої триптофаніл-тРНК-синтетази; при цьому I взаємодіє з ферментом по ділянках зв’язування АТР і РРi, III – в основному по ділянці зв’язування РРi, а II слабо взаємодіє з кожною з цих ділянок. Інгібіторна дія фосфонатних аналогів АР₄А викликана видаленням з ферменту істотного для активності іона цинку. На основі отриманих результатів висловлено гіпотезу, що іон Zn²⁺ в активному центрі ферменту локалізований поблизу РРi -зв’язувальної ділянки або безпосередньо у ній. Phosphonate analogs of Ap₄A—ApcpppA(I), AppcppA(II) and ApcppcpA(III)—inhibit the enzymic activity of bovine tryptophanyl-tRNA-synthetase (EC 6.1.1.2); I effectively interacts with ATP and PPi binding sites, III — mainly with PPi binding site, and II interacts weakly with both of them. After prolonged incubation (5 h, 37 °C) with I or III an irreversible 80 % inhibition of the enzyme is observed, whereas with II it is only 40 %. The inhibiting action of the Ap₄A analogs is shown to be due to the removal of essential Zn²⁺ ion from the enzyme. Based on these observations, an assumption is made that Zn²⁺ in the active site of the enzyme is located in or near the PPi binding site. 1986 Article Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы / Т.И. Меркулова, М.К. Нурбеков, Н.Б. Тарусова, Г.К. Ковалева // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 4. — С. 179-185. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001B1 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152778 547.963.3 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Меркулова, Т.И. Нурбеков, М.К. Тарусова, Н.Б. Ковалева, Г.К. Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы Биополимеры и клетка
description	Фосфонатные аналоги Ар₄А–АрсрррА (I), АррсррА (II) и АрсррсрА (III) ингибируют активность бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы; при этом I взаимодействует с ферментом по участкам связывания АТР и РРi, III – в основном по участку связывания РРi, а II слабо взаимодействует с каждым из этих участков. Ингибиторное действие фосфонатных аналогов АР₄А вызвано удалением с фермента существенного для активности иона цинка. На основании полученных результатов высказана гипотеза, что ион Zn²⁺ в активном центре фермента локализован вблизи от РРi связывающего участка или непосредственно в нем.
format	Article
author	Меркулова, Т.И. Нурбеков, М.К. Тарусова, Н.Б. Ковалева, Г.К.
author_facet	Меркулова, Т.И. Нурбеков, М.К. Тарусова, Н.Б. Ковалева, Г.К.
author_sort	Меркулова, Т.И.
title	Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы
title_short	Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы
title_full	Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы
title_fullStr	Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы
title_full_unstemmed	Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы
title_sort	фосфонатные аналоги р¹, р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (аp₄а) как ингибиторы бычьей триптофанил-трнк-синтетазы
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1986
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152778
citation_txt	Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы / Т.И. Меркулова, М.К. Нурбеков, Н.Б. Тарусова, Г.К. Ковалева // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 4. — С. 179-185. — Бібліогр.: 14 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT merkulovati fosfonatnyeanalogir1r4bis5adenoziltetrafosfataap4akakingibitorybyčʹejtriptofaniltrnksintetazy AT nurbekovmk fosfonatnyeanalogir1r4bis5adenoziltetrafosfataap4akakingibitorybyčʹejtriptofaniltrnksintetazy AT tarusovanb fosfonatnyeanalogir1r4bis5adenoziltetrafosfataap4akakingibitorybyčʹejtriptofaniltrnksintetazy AT kovalevagk fosfonatnyeanalogir1r4bis5adenoziltetrafosfataap4akakingibitorybyčʹejtriptofaniltrnksintetazy
first_indexed	2025-07-14T04:16:24Z
last_indexed	2025-07-14T04:16:24Z
_version_	1837594401582350336
fulltext	Структура и функция биополимеров УДК 547.963.3 ФОСФОНАТНЫЕ АНАЛОГИ Р1,Р4-БИС(5' -АДЕНОЗИЛ)ТЕТРАФОСФАТА (Ар4А) КАК ИНГИБИТОРЫ БЫЧЬЕЙ ТРИПТОФАНИ Л-тРНК-СИНТЕТАЗЫ * Т. И. Меркулова, М. К. Нурбеков, Н. Б. Тарусова, Г. К. Ковалева Введение. Триптофанил-тРНК-синтетаза (КФ 6.1.1.2) из поджелудоч- ной железы крупного рогатого скота (Мг 60 000x2) катализирует акти- вацию L-триптофана с последующим его переносом на тРНКТ г р . Фер- мент, в отличие от ряда других аминоацил-тРНК-синтетаз, не катали- зирует с заметной скоростью синтеза динуклеотидного производного, Ар4А — важного регуляторного фактора многих метаболических процессов в клетке [1—3]. Показано, что фермент не может эффектив- но использовать Ар4А вместо АТР при активации триптофана [4]. Ар4А обратимо ингибирует ферментативную активность конкурентно по отношению и к АТР, и к пирофосфату (РРг). На основании этого предложено [4] использовать диаденозилолигофосфаты типа Ар4А для ингибиторного анализа активного центра фермента. В настоящей ра- боте изучены АТР- и РРг-связывающие участки триптофанил-тРНК- синтетазы с помощью фосфонатных аналогов Ар4А и показано, что последние могут необратимо ингибировать фермент за счет удаления из активного центра иона цинка, существенного для активности. Материалы и методы. В работе использовали L-метилен-[14С] триптофан, 2146 ГБк/моль; [3 2Р]пирофосфат, 1221 ГБк/моль («Amersham», Англия); L-триптофан («Sigma», США); динатриевую соль АТР («Reanal», В Н Р ) ; активированный уголь Norit A («Serva», ФРГ); бромид цетилтриметиламмония (цетавлон), нитроцеллюлоз- ные фильтры «Synpor» № 2 и 3 («Chemapol», ЧССР); нитроцеллюлозные фильтры («МП- Проге», США). Фосфонатные аналоги Ар4А синтезировали, как описано в [5, 6] . Чистоту нуклеотидов проверяли методом тонкослойной хроматографии на PEI- целлюлозных пластинках ( 2 0 X 2 0 см) UV-254 («Мегск», ФРГ): промывка водой и пос- ле высушивания на воздухе хроматография в 0,75 Μ LiCl, а также методом жидкост- ной хроматографии с высоким разрешением ( В Ж Х ) . Суммарная тРНК и 2 %-ная тРНК Т г р из дрожжей и печени быка получены, как описано в работах [7, 8] . Препараты фермента получали по методике, описанной ранее в [9], и перед использованием подвергали кислотному переосаждению [9]. Препараты гомогенны при электрофорезе в денатурирующих условиях. Активность фермента в реакциях АТР- [3 2Р]пирофосфатного обмена и аминоацилирования тРНК Т г р определяли согласно [9]. Радиоактивность измеряли в толуоловом сцинтилляторе на счетчике «Intertechnique» (Франция). Тип ингибирования определяли по методу Лайнуивера — Берка и методу Диксона [10]. Величины констант обратимого ингибирования Кг определяли графически как сред- ние абсолютные значения абсциссы точки пересечения прямых линий, описывающих зависимость величины обратной скорости от концентрации ингибитора при различных концентрациях субстрата. * Представлена членом редколлегии д. б. н. Л. Л. Киселевым. Сокращения: Ар4А—Р1 ,Р4-бис(5 /-аденозил)тетрафосфат; АрсрррА, АррсррА, АрсррсрА — фосфонатные аналоги Ар4А, содержащие метиленовые группировки между Р1- и Р2-, Р2- и Р3-атомами, а также между Р1- и Р2, Р3- и Р4-атомами соответственно. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 4 3 - 6-335 179 Спектры К Д снимали на дихрографе Mark III («Jobin-Ivon», Франция). В ближ- ней УФ-области (250—340 нм) измерения проводили при концентрации белка 0,7 мг/мл в кюветах с длиной оптического пути 1 см (чувствительность прибора 1 - Ю - 6 А /мм) при постоянной времени 10 с и скорости сканирования 0,1 нм/с. Определение ионов цинка проводили на атомно-адсорбционном спектрофотометре «Hitachi-207» [11]. Результаты и обсуждение. В испытанных фосфонатных аналогах Ар4А, 1—III (табл. 1), содержащих остатки метилендифосфоновой кис- лоты, метиленовые группы расположены: I — между Р1- и Ρ2-, II — между Р2- и Р3-атомами, III — между Р1- и Р2-, а также между Р3- и Р4-атомами. Фосфонатные аналоги Ар4А синтезированы недавно [5,6] , и их физико-химические свойства еще недостаточно изучены, хотя яс- но, что они определяются фосфонатной природой этих соединений и степенью взаимодействия адениновых оснований [5, 6]. Эти нуклеотид- ные производные могут образовывать прочные комплексы с ионами двухвалентных металлов [12]. Для III определены [12] константы ассоциации с Mg2+ и Zn2+ (стехиометрия III — М е 2 + ~ 1 ) , которые со- ставляют 2,4 и 0,26 мкМ соответственно (для Ар4А эти константы — 28 и 15 мкМ [12]). I и II, как показывают наши предварительные опыты, также достаточно прочно связывают ион Zn2+ Триптофанил-тРНК-синтета- Т а б л и ц а 1 Константы ингибирования триптофанзависимого ЛТР-[Ъ2Р]РРг обмена, катализируемого бычьей триптофанил-тРНК-синтетазой, фосфонатными аналогами Ар^А Inhibition constants of tryptophan dependent АТР-[Ъ2Р]РРг exchange, catalysed by bovine tryptophanyl-tRNA synthetase, with phosphonate analogs of Ap4A Аналог Ар 4А Кі (АТР), мМ Kt (PPj)» мМ I (АрсрррА) 0,9 ± 0 , 1 2,9 ± 0 , 1 II (АррсррА) 7 , 7 ± 0 , 3 6 , 7 ± 0 , 4 III (АрсррсрА) 9,0 ± 0 , 3 1,5 ± 0 , 2 за — цинксодержащий фермент ,[13]. Ион цинка связан с белко- вой молекулой довольно лабиль- но; его удаление с фермента длительным диализом приводит к потере ферментативной актив- ности в частичной и полной ре- акциях [13]. Можно было ожи- дать, что исследуемые фосфонат- ные аналоги Ар4А, связываясь в активном центре, будут удалять существенный для активности ион цинка. Чтобы проверить это, изучали взаимодействие I—III с ферментом в условиях реакции триптофанзависимого АТР-[32Р]Х ХРРг обмена и условиях дли- тельной преинкубации их с фер- ментом в отсутствие АТР и РР. I—III в концентрации I X ΧΙΟ - 3 Μ частично ингибируют реакцию АТР-[32Р]РРг обмена, катализируемую ферментом. Для фермента необходим ион Mg2+, который активирует его и явля- ется косубстратом АТР; только ATP-Mg2+— субстрат частичной и полной ферментативной реакций [см. 14]. Ингибирующее действие I—III на фермент могло быть след- ствием связывания необходимого для активности иона Mg2+ . Однако это не так: степень ингибирования сохраняется практически постоян- ной при варьировании концентраций Mg2+ от 5 до 15 мМ. На рис. 1 в двойных обратных координатах приведены зависимо- сти скорости реакции ATP-[ 3 2 P]PP; обмена от концентраций АТР и РРг в отсутствие ингибиторов и в их присутствии. Видно, что ингиби- рование во всех случаях носит конкурентный характер по отношению и к АТР, и к РРг·. Ранее аналогичный характер ингибирования был обнаружен для Ар4А и Ар3А [4]. Он может отражать связывание динуклеотидного производного как на одной субъединице фермента одновременно по участкам для АТР и РРг, так и на двух субъедини- цах: на одной — по участку связывания АТР и на другой — по участ- ку связывания РРг. П р и м е ч а н и е . Все аналоги проявляют конкурентный по отношению к АТР и PPi ТИП и н г и б и р о в а н и я . / (г ( А Т Р ) и / С г ( Р Р 0 — величины констант обратимого ингибирова- ния, конкурентного в отношении АТР и РРі соответственно. Для Ар4А / и (АТР) найде- на равной 3 ,8±0 ,1 мМ, Кг (РР<)—10,2± ± 0 , 5 мМ [4]; Km для АТР — 2 , 2 ± 0 Д мМ; для РРг — 0 ,2±0 ,1 мМ. Каждое из приве- денных значений Кг есть среднее из не ме- нее чем трех определений. 180 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 4 Рис. 1. Зависимость в двойных обратных координатах скорости триптофанзависимого А Т Р - [ 3 2 Р ] Р Р , обмена, катализируемого триптофанил-тРНК-синтетазой, в присутствии I (а, б), II (в, г), III (д, е) от концентрации ATP-Mg 2+ (а, в, д) и РР,· (б, г, е). Кон- центрации I—III (мМ): I — 0 ( / ) ; 0 ,4(2); 0 ,8(5); 2 ,0(4) ; II—0(У); 0 ,56(2); 1,12(5); 2 ,80(4); I I I — 0 ( 1 ) ; 3 , 9 ( 2 ) ; 7 ,8(5) . Fig. 1. The double reciprocal plots of the rate of tryptophan dependent АТР-[ 3 2Р]РР г · exchange catalyzed by tryptophanyl-tRNA-synthetase in the presence of Ap4A analogs I (a, б ) , II (в, г) , III (д, e) versus ATP-Mg 2+ {а, в, д) and Р Р { (б, г, e). БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 4 3 - 6-335 181 В табл. 1 приведены значения Кг для I—III, определенные по ме- тоду Диксона [10]. Наибольшее сродство к АТР-связывающему уча- стку проявляет I, значение Кг для которого близко к величине Km ДЛЯ АТР, определенной в той же реакции. Значения Кг для II и III пре- вышают Km для АТР в ~ 4 раза. Сродство к РР;-связывающему уча- стку всех трех ингибиторов в условиях реакции снижено по сравнению с РРг Кг — для I и III примерно на порядок, а для II — в 14 раз выше К ш ДЛЯ РРг. Наиболее слабым ингибирующим действием обладает II. В его молекуле, как и в молекуле I, сохранен Р1 — О — Р2 фрагмент, необ- ходимый для образования интермеди^та ферментативной реакции — триптофаниладенилата. Наблюдаемое для II слабое ингибирование могло быть вызвано участием его как плохого субстрата в фермента- тивной реакции. Однако мы показали, что II не заменяет АТР ни в одной из реакций, катализируемых ферментом, и не образует трипто- фаниладенилата на ферменте. В табл. 2 приведены данные по взаимодействию фермента с I, II и III в условиях его длительной преинкубации (рН 7,5, 37 °С, 5 ч) с каждым из аналогов. Видно, что такая преинкубация приводит к инги- бированию фермента на ~ 8 0 % для I и III и на ~ 4 0 % для II. На- блюдаемое развитие ингибирования во времени указывает на его не- обратимый характер. Фосфонатные аналоги Ар4А не содержат в своих молекулах высокореакционноспособных группировок и не могут поэто- му модифицировать существенные для активности аминокислотные остатки фермента. В то же время они могут, как указывалось выше, хелатировать необходимый для активности ион цинка, достаточно ла- бильно связанный с ферментом [13]. Т а б л и ц а 2 Изменение активности фермента (7 мкМ) в реакции триптофанзависимого АТР-[г2Р]РР{ обмена в ходе инкубации (рН 7,5; 37°С) с фосфонатными аналогами Л/?4Л, I—III (5 мМ) в отсутствие и в присутствии ATP-Mg2+ (5 мМ) или РРг (2 мМ) Time-course dependence of the enzyme inactivation in tryptophan dependent ATP-[32P]PPi exchange under the action of Ap4A analogs I—III (5 mM) in the presence and absence of ATP-Mg2+ (5 mM) or PP{ (2 mM) Остаточная активность фермента в присутствии ингибиторов, % Время инкубаций, ч I 1 + + A T P - M g 2 + 1+ + Р Р і III I I I + +ATP-Mg 2 + I I I + + Р Р ; II 0 , 2 100 100 100 1 6 8 8 5 9 8 102 105 100 105 2 4 2 6 3 7 8 7 5 8 0 100 9 6 3 2 8 4 2 5 4 5 5 6 0 9 8 7 0 4 2 3 3 5 3 9 3 5 3 2 9 9 6 5 5 18 2 8 3 2 18 2 0 9 7 6 2 П р и м е ч а н и е . Все пробы содержали 10 мМ MgCl 2 и 5 ·10~ 5 Μ L-триптофан, добав- ленные для стабилизации фермента. Для определения активности аликвоты разводили в 200 раз. Для триптофанил-тРНК-синтетазы показано [13], что удаление ионов Ζη2+ приводит к существенным конформационным перестройкам в молекуле фермента. Это находит отражение в спектрах КД в области 260—340 нм: удаление цинка сопровождается полным исчезновением пика при 290—300 нм [13]. На рис. 2 приведены спектры КД в ближ- ней УФ-области исходного фермента (спектр 4) и препарата, преин- кубированного с III в течение 3 ч при 37 °С и затем подвергнутого гель-фильтрации для удаления избытка ингибитора (спектр 3). Видно, что пик в области 290—300 нм для фермента, наполовину утратившего активность в присутствии III, снижается в два раза по сравнению с исходным ферментом. Прямое определение содержания цинка в этих препаратах методом атомно-адсорбционной спектроскопии [11] пока- 182 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 4 зало, что исходный и подвергнутый обработке III препараты фермен- та содержат 1,1 и 0,5 атомов цинка (соответственно) на белковую мо- лекулу. Аналогичные соотношения между уменьшением пика при 290— 300 нм в спектрах КД и снижением ферментативной активности получены также для I (рис. 2, спектр 2). Таким образом, необратимое Рис. 2. Спектры К Д в ближней ультрафиолетовой области исходной триптофанил- тРНК-синтетазы и препаратов фермента, обработанных фосфонатными аналогами Ар4А и подвергнутых гель-фильтрации: 1 — нулевая линия; 2, 3 — фермент, обработанный I и III соответственно (инкубация 3 ч, 37 °С, рН 7,5); 4 — исходный фермент. Fig. 2. CD spectra in the near U V of the native tryptophanyl-tRNA-synthetase and of the enzyme preparations treated with Ap4A analogs and liberated from them by gel filtration. ингибирование триптофанил-тРНК-синтетазы фосфонатными аналога- ми Ар4А вызвано удалением с фермента существенного для активности иона цинка. В отличие от орто-фенантролина фосфонатные аналоги Ар4А мож- но рассматривать для триптофанил-тРНК-синтетазы как аффинные цинкхелатирующие реагенты, так как они обладают значительным сродством к АТР- и (или) пирофосфатсвязывающим участкам актив- ного центра фермента. В табл. 2 приведены также данные по защите фермента АТР и РРi от ингибирования I и III. АТР и РРi примерно в равной степени защищают фермент от ингибирования I. Их совместное добавление приводит к значительному усилению защитного эффекта. В случае III РРi полностью защищает фермент от потери активности, а АТР на степень ингибирования не влияет. Из сопоставления этих данных с БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 4 3 - 6-335 1 8 3 приведенными в табл. 1 величинами Кг можно заключить, что как в условиях реакции АТР-[3 2Р]РРг обмена, так и в отсутствие субстра- тов I взаимодействует с ферментом как аналог АТР и РРг, а III — только как аналог РРг\ Ранее на основании опытов с удалением Zn2+ с помощью орто- фенантролина предполагали возможное участие АТР в связывании Zn2+ на ферменте [13]. Наблюдаемая нами полная защита РРг от ин- гибирования фермента III (за счет удаления существенного для актив- ности Zn2+) указывает на то, что ион цинка локализован вблизи от РРг-связывающего участка или непосредственно в нем. Авторы глубоко признательны JI. JI. Киселеву за интерес к работе и ценные советы; О. О. Фаворовой — за полезные замечания по руко- писи статьи; А. В. Ажаеву — за проверку чистоты фосфонатных анало- гов Ар4А методом ВЖХ: Н. Т. Гурвич — за снятие спектров КД; С. Г. Дмитриенко — за определение содержания цинка в образце фермента. P H O S P H O N A T E ANALOGS OF Ρ1, P 4 -BIS(5 ' -ADENOSYL)TETRAPHOSPHATE (Ap4A) AS INHIBITORS OF BOVINE TRYPTOPHANYL-tRNA-SYNTHETASE Т. I. Merkulova, Μ. K. Nurbekov, N. B. Tarusova, G. K. Kovaleva Institute of Molecular Biology, Academy of Sciences of the USSR, Moscow S u m m a r y Phosphonate analogs of Ap 4A—ApcpppA(I) , AppcppA(II) and A p c p p c p A ( I I I ) — i n h i - bit the enzymic activity of bovine tryptophanyl-tRNA-synthetase (EC 6.1.1.2); I effective- ly interacts with ATP and РРг binding sites, III — m a i n l y with PP* binding site, and II interacts weakly with both of them. After prolonged incubation (5 h, 37 °С) with I or III an irreversible 80 % inhibition of the enzyme is observed, whereas with II it is only 40 %. The inhibiting action of the Ap4A analogs is shown to be due to, the removal of essential Zn 2 + ion from the enzyme. Based on these observations, an assumption is made that Zn2+ in the active site of the enzyme is located in or near the PP< binding site. 1. Zamecnik P. Diadenosine 5',5'"-Ρ1, P4-tetraphosphate (Ap4A) : its role in cellular me- t a b o l i s m / / A n a l . Biochem.— 1983.—134, N 1 .—P. 1—10. 2. Blatiquet S., Plateau P., Brevet A. The role of zinc in 5',5'-diadenosine tetraphosphate production by aminoacyl-transfer RNA synthetases / / Мої. and Cell. Biochem.— 1983.—52, N 1 .—P. 3—11. 3. Goerlich O., Foeckler R., Holler E. Mechanism of synthesis of adenosine(5') tetrapho- sphate (5') adenosine (AppppA) by aminoacyl-tRNA synthe tases / /Eur . J. B iochem.— 1982.—126, N 1 .—P. 135—142. 4. Ковалева Г. КМеркулова Т. ИНурбеков М. /С Взаимодействие бычьей трипто- фанил-тРНК-синтетазы с Р1 ,Р4-бис(5 /-аденозил)тетрафосфатом и Р 1 ,Р 3-бис(5 ,-адено- зил)трифосфатом (Ар4А и А р 3 А ) / / М о л е к у л я р . биология.— 1986.—20, № 2 . — С. 558—562. 5. Тарусова Н. Б., Завгородний С. Г., Осипова Τ. И. Фосфорорганические аналоги биологически активных соединений. XIV. Синтез фосфонатных аналогов PJ ,P4- бис(5'аденозил)тетрафосфата и 5'-нуклеозидтрифосфатов / / Биоорган. химия.— 1985.—11, «№6.— С. 802—807. 6. Phosphonate analogs of nuc leot ides - tr iphosphates and P ^ P M i a d e n o s i n e tetraphos- phate / N. B. Tarussova, Т. I. Osipova, A. I. Biriukov et al. / / Nucl. Acids Res.— 1984.— N 14.— P. 287—288. 7. Maxwell #., Wimmer E„ Tener G. Λί. The isolation of yeast typosine and tryptophan transfer ribonucleic acids / / B i o c h e m i s t r y . — 1968.—7, N 7 . — P . 2629—2634. 8. Roy K. L., Soil D. Fractionation of Escherichia coli transfer RNA on benzoylated DEAE-cel lulose / / Biochim. et biophys. acta.— 1968.—161, N 2 . — P . 572—574. 9 Kisselev L. L.t Favorova О. О., Kovaleva G. K. Tryptophanyl-tRNA synthetase from beef p a n c r e a s / / M e t h . Enzymol.— 1979.—59, pt G . — P . 234—257. 10. Диксон ΜУэбб Э. Ферменты.—Μ.: Мир, 1982.—Т. 1 .—392 с. 11. Fuma К., Vallee В. L. The physical basis of analytical atomic absorption spectro- metry. The pertinence of the Beer —Lambert l a w / / A n a l . C h e m — 1963.—35, N 8 — P. 942—946. 184 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 4 12. Circular dichroism and ordered structure, of b isnucleos ide o lygophosphates and their Z n 2 + and M g 2 + complexes / E. Holler, B. Holmquist , B. L. Va l l ee et al. / / Biochemi- stry.— 1983.—22, N 2 1 — P . 4924—4933. 13. Bovine t ryptophanyl - tRNA synthetase . A z inc meta l loenzyme / L. L. Kisselev, О. O. Favorova, Μ. K. Nurbekov et a l . / / E u r . J. Biochem.— 1981 —120, N 3.— P. 511—517. 14. Киселев JI. JI., Фаворова О. О., Лаврик О. И. Биосинтез белков от аминокислот д о аминоацил-тРНК.— М. : Наука, 1 9 8 4 . - 4 0 8 с. Ин-т молекуляр. биологии А Н СССР, Москва Получено 29-10.85 УДК 576:547.963.3 РИБОСОМНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ ИЗ АМИНОАЦИЛ-тРНК В ОТСУТСТВИЕ МАТРИЧНОГО ПОЛИНУКЛЕОТИДА: СИНТЕЗ ПОЛИФЕНИЛАЛАНИНА ИЗ ФЕНИЛАЛАНИЛ-тРНКЛиз Г. Ж. Юсупова (Тналина), Н. В. Белицина, А. С. Спирин Введение. Ранее было показано, что рибосомы Escherichia coli в от- сутствие матричного полинуклеотида способны использовать лизил- тРНК и некоторые другие аминоацил-тРНК в качестве субстратов для синтеза полипептидов [1—3]. Среди изученных 16 аминоацил-тРНК лучшими субстратами для рибосомного безматричного синтеза поли- пептидов оказались лизил-, серил-, треонил- и аспартил-тРНК. Προ- лил-, фенилаланил- и аспарагинил-тРНК оказались практически не- активными субстратами для элонгации в отсутствие матрицы [2, 3]. Однако было неясно, что определяет эффективность аминоацил-тРНК как субстрата для безматричного синтеза: структура т Р Н К или при- рода аминокислотного остатка. Удобной моделью для решения этой проблемы оказались ложноацилированные тРНК. В этой работе показано, что фенилаланил-тРНК^ 3 , так же как и лизил-тРНКЛиз, способна служить субстратом для синтеза гомопеп- тидов на рибосомах в отсутствие поли (А). Из этих результатов сле- дует, что именно структура тРНК определяет способность аминоаци- лированной тРНКА и з участвовать в элонгации пептида в отсутствие кодон-антикодонового спаривания. Фенилаланил-тРНКФен является не- активным субстратом для рибосомного синтеза в отсутствие поли (У). Материалы и методы. В работе использованы рибосомы из Е. coli MRE-600, 4- кратно отмытые 1 Μ NH4C1 [4, 5 ] . Очищенные рибосомы хранили в замороженном состоянии при — 7 0 °С в буферном растворе (20 мМ трис-HCl, рН 3 7°с 7,6, 100 мМ NH4C1, 10 мМ MgCl 2 , 0,1 мМ Э Д Т А и 10 %-ный глицерин). Очищенные факторы элон- гации EF-Tu и EF-G были получены из Е. coli MRE-600, в основном согласно методике, описанной Казиро и др. [6, 7 ] . Препарат [ 1 4 С ] л и з и л - т Р Н К Л и з из Е. coli получен с помощью аффинной хромато- графии на иммобилизованном факторе EF-Tu из Thermus thermophilus НВ8 [8] . Фак- тор элонгации EF-Tu из Т. thermophilus был предоставлен М. Б. Гарбер (Ин-т белка А Н СССР) и иммобилизован на BrCN-активированной сефарозе 4В («Pharmacia», Швеция) . Исходный препарат т Р Н К из Е. coli («Boehringer-Manheim», Ф Р Г ) , энзима- тически ацилированный [1 4С] лизином («Amersham», Англия, 12,9 ГБк/ммоль) , получа- ли, как описано в [9]; конечный препарат т Р Н К сод ерж ал 52—59 пмолей лизина на 1ед. А2бо тРНК. Препарат, обогащенный [ 1 4 С]лизил-тРНК^ И 3 , с оде рж ал 1000—1100 пмолей [ 1 4 С]лизина на 1 ед. А2бо т Р Н К (1 ед. А 2 т соответствует 1500 пмолям т Р Н К ) . Перед процедурой ложного аминоацилирования [ 1 4 С ] л и з и л - т Р Н К Л и з деацилиро- вали в течение 1 ч при 37 °С в буфере, содержащем 100 мМ трис-HCl, рНз7 0 с 8,9. Л о ж н о е ацилирование т Р Н К Л и з из Ε coli [ 3 Н ] фенилаланином («Amersham», 1850 Г Б к / /ммоль) проводили с помощью фенилаланил-тРНК-синтетазы из д р о ж ж е й , как описано в методике [10] . Препарат индивидуальной фенилаланил-тРНК-синтетазы из д р о ж ж е й с удельной активностью 3000—3500 ед . /мг белка предоставлен доктором П. Реми (Страсбур, Франция). Степень аминоацилирования составляла 750 пмолей фенилалани- на на 1 ед. Агбо т Р Н К Л и з . В о з м о ж н у ю примесь т Р Н К ф е н в препаратах т Р Н К Л и з оце- нивали по степени ацилирования [ 3 Н ] фенилаланином препаратов т Р Н К Л и з при исполь- зовании ферментной фракции из Е. coli в стандартных условиях [9];•; примесь т Р Н К ф е н в препаратах т Р Н К составляла 20—25 пмолей на 1 ед. А26о т Р Н К Л и з , т. е. не более 2 - 2 , 5 %. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 4 3 - 6-335 1 8 5

Фосфонатные аналоги Р¹, Р⁴-бис(5'-аденозил)тетрафосфата (Аp₄А) как ингибиторы бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы

Репозитарії

Схожі ресурси