Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях
На основании анализа литературы и собственных экспериментальных данных предложено новое направление в биологической азотфиксации – создание азотфиксирующих производных бактерий, способных развиваться в небобовых растениях....
Збережено в:
| Дата: | 1986 |
|---|---|
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1986
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152934 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях / В.А. Кордюм, Н.А. Козыровская, Н.В. Гуньковская // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 227-239.. — Бібліогр.: 54 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-152934 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1529342019-06-14T01:28:13Z Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях Кордюм, В.А. Козыровская, Н.А. Гуньковская, Н.В. Обзоры На основании анализа литературы и собственных экспериментальных данных предложено новое направление в биологической азотфиксации – создание азотфиксирующих производных бактерий, способных развиваться в небобовых растениях. На основі аналізу літератури і власних експериментальних даних запропоновано новий напрямок у біологічній азотфіксації – створення азотфіксуючих похідних бактерій, здатних розвиватися у небобових рослинах. A new trend in the biological nitrogen fixation, the construction of the nitrogen-fixing derivatives of bacteria able to grow in nonlegumes has been theoretically and experimentally substantiated. 1986 Article Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях / В.А. Кордюм, Н.А. Козыровская, Н.В. Гуньковская // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 227-239.. — Бібліогр.: 54 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001BB http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152934 577.21:57У.252.5:579.842 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Обзоры Обзоры |
| spellingShingle |
Обзоры Обзоры Кордюм, В.А. Козыровская, Н.А. Гуньковская, Н.В. Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях Биополимеры и клетка |
| description |
На основании анализа литературы и собственных экспериментальных данных предложено новое направление в биологической азотфиксации – создание азотфиксирующих производных бактерий, способных развиваться в небобовых растениях. |
| format |
Article |
| author |
Кордюм, В.А. Козыровская, Н.А. Гуньковская, Н.В. |
| author_facet |
Кордюм, В.А. Козыровская, Н.А. Гуньковская, Н.В. |
| author_sort |
Кордюм, В.А. |
| title |
Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях |
| title_short |
Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях |
| title_full |
Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях |
| title_fullStr |
Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях |
| title_full_unstemmed |
Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях |
| title_sort |
теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1986 |
| topic_facet |
Обзоры |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152934 |
| citation_txt |
Теоретическое обоснование и экспериментальное создание азотфиксаторов нового типа, способных развиваться и фиксировать азот атмосферы в небобовых растениях / В.А. Кордюм, Н.А. Козыровская, Н.В. Гуньковская // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 227-239.. — Бібліогр.: 54 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT kordûmva teoretičeskoeobosnovanieiéksperimentalʹnoesozdanieazotfiksatorovnovogotipasposobnyhrazvivatʹsâifiksirovatʹazotatmosferyvnebobovyhrasteniâh AT kozyrovskaâna teoretičeskoeobosnovanieiéksperimentalʹnoesozdanieazotfiksatorovnovogotipasposobnyhrazvivatʹsâifiksirovatʹazotatmosferyvnebobovyhrasteniâh AT gunʹkovskaânv teoretičeskoeobosnovanieiéksperimentalʹnoesozdanieazotfiksatorovnovogotipasposobnyhrazvivatʹsâifiksirovatʹazotatmosferyvnebobovyhrasteniâh |
| first_indexed |
2025-07-14T04:23:26Z |
| last_indexed |
2025-07-14T04:23:26Z |
| _version_ |
1837594844442132480 |
| fulltext |
Μ Обзоры
У Д К 577.21:57У.252.5:579.842
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ
И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ СОЗДАНИЕ
АЗОТФИКСАТОРОВ НОВОГО ТИПА,
СПОСОБНЫХ РАЗВИВАТЬСЯ
II ФИКСИРОВАТЬ АЗОТ АТМОСФЕРЫ
В НЕБОБОВЫХ РАСТЕНИЯХ
В. А. Кордюм, Н. А. Козыровская, Н. В. Гуньковская
Несмотря на то, что биосфера в прямом смысле слова «купается» в
азоте — над каждым квадратным километром поверхности нашей пла-
неты атмосфера содержит около 8 млн τ данного элемента, — для жи-
вого он является наиболее дефицитным и в значительной мере лимити-
рует протекание биологических процессов на Земле. Практически весь
азот, включаемый в биологические превращения, вовлекается за счет
биологической азотфиксации. Его количество оценивается в 139 млн τ в
год [1], и продуктивность биосферных процессов определяется этой ве-
личиной. В еще большей мере это касается сельскохозяйственного про-
изводства. Здесь для устранения азотного дефицита используют мине-
ральные удобрения. Однако даже в развитых странах химическая про-
мышленность не в состоянии полностью удовлетворить потребности в
связанном азоте, а в общем балансе биологическая азотфиксация на
полях поставляет растениям столько, сколько дает его вся химическая
промышленность. Но в развивающемся мире этого недостаточно. Кроме
того, растения усваивают лишь 30—40 % внесенного удобрения. Осталь-
ное в конце концов вымывается и, попадая в реки, озера, водохрани-
лища, вызывает цветение, развитие нежелательных организмов. В до-
вершение негативного влияния связанный азот на своем пути подавляет
биологическую азотфиксацию, в результате чего эффект от внесения
его в почву снижается еще больше, так как надо увеличить дозу пре-
парата, чтобы компенсировать убыль естественных процессов.
Не менее впечатляюще выглядит и экономическая сторона пробле-
мы. Только на промышленное производство азотных удобрений еже-
годно во всем мире расходуется более 1,6 % всей потребляемой чело-
вечеством энергии [2].
Еще больше тратится ее на последующих этапах — храпении,
транспортировке, внесении и т. п. Если сюда добавить энергетические
затраты на очистку окружающей среды, возрастающие усилия для до-
бывания 'прежнего количества продуктов водоемов, лесов и т. д., ску-
деющих от загрязнений, то энергия, связанная с производством азотных
удобрений, по-видимому, превысит 3,5 % общего мирового ее потреб-
ления и составит в условном, «нефтяном», исчислении более 600 млн τ
ежегодно. И это только расход энергии в чистом виде, не считая
стоимости заводов, транспорта, рабочей силы и т. д.
Иное решение в свое время 'найдено эволюцией — до человека по-
требности в связанном азоте во всех без исключения звеньях в биосфе-
ре удовлетворялись за счет биологической азотфиксации. В усреднен-
ном пересчете азотфиксация обеспечивает поступление на каждый
гектар поверхности нашей планеты несколько более 12 кг связанного
227 Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А , 1986, т. 2, № 5·
азота в год [3]. Учитывая реальные перспективы, по-видимому, един-
ственной возможностью, которую сегодня признают во всем мире, и
решающей если не все, то по крайней мере основные проблемы, явля-
ется такая интенсификация и перераспределение биологической азот-
фиксации, которые, приобретая іновое качественное звучание, устранят
потребности в азотных химических удобрениях.
Развитие молекулярной генетики и генетической инженерии позво-
лят в обозримом будущем решить эту проблему. Ее анализ дал воз-
можность сформулировать нам в 1982 г. 11 направлений поиска на пути
удовлетворения потребностей сельского хозяйства в связанном азоте:
изменение спектра почвенной азотфиксирующей микрофлоры; повыше-
ние эффективности функционирования клубеньковых бактерий в бобо-
вых растениях; широкая (практическая реализация потенциальных воз-
можностей азотфиксирующих спирилл; поиски в природе новых азотфик-
сирующих симбионтов; придание клубеньковым бактериям способности
развиваться на небобовых растениях; придание способности к симбиозу
інесимбиотическим азотфиксаторам; придание способности фиксировать
азот актиномицетным (т. е. прокариотическим) микоризам; создание
симбионтов-органелл, фиксирующих азот (нитросом) в клетках эука-
риотических объектов; придание способности фиксировать азот ат-
мосферы непосредственно высшим растениям; придание способности
фиксировать азот атмосферы прокариотам, развивающимся в расте-
ниях; получение «азотфиксирующих» животных за счет придания азот-
фиксирующей способности [населяющей их микрофлоре. К ним примы-
кают четыре самостоятельные задачи, общие для всех направлений:
защита биологической азотфиксации от кислородной инактивации;
повышение эффективности азотфиксации; повышение интенсивности
азотфиксации; проблемы конкурентоспособности вносимых в природу
искусственно созданных, улучшенных или измененных форм по отно-
шению к их диким сородичам, занимающим идентичные экологические
ниши [4]. Сегодня можно сформулировать еще одно направление, к
которому в отличие от остальных, изложенных выше, задачи не имеют
прямого отношения: селекция растений, способных более эффективно-
взаимодействовать с азотфиксирующими бактериями [5, 6].
Пока наиболее эффективно развиваются первые три направления.
Однако, несмотря на значительную концентрацию сил и средств и не-
сомненные достигнутые успехи, очень четко выявились принципиальные
ограничения этих направлений. В -почве как качественный, так и коли-
чественный состав азотфиксирующих бактерий весьма велик [7]. Так,
например, в ризосфере сорго и проса выделяемые азотфиксаторы отно-
сятся не менее чем к 22 родам [8]. Немало их можно изолировать из
филосферы [9]. Однако среди форм, обитающих непосредственно на
корнях (а не в прикорневой зоне), азотфиксаторов мало [10]. В то же
время центральной проблемой накопления связанного азота бактерия-
ми являются энергетика и конкурентный перехват. Растения — основ-
ной поставщик энергии, и корневые выделения во многом обеспечивают
энергетические потребности почвенных бактерий. Лучше всего энергией
обеспечены те микроорганизмы, которые непосредственно развиваются
;на поверхности корней. По мере удаления от 'последних концентрация
органических соединений круто падает. С другой стороны, аз»от, обра-
зующийся в отдалении от корней, эффективно перехватывается бак-
териями.
Благодаря работам ряда ученых, в значительной мере иниции-
рованных и выполненных В. Клингмюллером [11 —13], развились ис-
следования по переносу nif-генов в бактерии, развивающиеся на корнях
растений. Сегодня можно получать самые разнообразные азотфиксиру-
ющие производные таких бактерий. Можно ожидать, что в будущем
эти работы получат и практическое применение. Однако при переносе
таких азотфиксаторов в почву возникнут два принципиальных ограни-
чения. Первое связано с тем, что д а ж е в таком случае энергетика ока-
жется все равно крайне напряженной, существенно ограничивающей
228 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5·
потенциальные возможности новых азотфиксаторов. Второе связано с
занятостью экологических ниш и проблемой конкурентоспособности
вносимых искусственно получаемых форм с их дикими, более приспо-
собленными сородича ми.
Повышение эффективности клубеньковых бактерий уже привело к
хорошим практическим результатам [2], но оно ограничено почти
и с к л ю ч и τ е л ьно бобов ы м и ρ а с τ е Η и я м и.
Что же касается азоспирилл, то их изучение подтвердило перспек-
тивность направления и в ряде случаев продемонстрировало в модель-
ных экспериментах весьма неплохие результаты [14]. Однако работ,
далеких от оптимизма, также немало и основаны они на вполне доброт-
ном экспериментальном материале. Кроме того, настораживает и весь-
ма небольшой вклад азоспирилл в общий фонд накопления азота в
природе, что неблагоприятно контрастирует с аналогичными данными
для систем клубеньковые бактерии — бобовые растения. Это дает ос-
нование полагать, что хотя азоспириллы со временем и найдут прак-
тическое применение, но вряд ли решат проблему дефицита связанного
азота. Последняя скорее всего будет решена комплексно, с использо-
ванием разных подходов.
В этой связи весьма перспективным представляется направление,
•связанное с получением азотфиксирующих производных бактерий, ес-
тественно развивающихся в тканях небобовых растений, но природно
неспособных к усвоению азота атмосферы.
Идея этого направления была сформулирована нами в качестве
рабочего положения в 1978 г. и опубликована вместе с первыми эк-
спериментальными данными в 1980 г. [15]. Перечень бактерий, разви-
вающихся в растениях, весьма обширен, а взаимоотношения компонен-
тов такого сообщества сложны и динамичны. Наиболее интересна в
рассматриваемом плане группа фитопатогенных бактерий. Их развитие
вызывает поражения растений, приводящие к падению урожая. Но во
многих случаях они развиваются без нанесения ущерба хозяину. Хоро-
шей аналогией являются энтеробактерии, обитающие в пищеваритель-
ном тракте млекопитающих. Польза макроорганизму от них постоян-
ная и значительная, а вред в случае приобретения этими микроорганиз-
мами патогенных свойств (например, вследствие переноса в их клетки
соответствующих генов па плазмидах) , хотя и имеет яркое выражение,
по преходящ. Часто и фитопатогенные бактерии обитают в тканях и па
поверхности растений, не вызывая патологий. Зато хозяйская специфич-
ность, т. е. способность проникать в определенные ткани определенных
растений и развиваться в них, присуща постоянно. В то же время се-
годня техника переноса ш'/-генов в различные прокариоты отработана
весьма эффективно, а передача хозяйской специфичности осуществля-
ется лишь за счет переноса симбиотических плазмид клубеньковых бак-
терий в иные виды и затрагивает способность з а р а ж а т ь бобовые расте-
ния [16] и немногочисленные, не имеющие сколько-нибудь существен-
ного хозяйственного значения, небобовые, на которых в природе
развиваются некоторые клубеньковые бактерии [17].
Придание бактериям, развивающимся в растениях и образующим
там заметную биомассу, способности фиксировать азот атмосферы, об-
ходит эту трудность, связанную с неумением передавать (за исключе-
нием редких и ограниченных случаев) хозяйскую специфичность, и од-
новременно позволяет подойти к решению двух других проблем. Во-
первых, получаемые таким путем микроорганизмы не должны вы-
тесняться почвенными бактериями, так как занимают свободную эко-
логическую нишу. Во-вторых, находясь внутри растений, они не долж-
ны испытывать столь острого дефицита в источниках энергии, как
это имеет место у форм, развивающихся на поверхности рас-
тений.
Д л я экспериментального обоснования избранного нами направле-
ния и учитывая отсутствие в литературе подобных работ, необходимо
было ответить на следующие вопросы.
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 2 — 6-535 229
1. Будет ли осуществляться перенос nif-генов в фитопатогенные
бактерии, естественно развивающиеся в растениях, или в процессе
переноса nif-кластер полностью или частично подвергнется элиминации?
2. Будет ли происходить экспрессия генов, отвечающих за азот-
фиксацию, если перенос произойдет?
Решение этих вопросов інадо было начать с выбора объектов ис-
следования. Микроорганизмов, взаимодействующих с растениями, очень
много и их таксономическая принадлежность исключительно разнооб-
разна. Среди них имеются и азотфиксирующие формы. Так, в природе
существуют азотфиксирующие бактерии, развивающиеся внутри ткани,
формируя на листьях и стеблях небобовых растений подобие клубень-
ков [18]. Известны виды бактерий, близкие фитопатогенным, способные
усваивать азот атмосферы [19, 20]. Некоторые бактерии, развивающие-
ся в тканях растения-хозяина, родственны классическим азотфиксато-
рам-ризобиям [21]. Однако, как и в случае ризобий, эти бактерии об-
ладают строгой хозяйской специфичностью и не способны развиваться
в основных сельскохозяйственных растениях. В изобилии распростране-
ны ризосферные и эпифитные микроорганизмы. У них, как правило,
отсутствует узкая хозяйская специфичность, ή о их биомасса на единицу
массы растения столь мала, что трудно ожидать заметного вклада в
обеспечение растения связанным азотом в случае изменения того или
иного вида данной группы в нужном направлении. Кроме того, их эк-
зогенная локализация неизбежно приведет к возникновению проблем,
отмеченных выше.
По совокупности показателей наиболее перспективными, как нам
представляется, являются фитопатогенные бактерии. У них эволюцион-
іно отработан механизм проникновения в растение, размножения в нем,
что обеспечивает высокую степень контакта с растительной клеткой.
При развитии в растении они накапливают значительную биомассу в
отличие от эпифитных и ризосферных бактерий. Одни и те же виды
фитопатогенов имеют широкий спектр агрессивности по отношению к
растению-хозяину, что позволило бы отбирать нужные формы, а изме-
нение экспериментальным путем степени агрессивности не представляет
(непреодолимых трудностей. Заражение растений слабовирулентными
штаммами обеспечило бы, кроме того, иммунизацию его к повторной
инфекции, что имело бы дополнительное важное практическое значение.
Фитопатогенные бактерии — благоприятный материал для генети-
ческой инженерии. Д л я многих групп разработаны эффективные спо-
собы переноса генетической информации [22, 23]. Описаны плазмиды
и изучены их свойства у представителей наиболее распространенных
родов Agrobacterium [24, 25], Erwinia [26—29], Pseudomonas [ЗО, 31]
Corynebacterium [32]. Клонированы гены патогенності! у представите-
лей родов Erwinia [33—40], Xanihomonas [41, 42], Pseudomonas [43].
Таким образом, в настоящее время манипулирование генетическим
материалом фитопатогенных бактерий не представляет принципиаль-
ных трудностей. Анализ возможности использования фитопатогенных
бактерий для создания новых азотфиксирующих форм, развивающихся
в небобовых растениях, позволил нам выбрать в качестве модельных
объектов бактерии Erwinia и Xanthomonas. Это объясняется следующими
моментами. Во-первых, представители указанных родов являются хоро-
шими реципиентами плазмид Р 1 группы несовместимости, что важно для
переноса в их клетки nif-генов [44, 45]. Во-вторых, развиваясь в тканях
растения-хозяина, они накапливают значительную биомассу и создают,
таким образом, благоприятные условия для тестирования экспрессии
ш'/-генов (и накопления связанного азота) . В-третьих, вирулентные
свойства этих бактерий легко и быстро тестируются в лабораторных и
полевых условиях на доступном растительном материале. Наконец,
в-четвертых, такой выбор открывает возможность использования ши-
рокого диапазона хозяйской специфичности.
Вид Е. aroideae относится к мягкогнилостной группе бактерий
«carotovora». Отличительной особенностью этого вида является выде-
230 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5·
ление значительного количества пектолитических ферментов и способ-
ность вызывать мацерацию паренхиматических тканей широкого круга
растений.
Вид Аг. beiicola является узкоспециализированным возбудителем
заболевания свеклы. Тип заболевания по внешним признакам похож
>на корончатый галл, но принципиально отличается от него: развитие
опухоли прогрессирует только в присутствии бактерий. Анатомическое
различие между корончатым галлом и опухолью, вызываемой ксантомо-
насом, состоит в том, что при корневом раке внутренняя ткань опухоли
твердая, а в наростах, вызываемых ксантомонасом, — рыхлая, внутри
ее имеются каверны, заполненные бактериями-возбудителями.
Избрав указанные виды бактерий в качестве реципиентов nif-ге-
нов, мы приступили к конструированию азотфиксирующих форм этих
бактерий. К началу работы были уже получены ш'/'-плазмиды, имеющие
в своем составе весь набор nif-генов Klebsiella pneumoniae, и показана
экспрессия этих генов у Е. colt [46], Salmonella typhimurium [47].
В своей работе мы использовали плазмиду с широким кругом хозяев
pRDl (Rfb Gnd His Nif Shi A Km Τ с Carb) [48], любезно предоставлен-
ную нам д-ром А. Кондороши (Венгрия).
Методом конъюгации илазмида была введена в реципиеитные виды
бактерий Е. aroideae и X. beiicola из Е. coli. Частота такого переноса
оказалась для разных объектов различной [49]. В одном случае (Е. aroi-
deae) частота переноса детерминантов устойчивости к антибиотикам,
кодируемым плазмидой, была высокой и совпадала с частотой перено-
са nif-генов. В другом случае (X. beiicola) такой корреляции не наблю-
далось. Некоторые примеры осуществленных переносов представлены в
табл. 1. Гены антибиотикоустойчивости, будучи переданными, стабиль-
но наследовались у всех исследуемых трансконъюгантов и выражались,
как правило, более эффективно, чем у донора [50].
Детальное исследование стабильных по А/7/-фенотипу клонов эр-
випии и ксантомонаса выявило некоторые особенности экспрессии ге-
Т а б л и ц а 1
Перенос маркеров pRDl из Е. coli К-12 JC54G6 в исследуемые бактерии
Transfer of pRDl markers from Ε. coli К-12 J Co 166 to bacteria studied
1 Частота перенос; i маркеров
Реципиент Селекция
Kmr -\-Tcr+ Carbr м у 1-
X. bcticola 7325 pro trp Kmr Tcr Carbr 3 , 4 - Ι Ο - 4 3 , 3 · 10—5
X. beticoia 8717 To же 1 , 0 - 1 0 — 4 1 , 3 - 1 0 - 5
Ε. aroideae 8634 » 2 , 5 . 1 ο - 1 9 , 3 . 1 0 ~ 2
Ε. aroideae 8947 » 1 , 0 - 1 0 — 1 1 ,0 .10 — 1
Ε. coli HB101 Smr Κηί Tcr 2 , 0 - 1 0 _ 1 2 ,0 -10 — 1
Т а б л и ц а 2
Ацетиленредуктазная активность трансконъюгантов
Acetylene reductase activity of transconjugants
Вид, штамм бактерий
Количество
этилена,
нмоль
Время, ч Количество
белка, мг
Ацетиленредуктазная
активность, нМ С2Н4/мг«ч
X. beticoia 8717.33 470-4-29 7 0 , 2 2 3 0 5 4 - 1 0
Χ. beticoia 8717.11 4 9 0 0 ± 5 5 7 0 , 2 2 3 1 8 0 ±37
Χ. beticoia 7325.10 5 6 7 ± 2 l 7 0 , 2 1 3 8 6 + 1 4
Ε. aroideae 8634.1 1 4 0 - И 9 7 0 , 1 3 1 5 3 + 1 0
Ξ. aroideae 8941.4 6 0 0 + 1 7 7 0 , 1 3 660 ± 2 1
Ε. coli Κ-12 JC5466 4 1 0 ± 4 9 0 , 1 0 5 8 0 ± 7
Κ. pneumoniae SK-24 4 7 5 8 + 2 7 9 0 , 1 7 3 1 1 0 + 4 8
231 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5·
нов азотфиксации в их клетках по сравнению с донорным штаммом
Е. coli IС5466 (pRDl) [51]. Во-первых, ацетилепредуктазная активность
этих клонов значительно превосходит по величине таковую донора
(табл. 2). Это может быть связано с тем, что у новых хозяев изменена
регуляция по сравнению с донорным штаммом, а также с хромосомной
локализацией ш'/-генов. Во-вторых, трансконыоганты эрвинии и ксаи-
томоиаса экспрессируют nif-геиы в аэробных условиях. При содержании
Р и с . 1. В л и я н и е к и с л о р о д а на а ц е т и л е н р е д у к т а з н у ю а к т и в н о с т ь X. beticola 8717.11: 1—•
а ц е т и л е п р е д у к т а з н а я а к т и в н о с т ь ; 2 — п о г л о щ е н и е к и с л о р о д а .
F i g . 1. T h e e f f e c t of o x y g e n o n t h e a c e t y l e n e r e d u c t a s e a c t i v i t y of A", beticola 8717.11:
/ — a c e t y l e n e r e d u c t a s e a c t i v i t y ; 2 — o x y g e n u p t a k e .
Р и с . 2. Д и с к и к л у б н е й к а р т о ф е л я , п о р а ж е н н ы е б а к т е р и я м и / : . aroideae. У ч е т ч е р е з с у т к и
п о с л е з а р а ж е н и я . 1 \ — - к о н т р о л ь н а я , н е и н ф и ц и р о в а н н а я т к а н ь .
F i g . 2. D i s k s of p o t a t o t u b e r s i n f e c t e d w i t h b a c t e r i a /; . aroideae. T h e a c c o u n t w a s t a k e n
?4 h М і с т i n f e c t i o n . К - c o n t r o l , u n i n f e c t e d t i s s u e .
кислорода в газовой фазе в количестве 15—16 % клетки сохраняют
15—20 % ацетиленредуктазной активности, достигаемой при оптимуме
0 2 (рис. 1). Это свидетельствует о наличии у них защиты нитрогеназы
от кислородной инактивации.
Таким образом, было установлено, что 'нет принципиальных запре-
тов на перенос ш/-генов в фитопатогенные бактерии.
3. Будет ли иметь место устойчивость МУ-фенотипа или выражение
генов азотфиксации окажется неустойчивым, а сам ш'/-кластер быстро
функционально инактивируется? Исследование экспрессии генов азот-
фиксации у трансконъюгантов ксантомонаса показало, что в результате
конъюгации сформировалось три типа производных: уУ//~-клоны, ста-
бильные клоны и нестабильные Nif·· -клоны [15]. Последние теряли
nif-геиы через три пассажа в неселективных условиях. Результаты
электрофореза в агарозиом геле плазмидной Д Н К и обратный перенос
плазмиды в Е. coli свидетельствуют о том, что в этих клонах произошла
сегрегация шУ+-нризнака (обычное явление для плазмиды pRDl в гесА
штаммах E coli [52]), следствием чего явилось образование плазмиды
меньшей молекулярной массы, утерявшей nif-геиы, но сохранившей де-
терминанты устойчивости к Km, Тс, Curb [49, 50].
Анализ Д Н К , изолированной из первичных клонов трансконъюган-
тов ксантомонаса (сохранивших при дальнейших пассажах в неселек-
тивных условиях МУ-фенотип), в геле агарозы с помощью электрофоре-
за показал присутствие в их клетках плазмиды, молекулярная масса
которой соответствует таковой плазмиды RP4 — исходной для констру-
ирования pRDl. Электронно-микроскопическое исследование плазмид-
ных препаратов этих клонов выявило совпадение молекулярных масс
исследуемой плазмиды и RP4, а рестрикция эндонуклеазами EcoRI и
В а т Н І — идентичность их сайтов рестрикции.
ίτ
2 3 2 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5·
Перенос плазмиды pRDl из Ε. coli в клетки эрвинии и ксантомо-
наса привел к изменению у них культ.урально-биохимических свойств.
Наиболее заметно выражено оно у трансконъюгантов ксантомонаса.
Особенно отличались в этом отношении стабильные Л7/+-формы. Введе-
ние плазмиды коррелировало у них с изменением морфологии клетки и
колоний, потерей характерного желтого пигмента па агарнзованных пи-
тательных средах, появлением признаков, характерных для до-
нора [ 15, 50].
Наблюдались изменения биохимических свойств у трансконъюган-
тов эрвинии под влиянием введения в их клетки плазмиды pRDl, од-
нако они не столь заметны, как у производных ксантомонаса [50, 53].
Таким образом, хотя перенос nif-генов и сопровождался рядом из-
менений у фитопатогеиных бактерий, тем не менее можно было полу-
чить устойчивые азотфиксирующие производные, стабильно сохраняю-
щие nif+-признак в песелективных условиях.
4. Сохранится ли способность искусственно полученных форм бак-
терий развиваться в растении в случае устойчивости Nif-фенотипа? Ис-
пользуя плазмиды в исследованиях для получения новых штаммов
бактерий с заданными свойствами, можно ожидать изменения не только
культурально-биохимических свойств, но и характера их взаимоотно-
шений с хозяином, если такие взаимоотношения им свойственны. В ли-
тературе описаны подобные случаи. Так, происходила потеря вирулент-
ности фитопатогенными бактериями после введения в их клетки
трапепозонов с помощью плазм ид Р 1 группы несовместимости [23]. От-
сутствовала онкогенная активность у A. ttunefaciens вследствие специ-
фического взаимодействия введенной в агробактерии pSa и резидент-
ной плазмиды Ті [54]. В наших работах введение pRDl в клетки ксанто-
монаса и эрвиний привело к изменению у этих бактерий вирулентности.
У небольшого процента трансконъюгантов ксантомонаса наблюдалась
утрата вирулентных свойств, причем она коррелировала со стабильным
Nif-феиотииом бактерий [15]. У нестабильных форм, а т а к ж е Nif-форм
ксантомонаса наблюдали повышение способности взаимодействия с
тканями свеклы. Это проявлялось в возрастании скорости распростра-
нения бактерий в тканях и увеличении размеров наростов на ткани
свеклы по сравнению с диким типом. Присутствие других плазмид Р1
группы несовместимости (RP4, R68.45) оказывает подобное влияние.
Возможно, усиление активности исследуемых бактерий в присутствии в
клетках плазмид Іпс Р1 группы связано с изменением компонентов кле-
точной мембраны, влекущим за собой изменение ее вязкости и повыше-
ние проницаемости. Последнее важно как для поступления в клетку
бактерий питательных веществ из растения-хозяина, так и для выхода
продуктов бактериального происхождения.
Введение плазмиды pRDl в клетки одного из штаммов эрвиний,
8947, сопровождалось резким возрастанием уровня синтеза пектоли-
тических ферментов, что приводило к усилению мацерации раститель-
ных тканей транскопъюгантамп в 2—3 раза [50, 53] (рис. 2) . Пекто-
литическая активность трансконъюгантов другого штамма эрвиний,
8634, была несколько ослаблена по сравнению с диким. Стабильные по
Nif-фенотипу производные эрвинии сохраняли вирулентные свойства
после 10 пассажей через ткань клубней картофеля и корня моркови. Не
терялись эти свойства и при хранении культур в музее на протяжении
пяти лет.
У авирулентных клонов трансконъюгантов ксантомонаса со ста-
бильной экспрессией /2//-генов после излечивания от плазмиды происхо-
дила реверсия вирулентности, однако активность ревертантов в отноше-
нии растения-хозяина значительно слабее, чем у дикого типа. При
пассировании излеченной от плазмиды Nif+-формы ксантомонаса в тка-
ни корнеплода свеклы в течение шести пассажей вирулентные свойства
бактерий сохранялись, а период между заражением ткани корнеплода
свеклы и появлением наростов на их поверхности сократился.
Таким образом, стабилизация Nif-фенотипа трансконъюгантов
7 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5·
ксантомонаса и эрвиний, 'происходящая за счет включения nif-генов в
хромосому, пе приводила к инактивации или потере генов вирулентно-
сти и, как следствие того, неспособности их взаимодействовать с рас-
тением-хозяином.
5 . Будет ли происходить полноценное функционирование nif-ге-
нов у трансконъюгантов при развитии их не на специальных средах, а в
растении? В качестве моделей для выяснения возможности полноцен-
ного функционирования nif-генов К. pneumoniae у сконструированных
гибридных форм бактерий в условиях их роста в ткани растения были
избраны клоны трансконъюгантов Е. aroideae и Лг. beticola со стабиль-
ным Af//-фенотипом. Экспрессию nif-генов у производных бактерий эр-
виний тестировали методом редукции ацетилена на дисках клубней
картофеля и корней редиса, моркови и редьки в микроэксикаторах
собственной конструкции [53]. Исследуемые бактерии инокулировали
па диски овощей и инкубировали сутки при оптимальной температуре
роста. После проявления инфекции диски растительного материала по-
мещали в микроэксикаторы и последние заполняли ацетиленовой
смесью. Этилен, образуемый при восстановлении ацетилена нитрогена-
зой бактерий и выделяемый растительными тканями эндогенно, реги-
стрировали методом газовой хроматографии. Количество эндогенного
этилена было небольшим: 0,4 нмоля С2Н4 на диск клубня картофеля
за 18 ч. В присутствии ацетилена исследуемые бактерии, развиваясь
ла ткани клубня картофеля, образовывали 7 9 7 + 1 2 нмолей С2Н4 т а
диск клубня картофеля за 18 ч. На безазотпой питательной среде в тех
же условиях эти бактерии выделяли 6 0 0 + 1 7 нмолей С2Н4 на флакон.
Таким образом, развиваясь в тканях растений, гибридные формы
эрвинии редуцируют ацетилен столь же активно, как и на специальной
питательной среде без азота. Этот вывод был подтвержден в испыта-
нии па ацетиленредукцию корней редиса, инфицированных Nif+ эрвини-
ями. Количество этилена, образуемого в камерах микроэксикаторов с
корнями редиса, составляло 1220+41 нмолей С2Н4 на один корень реди-
са при наличии следовых количеств эндогенного этилена в контрольных
камерах.
В такой же последовательности — сначала на дисках корнеплодов,
а затем па интактных растениях столовой свеклы — исследовали
экспрессию ш'/-генов у гибридных форм ксантомонаса. Д л я этой цели
использовали слабовирулентную Nif+-форму бактерий, излеченных от
оставшейся части плазмиды pRDl.
Как и в экспериментах с модельной системой эрвиния — клубни
картофеля, в системе ксантомонас — диск корнеплода свеклы в атмос-
фере ацетилена обнаружен этилен, по количеству в значительной ме-
ре превосходящий эндогенный.
Диски корнеплодов свеклы, простерилизованные этанолом и отмы-
тые стерильной водой, инфицировали суспензией клеток исследуемых
бактерий. После проявления инфекции ткани корнеплодов свеклы тести-
ровали на редукцию ацетилена, а затем из них изолировали бактерии
на селективной среде с налидиксовой кислотой (исследуемая стабиль-
ная по Nif-фенотипу форма ксантомонаса устойчива к последней) и
полноценной питательной среде без селекции (для выявления возмож-
ных ревертантов к дикому типу, отличающемуся характерной пигменти-
рованной морфологией колоний). Выборку клонов-изолятов использо-
вали для определения Nif-фенотипа и повторного заражения свежих
дисков корнеплодов свеклы (второй пассаж и т. д.).
В контрольных экспериментах исследовали обеззараженные ука-
занным выше способом диски корнеплода на бактериальную обсеменен-
ность, а также проводили изоляцию бактерий на полноценной питатель-
ной среде из дисков, инокулированных культурой Е. coli НВ101. В пер-
вом случае бактерии в ткани не были обнаружены, во втором — изоли-
ровались бактерии с характерной для кишечной палочки морфологией
колоний и клеток, не редуцирующие ацетилен, авир.улентные по отно-
шению к тканям корнеплода свеклы.
8 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5·
В каждой из трех серий экспериментов (2,5—3 месяца) в 1—5 пас-
сажах через растения наблюдали высокую ацетиленредуктазную ак-
тивность тканей свеклы (табл. 3). Бактерии, изолированные в селектив-
ных условиях из дисков свеклы, имели iWy-фенотип практически у
100 % выборки клонов. В шестом пассаже обнаружен этилен в тканях,
по количеству соответствующий эндогенному. Клоны-изоляты в этом
случае имели фенотип и проявляли вирулентные свойства. Nif--
изоляты ксантомонаса были хорошими реципиентами pRDl, которая
переходила в их клетки из Е. coli (pRDl) с частотой 2-10~2. Ацетилен-
редуктазную активность проявляли 89,5 % клонов трансконъюгантов.
Это свидетельствует о том, что в клетках трансконъюгантов есть ус-
ловия для экспрессии nif-генов, и, таким образом, не изменения в
системе общей азотной регуляции (ntr) являются следствием отсут-
ствия Nif-фенотипа у 6-кратно пассированных в ткани корнеплода свек-
лы производных ксантомонаса. Причина потери iWf-феиотипа бактерий
в растительных тканях через пять пассажей будет установлена в даль-
нейших экспериментах.
Т а б л и ц а 3
Ацетиленредуктазная активность X. beticola 8717.11 в условиях развития в ткани
корнеплода свеклы
Acetylene reductase activity of X. beticola 8717.11 under growth conditions in beet root
tissue
№ пассажа
Количество клеток на
1 мг ткани
Количество этилена,
нмоль
Удельное количество
этилена, нМ/г сырого
веса ткани-ч
1 7 - Ю 8 379 2100
2 4 -Ю 8 375 2083
3 М О 8 264 1466
4 2-Ю 7 256 1422
5 3 -Ю 6 236 1311
6 4 - Ю 6 0 ,12 6
В отношении интактных растений свеклы исследуемые бактерии
ксантомонаса Nif+ проявляли слабую активность, поэтому их исполь-
зовали в смеси с клетками ксантомонаса Nif~ с высокой активностью
в растительных тканях в соотношении 1 : 2 и 1 : 5 . Используя смесь
клеток, мы преследовали две цели: изучали экспрессию nif-тенов
трансконъюгантов ксантомонаса при развитии их в растении; исследо-
вали конкурентоспособность Nif+- и А/7[~-форм ксантомонаса в ткани
растения.
Наросты на тканях корнеплодов свеклы, образуемые смесью кле-
ток ксантомонаса, тестировали >на ацетиленредуктазную активность.
Количество этилена, образуемого исследуемыми бактериями в атмосфе-
ре ацетилена (101 =4= 12 нмолей С2Н4 /г сырого веса ткани за 1 ч) , значи-
тельно выше выделяемого тканями свеклы и бактериями эндогенно
(6 нмолей С2Н4 /г сырого веса ткани за 1 ч). Ацетиленредуктазную ак-
тивность наросты тканей корнеплодов свеклы сохраняли на протяжении
почти всего вегетационного периода свеклы (около 4 месяцев). После
четырех месяцев инкубирования смеси Nif+- и Nif--форм ксантомонаса
указанная активность у изолированных в селективных условиях бакте-
рий не была обнаружена.
Таким образом, экспериментально показано, что nif-тены К. pneu-
moniae активны у трансконъюгантов Е. aroideae и X. beticola при раз-
витии их в растении-хозяине, а у производных ксантомонаса стабильно
поддерживаются клетками на протяжении длительного периода инкуби-
рования их in plant а, фактически равного вегетационному.
6. Будет ли устойчива популяция Nif+-производных в растениях?
Проблема сохранения гибридных Nif+-форм бактерий в естественной
среде обитания содержит две основные трудности: 1) вытеснение их
более конкурентоспособными дикими формами; 2) реверсию к дикому
235 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5·
Nif~-типу, имеющему селективное преимущество перед Nif+-формами..
Нам предстояло решить, какова ситуация сохранения стабильности
Nif-фенотииа производных ксантомонаса и эрвиний в растительных
тканях, а также определить, являются ли Nif+ -формы бактерий конку-
рентоспособными с дикой формой.
В отношении неспециализированных бактерий Е. aroideae с широ-
ким кругом хозяев выяснено, что в лабораторных условиях на тканях
овощных культур в течение двух суток Nif-фенотпп сохраняли от 40 до
70 % клеток [53]. В экспериментах, выполненных в открытом грунте на
интактных растениях (редис), показано, что практически все клетки,
изолированные из пораженной ткани на полноценной питательной среде
через 7 сут после проявления инфекции, имели Nif-фенотип; через
30 сут — к ρ о А4 е Nif+-форм эрвиний, выделялись также бактерии, про-
никающие в места поражения ткани из почвы; последние отличались
от эрвиний по морфологии колоний, не обладали вирулентными свой-
ствами и имели А7/~-фенотип. Количественно NifJr и Nif~ бактерии бы-
ли представлены как 1 0 : 1 .
Таким образом, Nif+-производные Е. aroideae занимают свободную
экологическую пишу па корнях редиса, развиваясь в его ткани, и со-
храняют Nif-фенотпп, однако подвергая мацерации паренхиму расте-
ния-хозяина, создают благоприятные условия для заселения некротизи-
рованной ткани сапрофитными бактериями из почвы.
X. beiicola — узкоспециализированные бактерии и развиваются
только в ткани корнеплода свеклы, занимая свою экологическую нишу.
Поэтому вероятность сохранения гибридных Л7/+-форм этих бактерий
в ткани растения больше, чем в случае эрвиний. Однако не исключе-
на возможность их реверсии к дикому типу и вытеснения более при-
способленными ревертантами.
В лабораторных условиях при пассировании Nif+-производных
ксантомонаса в ткани дисков корнеплодов свеклы обнаружено появле-
ние ревертантов среди изолятов из инфицированной ткани свеклы по-
сле 1—2 пассажей через ткань с частотой 1 клетка на 200 клеток с
Nif-фенотипом. На протяжении четырех пассажей количество ревертан-
тов возрастало до соотношения 1 : 10 и в дальнейших пассажах не из-
менялось. Несмотря на сокращение количества Nif+-клеток ксантомо-
наса, ацетиленредуктазная активность тканей корнеплода свеклы из-
менялась незначительно (табл. 3).
В экспериментах на интактных растениях исследовали возможность
вытеснения Nif+-форм ксантомонаса дикой формой или ее производны-
ми, содержащими плазмиду R68.45 (в последнем случае исследовали
еще и динамику распространения плазмиды при конъюгации бактерий
in plania). Д л я этих целей использовали инокуляционные смеси бакте-
рий, как указывалось выше. В течение трех месяцев (май—июнь) ис-
ходное соотношение клеток исследуемых культур сохранялось (провер-
ки производили через каждые 14 дней), а в некоторых случаях наблю-
дали тенденцию к увеличению количества Nif+-клеток в корнеплодах
свеклы. Через четыре месяца после инокуляции растений смесью куль-
тур изолировали лишь производные ксантомонаса, утратившие Nif-фе-
нотип. Это было выявлено в тех экспериментах, где исследовали смесь
Nif+-формы ксантомонаса с производными, имеющими плазмиду R68.45.
100 % изолированных клеток имели Nif-Km rТс г-фенотип, т. е. все клет-
ки Nif+-формы ксантомонаса получили плазмиду R68.45 в результате
конъюгации in plania. Возможно, это и явилось причиной потери Nif-
фенотипа, так как в лабораторных условиях была получена репрессия
nif-генов при введении в клетки ксантомонаса R68.45 традиционными
методами конъюгации.
Таким образом, модельные эксперименты по выяснению возможно-
сти функционирования ш'/-генов К. pneumoniae, а также их генетиче-
ской стабильности у гибридных форм бактерий Е. aroideae и X. beiicola
в условиях развития последних в тканях растения-хозяина, т. е. прибли-
женных к естественным, показали, что у этих гибридов наблюдается
236 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5·
экспрессия nif-генов при развитии in planter, nif-геиы наследуются при
этом на протяжении длительного периода времени; гибридные формы
эрвиний и ксантомонаса занимают соответствующую экологическую
інишу на хозяйском растении; при развитии in planta Nif+-формы ксан-
томонаса успешно конкурируют с Nif- -формами.
В результате проведенной работы экспериментально обосновано
теоретически сформулированное нами ранее новое направление —
создание не существовавших ранее азотфиксирующих организмов, спо-
собных развиваться в небобовых растениях и усваивать при этом сво-
бодный азот атмосферы. Эта работа позволила уточнить выполнимость
тех обязательных требований к новым азотфиксаторам, без которых
выбранный путь не мог бы выйти за пределы только теоретических
изысканий, а также указать на те методические подходы, которые для
этого необходимо использовать.
Первое по значимости требование сводится к устойчивости Nif-фе-
нотипа, так как в противном случае вся работа остановится иа первом
же этапе. Ему полностью удовлетворяет получение форм, у которых
nif-геиы транспозированы в хромосому. Д л я этого очень удачной ока-
залась плазмида pRDl.
Второе требование сводится к обязательной конкурентоспособности
получаемых азотфиксирующих производных по отношению к диким ана-
логичным видам. Невыполнение этого требования в свое время явилось
причиной невозможности использования многих бактериальных удобре-
ний. В проведенных работах было показано, что стабильные по Nif-фе-
нотипу формы ксантомонаса успешно конкурировали с дикой формой в
растительной ткани и в этом случае на протяжении почти всего вегета-
ционного периода вытеснения не происходило — в растении длительно
существовала равновесная популяция.
Третье требование диктует необходимость высокого уровня азот-
фиксации у получаемых форм не только на питательных средах, но и
в растении. Прямые замеры ацетиленредукции показали, что искус-
ственные производные фитопатогенных бактерий и в чистой культуре,
и при инокуляции растений по данному показателю количественно пре-
восходят донорные штаммы.
Наконец, четвертое требование касается проблемы кислородной за-
щиты. Д л я искусственно получаемых азотфиксаторов предпочтительно
найти такое решение, при котором сами бактерии берут на себя защиту
нитрогеназы от кислорода. Оказалось, что по крайней мере некоторые
бактерии, развивающиеся в растениях, потенциально несут такую функ-
цию. И хотя до получения нового класса азотфиксаторов практической
значимости предстоит еще большой и нелегкий путь, проведенная ра-
бота показывает его принципиальную выполнимость.
THE THEORETICAL BASIS AND EXPERIMENTAL CONSTRUCTION
OF NEW-TYPE NITROGEN FIXERS ABLE TO GROW
AND FIX THE A T M O S P H E R I C NITROGEN IN N O N L E G U M E S
V. A. Kordyum, N. A. Kozyrovskaya, Ν. V. Gunkovskaya
Ins t i tu te of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
A new trend in the biological n i t rogen fixation, the construct ion of the n i t rogen-f ix ing
derivatives of bacteria able to grow in nonlegumes has been theoret ical ly and experimen-
tal ly substant ia ted .
1. Stewart W. D. P. Ni t rogen f ixation — its current relevance and fu tu re p o t e n t i a l / /
Isr. J. Bot. — 1983.—32, N 1. — P. 5—44.
2. Баев Α. Α., Злотников К. Μ. Биологическая фиксация азота и генетическая инжене-
рия / / Биотехнология. — М. : Наука, 1984. — С. 217—223.
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 3 — 6-535 237
3. Paul Ε. A. Contribution of nitrogen fixation to ecosystem functioning and nitrogen
flixes on a globas b a s i s / / E c o l . Bull. — 1978. — N 26. — P. 282—293.
4. Кордюм В. А. Биологическая азотфиксация. Проблемы и перспективы//'Молеку-
ляр. биология. — 1982. — Вып. 30. — С. 45—57.
5. Ela S. W., Anderson Μ. Α., Brill W. J. Screening and selection of maize to enhance
associative bacterial nitrogen f i x a t i o n / / P l a n t Physiol. — 1982.—70, N 5. — P. 1564—
1567.
6. Jyama S., Sano Y., Fujii T. Diallel analysis of nitrogen fixation in the rhizosphere or
rice / ' / P l a n t Sci. Lett. — 1983.—30, N 2. — P. 129—135.
7. Balandreau J. Microbiology of the association / / Can. J. Microbiol. — 1983.—29, N 8.—
P. 851—859..
8. Vose P. B. Developments in nonlegume N2-fixing systems / / Ibid. — P. 837—850.
9. Ishac Υ. Z., El-Borollosy Μ. Α., Refaat A. A. Nitrogen fixing microorganisms in the
phyllosphere of some crop plants in E g y p t / / S o i l Biol, and Conserv. Biosphere.—
1984.—2. — P . 541—553.
10. Schroth Μ. N., Hancock J. G. Disease-suppressive soil and root-colonizing bacteria / /
Science. — 1982.—216, N 4553. — P. 1376—1381.
11. Klingmilller W. Genetic engineering for practical appl icat ion/ /Naturwissenschaften.—
1979. — N 66. — P . 182—189.
12. Kleeberger Α., Klingmilller W. Plasmid-mediated transfer of nitrogen-fixing capability
to bacteria from the rhizosphere of g r a s s e s / / М о ї . and Gen. Genet. — 1980.—180,
N 3. — P . 621—627.
13. Chen /., Ye Ζ. Transfer and expression of Klebsiella nif genes in Alcaligenes faecalis,
a nitrogen-fixing bacterium associated with rice r o o t / / P l a s m i d . — 1983.—10, N 3.—
P. 290—292.
14. Patriquin D. G., Dobereiner J., Lain D. К. Sites and processes of association between
diazotrophs and g ras ses / ' /Can . J. Microbiol. — 1983.—29, N 8. — P. 900—915.
15. Перенос маркеров плазмиды pRDl в Xanthomonas beticoia//В. А. Кордюм, Η. Α. Κο-
зыровская, Р. И. Гвоздяк, В. А. М у р а с / / Д о к л . АН УССР. — Сер. Б. — 1980. —
№ 5. — С. 82—85.
16. Rhizobium meliloti nodulation genes allow Agrobacterium tumefaciens and Escheri-
chia coli to form pseudonodules on alfalfa / A. M. Hirsh, K. J. Wilson, J. D. G. Jones
et a l . / / J . BacterioL— 1984.—158, N 3. — P. 1133—1143.
17. Heat curing of a Sym plasmid in a fast-growing Rhizobium sp. that is able to nodu-
late legumes and nonlegume Parasponia sp. / N. A. Morrison, Y. Ha Ceh, M. J. Trinick
et al. I f Ibid. — 1983.—153, N 1. — P. 527—531.
18. Silver W. S., Centifanto G. M., Nicolas D. J. D. Nitrogen fixation by the leaf-nodu-
le endophyte of Psychotria bacteriophyta// Nature. — 1963.—199, N 4675. — P. 396—
397.
19. Taboada J., Herrera T. Effecto de aminoacidos sorbe la fijacion de nitrogeno por
Agrobacterium azotophilum / ' / An. Inst. biol. Univ. nac. auton. Мех. Ser.-Biol. exp.—
1972.—43, N 1. — P . 35—42.
20. Papen ΗWerner D. N2-fixation in Erwinia herbicola / / Arch. Microbiol. — 1979.—
120, N 1. — P . 25—30.
21. Serological and immunoelectrophoretical relationships between Rhizobium and Agro-
bacterium strains / M. A. Abd-El-Rehim, A. S. Abdel-Ghaffar, F. Kreaman, W. N. Gob-
tial / / Egypt. J. Soil Sci. — 1975. — Spec, issue. — P. 471—476.
22. Perombelon M. С. M., Boucher C. Developing a mating system in Erwinia carotovo-
ra / / P r o c . 4th int. conf. plant pathog. bact. — Angers, 1978.—V. 1. — P . 47—52.
23. Boistard P., Boucher C. PI group plasmids as tool for genetic study of phytopathoge-
nic bacteria / / ' Ibid. — P. 17—30.
24. Zaenen J., van Zarebeke N., Teuchy H. Supercoiled circular DNA in crown-gall induc-
ing Agrobacterium strains / / J . Мої. Biol. — 1974.—86, N 1. — P . 109—127.
25. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of
crown-gall tumor igenes i s /М. D. Chilton, Μ. H. Drummond, D. J. Merlo et a l . / /
Cell.— 1979. — N 11. — P . 263—271.
26. Chatterjee Α., Starr M. Erwinia spp. and other Enterobacteriaceae carried on R fac-
tors / / J . BacterioL — 1972.—112, N 3. — P. 576—578.
27. Coplin D. L.} Rowan R. C. Conjugative plasmids in Erwinia stuwartii / / ' Proc. 4th int.
conf. plant pathg. bact. — Angers, 1978. —V. 1. — P . 67—73.
28. Sparks R. В., Lacy G. H. Purification and characterization of cryptic plasmids pLSl
and pLS2 from Erwinia chrysanthemi / / Phytopathology. — 1980.—70, N 5. — P. 369—
372.
29. Неборачко Л. Η., Евоздяк Р. П., Кордюм В. А. Экспрессия гетерологичных плазмид
в Erwinia carotovora / / ' Докл. АН СССР. — 1982.—264, № 5. — С. 1242—1245.
30. Haas D., Holloway В. W. R-factor variants with enhanced sex factor activity in Pse-
udomonas aeruginosa / / Мої. and Gen. Genet. — 1976.—144, N 3. — P. 243—248.
31. Hendrick C. Α., Haskins W. P., Vidaver A. K. Conjugative plasmid in Corynebacterium
flaccumfaciens subsp. oortii that confers resistance to arsenite, arsenate and antimo-
ny (III) / / A p p l . and Environ. Microbiol. — 1984.—48, N 1. — P . 56—60.
32. Transfer, mapping and cloning of Pseudomonas syringae pv. syringae plasmid pCG131
and assessement of its role in virulence / C. F. Gonzales, S. K. Layfer, A. K. Vidaver,
R. H. Olsen / /Phy topa tho logy .— 1984.—74, N 10. — P . 1245—1250.
33. Construction of a genomic library of Erwinia chrysanthemi and molecular cloning of
cellulase g e n e / F . Barras, Μ. H. Boyer, J. P. Chambost et a l . / / 'Mol . and Gen. Ge-
net. — 1984.—197, N 3. — P. 513—515.
34. Molecular cloning of pectate lyase genes from Erwinia chrysanthemi and their ex-
238 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5·
pression in Escherichia coli/ N. T. Keen, D. Dahlbeok, B. Staskawice ct a l . / / J . B a o
teriol. — 1984.—159, N 3. — P. 825—831.
35. Molecular cloning in Escherichia coli of Erwinia chrysanthemi genes encoding multip-
le forms of pectate lyase / A. Collmer, C. Shoedel, D. L. Roeder et al. / / Ibid. — 1985.—
161, N 3. — P . 913—920.
36. Van Gysegem FToussaint Α., Schoonejans E. In vivo cloning of the pectate lyase
and cellulase genes of Erwinia chrysanthemi / / The EMBO J . — 1985.—4, N 3 —
P. 787—792.
37. Molecular cloning of Erwinia chrysanthemi pectinase and cellulase structural genes /
A. Hotoujansky, A. Diolez, M. Boccara et al. / / Ibid. — P. 781—785.
38. Cloning of the pectate lyase genes from Erwinia carotouora and their expression in
Escherichia coli / S.-P. Lei, H.-C. Lin, L. Hoffernan et a l . / / G e n e . — 1985.—35, N 1 —
2. — P. 63—70.
39. Link R. Т., Chatterjee A. K. Cloning and expression in Escherichia coli of pectinase
gene of Erwinia carotovora subsp. carotouora / / ' Appl. and Environ. Microbiol.— 1985.—
49, N 3. — P . 714—717.
40. Reverchon S., Hugouvieux-Cotte-Pattat N., Robert-Bandoy J. Cloning of genes en-
coding pectolytic enzymes from a genomic library of the phytopathogenic bacterium
Erwinia chrysanthemi !/ Gene. — 1985.—35, N 1—2.— P. 121—130.
41. Cloning of genes involved in pathogenecity of Xanlhomotias campestris pv. campestris
using the broad host range cosmid pLAFRl / М . J. Daniels, С. E. Barber, P. C. Tur-
ner et al. / / The EMBO J. — 1984.—3, N 13. — P. 3323—3328.
42. Turner P., Barber C., Daniels M. Evidence for clastered pathogenecity genes in Xan-
thomotias campestris pv. campestris / / ' Мої. and Gen. Genet .— 1985.—199, N 2.—
P. 338—344.
43. Ehrenshaft M., Mills D. Construction of a cosmid clone library of Pseudomonas syrin-
gae pv. phaseolicola and isolation of genes by functional complementa t ion/ ' /Appl .
and Environ. Microbiol. — 1985.—50, N 1. — P . 169—171.
44. Лобанок Т. Ε., Песнякевич А. Г., Фомиче в Ю. К. Восприятие и передача плазмиды
Rts бактериями рода Erwinia / / Генетика.— 1979.—15, № 10. — С. 1739—1745.
45. Mingtan L., Panopoulos N. J., Shaffer S. Transmission of R plasmids among Xan-
thomonas spp. and other plant pathogenic bacteria / / Phytopathology. — 1977.—67,
N 8. — P . 1044—1050.
46. Cannon F. C., Dixon R. Α., Postgate J. R. Derivation and properties of F-prime fac-
tors in Escherichia coli carrying nitrogen fixation genes from Klebsiella pneumoniae //
J. Gen. Microbiol.— 1976.—93, N 1. — P . 111 — 125.
47. Postgate J. R., Krishnapillai V. Expression of Klebsiella nif and his genes in Salmo-
nella typhimurium / / ' Ibid. — 1977.—98, N 2. — P. 379—385.
48. Dixon R. Α., Cannon F. C., Kondorosi A. Construction of P-plasmid carrying nitrogen
fixation genes from Klebsiella pneumoniae / / Nature. — 1976.—260, N 5548. — P. 268—
271.
49. Козыровская Η. Α., Кордюм В. А. Влияние плазмиды pRDl на свойства фитопато-
генных бактерий/ /Молекуляр . генетика, микробиология и вирусология.— 1983.—
№ 5. — С. 35—38.
50. Changes in properties of phytopathogenic bacteria affected by plasmid pRDl /
N. A. Kozyrovskava, R. I. Gvozdyak, V. A. Muras, V. A. K o r d y u m / / A r c h . Mikrobi-
ol. — 1984.—137, N 4. — P. 338—343.
51. Кордюм Β. Α., Козыровская Η. А. Особенности экспрессии генов азотфиксации (nif)
у эксконъюганта Xanthomonas beticola / ' / Рекомбинантные плазмиды: Тез. докл. все-
союз. конф. — Пущино, 1982. — С. 67.
52. Spontaneous degradation of pRDl DNA into unique size classes is rec A dependent /
A. Piihler, H. J. Burckhardt, F. C. Cannon, W. W o h l e b e n / / М о ї . and Gen. Genet .—
1979,—171, N 1. — P . 1—6.
53. Придание способности фиксировать азот атмосферы бактериям Erwinia aroideae /
B. А. Кордюм, Н. А. Козыровская, Р. И. Гвоздяк, С. Ф. Х о д о с / / Д о к л . АН СССР.—
1983.—271, № 1. —С. 206—210.
54. Far г and S. К., Kado С. J., Ireland С. R. Suppression of tumorgenicity by Inc WR
plasmid pSa in Agrobacterium tumefaciens // Мої. and Gen. Genet .— 1981.—181,
N 1. — P . 44—51,
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР Получено 17.01.86
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1986, т. 2, Кя 5 2 3 9
|