Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности
Приведено теоретическое обоснование методики эксперимента для определения электрофоретической подвижности при помощи изотахофореза при постоянном напряжении. Способ измерения основан на зависимости скорости границы терминатор–лидер в случае ИТФ при постоянном напряжении от параметров терминатора, в...
Gespeichert in:
| Datum: | 1986 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1986
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152969 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности / М.Ю. Жуков, Л.Е. Король // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 256-261. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-152969 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1529692019-07-02T19:06:35Z Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности Жуков, М.Ю. Король, Л.Е. Структура и функции биополимеров Приведено теоретическое обоснование методики эксперимента для определения электрофоретической подвижности при помощи изотахофореза при постоянном напряжении. Способ измерения основан на зависимости скорости границы терминатор–лидер в случае ИТФ при постоянном напряжении от параметров терминатора, в качестве которого выступает исследуемое вещество. Приведено теоретичне обгрунтування методики експерименту для визначення електрофоретичної рухливості за допомогою ізотахофорезу (ІТФ) за постійної напруги. Спосіб вимірювання заснований на залежності швидкості кордону термінатор-лідер у разі ІТФ за постійної напруги від параметрів термінатора, яким слугує досліджувана речовина. The simple experimental procedure which permits determining the dependence of electro-phoretic mobility of substances on pH of the solution is described. The absence of experimental data on such dependences considerably delays the progress of electrophoretic methods and their use for analyzing separating biopolymers. 1986 Article Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности / М.Ю. Жуков, Л.Е. Король // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 256-261. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001BF http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152969 517.9:532:536.7 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Жуков, М.Ю. Король, Л.Е. Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности Биополимеры и клетка |
| description |
Приведено теоретическое обоснование методики эксперимента для определения электрофоретической подвижности при помощи изотахофореза при постоянном напряжении. Способ измерения основан на зависимости скорости границы терминатор–лидер в случае ИТФ при постоянном напряжении от параметров терминатора, в качестве которого выступает исследуемое вещество. |
| format |
Article |
| author |
Жуков, М.Ю. Король, Л.Е. |
| author_facet |
Жуков, М.Ю. Король, Л.Е. |
| author_sort |
Жуков, М.Ю. |
| title |
Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности |
| title_short |
Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности |
| title_full |
Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности |
| title_fullStr |
Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности |
| title_full_unstemmed |
Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности |
| title_sort |
использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1986 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152969 |
| citation_txt |
Использование изотахофореза при постоянном напряжении для определения подвижности / М.Ю. Жуков, Л.Е. Король // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 256-261. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT žukovmû ispolʹzovanieizotahoforezapripostoânnomnaprâženiidlâopredeleniâpodvižnosti AT korolʹle ispolʹzovanieizotahoforezapripostoânnomnaprâženiidlâopredeleniâpodvižnosti |
| first_indexed |
2025-07-14T04:41:44Z |
| last_indexed |
2025-07-14T04:41:44Z |
| _version_ |
1837595995265826816 |
| fulltext |
1. Аболина Т. А. Микроэлектрофорез как метод изучения поверхностной структуры бак-
териальных клеток / / Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.— 1980.—
№ 4. — С . 21—27.
2. Духин С. С., Дерягин Б. В. Электрофорез. — М . : Наука, 1976.—332 с.
3. Троицкий Г. В. Электрофорез белков. — Харьков : Вища шк., 1962.—319 с.
4. Ramsey S. W., Nowtand Ε. D., Simpson L. B. Resolution of microbial mixtures by
free-flow elec t rophores is / ' /Eur . J. Appl. Microbiol, and Biotechnol. — 1982. — N 9.—
P. 217—226.
5. Разделение клеточных суспензий/А. И. Мирошников, В. М. Фомченков, И. С. Габу-
ев, В. А. Чеканов. — М . : Наука, 1977.—367 с.
6. Hantiig К. New aspects in preparative and analytical continuous free-flow electropho-
resis / / Electrophoresis. — 1982.—3, N 2. — P. 235—243.
7. Силис Я. Я-, Кофман Α. Μ., Розенблит Α. Б. Первичная обработка хроматограмм и
спектров на ЭВМ. Принципы. Алгоритмы. Программы. — Рига : Зинатне, 1980.—128 с.
8. Хемминг Р. В. Цифровые фильтры. — М. : Радио и связь, 1980.—224 с.
9. Мазаное A. JI. Гаврюшкин А. В. Методы математической обработки эксперименталь-
ных данных электрофореза в свободном потоке. Анализ распределения материала по
сечению проточной камеры / /Молекуляр . биология.— 1984. — Вып. 36. — С. 34—43.
ВНИИ прикл. микробиологии Получено 21.10.85
Главмикробиопрома при СМ СССР,
Оболенск Московской области
УДК 517.9:532:536.7
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИЗОТАХОФОРЕЗА
ПРИ ПОСТОЯННОМ НАПРЯЖЕНИИ
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ
М. Ю. Жуков, Л. Е. Король
Электрофоретическая подвижность является важной характеристикой
молекул, в том числе биополимеров, а ее измерение требует приме-
нения специальных аналитических методов.
В работе [1] содержится описание способа измерения подвижности
ионов электролита при помощи видоизмененного метода изотахофореза
(ИТФ) в смеси лидер — терминатор. Основная идея предлагаемого
способа измерения заключается в изменении режима проведения
ИТФ — в электрофоретической камере поддерживается постоянная раз-
ность потенциалов на электродах, а не постоянная плотность тока.
Это приводит к тому, что скорость движения границы между лидером
и терминатором, зависящая в режиме с постоянной плотностью тока
лишь от физико-химических параметров лидера, определяется пара-
метрами как лидера, так и терминатора. В конечном итоге в случае
стандартного лидера имеется возможность определения подвижности
ионов терминатора на основе измерения времени движения границы зон.
К сожалению, при выводе расчетных формул в работе [1] допу-
щены серьезные ошибки — игнорировано регулирующее соотношение
Кольрауша, что привело к неправильному определению значений рН,
для которых измерены электрофоретические подвижности; не учтено
падение напряжения на участках электрод — датчик регистрации гра-
ниц зон (термопара), что, по-видимому, привело к внесению система-
тических погрешностей при определении величины электрофоретиче-
ской подвижности.
Ниже излагается исправленная методика измерения подвижности
ионов слабых электролитов, основанная на теории ИТФ, детально раз-
работанной для стационарного случая в работах [2, 3] и для нестацио-
нарного — в [4—6].
Т е о р и я И Т Ф д л я р е ж и м а с п о с т о я н н ы м н а п р я ж е -
н и е м . Рассмотрим электрофоретическую камеру, заполненную раство-
ром двух слабых кислот и одного слабого основания. Схематический
вид камеры и начальное распределение концентраций кислот и осно-
256 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, Λ1> 5
ваний в момент времени t=0 показаны іна рисунке, а. В точках х=0
и χ = ι расположены электроды, а в точках х=х0 и х = 1о — датчики,
регистрирующие границы зон (например, термопары). В области
< х 0 находится терминатор (Г)-электролит, состоящий из слабой кисло-
ты НАТ с концентрацией ат и слабого основания В с концентрацией
Ьт . В области Хо<х находится лидер (L)-электролит, состоящий из сла-
бой кислоты НАЬ с концентрацией aL и слабого основания В с кон-
Расположение зон в электрофоретической камере.
Zone distribution in electrophoretic chamber.
центрацией bL. Ионы слабого основания H+B выполняют роль проти-
воиона.
В соответствии с [1J введем электрофоретические подвижности пгт И
mL слабых кислот НАТ и HAL
(1)
(2)
Здесь Η — концентрация иона водорода ат(Н), aL(H)—степени дис-
социации кислот НАТ и HAl уТУ yL — подвижности ионов Αψ и Α~Ζ
(кислотных остатков); Кт и/Cl—константы диссоциации кислот НАТ и Η Ас
Электрофоретическая подвижность характеризует скорость движе-
ния в электрическом поле комплекса нейтральная молекула — ион
кислоты, возникающего в результате быстрых химических реакций, и,
естественно, зависит от рН раствора (рН = —lg Я ) .
Потребуем выполнения условия, при котором лидер перемещается в
электрическом поле быстрее терминатора
mL(H)>mT(H). (3)
Тогда в процессе движения под действием электрического поля в элект-
рофоретической камере возникают три зоны электролитов (рисунок, б).
Зона Т, расположенная в интервале О ^ л ' С х о — терминатор с преж-
ним составом и концентрациями; зона L, расположенная в интервале
x(t) <Сх^1 — лидер с прежним составом и концентрациями; зона 5,
расположенная в интервале x0<Cx<.x(t) ·—электролит, имеющий такой
же состав, как и терминатор, но с иными концентрациями компонент,
т. е. электролит, состоящий из слабой кислоты НАт с концентрацией as
и слабого основания В с концентрацией bS- Граница между зонами 5
и L движется по закону x = x(t) со скоростью v.
Концентрации as, bs, скорость движения границы υ и напряжен-
ности электрического поля Ету Es, EL (рисунок, б) определяются зако-
нами сохранения массы, заряда и условием электронейтральности
[3, 6]. В случае, когда концентрации компонент смеси достаточно велики
по сравнению с концентрацией ионов водорода (на практике это усло-
257 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, Λ1> 5
где
Начальное условие для (11), означающее, что в момент t = 0 граница
x=zx(t) находится В точке Х = Хо, имеет вид
258 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5
Здесь у в — подвижность ионов слабого основания Н+В; / — плотность
электрического тока; F -— число Фарадея; HTi # s , HL — концентрации
ионов водорода в зонах Г, 5, L соответственно.
Формула (4) представляет собой хорошо известное регулирующее
соотношение Кольрауша [2—6]; (5) — аналог соотношения Кольрауша
для противоиона [6]; (6) — известное в теории ИТФ выражение для
скорости движущейся границы [2—6]; (7) — отражают тот факт, что
вещества слева и справа от границы χ = χ ( ί ) движутся с одинаковой
скоростью. Формула (8) ІНЄ встречается в стационарной теории ИТФ
[2, 3], рассматривающей финальные стадии процесса. Ее аналоги име-
ются в [4—6], где впервые отмечено наличие неподвижной границы со
скачками концентрации терминатора.
Концентрации ионов водорода Нт, HSy HL (или р Н = — l g # ) для
электролита слабая кислота—слабое основание определяются усло-
вием электронейтральности [7].
где Ав — константа диссоциации основания п.
Разность потенциалов ( — U ) иа электродах х=0, х=1 определя-
ется соотношением (рисунок, б)
В обычном режиме И1Ф — режиме с постоянной плотностью тока
(у = c o n s t ) — г р а н и ц а χ = χ ( ί ) движется с постоянной скоростью υ =
= const, задаваемой соотношением (6). Закон движения имеет вид
x(t)=Xo-\-vt. Формула (10) в этом случае определяет зависимость
разности потенциалов от времени U=U(t).
В видоизмененном методе ИТФ — режиме с постоянной разностью
потенциалов (U=const)—граница χ = χ ( ί ) движется с переменной
скоростью. В этом случае формула (10) определяет закон движения
границы. Действительно, подставляя (7) и (8) в (10), с учетом ν = χ ,
получим дифференциальное уравнение
Таким образом, электрофоретическая подвижность т т при ρΗ τ =
= pHs = ρΚτ + рКв определяется разностью потенциалов [/, расстояни-
ем между датчиками /, временем прохождения границы зоны от одного
датчика к другому U и величиной mL. Значения U, /, t0 могут быть лег-
ко измерены, а значение mL определяется параметрами лидера, в ка-
честве которого следует выбирать стандартный электролит с извест-
ными свойствами. Изменение величины pHT = pH s для построения за-
висимости тт = тт(рНт) достигается путем проведения экспериментов
с различными основаниями В, т. е. с различными рКв·
Замечание 2. Величины рНт = pHs и pHL могут быть непосредст-
венно измерены в момент начала эксперимента, так как в процессе эволю-
ции они остаются неизменными. В этом случае отпадает необходимость в
информации о рКт и рКь*
Замечание 3. Формулы (18) справедливы лишь при выполнении усло-
вия (3), которое в данном случае имеет вид rriL(HL)> mT(HT).
Замечание 4. Нет никаких физических противоречий, препятствую-
щих расположению электродов в точках х=х0=О и х=1=10, т. е. не-
посредственно в рабочей части электрофоретической камеры, а не
в сосудах с буферным раствором, как это обычно делается. Действи-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 259
Решая задачи ( И ) , (13), определим время t0 прохождения грани-
цы x=x(t) между датчиками в точках х=Хо и x=U\
Соотношения (4), (5), (9), (14), (15) при известных величинах
ct>Li bL, и , to, Κτ, Kb, Kl, VL, Уву Xo, /о, I позволяют в принципе опреде-
лить величину mT — mT(Hs) и Hs (или ут, #S) .
Замечание 1. Кислоту HAl можно считать сильной, т. е. полностью
диссоциирующей на ионы (Kl = ОО, ть = уl). В этом случае все соотно-
шения остаются прежними, за исключением формулы (9) для определения
концентрации ионов водорода HL в зоне L, которая заменяется следую-
щей [7]
О п и с а н и е м е т о д и к и э к с п е р и м е н т а д л я о п р е д е -
л е н и я э л е к т р о ф о р е т и ч е с к о й п о д в и ж н о с т и . Основной не-
достаток, затрудняющий применение формул (4), (5), (9), (14), (15)
для определения т т , заключается в том, что в эти формулы входит
неизвестная величина ут. Однако существует режим эксперимента, сво-
бодный от указанного недостатка.
Обеспечим следующие условия:
Это означает, что концентрации кислоты и основания в лидере и тер-
минаторе должны совпадать, а датчики, регистрирующие границу зоны,
должны быть совмещены с электродами, на которых поддерживается
постоянная разность потенциалов (впрочем, условие / = / 0 не является
обязательным — его несоблюдение приводит лишь к более громоздким
формулам).
Из (4), (5) (9), (14), (15) имеем:
тельно, роль электрического поля заключается, в частности, в под-
держании концентрации терминатора непосредственно справа от элект-
рода х = 0, равной aTf и концентрации лидера непосредственно слева от
электрода х—1, равной aL, т. е. такими же, как и их концентрации
в сосудах с буферным раствором. Это означает, что электрод может
быть расположен в любой части сосудов с буферным раствором, и, в
частности, на границе сосуда с рабочей частью камеры.
О ш и б к и р а с ч е т о в р а б о т ы [1]. Авторы работы [1] пола-
гают, что зона S (рисунок, б) іне образуется, т. е. что концентрации
терминатора в этой зоне прежние as=aTy bs=bT. Это противоречит ре-
гулирующим соотношениям Кольрауша (4), (5) и в итоге приводит к
неправильному определению рН в зоне 5, которое ошибочно считается
совпадающим с рН в зоне Т. На основе (4), (5), (9) возможно построе-
ние пересчетных формул для определения истинного значения рН
в зоне 5, которые не приведены ввиду их громоздкости. Использование
этих формул для пересчета на основе экспериментов работы [1] в слу-
чае большинства веществ дало противоречивые результаты. Это связа-
но с тем, что для этих веществ измеренные в [1] значения т т оказались
большими уТу что невозможно (см. (1), (2), откуда следует o c r ^ l ,
m T ^ y T ) . Вероятно, дело в том, что для определения гпт использовали
формулу (14) при ε = 0. Как уже указывалось, это соответствует сов-
мещенному расположению датчиков (термопар) и электродов—·χ 0 =0,
/ = / 0 . Из текста работы [1] неясно, были ли выполнены указанные ус-
ловия совмещения.
Для проверки методики, предложенной в [1], проведены экспери-
менты на установке, описанной в [8]. Результаты экспериментов по-
казали, что указанная методика неприменима для определения элект-
рофоретической подвижности. Результаты экспериментов по методике,
предложенной в настоящей статье, показали существование неподвиж-
ной границы раздела, что косвенно подтверждает правильность этой
методики и уж во всяком случае неприменимость методики работы [1].
Полные результаты экспериментов по измерению нодвижностей будут
опубликованы в следующей статье.
USE OF ISOTACHOPHORESIS AT A CONSTANT VOLTAGE
FOR DETERMINATION OF MOBILITY
M. Yu. Zhukov, L. E. Korol
M. A. Suslov University, Rostov
Institute of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
The simple experimental procedure which permits determining the dependence of electro-
phoretic mobility of substances on pH of the solution is described. The absence of expe-
rimental data on such dependences considerably delays the progress of electrophoretic
methods and their use for analyzing separat ing biopolymers.
1. Carchon H., Eggermont E. Isotachophoretic determination of relative apparent mobili-
ty as an estimate of electrophoretic mobility of ions / /E lec t rophores i s . — 1982.— N 3.—
P. 263—274.
2. Ilaglund H. Isotachophoresis / / ' Sci. Tools. — 1970.—17, N 1. — P . 9—13.
3. Routs R. T. Electrolyte systems in isotachophoresis and their application to some pro-
teins separation. — Solna: Solna Skriv, 1971.—137 p.
4. Жуков Μ. Ю., Юдович В. И. Математическая модель изотахофореза / /Докл . ΑΙΤ
СССР. — 1982.—267, № 2. — С. 334—338.
5. Жуков М. Ю. Нестационарная модель изотахофореза / / Журн. вычисл. математики и
мат. физики. — 1984. — № 4. — С. 549—565.
6. Бабский В. Г., Жуков М. Ю., Юдович В. И. Математическая теория электрофореза. —
Киев : Наук, думка, 1983,—203 с.
7. Корыта И., Дворжак И., Богачкова В. Электрохимия. — М. : Мир, 1975.—472 с.
260 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, Λ1> 5
3. Универсальная установка для жидкостного колоночного электрофореза биополиме-
р о в / Л . Е. Король, I I. И. Коньшин, Г. Ю. Ажицкий, В. И. Андриенко/ /Молекуляр
биология. — 1984. — Вып. 36. — С. 70—71.
Получено 21.10.85 Рост. гос. ун-т им. М. А. Суслова
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев
УДК 543.545
ОПЫТ АНАЛИТИЧЕСКОГО ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЯ
В СВЕРХТОНКИХ БЛОКАХ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГЕЛЯ
С ПРИМЕНЕНИЕМ АЛМАЛИТОВ — АМФОЛИТОВ-НОСИТЕЛЕЙ *
А. В. Шурхал, Г. Т. Азимбаева, А. В. Подогас,
К. Б. Муеабеков, В. А. Пасечник
Введение. Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) является одним
из наиболее распространенных и прогрессивных методов анализа
свойств биологических полимеров. Принципиальная идея метода сфор-
мулирована в работах Колина и Свенсона (Рилби) (цитировано по
[1]) и заключается в том, что макромолекулы, несущие заряд, под дей-
ствием электрического поля мигрируют вдоль градиента рН, пока не
достигнут соответствующего значения изоэлектрической ТОЧКИ (pi) .
В настоящее время успешно развиваются вопросы общей теории ИЭФ
[2] и разработан широкий диапазон его методических модификаций [3].
В качестве субстрата для формирования градиента рН используются
разнообразные химические агенты, однако наибольшее распространение
получили синтетические амфолиты-носители, из которых более пред-
почтительными являются амфолиты, известные под коммерческими
(названиями «амфолины» производства «LKB» (Швеция); «сервалиты» и
«фармалиты», выпускаемые соответствующими фирмами «Serva» (ФРГ)
и «Pharmacia» (Швеция). В Советском Союзе ранее были предприняты
попытки синтезировать собственные амфолиты [4, 5]. В данном сооб-
щении представлены результаты опытов по аналитическому ИЭФ в
сверхтонких слоях полиакриламидного геля (ПААГ), где амфолитами-
носителями служили препараты, синтезированные в Казахском государ-
ственном университете им. С. М. Кирова.
Материалы и методы. Амфолит-носитель синтезирован в Казахском государствен-
ном университете им. С. М. Кирова на кафедре коллоидной химии и получил название
«Алмалит». Синтез проведен на основе взаимодействия промышленных смесей полн-
этиленполиаминов (ПЭПА) с непредельными карбоновыми кислотами при соотношении
амино- и карбоксильных групп (N/COOH) в исходных реагентах 2 : 1 . Реакцию про-
водили в круглодонной колбе, снабженной мешалкой, путем взаимодействия кислоты с
водным раствором ПЭПА в течение 1 ч в токе инертного газа. Для завершения реакции
смесь термостатировали при 70 °С в течение 5 ч. Синтезированный продукт получали в
виде 40%-ного водного раствора. Синтезированные таким образом алмалиты были ис-
следованы методом ИЭФ в градиенте плотности сахарозы в колонке «LKB» объемом
110 мл. В ходе опыта одновременно измеряли градиент рН, электропроводность и по-
глощение в УФ-части спектра при 280 нм. Свойства алмалитов в режиме ИЭФ иссле-
дованы методом аналитического ИЭФ в сверхтонких гелях полиакриламида. Техника
приготовления растворов гелей, содержащих алмалиты-носители, формирование сверх-
тонких гелевых блоков и основные параметры режима ИЭФ описаны нами ранее [6].
В опытах использованы источники питания фирмы «Desaga» «Desatronic-2000», а так-
же источники, разработанные в СКВ БФА, ИГ1Э-2000-02 с режимом стабилизации по
мощности. Префокусирование и разделение проводили при 4 °С. Распределение гради-
* Амфолиты-носители синтезированы в Казахском госуниверситете.
261 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, Λ1> 5
|