Белковый блотинг

Метод белкового блотинга активно используется в молекулярно-биологических исследованиях для анализа взаимодействий типа белок – ДНК и белок – белок, включая определение специфичности антигенов и антител. Рассмотрены различные этапы блотинга – перенос белков на мембраны, обработка блотов, создание и...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1986
1. Verfasser:	Маргулис, Б.А.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1986
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Структура и функции биополимеров
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152971
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Белковый блотинг / Б.А. Маргулис // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 246-251. — Бібліогр.: 23 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-152971
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1529712019-06-14T01:28:52Z Белковый блотинг Маргулис, Б.А. Структура и функции биополимеров Метод белкового блотинга активно используется в молекулярно-биологических исследованиях для анализа взаимодействий типа белок – ДНК и белок – белок, включая определение специфичности антигенов и антител. Рассмотрены различные этапы блотинга – перенос белков на мембраны, обработка блотов, создание иммунных комплексов на репликах и окрашивание блотов. Представлены два примера применения иммуноблотинга для анализа специфичности антител к интерферонам человека. Метод білкового блотингу активно використовується в молекулярно-біологічних дослідженнях для аналізу взаємодій типу білок–ДНК і білок–білок, включаючи визначення специфічності антигенів і антитіл. Розглянуто різні етапи блотингу – перенесення білків на мембрани, обробка блотів, створення імунних комплексів на репліках і фарбування блотів. Представлено два приклади застосування імуноблотингу для аналізу специфічності антитіл до інтерферонів людини. The detailed procedure of protein blotting is described in the following order: protein transfer onto the replica, blocking of the non-specific interactions, the interaction of the immobilized antigen with the 1st and 2nd antibodies, the visualization of immune complexes on the blot. Two practical applications of immunoblotting are considered when analyzing anti-oca-interferon monAbs' specificity and investigating (5-interferon expression in human HeLa cells. 1986 Article Белковый блотинг / Б.А. Маргулис // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 246-251. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001BD http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152971 57.086.088.3 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Маргулис, Б.А. Белковый блотинг Биополимеры и клетка
description	Метод белкового блотинга активно используется в молекулярно-биологических исследованиях для анализа взаимодействий типа белок – ДНК и белок – белок, включая определение специфичности антигенов и антител. Рассмотрены различные этапы блотинга – перенос белков на мембраны, обработка блотов, создание иммунных комплексов на репликах и окрашивание блотов. Представлены два примера применения иммуноблотинга для анализа специфичности антител к интерферонам человека.
format	Article
author	Маргулис, Б.А.
author_facet	Маргулис, Б.А.
author_sort	Маргулис, Б.А.
title	Белковый блотинг
title_short	Белковый блотинг
title_full	Белковый блотинг
title_fullStr	Белковый блотинг
title_full_unstemmed	Белковый блотинг
title_sort	белковый блотинг
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1986
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/152971
citation_txt	Белковый блотинг / Б.А. Маргулис // Биополимеры и клетка. — 1986. — Т. 2, № 5. — С. 246-251. — Бібліогр.: 23 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT margulisba belkovyjbloting
first_indexed	2025-07-14T04:41:50Z
last_indexed	2025-07-14T04:41:50Z
_version_	1837596001553088512
fulltext	Электрофорез клеток и биологических макромолекул получил широ- кое распространение как один из основных методов их фракциониро- вания и анализа. Он отличается универсальностью, доступностью тех- нических средств и методик, высокой разрешающей способностью. Ill Всесоюзное рабочее совещание по теории и практике электрофо- реза, состоявшееся в Каневе в мае 1985 г., позволило обсудить раз- личные варианты и приложения этого метода, оценить перспективные направления его развития. Содержание наиболее показательных для современного состояния метода электрофореза докладов, заслушан- ных на совещании, отражено в статьях и хронике, опубликованных в этом выпуске журнала. В них представлены отечественные достижения в разработке аппаратуры и реактивов для электрофореза, оригиналь- ных методик и теоретических моделей. УДК 57.086.088.3 БЕЛКОВЫЙ БЛОТИНГ Б. А. Маргулис Метод белкового блотинга, сочетающий высокую разрешающую способ- ность электрофоретических техник с огромной чувствительностью твер- дофазного анализа макромолекулярных комплексов, применяют для идентификации ДНК- и РНК-связывающих белков, гликопротеидов, ферментов, для определения специфичности антигенов и антител. Само название метода говорит о сущности процедуры (блот — англ. — промо- кашка), которая заключается в переносе зон полипептидов после элект- рофореза (ЭФ) из толщи акриламидного или агарового геля на поверх- ность целлюлозной мембраны или аффинной бумаги. Находясь в иммобилизованном состоянии іна таких репликах или отпечатках, белки доступны для взаимодействия с другими молекулами, в растворе кото- рых инкубируется блот. Основы метода изложены в книге Л. А. Остер- мана [1]. В данном сообщении приведена характеристика отдельных этапов блотинга и даны примеры использования этого метода в моле- кулярнобиологических исследованиях. Белковый блотинг производится в следующей последовательности: ЭФ, перенос белков на реплику, исключение центров неспецифического связывания на блоте и чередующиеся этапы формирования комплексов типа белок — белок (или белок — ДНК) и отмывок слабо или иеспе- цифически связанных молекул с поверхности блота. Последним этапом является авторадиография блота или выявление специфически связан- ной с зонами биологической активности. Согласно порядку процедур при блотинге, рассмотрим подробнее этапы эксперимента. Э л е к т р о ф о р е з . Для разделения белков или пептидов можно использовать любой подходящий метод ЭФ в вертикальном блоке или тонком слое, включая наиболее чувствительный, двухмерный ЭФ [2, 3]. Поскольку часть блота можно окрашивать на общий белок (Амидо черным или Кумасси), рекомендуется на соседние с необходимой для опыта дорожки наносить смесь белков — стандартов с известными мо- лекулярными массами. После переноса блот разрезается вдоль направ- ления ЭФ, и одна полоса используется для выявления специфических комплексов, другая — окрашивается. Таким образом можно определить молекулярную массу исследуемого белка, перенесенного на блот. 246 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 М а т е р и а л ы д л я б л о τ и н г а. В качестве сорбирующей плен- ки обычно используют інитроцеллюлозньїе мембраны фирм «Schleicher and Schulle» (ФРГ) или «Мііііроге» (США). Размер пор нитроцел- люлозных пленок — 0,22 или 0,45 мкм. С 1984 г. начался выпуск нитро- целлюлозных мембран на нейлоновой основе для многократного исполь- зования [4]. Белковый блотинг можно проводить на аминобензилоксиме- тил целлюлозной бумаге, которую применяют в качестве ионообменного носителя, но она нуждается в предварительной активации [5]. П е р е н о с б е л к о в н а м е м б р а н у . Есть два основных ва- рианта приготовления отпечатков с геля: пассивный диффузионный пе- ренос (или в условиях повышенного осмоса) по Саузерну и электро- блотинг, Вестерн-блотинг. В первом случае в какой-либо емкости соби- рается «сэндвич», состоящий из следующих элементов: стопка листов фильтровальной бумаги, нижний блот (нитроцеллюлоза), гель, верхний блот, стопка фильтров, стекло, груз. Нижнюю стопку фильтров погру- жают в раствор для блотинга или соединяют с ним при помощи мости- ков из фильтровальной бумаги. В качестве такого раствора мы приме- няли 10-кратный электродный буфер для ЭФ по Лаэммли [2] или тот же неконцентрированный раствор (20 мМ трис, 192 мМ глицин, рН 8,3—8,6). Процедура диффузионного переноса длится от 8—12 ч до нескольких дней. Эффективность его определяется концентрацией ге- ля, размером мембранных пор и молекулярной массой белков [6]. В на- ших опытах метод с применением мембраны 0,45 мкм при длительности переноса 12—14 ч подходит для белков с молекулярными массами менее 100 000. При одновременном использовании двух блотов с обеих сто- рон геля после інативного изоэлектрофокусирования (буфер: 10 мМ трис-HCl, рН 8,15) 40 % белкового материала переходит в нижний, 60 % — в верхний блот. Эффективность любого из видов блотинга мож- но проверить окрашиванием геля, с которого приготовлена реплика, и сравнением с необработанным гелем. Метод электропереноса белков предложен в работе [8]. Блотинг производится в специальных камерах, смонтированных по следующей схеме: катод, сборка, содержащая гель и блот, и анод. Гель и блот должны плотно прижиматься друг к другу. Основные требования к кон- струкции: отсутствие пузырьков воздуха в сборке и равномерность электрического поля. Для электропереноса белков с геля после ЭФ с DS-Na [2, 3] применяют раствор: 20 мМ трис, 192 мМ глицин, рН 8,3— 8,6, 20 %-ный метанол [8]. Метанол (по нашим данным, его можно за- менить этанолом) служит для растворения DS-Na, т. е. для частичной ренатурации белков, переносимых іна блот. Удаление метанола из электродного раствора приводит к ускорению переноса, а введение 0,1 %-ного DS-Na обеспечивает более полный перенос крупных белков с молекулярными массами около 100 000 [6]. Электроблотинг с «кислых гелей» (например, после ЭФ гистонов) проводится в растворе 0,9 Μ уксусной кислоты при обратной полярности. При величине градиента напряжения 5—6 В/см и токе 300 мА электроблотинг проходит за 1—3 ч [8], однако можно увеличить это время до 12—14 ч (т. е. в течение ночи). Недавно появилось сообщение об использовании гори- зонтального прибора для получения сразу большого количества реплик [9]. После окончания переноса белков блот быстро промывают в не- скольких сменах воды либо в солевых растворах: 0,14 Μ NaCl, 10 мМ Ыа-фосфатный буфер, рН 7,2—7,4 (ЗФС) или 0,14 Μ NaCl, 50 мМ трис-HCl, рН 7,4—7,5 (ЗТС). Высушенный после промывки блот мож- но хранить по крайней мере несколько дней. Часть блота обычно ис- пользуют для определения позиции маркерных зон и для проверки ка- чества блотинга. Эта полоса реплики окрашивается в растворах: 0,1 %- ный Амидо черный 10 В, 25 %-ный изопропанол (или 40 %-ный мета- нол), 10 %-ная уксусная кислота или 0,2 %-ный Кумасси ярко голубой R-250, 10 %-ный метанол, 10 %-ная уксусная кислота. Обесцвечивание- фона производится в тех же растворах (без красителя). 2 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 Основную, неокрашенную часть блота используют для формирова- ния и выявления специфических комплексов, чаще всего иммунных. Процедуры иммуноблотинга после переноса белка на реплику прово- дятся в следующем порядке. 1. Блокирование неспецифически активных участков блота. Д л я этого применяются растворы в ЗФС или ЗТС белков: 1—5 % бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1—3 % овальбумина, 10—15 % сыво- ротки крупного рогатого скота, 0,25 % желатина, 14 % обезжиренного молока и т. д. Инкубация в блокирующем растворе при помешивании длится 45—60 мин. 2. Взаимодействие с первыми антителами. Специфические анти- тела добавляют к блокирующему раствору в концентрации 1 — 10 мкг/мл; при использовании неочищенной сыворотки последнюю раз- бавляют ЗФС или ЗТС в соответствии с титром. Нанесение первых ан- тител на блот производится в течение 60—150 мин. 3. Отмывка неспецифически связывающихся первых антител. По- сле нескольких быстрых промывок в ЗФС или ЗТС для .удаления белков со стенок сосуда следуют 2—3 инкубации с постоянным помешиванием в растворах 0,05 %-ного Твина-20 или Нонидета Р-40 в ЗФС или ЗТС. 4. Инкубация с мечеными вторыми антителами или белком А. По- следний этап формирования иммунного комплекса заключается в до- бавлении вторых антител, конъюгированных с каким-либо ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза или галактозидаза) , или меченных 125/. При использовании конъюгата концентрация вторых антител 1 — 10 мкг/мл; меченые антитела или белок А разбавляют до содержания метки 1—2-Ю6 и м п - м и н - ^ м л - 1 . Вторые антитела растворяют в блоки- рующем растворе; время инкубации составляет 45—60 мин для меченых антител и 60—90 мин — для конъюгатов. В последнее время для иммуноферментного анализа >на блоте при- меняют ПАП — комплекс пероксидазы с антителами к пероксидазе. Опыт идет по такой схеме: антиген — первые антитела — вторые анти- тела — ГІАП. Первые антитела и антитела к пероксидазе должны быть выработаны в животных одного вида. Недавно появилось сообщение о применении иммунозолота для белкового блотинга [10]. В этом случае меткой для образованного иммунного комплекса служат частицы кол- лоидного золота с прикрепленными вторыми антителами. Чувствитель- ность метода иммуноблотинга может быть повышена при использова- нии биотинилированных вторых антител и авидина с изотопной и фер- ментативной меткой [11]. Применяют также способ модификации анти- генов, например динитрофенолом, и выявление зон антителами к мо- дифицирующим лигандам [12]. 5. Отмывка блота после инкубации со вторыми антителами. Эта процедура производится в соответствии с пунктом 3. Для снижения фо- новой окраски или активности можно повышать концентрацию неион- ного детергента. Рассмотрим два примера использования метода иммуноблотинга для анализа специфичности моно- и поликлональных антител к а- и β-интерферонам человека. А. В Институте цитологии АН СССР (совместно с В Н И И О Н Б Главмикробиопрома при СМ СССР) была получена серия моноклональ- ных антител (МКА) к лейкоцитарному (а2) интерферону человека. Анализ специфичности МКА к а2-интерферону проводили методом им- муноблотинга. Антиген, содержащийся в бактериальном экстракте, (на- носили на 13 %-ный полиакриламидный гель в концентрации 1—3-Ю5 ME на лунку. Перенос белка на нитроцеллюлозу (ФРГ, ВА85, 0,45 мкм) проводили при токе 300 мА в приборе собственной конструк- ции. После переноса блот инкубировали 1 ч в растворе 15 %-ного БСА, куда затем добавляли МКА 218. Блот инкубировали ночь с этими ан- тителами, отмывали в растворе 0,05 %-ного Твин-20 и 1 ч в растворе меченных 1251 вторых антител в ЗФС (106 и м п - м и н - ^ м л - 1 ) . Мечение антимышиных кроличьих антител производили по стандартному методу 2 4 8 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 с хлорамином Τ до удельной активности 2-Ю7 имп·мин-*1 ·мкг - 1 Ig. Отмывку вторых антител проводили в двух сменах (по 30 мин) раство- ра: ЗФС, 0,5 %-ный Нонидет Р-40, 0,1 % DS-Na, 0,2 %-ный желати-н, 5 мМ ЭДТА. На рис. 1 представлена электрофореграмма бактериально- го экстракта и фотография блота. Отметим высокую специфичность метода при использовании МКА. Б. Поликлональные антитела (в кролике) к β-интерферону для ана- лиза экспрессии этого белка в клетках человека HeLa в норме и при Рис. 1. Определение специфичности моноклональных антител МКА 218 к аг-интерферону человека: А — э л е к - трофореграмма бактериального экс- тракта, содержащего аг-интерферон (a2-IFX) (13 %-ный ПААГ); Б — ав- торадиограмма с иммуноблота после его обработки МКА 218 и кроличьими (антимышиными) 125I — IgG. Fig. 1. Determination of the specificity of monoclonal antibodies MKA 218 for human (^-interferon: A—elect ropho- retic pattern of bacterial lysate, con- taining a 2 - interferon (a2 IFN) (13% PAAG); Б — autoradiogram of immu- noblot after its incubation with MKA 218 and rabbit (antimouse) l25I—IgG. peroxidase b, 94 kD, Рис. 2. Выявление β-интерферона в клетках человека HeLa: иммупобло- ты, полученные с геля (12 %-ный ПААГ) после ЭФ экстрактов нормаль- ных клеток (Л) и клеток после тепло- вого шока в течение 40 мин при 44 °С • : , (Б) (блоты обработаны моноспецифи- УЙ \ ческими антителами к β-интерферону и конъюгатом антикроличьих антител с пероксидазой); В — блот с перене- сенными стандартами молекулярных масс: фосфорилаза b ( Φ ) — 9 4 000: БСА — 67 000; угольная ангидраза Ї(УА)— 30 000. J Fig. 2. Detection of β-interferon in hu- man HeLa cells: А, Б — immunoblots of the gels (12% PAAG) after the 2 electrophoresis of normal (/4) and he- at-shocked (44 °С, 40 min) cell extracts (Б). Blots were treated by anli-β-ίπ- terferon monospecific antibodies and _.antirabbit antibodies conjugated with ; В — blot with molecular-weight s tandards (Pharmacia) : Φ — phosphorylase БСА — bovine serum albumin, 67 kD, УА — carbonic anhydrasc, 30 kD. действии теплового шока. Белки клеточных препаратов разделяли по Лаэммли [2] и переносили на мембрану ВА85. Блот инкубировали в ЗТС с 1 %-ным овальбумином 1 ч. Затем в инкубационный раствор добавляли антитела к β-интерферону (ВНИИгенетики Главмикробио- прома при СМ СССР) до концентрации, не превышающей 1 мкг/мл. После 3—4 ч инкубации и отмывок в 0,05 %-ном Твин-20 ЗТС блот переносили в раствор антикроличьих антител, полученных из овечьей сыворотки и конъюгированных с пероксидазой хрена (препарат Ин-та вакцин и сывороток МЗ СССР, Ленингр. обл.) и разбавленных в ЗТС с 0,05 %-ным Твин-20. Через 1 ч блот снова промывали и помещали в раствор диаминобензидина (1 мг/мл в 50 мМ трис-HCl, рН 7,5), ку- да добавляли 3,5 мкл Н2О2. На рис. 2 представлена фотография окра- шенного блота. Зона β-интерферона выявляется в .нормальных и об- работанных теплом клетках. По данным радиоиммуноанализа, с теми же антителами на плате синтез β-интерферона в HeLa после теплового шока не идет. Результаты блотинга в этом случае указывают на сохра- БПОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА, 198G, т. 2, ХЬ 5 2 4 9 нение в течение 3 ч (45 мин — тепловой шок и 2 ч 15 мин — восстанов- ление и мечение) исходного пула интерферона в клетках. Рост количества работ с использованием белкового блотинга, по- явившихся в последние годы, свидетельствует о широких возможностях метода. Появились сообщения об использовании его для характеристи- ки олигосахаридных цепей гликопротеинов [13], гликолипидов [14], мембранных белков бактерий [15], изоферментов креатинкиназы [16] и динеинов [17]. Необходимо отметить также работы по совершенство- ванию самой техники блотинга: приготовление нескольких последова- тельных иммунореплик с одного блота [18], применение блотов для очистки антигенов [19, 20], использование флюорографии [21] и высоко- эффективных иммунохимических методов [17] для выявления белковых зон на блотах. Как и любой другой метод, белковый блотинг имеет ог- раничения, связанные с особенностями антигена, техникой переноса или сорбирующей способностью мембран [22]. Способ обойти подобные затруднения и выбрать оптимальный вариант процедуры блотинга заключается в проведении предварительных экспериментов с каждым ІНОВЬІМ антигеном (или антителами) в системе капиллярного точечного блотинга (дот-блотинг). Антиген (или антитела) наносится точками на мембрану [23] в различных разбавлениях и в разных буферных раст- ворах с детергентом или без него. Отработав способ нанесения анти- гена (аналог блотинга), титр антител, условия отмывок и определив общую чувствительность метода и эффективность системы сборки комп- лексов, можно переходить к опытам по методу иммуноблотинга. THE PROTEIN BLOTTING В. A. Margulis Institute of Cytology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad S u m m a r y The detailed procedure of protein blotting is described in the following order: protein t ransfer onto the replica, blocking of the non-specific interactions, the interaction of the immobilized antigen with the 1st and 2nd antibodies, the visualization of immune comple- xes on the blot. Two practical applications of immunoblotting are considered when ana- lyzing anti-a2- interferon monAbs' specificity and investigating β-interferon expression in human HeLa cells. 1. Остерман JJ. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. — М. : Наука, 1983.—304 с. 2. Laemmli U. /С. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of T4 / / Nature. — 1970.—227, N 5259. — P. 680—685. 3. O'Farrell P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins / / ' J . Biol. Chem. — 1975.—250, N 10. — P. 4907—4921. 4. Chromatography. Electrophoresis. Immunochemistry: BioRad Catalogue K1985. — Rich- mond : BioRad Lab., 1985.—256 p. 5. Products for nucleic acids and protein research: Schleicher and Schull Catalogue. — Dassel : Schleicher and Schull, 1982.—11 p. 6. Sodium dodecyl sulfate-mediatcd transfer of electrophoretically separated DNA binding p r o t e i n s / A . M. Aubertin, L. Tondre, C. Lopez et a l . / ' /Ana l . Biochem. — 1983—131, N 1.—P. 127—134. 7. Reinhardt M. P., Malamud D. Protein t ransfer from isoelectric focusing gels: the na- tive blot / / Ibid. — 1982,—123, N 2. — P. 229—235. 8. Towbin H., Staehilin Т., Gordon J. Electrophoretic t ransfer of proteins from polyac- rylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some a p p l i c a t i o n s / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA. — 1979.—76, N 9. — P. 4350—4354. 9. Manabe Т., Takahashi Y., Okuyama T. An electroblotting apparatus for multiple repli- ca technique and identification of human serum proteins on micro two-dimensional gels / / Anal. Biochem. — 1984.—143, N 1. — P. 39—45. 10. Sensitive visualisation of antigen-antibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and immunogold / silver s t a i n i n g / М . Moeremans, G. Da- neels, A. van Dijck et a l . / / J . Immunol. — 1984.—74, N 3. — P. 353—360. 11. Heggeness Μ. H., Ash J. F. Use of the avidin-biotin complex for the localisation of ac- tin and myosin with fluorescence m i c r o s c o p v / / J . Cell Biol. — 1977.—73, N 3.— P. 783—788. 250 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5 12. Wojtkowiak Ζ., Briggs R. С., Hnilica L. C. A sensitive method for s taining proteins transferred to nitrocellulose s h e e t s / / A n a l . Biochem. — 1983.—129, N 2. — P. 486—489. 13. Faye L., Chrispeels M. J. Characterization of N-linked oligosaccharides by affinoblott- ing with concanavalin Α-peroxidase and treatment of the blots with glicosidases / / Ibid.— 1985.— 149, N 1.—P. 218—224. 14. Handman E., Jarvis Η. M. Nitrocellulose-based assays for the detection of glycolipids and other antigens : mechanism of binding to n i t roce l lu lose / / J . · Immunol. Meth .— 1985.—83, N 1. — P . 113—123. 15. Loeb M. R. Immunoblot method for identifying surface components, determining their cross-reactivity, and investigating cell topology: results with Haemophilus influenzae type b / / Anal. Biochem. — 1984.—143, N 1. — P . 196—204. 16. Grace A. M., Strauss A. W., Sobel В. E. Sensitive quantification of isoforms of canine MM creatine kinase with an immunoblot procedure suitable for large numbers of samples / / Ibid. — 1985.—149, N 1. — P. 209—217. 17. King S. M., Offer Т., Witman G. B. Characterization of monoclonal antibodies against Chlamydomonas flagellar dyneins by high-resolution protein blott ing If Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1985.—82, N 14. — P . 4717—4721. 18. Legocki R. P., Verma D. P. S. Multiple immunoreplica technique: screening for spe- cific proteins with a series of different antibodies using one polyacrylamide gel / / Anal. Biochem. — 1981.—Ill, N 2. — P. 385—392. 19. Preparative elution of proteins from nitrocellulose membranes af ter separation by so- dium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis / B. S. Parekh, Η. B. Mehta, M. D. West, R. C. M o n t e l a r o / / I b i d . — 1985,—148, N 1. — P . 87—92. 20. Atkinson P. J. The recovery of nitrocellulose-bound p r o t e i n / / I b i d . — P. 105—110. 21. Roberts R. L. Comparison of fluographic methods for detecting radioactivity in poly- acrylamide gels or on nitrocellulose f i l t e r s / / I b i d . — 147, N 2. — P. 521—524. 22. Lin W., Kasamatsu H. On the electrotransfer of polypeptides from gels to nitrocellu- lose membranes / / Ibid. — 1983.—128, N 2. — P. 302—311. 23. Jahn R., Shieber W., Greengard P. A quantitative dot-immunoblott ing assay for pro- teins using nitrocellulose membrane f i l t e r / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA. — 1984.— 81, N 6. — P . 1684—1687. Ин-т цитологии АН СССР, Ленинград Получено 21.10.85 УДК 576.8.094.2.087.4:543.545 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В СВОБОДНОМ ПОТОКЕ КЛЕТОК И БЕЛКОВ И. С. Габуев, А. Л. Мазанов, В. Н. Брезгунов, И. Н. Прелова, А. С. Колезнев Введение. Электрофоретическая подвижность (ЭФП) клеток микроор- ганизмов является весьма информативной их характеристикой [1]. ЭФП клеток измеряют в основном методом микроэлектрофореза [2]. В ла- бораторной практике часто приходится измерять ЭФП белков и других макромолекул, для чего обычно используют метод подвижной границы [3]. Недостатками этих методов являются длительность, трудоемкость, низкая точность измерений. В последнее время успешно разрабатывается метод электрофоре- за в свободном потоке (ЭФСП), который обеспечивает непрерывное препаративное разделение смесей микроорганизмов [4], клеток крови, лимфоцитов, субклеточных частиц, фагов, белков и других макромоле- кул [5] за 1—5 мин. В ряде экспериментальных установок ЭФСП осу- ществляется оптическая регистрация разделившихся фракций [6]. Од- нако в настоящее время нет серийно выпускаемой аппаратуры, обес- печивающей как препаративное разделение, так и точное измерение ЭФП частиц. Поэтому нами была разработана универсальная установ- ка для препаративного и аналитического ЭФСП, изучены ее эксплуа- тационные и метрологические характеристики. Материалы и методы. А п п а р а т у р а д л я ЭФСП. Структурная схема уста- новки для ЭФСП приведена на рис. 1. Буферный раствор поступает в камеру разде- ления через демпферные сосуды (ДС) 60 каналов ввода. Два центробежных насоса 251 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1986, т. 2, № 5

Белковый блотинг

Institution

Ähnliche Einträge