ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов
Методом блот-гибридизации изучен полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ДНК-последовательностей, тесно сцепленных (зонд St-14) или расположенных внутри, т. е. представляющих собой фрагменты гена фактора (F) VIII: С свертывания крови (р51.61 и р1.8), в ленинградской популяции (контроль) —...
Збережено в:
| Дата: | 1990 |
|---|---|
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1990
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153075 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов / М.В. Асеев, Т.Э. Иващенко, В.Н. Горбунова, В.С. Баранов // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 2. — С. 45-52. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-153075 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1530752019-06-14T01:26:15Z ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов Асеев, М.В. Иващенко, Т.Э. Горбунова, В.Н. Баранов, В.С. Методом блот-гибридизации изучен полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ДНК-последовательностей, тесно сцепленных (зонд St-14) или расположенных внутри, т. е. представляющих собой фрагменты гена фактора (F) VIII: С свертывания крови (р51.61 и р1.8), в ленинградской популяции (контроль) — в семьях высокого риска и непосредственно у больных гемофилией А. Частота ПДРФ-аллелей, выявленная этими зондами, во всех исследованных группах в целом хорошо коррелирует с аналогичными показателями для западноевропейских и североамериканских популяций. В исследованиях с зондом St-14 обнаружены два дополнительных, ранее неописанных аллеля 4,35 и 4,2 т. п. о. Подтверждена высокая информативность внесенного зонда St-14 и сравнительно низкая — внутригенных зондов. Совместное использование трех зондов в семьях высокого риска позволило установить диагноз и подтвердить гетерозиготное носительство гена гемофилии A у 11 u отвергнуть его у двух -женщин — близких родственников пробандов, а также с вероятностью более 95 % осуществить пренатaльную диагностику гемофилии А у плода 9-й недели развития. Методом блот-гібридизації вивчено поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ) ДНК-послідовностей, тісно зчеплених (зонд St-14) або розташованих усередині, тобто які представляють собою фрагменти гена фактора (F) VIII:С згортання крові (р51.61 і р1.8), у ленінградській популяції (контроль) – у родинах високого ризику і безпосередньо у хворих на гемофілію А. Частота ПДРФ-алелів, виявлена цими зондами, у всіх досліджених групах у цілому добре корелює з аналогічними показниками для західноєвропейських та північноамериканських популяцій. У дослідженнях із зондом St-14 виявлено два додаткових, раніше не описаних алелі 4,35 і 4,2 тис. п. о. Підтверджено високу інформативність внесеного зонда St- 14 і порівняно низька – внутрішньогенних зондів. Спільне використання трьох зондів у родинах високого ризику дозволило встановити діагноз і підтвердити гетерозиготне носійство гена гемофілії A у 11 і відкинути його у двох жінок – близьких родичів пробандів, а також з імовірністю більше 95 % здійснити пренатaльную діагностику гемофілії А у плоду 9 -го тижня розвитку. RFLP analysis of DNA sequences close to (probe St-14) or inside Factor VIII : C gene (probes p. 51.61 and probe p. 1.8) was carried out in the Leningrad population (control group), in the families with high risk of haemophilia A as well as in patients with haemophilia A. The frequency of corresponding alleles in normal and haemophilia A X chromosomes were in good concordance with relative allelic frequencies in populations of Western Europe and North America. Two rare and previously unkown alleles (4.2 and 4.35 base pairs) were detected in studies with St-14 probe. High informativity of closely linked St-14 probe and low predictive values of tested intragenetic probes have been confirmed. Using RFLP technique with 3 tested probes haemophilia A heterozygotcs carriers have been diagnosed in 11 and rejected in 2 close female relatives of haemophilia patients. Prenatal diagnosis of haemophilia A in a 9-week embryo has been perfotned. 1990 Article ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов / М.В. Асеев, Т.Э. Иващенко, В.Н. Горбунова, В.С. Баранов // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 2. — С. 45-52. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000259 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153075 577.213.3 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| description |
Методом блот-гибридизации изучен полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ДНК-последовательностей, тесно сцепленных (зонд St-14) или расположенных внутри, т. е. представляющих собой фрагменты гена фактора (F) VIII: С свертывания крови (р51.61 и р1.8), в ленинградской популяции (контроль) — в семьях высокого риска и непосредственно у больных гемофилией А. Частота ПДРФ-аллелей, выявленная этими зондами, во всех исследованных группах в целом хорошо коррелирует с аналогичными показателями для западноевропейских и североамериканских популяций. В исследованиях с зондом St-14 обнаружены два дополнительных, ранее неописанных аллеля 4,35 и 4,2 т. п. о. Подтверждена высокая информативность внесенного зонда St-14 и сравнительно низкая — внутригенных зондов. Совместное использование трех зондов в семьях высокого риска позволило установить диагноз и подтвердить гетерозиготное носительство гена гемофилии A у 11 u отвергнуть его у двух -женщин — близких родственников пробандов, а также с вероятностью более 95 % осуществить пренатaльную диагностику гемофилии А у плода 9-й недели развития. |
| format |
Article |
| author |
Асеев, М.В. Иващенко, Т.Э. Горбунова, В.Н. Баранов, В.С. |
| spellingShingle |
Асеев, М.В. Иващенко, Т.Э. Горбунова, В.Н. Баранов, В.С. ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов Биополимеры и клетка |
| author_facet |
Асеев, М.В. Иващенко, Т.Э. Горбунова, В.Н. Баранов, В.С. |
| author_sort |
Асеев, М.В. |
| title |
ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов |
| title_short |
ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов |
| title_full |
ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов |
| title_fullStr |
ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов |
| title_full_unstemmed |
ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов |
| title_sort |
пдрф-анализ и диагностика гемофилии а при помощи днк-зондов |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1990 |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153075 |
| citation_txt |
ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов / М.В. Асеев, Т.Э. Иващенко, В.Н. Горбунова, В.С. Баранов // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 2. — С. 45-52. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT aseevmv pdrfanalizidiagnostikagemofiliiapripomoŝidnkzondov AT ivaŝenkoté pdrfanalizidiagnostikagemofiliiapripomoŝidnkzondov AT gorbunovavn pdrfanalizidiagnostikagemofiliiapripomoŝidnkzondov AT baranovvs pdrfanalizidiagnostikagemofiliiapripomoŝidnkzondov |
| first_indexed |
2025-07-14T04:27:16Z |
| last_indexed |
2025-07-14T04:27:16Z |
| _version_ |
1837595085477249024 |
| fulltext |
4 . Marx J. L. Gene the rapy — so near and yet so fa r a w a y / / S c i e n c e . — 1986.— 232,
N 4752.— P. 824—825.
5. JlanuiOe В. А. Бактериальный .белок Rec А: биохимический, генетический и физико-
химический анализ // Генетика.— 1985.— 21, № 9 . — С. 1413—1427.
6. Сох М. M., Lehman I. R. E n z y m e s of genera l r e c o m b i n a t i o n / / A n n . Rev. Biochem.—
1987 .—56,—P. 229—262.
7. Kmiee E., Holloman \V. K. H o m o l o g o u s pa i r ing of DNA molecules promoted by a
protein f rom Ustilago I/ Cell.— 1982.— 29, N 2 , — P . 367—374.
8. Kenne K., Ljungquist S. A. A DNA-recombinogenic activi ty in h u m a n cells // Nucl.
Acids Res.— 1984,— 12, N 7,— P. 3057—3068.
9. General recombinat ion mechan i sms in ex t rac ts of meiotic c e l l s / Y . Hot ta , S. Taba ta ,
R. A. Bouchard et al. // Chromosoma.— 1985,— 93, N 2 , — P . 140—151.
10. IIsieh P., Meyn Al. S., Camerini-Otero R. D. Pa r t i a l pur i f ica t ion and charac te r iza t ion
of a recombinase f rom h u m a n c e l l s / / C e l l . — 1986,—44, N 3 , — P . 885—894.
11. Cassuto E., Lightfoot L.-A., Howard-Flanders P. Pa r t i a l pur i f ica t ion of an act ivi ty
f rom human cells tha t p romotes homologous pa i r ing and the fo rma t ion of hetero-
d up lex DNA in the presence of A T P / / М о ї . and Gen. Genet .— 1987.—208, N 1.—
P. 10—14.
12. Characterization of an ATP-dependen t DNA s t rand t r a n s f e r a s e f rom h u m a n c e l l s /
D. Ganea , P. Moore, L. Chccuri, R. K u c h e r l a p a t i / / М о ї . and Cell B io l .—1987 ,—7,
N 9 — P . 3124—3130.
13. Kolodner R., Evans D. H., Morrison P. T. Pur i f ica t ion and charac te r iza t ion of an
activity from Saccharomyces eerevisiae tha t ca ta lyses homologous pa i r ing and s t rand
e x c h a n g e / ' / P r o c . Nat . Acad. Sci. USA.— 1987,—84, N 16 .—P. 5560—5564.
14. L(Jj)Cz B., Roussei SCoppey J. H o m o l o g o u s recombinat ion in te rmedia tes between
two duplex DNA cata lyzed by human cell ex t rac t s //' Nucl. Acids Res.— 1987.— 15,
N 14 ,—P. 5643—5655.
15. Eisen A., Camerini-Olero R. D. A recombinase f rom Drosophila melanogaster
e m b r y o s / / P r o c . Nat . Acad. Sci. USA.— 1988.— 85, N 2 0 , — P . 74-81—7485.
16. Fishel R. A., Detmer K., Rich A. ident i f ica t ion of homologous pa i r ing and s t r and-
exchange activi ty f rom human tumor cell line based on Z-DNA af f in i ty chromato-
g r a p h y / / Ibid.— N 1 — P. 36—40.
17. Sensitive homologous recombinat ion s t r a n d - t r a n s f e r assay : Pa r t i a l pur i f ica t ion of a
Drosophila melanogasler enzyme and detection of sequence ef fec ts on the s t r and-
t r a n s f e r act ivi ty of Rec A protein / J . G. McCar thy , M. Sander , I\. Lowenhaup t ,
A. Rich // Ibid.— N 16 — P. 5854—5858.
18. Sugino A., AHtiss J., Resnick M. A. ATP- independent DNA s t rand t r a n s f e r ca ta lyzed
by p ro te in (s ) f rom meiotic cells of the yeast Saccharomyces eerevisiae // Ibid.—
N 11 ,—P. 3683—3687.
19. Маниатис Т., Фрич 3., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.— М. : Мир,
1984.— 420 с.
20. Клонирование Д Н К / Под ред. Д . Г л о в е р а — М . : Мир, 1988 — 320 с.
21. Kalb V. Р., Berniohr R. \V. A new s p e c t r o p h o t o m e t r y a s say for p r o t e i n / / A n a l .
Biochem.— 1977,—82, N 2 , — P . 362—371.
22. Symington L. S., Fogarty L. M., Kolodner R. Genetic recombinat ion of h o m o l o g o u s
p l a smids catalyzed by cell-free ex t rac t s of Saccharomyces eerevisiae // Cell.— 1983.—
35, N 3 — P . 805—813.
23. Darby V., Blattner F. H o m o l o g o u s recombinat ion ca ta lyzed by m a m m a l i a n cell
ex t rac t s in vitro If Science.— 1984.— 226, N 4679 .—P. 1213—1215.
24. Kucherlapati R. S., Spencer J., Moore P. D. H o m o l o g o u s recombinat ion ca ta lyzed
by h u m a n cell e x t r a c t s / / М о ї . and Cell Bio!.—1985.— 5, N 4 , — P . 714—720.
Ин-т ядер, физики им. Б. П. Константинова Получено 23.06.89
АН СССР, Ленинград
У Д К 577.213.3
М. В. Асеев, Т. Э. Иващенко, В. Н. Горбунова, В. С. Баранов
ПДРФ-АНАЛИЗ И ДИАГНОСТИКА ГЕМОФИЛИИ А
ПРИ ПОМОЩИ ДНК-ЗОНДОВ
Методом б лот-гибридизации изучен полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
(ПДРФ) ДНК-последовательностей, тесно сцепленных (зонд St-14) или расположен-
ных внутри, т. е. представляющих собой фрагменты гена фактора (F) VIII: С сверты-
вания крови (р51.61 и р1.8), в ленинградской популяции (контроль) — в семьях высо-
кого риска и непосредственно у больных гемофилией А. Частота ПДРФ-аллелей, вы-
явленная этими зондами, во всех исследованных группах в целом хорошо коррелирует
с аналогичными показателями для западноевропейских и североамериканских популя-
ций. В исследованиях с зондом St-14 обнаружены два дополнительных, ранее неописан-
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 4 — 9-923 4 5
ных аллеля 4,35 и 4,2 т. п. о. Подтверждена высокая информативность внесенного зон-
да St-14 и сравнительно низкая — внутригенных зондов. Совместное использование
трех зондов в семьях высокого риска позволило установить диагноз и подтвердить ге-
терозиготное носительство гена гемофилии A y l l u отвергнуть его у двух -женщин —
близких родственников пробандов, а также с вероятностью более 95 % осуществить
пренатaAbHiJio диагностику гемофилии А у плода cJ-ц tiCOCAU ЩШІТІІЯ,
Введение. Использование специфических молекулярных ДНК-зондов
для диагностики наследственных заболеваний как моногенной, так и
хромосомной этиологии — новое магистральное направление современ-
ной медицинской генетики [1—3]. Согласно существующим данным,,
уже сегодня более 170 различных наследственных нарушений может
быть выявлено при помощи ДНК-зондов [1], причем в связи со стре-
мительным прогрессом данных по молекулярной структуре генома че-
ловека число доступных для молекулярной диагностики болезней быст-
ро увеличивается [4, 5] .
Решающие успехи достигнуты в последние годы и в изучении мо-
лекулярной природы гемофилии А — тяжелого наследственного забо-
левания, обусловленного рецессивной мутацией гена F VIII : С, лока-
лизованного в длинном плече Х-хромосомы (Xq27.1) в непосредствен-
ной близости от места привычной ломки Х-хромосомы — Fra-X (Xq28)
[6, 7]. Сразу в нескольких лабораториях мира практически одновремен-
но выделен и охарактеризован сам ген [8, 9], его к Д Н К [10], изучена
экспрессия этого гена in vitro [10] и начат планомерный анализ моле-
кулярной природы мутаций гена F VIII : С, лежащих в основе различ-
ных клинических форм гемофилии А [11 —13]. Важным итогом таких
исследований явилось выделение фрагментов Д Н К как самого гена,
так и тесно сцепленных с ним районов, характеризующихся выражен-
ным П Д Р Ф при обработке определенными эндонуклеазами [14, 15].
Легко выявляемые методом блот-гибридизации или при помощи реак-
ции специфической амплификации Д Н К [16] такие полиморфные сай-
ты оказались удобными молекулярными маркерами мутантного гена F
V I I I : С и позволяют с высокой эффективностью выявить гетерозигот-
ное носительство мутантного гена F VIII : С в семьях высокого риска
[14], проследить генеалогию заболеваний в ряде поколений [15] и
проводить его пренатальную диагностику [17, 18].
В настоящем сообщении приведены первые данные ПДРФ-анали-
за с помощью ДНК-зондов, применяемых для диагностики гемофилии
A1 в отечественной (ленинградской) популяции, в том числе в семьях
высокого риска с целью выявления гетерозиготного носительства и пре-
натальної! диагностики гемофилии А.
Материалы и методы. Р а б о т а выполнена на 32 здоровых донорах и 100 членах
семей высокого риска (всего 30 семей), состоящих на учете Ленинградского гемофи-
лического центра, в том числе на 35 больных гемофилией А, 24 их матерях и 50 бли-
жайших родственниках пробанда. Наследственная передача гемофилии А по женской
линии подтверждена генеалогически в 12 семьях. Диагноз гемофилии А у пробандов
установлен в лаборатории свертывания крови Ленинград, ин-та гематологии и пере-
ливания крови М З Р С Ф С Р .
Д Н К выделяли из 15—20 мл периферической крови в соответствии с модифици-
рованным вариантом бесфенольного метода [18]. С этой целью лейкоциты отделяли от
эритроцитов в желатиновом градиенте ( 3 , 5 % желатина , 0 , 8 % NaCl ) , отмывали фи-
зиологическим раствором, лизировали (0,075 M NaCl, 0,025 M ЭДТА, р Н 8,0; 0,8 %
DS-Na, 0,8 M N a C l O 4 ) . После денатурации белков (хлороформ: октанол, 24:1) и от-
мывки (чистый хлороформ) Д Н К осаждали изопропанолом и растворяли в ТЕ-буфе-
ре. Рестрикционное расщепление Д Н К проводили соответствующими эндонуклеазами
(табл. 1 и 2) в течение 6—16 ч. Качество реакции проверяли на мини-форезе. Электро-
форез образцов Д Н К Для блот-анализа осуществляли в 0,8 % -ной агарозе, после чего
по методике [21] их переносили на капроновый фильтр «Хийу Калур» (Таллинн) .
В работе использованы три Д Н К - з о н д а . Д в а фрагмента Д Н К геномного гена F
VII I : С —р51.61 и р1.8 (любезно предоставлены Р. Лоуном, Сан-Франциско, США)
и один внегенный фрагмент — St-14 (любезно предоставлен Д ж . - Л . Манделем, Страс-
бург, Франция) .
46 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 4 — 9-923 46
Зонд р51.61 (рестриктаза HindIII) размером 4,7 т. п. о., последовательность, со-
д е р ж а щ а я с 14-го по 24-й экзоны и часть 26-го экзона гена F V I I I : С [19]. З о н д
р1.8 (рестриктаза BglI) размером 1,8 т. п. о., последовательность, с о д е р ж а щ а я часть
экзона 26 и З ' -нетранслируемую часть гена F V I I I r C [19]. Зонд St-14 (рестриктаза
Taql), 3,0 т. п. о., фрагмент локуса DXS52 на расстоянии 3—4,5 сантиморганиды от ге-
на F V I I I i C [19].
Т а б л и ц а 1
Частота аллелей локуса DXS52, выявляемая ДНК-зондом Si-14, в X-хромосомах
с нормальным и мутантным аллелями гена F VIII: С
Allelic frequences in DXS52 locus revealed by St-14 probe in normal and haemophilia
A X-chromosomes
№ Аллели
Размер рест-
рикционного
фрагмента,
т. п. о .
Частота встречаемости аллели в популяции, %
№ Аллели
Размер рест-
рикционного
фрагмента,
т. п. о .
Ленинград,
123 нормаль-
ные Х-хромо-
сомы
21 Х-хромосома
с геном гемофи-
лии А
Страсбург,
145 нормальных
Х-хромосом [20]
Сол τ Л эй к Сити,
54 нормальные
Х-хромосомы [20]
1 6,6 0 0 0,7 0
2 5,3 0,8 0 5,5 3,9
3 4,8 10,7 4 11,7 11,8
4 4,5 39,7 32,0 35,9 37,2
5 4,35 1,7 0 0 0
6* 4,2 0,8 0 0 0
7 4,1 17,4 24,0 21,4 ί 9,6
8 4,0 4,1 0 0,2 0
9 3,9 15,7 8,0 9,0 13,7
10 3,4 9,1 24,0 15,9 13,7
* Новые аллели, обнаруженные в данной работе.
Т а б л и ц а 2
HДРФ-анализ аллельного полиморфизма гена F VIII: С,
выявляемого ДНК-зондами р51.61 и р1.8
RFLP-analysis of allelic polymorphism of F VIIIiC gene as
revealed by intrageneiic probes p51-61 and pi.8
Частота аллелей, %
Д Н К - з о н д Рестриктаза
Аллель,
т . п. о.
Ленинград,
55 нормаль-
ных Х-хромо-
сом
США [20]
p51.61 HindIII 2,6 27 30
2,7 73 70
ρ 1.8 BgII 20,0 9,2 IO
5,0 90,8 90
Д Н К - з о н д ы выделяли из культур соответствующих плазмид щелочным лизисом с
последующим осаждением в градиенте хлористого цезия и бромистым этидием, метили
в реакции ник-трансляции 3 2 P (удельная активность 2 - Ю 8 имп · м и н - 1 · м к г - 1 ) , гибриди-
зовали на фильтрах ( 6 X S S C , 5 Х р а с т в о р Денхарда , 0,05 % DS-Na, 100 м к г / м л Д Н К
спермы лосося, 1 0 % декстрансульфат, 18 ч, 65 °С) с рестрицированной Д Н К доноров
по методу [21] и после отмывки экспонировали с рентгеновской пленкой в кассетах
с усиливающим экраном при — 70 °С.
Результаты и обсуждение. Итоги П Д Р Ф - а н а л и з а суммированы в
табл. 1 и 2. При этом в случае внегенного зонда St-14 (табл. 1) дан-
ные по Х-хромосоме здоровых доноров и «здоровых», т. е. не несущих
мутации гемофилии Ay Х-хромосом объединены. Всего, таким образом,
в системе St-MjTaql проанализированы 123 «здоровые» Х-хромосомы
и 21 Х-хромосома с геном гемофилии А. Спектр аллельного полимор-
физма в случае зонда St-14 отличается особенно большим разнообра-
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 4 — 9-923 4 7
зием. В системе Si-MITaq 1 выявляются до 10 различных аллелей как
на нормальной Х-хромосоме, так и на Х-хромосоме с мутацией гемо-
филии А. Такая вариабельность сайтов рестрикции дает при блот-
анализе весьма характерный паттерн аллелей с молекулярной массой
от 3,4 до 6,6 т. п. о., нередко уникальный для каждого индивидуума
(рис. 1). Частота различных типов St-14 аллелей в ленинградской по-
пуляции в целом хорошо коррелирует с аналогичными показателями в
популяциях Западной Европы и Северной Америки [20]. Вместе с тем
Рис. 1. П Д Р Ф - а и а л и з 21 индивидуума из популяции Ленинграда . Рестриктаза Taqly
;юпд St-14. Ра змеры фрагментов даны в т. п. о.
Fip;. 1. R F L P - a n a l y s i s of 21 persons in the Len ing rad popula t ion TaqI , probe St-14. Si-
zes of f r a g m e n t s are given in kb
в наших исследованиях с зондом St-14 были обнаружены два дополни-
тельных, ранее неописанных аллеля размером 4,35 и 4,2 т. п. о., частота
которых, однако, очень низкая (1,7 и 0,8 % соответственно).
В отличие от Si-M оба внутригенных зонда выявляли полимор-
физм лишь по одному сайту рестрикции. В обоих случаях соотноше-
ние аллелей в ленинградской популяции не отличалось от известных
литературных данных (табл. 2).
Проведенный популяционный анализ П Д Р Ф позволил предполо-
жить высокую информативность (гетерозиготность по Х-сцепленпым
аллелям) внегенного локуса DXS52, тестируемого зондом St-MjTaqly
и значительно более низкую — соответствующих фрагментов самого
гена F VII i : С по сайтам HindIII и BglI соответственно. ПДРФ-ана -
лиз семей с гемофилией А подтвердил это предположение. Информа-
тивными, т. е. гетерозиготными по соответствующим П Д Р Ф аллелям,
оказались матери детей с гемофилией А в 25 из 30 обследованных се-
мей, причем большинство из них было информативно только по зонду
Si-14. П Д Р Ф - а н а л и з 21 Х-хромосомы с геном гемофилии А в системе
St-MjTaql выявил те же сочетания аллелей, что и в Х-хромосомах без
этой мутации (табл. 1). Наблюдаемые при этом различия частот ряда
аллелей «больных» и «здоровых» Х-хромосом были статистически не-
достоверными.
Применение зонда St-14 позволило подтвердить гетерозиготное
носительство гемофилии у 11 и отвергнуть его у двух женщин группы
высокого риска с вероятностью более 95 %. При помощи внутригенных
зондов наличие гена гемофилии А с вероятностью около 99 % уста-
новлено у пяти из шести близких родственниц пробанда. Результаты
П Д Р Ф - а н а л и з а диагностических случаев гетерозиготного носительства
гемофилии А внегенным и внутригеиными ДНК-зондами совпадали.
Пример ПДРФ-анализа с целью выяснения гетерозиготного носитель-
ства в семье с гемофилией Л приведен на рис. 2.
В одной из 12 семей с точно установленной наследуемой формой
гемофилии А проведена пренатальная диагностика. С этой целью
осуществлен П Д Р Ф - а н а л и з всех доступных здоровых и больных членов
семьи П. и выяснено, что молекулярным маркером мутации гемофилии
А в данной семье является аллель 4,5 т. п. о. (рис. 3). На 9-й неделе
48 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 4 — 9-923 48
беременности у матери — облигатной гетерозиготной носительницы при
помощи хорионбиопсии получены ворсинки хориона плода, использо-
ванные для цитогенетического и молекулярного анализа. Мужской пол
плода установлен по наличию Y-хромосомы в интерфазных клетках и
в метафазных пластинках. Наличие аллеля размером 4,5 т. п. о. у пло-
да (рис. '3) однозначно
доказывало присут-
ствие у пробанда X-
хромосомы с мутацией
гемофилии А. По же-
ланию женщины дан-
ная беременность была
прервана на 11-й неде-
ле. П Д Р Ф - а н а л и з при
помощи внегенного зон-
Рис. 2. Родословные и
П Д Р Ф - а н а л и з двух семей
с наследственной формой
гемофилии А (рестриктаза
Taqly зонд St-14): а — му-
тантный ген сцеплен с ал-
лелем 3,9 т. п. о.; б — с ал-
лелями 3,4 и 4,1 т. п. о.
Fig . 2. R F L P - a n a l y s i s and
pedigrees of two famil ies
wi th hered i ta ry hemophil ia
A. (probe S t -14) : TaqI , a —
hemophil ia A gene linked to
3.9 kb allele; б — hemophi-
lia A gene linked to 3.4 and
4.1 kb alleles
да St-14 позволил обнаружить, что частота и соотношение аллелей у
жителей Ленинграда соответствуют таковым у жителей Западной Евро-
пы и Северной Америки [20]. Интересной особенностью, однако, пред-
ставляется наличие двух ранее неизвестных аллелей (4,2 и 4,35 т. п. о.).
Являются ли они редкой случайной находкой либо представляют собой
характерную особенность тонкой структуры локуса DXS52 ленинград-
ской популяции или какой-нибудь этнической группы северо-западного
региона страны — ответы на эти вопросы требуют специального изуче-
ния на большем материале. Частота аллелей St-14/Taql при анализе
нормальных Х-хромосом и Х-хромосом, несущих мутацию гемофилии
A1 статистически не отличается, т. е. аллели локуса DXS52 не обнару-
живают неравновесного сцепления с мутантным или нормальным геном
гемофилии А. Эти результаты хорошо подтверждают известные литера-
турные данные [14, 15].
В плане пренатальной диагностики и уточнения гетерозиготного
носительства гемофилии А особенно информативным оказался зонд
St-14. Следует, однако, учитывать, что локус DXS52, фрагментом ко-
торого является зонд St-14, находится на расстоянии 3,5—4 сантимор-
ганиды от гена F VIII : С, т. е. с вероятностью 3,5—4 % между этими
генами возможен кроссинговер. Принимая во внимание, что частота
кроссинговера в женском майозе примерно в 1,5—2 раза больше, чем
в мужском, вероятность ошибки ДНК-диагностики в случае зонда St-14
может возрастать до 5—6 % [4, 18]. Более надежные результаты диаг-
ностики гемофилии А дают внутригенные зонды. Информативность
примененных в работе внутригенных зондов р51.61 (рестриктаза
HindIII) и ρ 1.8 (рестриктаза BglI) оказалась невысока. Известно, что
более перспективным для целей диагностики является использование
системы р51.61/Вс11 [17, 18]. К сожалению, отсутствие такой отечест-
венной рестриктазы либо ее изошизомера служит серьезным препятст-
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 4 — 9 -923 49
виєм для использования этой очень перспективной аллельной системы.
Настоятельная необходимость в рестриктазе BclI особенно очевидна в
настоящее время, когда именно для этого сайта рестрикции предло-
жена система олпгоиуклеотидных праймеров, позволяющая проводить
специфическую амплификацию со-
ответствующего участка гена F
V I I I : С [16]. Точность диагностики
при этом возрастает до 99 % [16].
Поскольку существующие им-
муноферментные и другие лабора-
торные методы диагностики гемофи-
лии А проводятся только на образ-
цах крови, провести верификацию
диагностированного нами случая ге-
мофилии А у внутриутробного пло-
да оказалось невозможным. Между
тем разработка надежных методов
выявления гемофилии у внутри-
утробного плода после предшеству-
ющей молекулярной диагностики
представляется весьма актуальной
задачей современной коагулогии и
гематологии. В равной мере это от-
носится и к необходимости разработ-
Рис. 3. Пренатальная диагностика гемофи-
лии А в семье П. Размеры фрагментов да-
ны в т. п. о.
Fig. 3. P rena t a l d i agnos i s of hemophil ia
A in fami ly P. Sizes of f r a g m e n t s are g iven
in kb
ки более надежных тестов для выявления гетерозиготного носительст-
ва гемофилии А, так как существующие функциональные и иммунофер-
ментные методы, по крайней мере в 10—15 % случаев, дают ошибочные
результаты [14]. В этой связи необходимо подчеркнуть, что эффек-
тивная пренатальная диагностика гемофилии А возможна лишь при
доказанном гетерозиготном носительстве мутантного гена у матери,
поскольку значительная часть случаев гемофилии А (около 30 %) име-
ет спонтанное происхождение, т. е. возникает de novo [14]. Вероятность
повторного мутирования гена F VIII : С в гаметах той же женщины
невелика, и эти семьи должны быть исключены из пренатальной
диагностики. Отбор подобных семей проводится как на основании
генеалогического анализа, так и по результатам коагуляционных
исследований крови матери на гетерозиготное носительство гемо-
филии А.
Авторы выражают искреннюю признательность проф. Дж.-Л. Man-
делю (Страсбург, Франция) и проф. Р. Лоуну (Сан-Франциско, США),
за предоставление ДНК-зондов на гемофилию At а также благодар-
ность сотруднику Ленинград, ин-та гематологии и переливания крови
Л. П. Папаян и сотрудникам Ленинград, гемофил. центра Т. А. Андре-
евой, П. В. Храпову за предоставление семей с гемофилией А.
50 ISSN 0233-7&57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. т. G. № 2'
R F L P - A N A L Y S I S AND H A E M O P H I L I A A D I A G N O S T I C S W I T H DNA P R O B E S
Asecv M. V., Ivashchenko T. E., Gorbunova V. AL, Baranov V. S.
Ins t i tu te of Obstet r ics and Gynecology,
Academy of Medical Scicnces of the U S S R , Len ing rad
S u m m a r у
R F L P ana lys i s of DNA sequences close to (probe St-14) or inside Fac tor VI I I : C gene
(probes p. 51.61 and probe p. 1.8) w a s carried out in the Len ing rad popula t ion (control
g r o u p ) , in the famil ies with high risk of haemophi l ia A as well as in pa t i en t s wi th hae-
mophil ia A. The f requency of co r respond ing alleles in normal and haemophi l ia A X chro-
mosomes were in good concordance with relat ive allelic f requencies in popu la t ions of
Western Europe and North America. Two ra re and previously unkown al leles (4.2 and
4.35 base pairs) were detected in s tudies wi th St-14 probe. H i g h in fo rmat iv i ty of closely
linked St-14 probe and low predict ive va lues of tested in t ragene t i c probes have been
conf i rmed. U s i n g R F L P technique with 3 tested probes haemophi l ia A he te rozygo tes car-
riers have been d iagnosed in 11 and rejected in 2 close female re la t ives of haemophi l ic
pat ients . P rena ta l d i agnos i s of haemophi l ia A in a 9-week embryo has been per fomed.
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Jeanpierre MJunien Cl. DNA ana lys i s as clinical inves t iga t ion : When and h o w ? / /
Ann. Gene t .—1984.— 27, N 3 , — P . 135—147.
2. Баранов В. С. Дородовая диагностика наследственных болезней, современное сос-
тояние, реальные возможности и п е р с п е к т и в ы / / В е с т н . А М Н СССР. ·— 1987.·—
№ 4,— С. 44—50.
3. Калинин В. II. Генно-инженерная диагностика наследственных болезнен / / Диагнос-
тика наследст. болезней.— M., 1986 — С . 103—122.
4. Sommer S. A., Sobell J. L. Applicat ion of DNA-based d i agnos i s to pat ient care: the
example of hemophil ia A / / Mayo Clinic Proc.— 1987.—62, N 5 . — P . 3 8 7 - 4 0 4 .
5. Cooper D. AL, Schmidike J. D iagnos i s of genetic d iseases u s ing recombinant D N A / /
Hum. G e n e t — 1987,— 77, N 2 , — P . 66—75.
6. Reeombinalion between the factor VI I I gene and the DXS52 locus g ives the most pro-
bable genet ic order as cen t romere-Fra (X) -DXS15-DXS52-F8C-ielomere / L. M. Mulli-
gan , H. J. Grover , V. S. Blanchet te et a l . / / A m e r . J. Med. Genet .— 1987,— 26, N 4,—
P. 751—760.
7. The human genes for hemophil ia B f lank the X chromosome f rag i l e site at Xq27.3 /
M. Purrc l lo , B. Alhadef f , D. Espos i to et a l . / / T h e E M B O J .—1985 —4, N 3.—
P. 725—729.
8. Characterization of the h u m a n factor V H I gene / J . W. Gitscher, W. I. Wood, Т. M. Go-
ralka et a l . / / N a t u r e . — 1984.—312, N 3256 ,—P. 326—330.
9. Structure of h u m a n fac tor VI I I / G. A. Vahar , A. B. Keyt, D. Ea ton et al. / / Ibid.—
P. 337—342.
10. Molecular c loning of a cDNA encoding h u m a n ant ihemophi l ic fac tor / J . J. Toole,
JL L. Knopf, J. M. Wozney et al. / / Ibid.— P. 342—347.
11. Nonsense and missense mu ta t i ons in hemophil ia A: es t imate of the relat ive mu ta t ion
ra te at CG dinucleot ides / H. Youssouf ian , St. E. Antonarak i s , W. Bell et a l . / / A m e r .
J. Hum. Genet.— 1988,—42, N 4 . — P . 718—725.
12. Characterization of a par t ia l deletion of the factor VI I I gene in a haemophi l iac wi th
i n h i b i t o r / B . Bardoni , M. Sampier to , M. Romano et al. / / Hum. Genet .— 1988.— 79,
N 1 ,—P. 86—88.
13. Gitscher J. Ma te rna l dupl icat ion associated wi th gene deletion in sporadic hemophi-
l i a / / A m e r . J. Hum. Genet — 1988,—43, N 3 . — P . 274—279.
14. Detection of hemophil ia A carr iers us ing in t ragenic fac tor VI I I : C DNA polymorp-
hism / R. L. Lanco, J. A. Phill ips, P. J. Or l ando et a l . / / B l o o d . — 1987,—69, N 5.—
P. 1539—1541.
15. RFLP ana lys i s in famil ies with sporadic haemophil ia A. Es t ima te of the m u t a t i o n
rat io in male and female game te s / F. Bernardi , G. Marchet t i , V. B e r t a g n o l o et al. / /
Hum. Genet .— 1987.—76, N 2 . — P . 253—256.
16. Kogati S. G., Doherty M., Gitschier J. An improved method for p r ena t a l d i agnos i s of
genetic diseases bv ana lys i s of amplif ied DNA sequences. Applicat ion to hemophi l ia
A / / N e w Engl . J. Med — 1987.—317, N 16 .—P. 985—990.
17. Prenatal d i agnos i s of haemophi l ia A by fac tor V I I I gene ana lys i s / S. Έ. A n t o n a r a -
kis, K. L. Copeland, R. J. Ca rpen te r et a l . / / L a n c e t — 1985,—123, N 8443,—
1407—1409.
18. 1/2Erste e rgcbnisse bei der genomischen Car r ie rd iagnos t ik in Risikosippen mit Ha-
mophilic A und B in der D D R / M . Wehncr t , F. H. H e r r m a n n , H. Metzke et al. / / Z.
gesarnte inn. Med.— 1988,— 43, H. 16 ,—S. 441—444.
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. т. 6. № 2 4 — 9-923 51
19. Genetic m a p p i n g and d iagnosis of haemophilia A achieved through a BclI polymorp-
hism in the factor VII I gene /' J. Gitschier, D. Dravna, E. G. D. Tuddenham et a l . / /
Nature .— 1985 —314 , N 6013 .—P. 738—740.
20. Genetic screening for haemophil ia A with a polymorphic DNA probes / 1 . Oberle,
G. Camerino, R. Heil ig et a l . / / N e w Engl . J. Med.— 1985 — 312, N 13 .—P. 682—
686.
21. Maniaiis T., Fritsch E., Sambrook J. Molccular cloning.—New York: Cold Spring
Harbor , 1982,—420 p.
Ин-т акушерства и гинекологии АМН СССР, Ленинград Получено 06.04.89
УДК 575.116.4
В. Н. Горбунова, В. В. Красилышков, М. В. Асеев,
II. В. Санцевич, В. С. Баранов
ПДРФ-АНАЛИЗ ГЕНА МИОДИСТРОФИИ ДЮШЕННА
В ЛЕНИНГРАДСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ
И В СЕМЬЯХ ВЫСОКОГО РИСКА
Методом б лот-гибридизации исследован аллельный полиморфизм двух районов прокси-
мальной части гена миоОисторфии Дюшенна— DXS164 (зонд pERT87.15) и DXS206
(зонд pXJl.l) у жителей Ленинграда и в семьях высокого риска с миодистрофией
Дюшенна (МДД). Частота аллельного полиморфизма в популяции Ленинграда для
обоих изученных фрагментов гена МДД оказалась практически идентичной таковой в
популяции Северной Америки. Число женщин, гетерозиготных по аллелям локусов
DXS164 и DXS206, было примерно одинаковым и равнялось 40 %. Аллельный полимор-
физм гена МДД в семьях высокого риска не отличался от популяционного. Семь из де-
вяти семей высокого риска, подвергнутых ΠДРФ-анализу, оказались информативными
для последующей ДНК-диагностики. У одного из шести обследованных больных с МДД
обнаружена делеция проксимальной части гена МДД.
М Д Д — тяжелое летальное наследственное заболевание, сцепленное с
полом и встречающееся в среднем с частотой 1 : 3 000 новорожденных
мальчиков [1, 2] . Методами молекулярной генетики мутация картиро-
вана в средней части короткого плеча Х-хромосомы ( Х р 2 1 ) , подробно
охарактеризован сам ген, оказавшийся одним из наиболее крупных
известных генов млекопитающих [3], выделена и частично секвениро-
вана его к Д Н К [4] и начат планомерный анализ молекулярной приро-
ды этого заболевания. Оказалось, в частности, что у 60 % больных
М Д Д наблюдается делеция одного или нескольких экзонов гена М Д Д
[5]. На модели М Д Д реализован принцип «обратной генетики», впер-
вые идентифицирован белковый продукт этого гена — белок дистрофии,
содержащийся в норме в сарколемме мышечных волокон [6]. В случае
мутации М Д Д концентрация этого белка в скелетных мышцах резко
уменьшается. Получены и клонированы многочисленные фрагменты
самого гена, его к Д Н К и многочисленные последовательности Д Н К -
локусов, тесно сцепленных с геном М Д Д , позволяющие с высокой эф-
фективностью выявлять гетерозиготное носительство мутации М Д Д и
проводить диагностику (в том числе и пренатальную) этого тяжелого
заболевания [7].
Цель работы состояла в популяционном анализе частоты аллель-
ного полиморфизма двух районов гена М Д Д DXS164 и DXS206 при
помощи соответствующих ДНК-зондов у жителей Ленинграда, а так-
же в семьях высокого риска с М Д Д .
Материалы и методы. Работа выполнена на 101 здоровом доноре и 27 членах се-
мей высокого риска с М Д Д (всего 9 семей), из них 6 пробандов, 9 матерей, 12 сибсов
и ближайших родственников пробанда. Все обследованные семьи состоят на учете в
медико-генетической поликлинике № 70 Ленинграда. Наследственный характер забо-
левания установлен генеалогическим анализом родословных и верифицирован методом
дискриминационного анализа уровня сывороточной креатинфосфокиназы [8] в семи
семьях и не подтвержден — в двух.
52 ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1990. т. G. № 2
|