Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида
С помощью электрофореза в свободном потоке (ЭФСП) впервые выделены из бактериальных клеток Escherichia coli комплексы ДНК с мембранными белками. Изучены изменения ДНК и белков этих комплексов после УФ-облучения клеток. Показана возможность с помощью метода ЭФСП выявлять повреждения биомолекул в сост...
Gespeichert in:
| Datum: | 1990 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1990
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153436 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида / В.А. Сигаева, А.В. Гаврюшкин, Ю.А. Ершов // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 46-50. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-153436 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1534362019-06-15T01:28:17Z Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида Сигаева, В.А. Гаврюшкин, А.В. Ершов, Ю.А. Структура и функции биополимеров С помощью электрофореза в свободном потоке (ЭФСП) впервые выделены из бактериальных клеток Escherichia coli комплексы ДНК с мембранными белками. Изучены изменения ДНК и белков этих комплексов после УФ-облучения клеток. Показана возможность с помощью метода ЭФСП выявлять повреждения биомолекул в составе ненарушенного нуклеопротеидного комплекса. За допомогою електрофорезу у вільному потоці (ЕФСП) вперше виділено з бактерійних клітин Escherichia coli комплекси ДНК з мембранними білками. Вивчено зміни ДНК і білків цих комплексів після УФ-опромінення клітин. Показано можливість за допомогою методу ЕФСП виявляти пошкодження біомолекул у складі непорушеного нуклеопротеїдного комплексу. DNA-membrane complexes from E. coli were isolated by free-flow clectrophoresis. The changes in their structure after UV-irradiation were investigated. It was shown that free-flow electrophoresis can detect biomolecule damages in DNA-protein complex. 1990 Article Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида / В.А. Сигаева, А.В. Гаврюшкин, Ю.А. Ершов // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 46-50. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00026A http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153436 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Сигаева, В.А. Гаврюшкин, А.В. Ершов, Ю.А. Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида Биополимеры и клетка |
| description |
С помощью электрофореза в свободном потоке (ЭФСП) впервые выделены из бактериальных клеток Escherichia coli комплексы ДНК с мембранными белками. Изучены изменения ДНК и белков этих комплексов после УФ-облучения клеток. Показана возможность с помощью метода ЭФСП выявлять повреждения биомолекул в составе ненарушенного нуклеопротеидного комплекса. |
| format |
Article |
| author |
Сигаева, В.А. Гаврюшкин, А.В. Ершов, Ю.А. |
| author_facet |
Сигаева, В.А. Гаврюшкин, А.В. Ершов, Ю.А. |
| author_sort |
Сигаева, В.А. |
| title |
Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида |
| title_short |
Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида |
| title_full |
Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида |
| title_fullStr |
Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида |
| title_full_unstemmed |
Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида |
| title_sort |
исследование прочно связанных днк-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1990 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153436 |
| citation_txt |
Исследование прочно связанных ДНК-мембранных комплексов в составе бактериального нуклеоида / В.А. Сигаева, А.В. Гаврюшкин, Ю.А. Ершов // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 46-50. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT sigaevava issledovaniepročnosvâzannyhdnkmembrannyhkompleksovvsostavebakterialʹnogonukleoida AT gavrûškinav issledovaniepročnosvâzannyhdnkmembrannyhkompleksovvsostavebakterialʹnogonukleoida AT eršovûa issledovaniepročnosvâzannyhdnkmembrannyhkompleksovvsostavebakterialʹnogonukleoida |
| first_indexed |
2025-07-14T04:58:09Z |
| last_indexed |
2025-07-14T04:58:09Z |
| _version_ |
1837597029078925312 |
| fulltext |
18. Hiratsuka Т. Nucleot ide- induced c h a n g e of the in terac t ion be tween the 20- and 26-
k i loda l ton heavy-cha in s e g m e n t s of myos in adenos ine t r i p h o s p h a t a s e revealed by che-
mical c r o s s / / B i o c h e m i s t r y — 1 9 8 7 , — 2 6 , X 1 1 . — P . 3168—3173'.
19. Alexis M. N., Gratzer W. B. In te rac t ion of skeletal myos in l ight cha ins with calcium
i o n s / / I b i d . - 1 9 7 8 . - 1 7 , N 12 — P. 2 3 1 9 - 2 3 2 5 .
20. Trayer / . P., Trayer H. R., Levine B. A. Evidence tha t the amino t e rmina l reg ion of
Α Ι - l i g h t chain of myos in in te rac t s direct ly wi th the ca rboxy l - t e rmina l reg ion of
act in: A P M R s t u d y / / E u r . J . Biochem.— 19-87.— 161, N I і .—P. 259—266.
21. Position of the amino-ac ide t e r m i n u s of myos in l ight chain Г and l ight chain 2 de-
t e rmined by electron microscopy with monoc lona l a n t i b o d y / M . T o k u n a g a , M. Suzu-
ki, K. Saeki ct a l . / / J . Мої. Biol .— 1987,— 194, N 2 , — P . 245—256.
22. Mitioua O., Matsuda S., Yagi K. Calc ium-induced con fo rma t iona l c h a n g c of 20 000
da l ton l ight chain of ve r t eb ra t e s t r ia ted musc le myos in / / J . Biochem.— 1983.— 94,
N 1.— P. 25—36.
23. Waller G., Lowei/ S. Myos in subuni t in te rac t ion : local iza t ion of the alkal i l ight
c h a i n s / / J . Biol. Chem.— 1985.— 260, N 2 6 . — P . 14368—14373.
24. Lu R. Cli., Moo L., Wong A. G. Both the 25-ki lodal ton and 50-ki lodal ton d o m a i n s in
myos in s u b f r a g m e n t - Γ are close to the react ive t h i o l s / / P r o c . Nat . Acad. Sci. USA.—
1986.—83, N 17 ,—P. 6392—6396.
Н И И физиологии Киев. гос. ун-та им. Т. Г. Шевченко Получено 05.05.89
© В. А. Сигаева, А. В. Гаврюшкин, Ю. А. Ершов, 1990
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЧНО СВЯЗАННЫХ
ДНК-МЕМБРАННЫХ КОМПЛЕКСОВ
В СОСТАВЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО НУКЛЕОИДА
С помощью электрофореза в свободном потоке (ЭФСГ1) впервые выделены из бакте-
риальных клеток Escherichia coli комплексы ДНК с мембранными белками. Изучены
изменения ДНК и белков этих комплексов после УФ-облучения клеток. Показана воз-
можность с помощью метода ЭФСП выявлять повреждения биомолекул о составе
ненарушенного нуклеопротеидного комплекса.
Введение. Комплексы Д Н К с белками обеспечивают высокую степень
компактности Д Н К и осуществление ее важнейших функций [1J. При
воздействии на клетки УФ-радиации компоненты ДНК-белкового комп-
лекса претерпевают различные изменения. Имеются данные об увели-
чении количества белка, прочно связанного с Д Н К в УФ-облучепиых
клетках (УФ-сшивапие Д Н К с белком) [2]. Определение ДНК-белко-
вых сшивок в настоящее время затруднено, длительные процедуры их
выделения и очистки сопровождаются повреждением биомолекул и по-
терей их функциональной активности. При этом исследования ведут-
ся с нуклеопротеидами (нуклеотидопептидами), далекими от своего
нативиого состояния в клетке, что осложняет интерпретацию этих дан-
ных в биологических экспериментах. Поиск методов определения Д Н К -
белковых сшивок в целой клетке или в макромолекуляриом комплексе
важен для изучения их биологической роли. Быстро выделить ненару-
шенный макромолекулярный комплекс из бактериальных клеток позво-
ляет метод ЭФСП [3j.
В данной работе впервые с помощью этого метода исследованы
ДНК-белковые комплексы Е. coli, а также изменения состава Д Н К и
белков этих комплексов после УФ-облучения клеток.
Материалы и методы. В работе использован бактериальный штамм Е. coli К12
(дикий тип) , полученный из коллекции микроорганизмов Ин-та биохимии и физиоло-
гии микроорганизмов А Н СССР. Клетки выращивали в жидкой питательной среде М 9
в колбах по 250 мл на качалке при 37 °С. Д л я того чтобы пометить Д Н К , в культуру
через 1 ч после посева вносили 3 Н-тимидин (18,5 М Б к ) (удельная радиоактивность
0,66 Т Б к / м М ) . Клетки в стационарной фазе роста о с а ж д а л и центрифугированием,
промывали 0,02 M триэтаноламиновым буфером с удельной электропроводностью
46 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. λ<° 3 46
0,1 О м - 1 м - 1 и рН 7,0 (Л), ресуспендировали в том ж е буфере до концентрации IO7
клеток в 1 мл. Облучали 1 мл суспензии под лампой Д Б 30 (254 им) при 0—2 °С в
чашках Петри диаметром 11 см. Дозиметрию проводили ферриоксалатным методом
[4]. Д о з а облучения составляла 20 Д ж / м 2 . Получение и лизис протопластов выполня-
ли по методу [5]. Нуклеоид, связанный с мембраной, осторожно ресуспендировали
в 2 M растворе XaCl и центрифугировали для удаления белков. Осадок суспендиро-
вали в буфере (А), 1 мл раствора вводили в камеру ЭФСП. Разделение белков с по-
мощью Э Ф С П осуществляли в камере прибора «Desaga FF48». Р е ж и м разделения:
ток в камере 150 мА, напряжение на электродах 650 В, время нахождения образца в
Рис. 1. Электрофоретическпе профили разделения Д Н К и белков: а — контрольные
клетки; б — УФ-облученные в дозе 20 Д ж / м 2 (1 — Д Н К , 2 — белок)
1. Elcctroplioretic t races of DNA and protein spera t ion by f ree f low-elec t rophorcs is :
a —• control ; б — af te r UV i r radia t ion in dose of 20 D g / m ( / — DNA; 2 — prote in)
Рис. 2. Электронная фотография ДНК-мембранного комплекса, выделенного с помощью
Fig. 2. Elect ron microscopy of DNA-membrane complex isolated by f ree f low-elect ropho-
rcsis
электрическом поле 170 с, температура в камере 7 °С. После электрофореза получали
48 фракций по 5—10 мл. В к а ж д о й из них определяли оптическую плотность π Ή -
радиоактивпость. Электронно-микроскопическое исследование проводили по приборе
«Hitachi», пробы готовили по методу [б]. Прочно связанный Д Н К - б е л к о в ы й комплекс
выделяли, как описано [5], и обрабатывали проназой и Д Н К а з о й 1. Проназу добавля -
ли к препаратам, содержащим Д Н К (100 м к г / м л в количестве 50 м к г / м л ) , инкубиро-
вали при 37 °С 20 мин, а Д Н К а з у I — в концентрации 0,003 мг /мл , инкубировали
смесь при 37 °С 30 мин, 1, 7 и 10 ч. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
(ПААГ) проводили по методу Лем мли [7], электрофорез Д Н К — в 0,8 %-ном агароз-
ном геле, содержащем 0,09 M трис-боратный буфер, р Н 8,3, и 2 мМ ЭДТА. Д Н К выяв-
ляли, окрашивая гель бромистым этидием в концентрации 1 мкг /мл . Относительную
радиоактивность Д Н К регистрировали с помощью сцинтилляционного спектрометра
SL-4000 («Inter technique», Франция) .
Результаты и обсуждение. В ы д е л е н и е и д е п р о т е и н и з а -
ц и я н у к л е о и д а. На первом этапе выделения нуклеоида клетки
обрабатывали лизоцимом в концентрации 10 мкг/мл. Концентрация
фермента была снижена для предотвращения адсорбции экзогенного
белка на нуклеоиде [1]. Последующий мягкий лизис протопластов в
присутствии пепонпых детергентов приводил к вскрытию протопластов
и освобождению нуклеоида, который собирали на подушке 80 %-ного
раствора сахарозы. После центрифугирования в средней части про-
бирки образовывалась опалесцирующая полоса нуклеоида, а свободные
белки рибонуклеопротеида оставались в супернатанте.
К полученному нуклеоиду добавляли 2 M раствор NaCl, затем
разделяли Д Н К и белки с помощью ЭФСП.
На электрофоретических профилях разделения белков и Д Н К в ка-
мере ЭФСП (рис. 1) видно, что связанные с Д Н К белки обнаружива-
Э Ф С П
48 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. λ<° 3 47
, л е я во фракциях 10—14, а диссоциированные — находятся во фрак-
циях 15—21.
Ранее установлено, что полученные с помощью метода ЭФСП
Д Н ^ - б е л к о в ы е комплексы содержат белки наружной и цитоплазмати-
ческой мембран [3]. Электронные фотографии ДНК-комплекса после
очистки его в камере ЭФСП (рис. 2) показывают, что такой способ
депротеинизации не приводит к полному разрушению нуклеоида, петли
Д Н К остаются ненарушенными. Кроме того, бактериальная Д Н К име-
ет точки прикрепления к мембране. Специальные исследования приро-
ды ассоциации Д Н К с мембранными белками позволяют предположить
Рис. 3. Электрофоретические профили Д Н К в агарозном геле: а — ДНК-мембранный
комплекс, обработанный Д Н К а з о й I в течение 30 мин; б·—в течение 1 ч; в, г — 7 ч;
а — в — необлученные клетки; г — УФ-облученные. Справа указано число пар нуклео-
тидов в стандартных фрагментах
Fig. 3. DNA Electrophoretic t races in agarose gel: a — DNA-membrane complex treated
with disoxyribonuclease 1 for 30 min; б — for 60 minutes, в, г — f o r 7 hours, a-e —
control, г — UV-irradiat ion. Right-number of nucleotide pairs in markers
Рис. 4. Денситограммы электрофоретических профилей белков нуклеопротеида, не обра-
ботанного солями с высокой ионной силой (а) , и прочно связанных с Д Н К {б)\ 1 — не-
облученные клетки; 2 — УФ-облученные
Fig. 4. Dens i tograms of protein electrophoretic profiles: 1 — proteins of DNA-membra-
ne complex not t reated with sal ts of h igh ionic s t rength; 2 — protein closely bounded
with DNA; (a — cells are not t reated with UV-irradiat ion, б — UV-irradiat ion)
существование связи ковалентного типа [8]. Д л я проверки данного
предположения проводили дальнейшую депротеииизацию ДНК-белко-
вого комплекса различными растворами солей с высокой ионной силой
(4 M гуанидингидрохлорид, 6 M мочевина), разделение комплекса па
колонке ГАП. Обработка прочно связанного ДНК-белкового комплекса
проназой освобождала Д Н К . Нуклеазная обработка комплекса позво-
лила выделить белки и так называемую «якорную» Д Н К , т. е. фраг-
менты Д Н К , которые находятся в ассоциации с мембранными белками.
Э л е к т р о ф о р е з Д Н К в а г а р о з н о м г е л е проводили
после дозированной и исчерпывающей обработки ДНК-мембранных
комплексов Д Н К а з о й I. В суммарном препарате Д Н К , выделенной
из очищенных в камере ЭФСП препаратов ДНК-мембранного комплек-
са, после пуклеазной обработки в течение 30 мин, 1, 7 и 10 ч обнару-
жен ряд фрагментов различной длины — 1 000, 700, ~ 100 н. п.
(рис. 3).
Э л е к т р о ф о р е з б е л к о в в ПААГ показал (рис. 4, а ) , что
белки, не диссоциирующие в 2 M NaCl, имеют хорошо воспроизводи-
мый профиль, гетерогенны по составу. После дополнительной депроте-
ииизации комплекса общее количество белков значительно уменьша-
ется, главным образом за счет высокомолекулярных белков. В прочно
48 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. λ<° 3 48
связанном ДШ\-белковом комплексе остаются белки с низкой моле-
кулярной массой (рис. 4, б) , преобладающим среди них является белок
31 ООО, обнаруженный в составе препаратов внешней мембраны. Пока-
зано, что он может связываться с Д Н К , и этот комплекс пе диссоции-
рует в присутствии DS-Na [9]. Р я д минорных компонентов с молеку-
лярной массой 67 ООО, 80 ООО также обнаружен ранее в составе внут-
ренней мембраны [10]. Возможно, что эти белки образуют скелетную
структуру бактериальной хромосомы, необходимую для специфической
укладки и сегрегации хромосомы. На ней локализованы ферменты, обе-
спечивающие синтез, репликацию, транскрипцию Д Н К [5].
У Ф-о б л у ч е π и е приводит к изменениям в структуре пуклеопро-
теида. На электрофоретических профилях разделения белков и Д Н К ,
выделенных из УФ-облученпых клеток (рис. 1), наблюдается измене-
ние спектра распределения белков в электрофоретической камере, уве-
личение количества белков, находящихся в комплексе с Д Н К . Допол-
нительная депротеипизация ДНК-белкового комплекса па колонке с
ГАПом приводила к диссоциации значительной части белков, однако
1—2 % их оставались связанными с Д Н К . В УФ-облучеппых клетках
количество таких белков было в 1,5—2 раза больше по сравнению с
контролем. Это согласуется с полученными ранее данными об УФ-ип-
дуцпроваппом сшивании Д Н К с белком [2]. В электрофоретических
профилях белков в ПААГ (рис. 4, б) заметно увеличение количества
белков с молекулярной массой 31 000, 80 000. Молекулярная масса
«якорной» Д Н К , выделенной из УФ-облученных клеток, как и в конт-
рольных клетках, соответствует фрагментам, имеющим длину ~ 100 п. и.
(рис. 3, д). Увеличение количества прочно связанного с Д Н К белка,
возникающее в результате УФ-облучеиия, может привести к наруше-
нию ДНК-белковых взаимодействий и важнейших функций Д Н К .
Таким образом, применение различных методов позволило иссле-
довать прочно связанные комплексы Д Н К с мембранными белками. По-
сле УФ-облучения клеток не отмечено изменений длины фрагментов
Д Н К , прилегающих к мембране, не обнаружено появления качественно
новых белков, однако количество этих белков увеличивается, главным
образом за счет низкомолекулярных полипептидов, играющих важную
роль в стабилизации и функционировании Д Н К . УФ-индуцироваппое
сшивание Д Н К с этими белками может быть обнаружено в ненарушен-
ном пуклеопротеиде с помощью метода ЭФСП по увеличению электро-
потепциала мембранных белков, связанных с Д Н К .
I N V E S T I G A T I O N O F CLOSELY B O U N D E D D i NA-MEMBRANE C O M P L E X E S
IN T H E BACTERIAL N U C L E O I D C O M P O S I T I O N
V. A. S igaeva , Α. V. Gavryushkin, Yu. A. Ershov
All-Union Research Ins t i tu te of Applied Microbiology,
Obolensk, Moscow Region
S u m m a r у
DNA-membrane complexes f rom E. coll were isolated by f ree-f low electrophoresis . The
c h a n g e s in their s t ruc ture a f t e r UV-i r rad ia t ion were inves t iga ted . It w a s shown that
f ree-f low electrophoresis can detect biomolecule d a m a g e s in DNA-prote in complex.
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Бакаев В. В. Структура хромосомных Д Н П . XI. Об организации Д Н П комплекса
в бактериальной к л е т к е / / М о л е к у л я р . биология.— 1981.— 15, № 6.— С. 1350—1363.
2. Smith V. С., Iiamilin С. DNA synthes is kinetics, cell division delay and post-repli-
t'.'iiion repair a l ter uv i r radiat ion of frozen cells of Ii. coli В/г / 7 Pliotocliem and
Photobioi .— I'977.— 25, N 1.— P. 27—29.
o. Ucidricii II. (j., Olsen \Г. L. Desoxyribonucleic acid-envelope complexes from I:. coli / /
.1. Cell Biol.— 1975 — 65, N 2 , — P . 444—460.
4. Parker C. A.. Iiatchard C. G. A new sensit ive chemical ac t inometer / •' Proc. Rov. Soc
A.— 1956 — 235, N 6 — P . 51'8—536.
ISbN υ_.;.·,-7υ57. ЫЮПОЛП.МКРЫ II KJILTKA. 1990. Т. о. .V- 4 — O-SG 49
5. Прочно с в я з а н н ы е с Д Н К белки в составе нуклеоида Е. coli / А. И. Газиев,,
Л . А. Фоменко , Д . Г. З а к р ж е в с к а я , В. А. С и г а е в а / / Б и о х и м и я , — 1985 — 50 г
№ 5 . — С . 814—816.
6. Kleinschmidt А. К. M o n o l a y e r t e c h n i q u e s in e lec t ron mic roscopy of nucle ic acid
m o l e c u l e s / / Me th . E n z y m o l . — 196'8.— 12.— P . 361—379.
7. Lammli II. /(. Cleavage of structure DNA E. ^ o / / / / Nature.— 1 9 7 0 . - 2 2 7 , N 5259-—
P. 680—682 .
8. Berezny R. D y n a m i c p r o p e r t i e s of the n u c l e a r m a t r i x / / The cell nuc l eus / Ed .
H. B u s c h - N e w York: A c a d , p ress , 1 9 7 9 . — V . 7 . — P . 413—456.
9. Wolf-Wotz П., Norquist A. H. Deoxyr ibonuc le i c acid and ou te r m e m b r a n e ; b i n d i n g
t o o u t e r m e m b r a n e invo lves a specif ic p r o t e i n / / J . Bac te r io l .— 1979.— 140, N 1.—
P. 43—49.
10. Nicolaidas A. A., Rolland I. B. E v i d e n s for specif ic of c h r o m o s o m a l o r ig in w i th
ou t e r m e m b r a n e f r a c t i o n i so la ted f r o m E. coli / / J . Bac te r io l .— 1978.— 135, N 1.—
P . 178—189.
В Н И И прикл. микробиологии, Серпухов Моск . обл. Получено 30.08.88
УДК 577.214.3
© JI. Я. Денисова, С. Н. Загребельный, Η. М. Пустошилова,
А. Г. Веньяминова, В. В. Гори, В. Ф. Зарытова, Μ. Н. Рейкова, 1990
ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ
РИБООЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ЗАДАННОГО СТРОЕНИЯ
ПУТЕМ ТРАНСКРИПЦИИ ДЕЗОКСИРИБООЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
Транскрипция дезоксирибоолигонуклеотидных матриц в системе РНК-полимеразы
Escherichia coli является одним из перспективных методов получения рибоолигонуклео-
тидов заданного строения. Для получения препаративных количеств AGGGGAUUGAA-
AAUC-фрагмента антикодоновой петли фенилаланиновой тРНК и AU GAG G AAU ACCC-
AUG-фрагмента РНК фага MS2 проведена транскрипция комплементарных дезокси-
рибоолигонуклеотидов. Уровень включения нуклеотидов в продукт транскрипции при
этом составил не менее 70 % нуклеотидного материала матрицы.
Разработана процедура извлечения транскрипта из реакционной смеси, включаю-
щая хроматографию на гепарин-агарозе, хроматографию на гидрофобном сорбенте
Lichroprep RP18 и электрофорез в 20 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) с после-
дующей электроэлюцией целевого продукта из геля. При использовании в РНК-поли-
меразной реакции 5 о. е. A2Q0 дезоксирибоматрицы конечный выход точной РНК-копии
составил 1,0—1,5 о. е. A2бо·
Введение. В настоящее время олигорибонуклеотиды приобретают ог-
ромное значение как инструменты в молекулярно-биологических иссле-
дованиях при изучении структуры и функции Р Н К . Однако эти иссле-
дования развиваются недостаточно эффективно, и одна из основных
причин сложившейся ситуации — сложность методов синтеза достаточ-
но протяженных олигорибонуклеотидов. Несмотря на значительный
прогресс в области автоматизации синтеза олигорибонуклеотидов в по-
следние годы, химический синтез олигорибонуклеотидов все еще оста-
ется трудоемким процессом. При использовании РНК-лигазы удалось
синтезировать полирибонуклеотиды длиной до 20—70 звеньев, однако
эффективность этого метода крайне низка.
Ранее при изучении функциональных свойств ДНК-зависимой
РНК-полимеразы Е. coli мы обнаружили, что этот фермент достаточно
эффективно транскрибирует одпонитчатые дезоксирибоолигопуклеоти-
ды как выделенные из природных источников, так и полученные синте-
тическим путем [1—4]. Это послужило основанием считать транскрип-
цию дезоксиматриц одним из эффективных методов синтеза рибооли-
гонуклеотидов заданного строения. Последнему способствует и то об-
стоятельство, что синтез дезоксирибоолиго- и полинуклеотидов в на-
стоящее время является практически решенной задачей.
В предлагаемой работе представлены данные по препа-
ративному синтезу рибоолигонуклеотида длиной 15 звеньев —
50 TSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № 3*
|