Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов
С помощью электрофоретического фракционирования ДНК эукариот в инвертируемом электрическом поле показано наличие дискретных геномных фрагментов. Набор фрагментов однотипен для различных представителей эукариот и представляет собой гетерогенную популяцию молекул ДНК. унифицированных по размеру....
Gespeichert in:
| Datum: | 1990 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1990
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153446 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов / В.Т. Соловьян, В.А. Кунах // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 97-99. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-153446 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1534462019-07-04T16:22:11Z Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов Соловьян, В.Т. Кунах, В.А. Краткие сообщения С помощью электрофоретического фракционирования ДНК эукариот в инвертируемом электрическом поле показано наличие дискретных геномных фрагментов. Набор фрагментов однотипен для различных представителей эукариот и представляет собой гетерогенную популяцию молекул ДНК. унифицированных по размеру. За допомогою електрофоретичного фракціонування ДНК еукаріотів в інвертованому електричному полі показано наявність дискретних геномних фрагментів. Набір фрагментів однотиповий для різних представників еукаріотів і є гетерогенною популяцією молекул ДНК, уніфікованих за розміром. The fractionation of eukaryotic DNA by the field inversion gel electrophpresis results in the set of discrete fragments. The pattern of discrete fragments is similar to different members of eukaryotes under study and involves the various chromosomal size-uniform DNAs. 1990 Article Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов / В.Т. Соловьян, В.А. Кунах // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 97-99. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000276 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153446 577.21:575.113 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Краткие сообщения Краткие сообщения |
| spellingShingle |
Краткие сообщения Краткие сообщения Соловьян, В.Т. Кунах, В.А. Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов Биополимеры и клетка |
| description |
С помощью электрофоретического фракционирования ДНК эукариот в инвертируемом электрическом поле показано наличие дискретных геномных фрагментов. Набор фрагментов однотипен для различных представителей эукариот и представляет собой гетерогенную популяцию молекул ДНК. унифицированных по размеру. |
| format |
Article |
| author |
Соловьян, В.Т. Кунах, В.А. |
| author_facet |
Соловьян, В.Т. Кунах, В.А. |
| author_sort |
Соловьян, В.Т. |
| title |
Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов |
| title_short |
Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов |
| title_full |
Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов |
| title_fullStr |
Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов |
| title_full_unstemmed |
Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов |
| title_sort |
фракционирование днк эукариот в пульсирующем электрическом поле i. обнаружение дискретных геномных фрагментов |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1990 |
| topic_facet |
Краткие сообщения |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153446 |
| citation_txt |
Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле I. Обнаружение дискретных геномных фрагментов / В.Т. Соловьян, В.А. Кунах // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 97-99. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT solovʹânvt frakcionirovaniednkéukariotvpulʹsiruûŝemélektričeskompoleiobnaruženiediskretnyhgenomnyhfragmentov AT kunahva frakcionirovaniednkéukariotvpulʹsiruûŝemélektričeskompoleiobnaruženiediskretnyhgenomnyhfragmentov |
| first_indexed |
2025-07-14T04:58:34Z |
| last_indexed |
2025-07-14T04:58:34Z |
| _version_ |
1837597055253479424 |
| fulltext |
У Д К 577.21:575.113
© В. Т. Соловьян, В. А. Кунах, 1990
ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ДНК ЭУКАРИОТ
В ПУЛЬСИРУЮЩЕМ ЭЛЕКТРИЧЕСКОМ ПОЛЕ I.
ОБНАРУЖЕНИЕ ДИСКРЕТНЫХ ГЕНОМНЫХ ФРАГМЕНТОВ
С помощью электрофоретического фракционирования ДНК эукариот в инвертируемом
электрическом поле показано наличие дискретных геномных фрагментов. Набор фраг-
ментов однотипен для различных представителей эукариот и представляет собой гете-
рогенную популяцию молекул ДНК. унифицированных по размеру.
В 1983 г. Шварц и др. [1] сообщили об электрофореткческой системе с периодически
изменяющимся направлением прилагаемого поля, позволяющей разделять более круп-
ные молекулы Д Н К n j сравнению с обычной гель-электрофорезной техникой.
К настоящему времени разработаны различные системы электрофореза в пульси-
рующем поле, позволяющие разделять Д Н К от нескольких тысяч до IO6 пап основа-
ний (п. о.) (см. [2 ] ) .
Они с успехом были применены для изучения многих, прежде не охарактеризо-
ванных молекул Д Н К , включая интактные хромосомные Д Н К д р о ж ж е й и различных
представителей Pro iozoa [3].
В настоящем сообщении мы приводим результаты фракционирования Д Н К эука-
риот с помощью гель-электрофореза в инвертируемом электрическом поле.
Материалом исследования служили печень крысы, интактные растенля и полу-
ченные из них культивируемые клетки.
Препараты ядер получали по методу [4] с некоторыми модификациями. Грубый
осадок ядер получали, гомогеиизуя материал в буфере А (50 мМ трис-HCl, р Н 8,0, 10 мД\
Nr2-EDTA, 0,3 M маннитол, 0,1 % БСА (V фракция) , 4 мМ 2-меркаптоэтанол) па холо-
ду. После фильтрования гомогената и центрифугирования (1 000 g, 15 мин, 2 °С) оса-
док ядер ресусиендировалн в среде для выделения и наслаивали на 2,2 M сахарозную
подушку, приготовленную на буфере В (50 мМ трис-НСІ, 10 м М Na 2 -EDTA, рН 8,0).
После центрифугирования (80· IO3 g, 2 ч, 2 °С) осадок очищенных ядер промывали
буфером С (буфер В, содержащий 0,4 M сахарозу) и смешивали с равным объемом
1 %-ной легкоплавкой агарозы, приготовленной на ТЕ-буфере при 40 0C (ТЕ-буфер
содержит 10 мМ трис-НСІ, 1 мМ Na 2 -EDTA, рН 8,0).
Суспензию ядер разливали в плоские формы толщиной 2 мм, о х л а ж д а л и до по-
лучения геля и наслаивали равный объем лизирующего буфера (1 %-ный саркозилат
Na, приготовленный на ТЕ-буфере) . Лизис заплавленных в агарозу ядер проводили при
55 °С в течение 1 ч.
Д Н К лизированных ядер фракционировали при помощи гель-электрофореза в ин-
вертируемом электрическом поле в 0 ,5ХТВЕ-буфере в течение 20—24 ч при градиенте
напряжения 10 В/см .
Соотношение длительности импульсов «вперед» / « н а з а д » составляло 3 / 1 .
В качестве маркеров молекулярных масс использовали копкатамеры фага λ, при-
готовленные по [5], и интактные хромосомы Saccharomyces cerevisiae [6].
При фракционировании Д Н К использовали два режима инверсии электрического
поля: «А» — режим включал постоянное пульсирование электрического поля (24 с
«вперед» и 8 с «назад») , при «В»-режиме период пульсирования непрерывно увеличи-
вался от 1,5 до 360 с в направлении «вперед» и от 0,5 до 120 с в направлении
«назад».
Результаты фракционирования, представленные на рис. 1, показывают, что Д Н К
эукариот образует ряд дискретных фрагментов. Набор фрагментов однотипен для
различных представителей эукариот, использованных нами, и напоминает набор фраг-
ментов Д Н К дрозофилы, обнаруженный ранее [7].
Паттерн ДНК-фрагментов , напоминающий лесенку с шагом ~ 150 кВ, не является
артефактом пульс-электрофорезного фракционирования, поскольку при рефракциони-
ровании агарозных блоков, содержащих отдельные дискретные фрагменты, к а ж д ы й из
них занимает положение, соответствующее своему Rf (результаты не представлены) .
Решающим условием, приводящим к появлению дискретных фрагментов, является об-
работка заплавленных в агарозу ядер лизнрующим агентом или протеиназой К (рпс. 2 ) .
Универсальное распределение и высокое содержание (от 10 до 50 % Д Н К , остав-
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № 3' 7 — 0-89 97
їйеііся па старте ) предполагает , что дискретные Д Н К - ф р а г м е н т ы не я в л я ю т с я э к с т р а -
хромосомной д н к .
Рестрикционный анализ выделенных фрагментов, а также блот-гибридизация их
с рестрицированной суммарной Д Н К обнаруживает шлейф, характерный для хромо-
сомной Д Н К . В то ж е время рестрикционный анализ хлоропластной и митохондриаль-
Рис . I. Ф р а к ц и о н и р о в а н и е я д е р н ы х Д Н К в инвертируемом электрическом поле·, листья
( / ) и к у л ь т и в и р у е м ы е клетки (2) Crepis capillaris; листья Nicotiana tabacum (3); Rau-
wolfia serpentina (4); печень к р ы с ы (5) ; к о н к а т а м е р ы ф а г а λ (6 ) ; х р о м о с о м ы Saccha-
romyces cerevisiae (7). Р а з м е р ы ф р а г м е н т о в д а н ы в т. п. о.
F i g . 1. T h e f r a c t i o n a t i o n of n u c l e a r D N A by field inve r s ion gel e l ec t rophores i s : the lea-
ves (J) a n d c u l t u r e d cel ls (2) Crepis capillaris; l eaves Nicotiana tabacum (3 ) , Rau-
wolfia serpentina (4), the r a t l iver (5) ; l a m b d a o l i g o m e r s (6 ) ; c h r o m o s o m e s Saccharo-
myces cerevisiae (7).
Рис. 2. Ф а к т о р ы , п р и в о д я щ и е к появлению д и с -
кретных фрагментов . Н а з а п л а в л е н п ы е в ага-
розу я д р а С. capillaris н а с л а и в а л и 20 м М
E D T A (1)· 20 м М E D T A + протеиназа К
(200 м к г / м л (2) ; 20 м М E D T A + 1 % сарко-
з и л а т Na (3 ) ; 20 мМ E D T A + 1 % с а р к о з и л а т
Na + протеиназа К (.4)·, и н к у б и р о в а л и сутки
при 55 °С и ф р а к ц и о н и р о в а л и в р е ж и м е «В»;
M — х р о м о с о м ы S. cerevisiae. Р а з м е р ы ф р а г -
ментов д а н ы в т. п. о.
F ig . 2. F a c t o r s l e a d i n g t o t he a p p e a r a n c e of
d i sc re te f r a g m e n t s . A g a r o s e b locks con ta i -
n i n g i so la ted nuclei Crepis capillaris w e r e incu-
ba ted w i t h : 20 m M E D T A ( i ) ; 20 m M E D T A +
+ p r o t e i n a s e K (200 ng ' /ml , 2 ) ; 20 m M E D T A +
+ 1 % S a r k o s y l (3 ) ; 20 m M E D T A + p r o t e i n a s e
K + l % S a r k o s y l (4) f o r 24 h a t 55 °С a n d f rac -
t i o n a t e d in «В» reg ime . M — c h r o m o s o m e s S. ce-
J i o i i Д Н К растений, р а з м е р которых находится в пределах 120—220 кВ [8], о б н а р у ж и -
в а е т х о р о ш о р а з л и ч и м ы й н а б о р рестрикционных ф р а г м е н т о в ( р е з у л ь т а т ы не пред-
с т а в л е н ы ) .
В ы ш е и з л о ж е н н о е предполагает , что дискретные ф р а г м е н т ы Д Н К э у к а р и о т , обна-
р у ж и в а е м ы е с п о м о щ ь ю пульс -электрофорезного ф р а к ц и о н и р о в а н и я , п р е д с т а в л я ю т со-
бой н а б о р р а з л и ч н ы х х р о м о с о м н ы х Д Н К , имеющих о д и н а к о в ы й размер .
T H E F R A C T I O N A T I O N O F E U K A R Y O T I C D N A BY T H E F I E L D I N V E R S I O N
G E L E L E C T R O P H O R E S I S . 1. D E T E C T I O N O F D I S C R E T E F R A G M E N T S
V. T. S o l o v y a n , V. A. Kunakh
I n s t i t u t e of M o l e c u l a r B i o l o g y a n d Genet ics ,
A c a d e m y of Sc iences of t he U k r a i n i a n S S R , Kiev
S u m m a r y
T h e f r a c t i o n a t i o n of e u k a r y o t i c DiNA by the field invers ion gel e l ec t rophore s i s r e s u l t s in
the set of d i sc re t e f r a g m e n t s . The p a t t e r n of d i sc re t e f r a g m e n t s is s imi la r t o d i f f e r e n t
m e m b e r s of e u k a r y o t e s u n d e r s t u d y and invo lves t he v a r i o u s c h r o m o s o m a l s i z e -un i fo rm
D N A s .
98 I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № 3' 7 — 0-89 97
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Xeic t echniques for p u r i f y i n g l a rge D N A s and s t u d y i n g llicir p rope r t i e s and packa-
g i n g / D . C. S c h w a r t s , W. S a f f r a n , J . Welsh ct a l . / / C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p Q u a n t .
Biol .— 1983.— 47.— P. 189—195. .
2. Pulsed field gel e lec t rophores i s / E. Lai, B. W. Bi r ren , S. M. C la rk et al. / / BioTcch-
nique.— 1989.— 7, N 1 . — P . 34—42.
3. Iileclropliiirelic s e p a r a t i o n of l a r g e D N A molecu les by per iodic inver t ion of the e lectr ic
f i e l d / / G. F. Carle , M. F rank , Μ. V. O l son et a l / / S c i e n c e . — 1986 ,—232, N 4746,—
P. 65—68.
4. Smith H. S., Вегегпеї/ R. Nuc l ea r m a t r i x - b o u n d deoxyr ibonuc le ic acid syn thes i s : an
in vitro sys tem / / B iochemis t ry .— 1 9 8 2 . - 2 1 , N 26,— P. 6752—6771.
5. High-resolution s epa ra t i on and accu ra t e s ize d e t e r m i n a t i o n in pu l sed gel e lec t ropho-
resis of DNA. 1. D N A size s t r a n d a r t s and e f fec t of a g a r o s e a n d t e m p e r a t u r e /
M. K. M a t h c v , C. L. Smi th , C. R. C a n t o r ct a l . / / I b i d . — 1988,—27, N 2 6 , — P . 9204—
9210.
(і. Л simple and rapid me thod fo r p r e p a r i n g yeas t c h r o m o s o m e s fo r pu l sed field gel
e lec t rophores i s / M. Bellis, M. P a g e s , G. Ro izes et a l . / / N u c L Acids Res .— 1987,— 15,
N 1 6 , — P . 6749.
,. Чуриков II. Α., Аншценко В. .4., Бериташвияи Д. Р. О б н а р у ж е н и е гигантских вне-
хромосомных Д Н К , с о д е р ж а щ и х мобильные гены д р о з о ф и л ы / / Д о к л . А Н С С С Р . —
1987.— 296, № 2,— С. 457—459.
8. Exiranuelear g enes / P. Bor ts , Н. F. Tabak , L. A. Grivel l et al. / / E u k a r y o t i c genes :
s t ruct , activ. and r eguL— London , etc. : Acad, press , 1983.— P. 71—84.
IIH-T молекуляр . биологии и генетики AIT У С С Р , Киев Получено 2 2 . 1 1 . 8 9
У Д К 577.152.34.088.3:579.852.11
с Т. В. Сорочннская, С. И. Черных,
Т. Л. Левитина, Н. В. Роднин, 1990
ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА
β - Л АКТ AM А ЗЫ TEM-I Escherichia coli
Разработана система суперсинтсза фермента $-лактамазы в клетках Е. coli по фагозави-
ί имей технологии. Это позволило получить фермент в количестве (1—2) · 10& ед. актив-
ности в 1 мл культуральной жидкости. Предложен метод препаративного выделения
β-лактамазы, значительно упрошенный по сравнению с известными ранее. Выход препа-
рата составляет 45 % исходного количества фермента в культуральной жидкости. Пре-
ішрит форетически гомогенен и для использования в иммуноі/іерментном анализе в даль-
нейшей очистке не нуждается.
Введение. В последнее время в различных областях медицинских и биологических ис-
следовании широкое применение получил иммуноферментный анализ ( И Ф А ) . Много-
численные модификации И Ф А предполагают использование конъюгатов — комплексов
а н п п е л а и фермента или антигена и фермента . Наиболее распространенными фермен-
тами д л я конструирования конъюгатов являются щелочная фосфатаза , перокеидаза , β-
г а л а к т о з и д а з а [1] . Н а р я д у с этими ферментами в настоящее время начинают исполь-
зовать β - л а к т а м а з у [2] . П о своим физико-химическим свойствам этот фермент с мо-
лекулярной массой 28 500 удобен в работе, поскольку представлен одной субъедиппцей
и термостабилен. К о н ъ ю г а т ы па основе β - л а к т а м а з ы имеют р я д преимуществ перед тра-
диционными, а по чувствительности они сравнимы [3]. П р е ж д е всего необходимо от-
метить простоту детекции при использовании конъюгатов па основе β - л а к т а м а з ы . Конт-
растность реагента, применяемого д л я прочтения реакции, позволяет визуально регист-
рировать результаты анализа . По своему химическому составу реагент крайне прост,
доступен и представляет собой смесь пенициллина, к р а х м а л а и йода в водном растворе
KI, к тому ж е он не токсичен. Б о л ь ш и н с т в о других субстратов д л я индикации иммоби-
лизованных ферментов, в частности О Ф Д д л я пероксидазы хрена, токсичны, канцероген-
ны [4], о б л а д а ю т низкой стабильностью и синтез их затруднен . К о н ъ ю г а т ы па основе
β - л а к т а м а з ы довольно стабильны — при оптимальных условиях храпения их актив-
ность сохранялась не менее 18 месяцев [3] .
Р а з р а б о т к а π создание диагностикумов с применением конъюгатов на основе β-
л а к т а м а з ы требует высокоочищенпого фермента . Д л я обеспечения значительных коли-
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № 3' 7 — 0-89 97
|