Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli

Разработана система суперсинтеза фермента β-лактамазы в клетках Е. coli по фагозависамой технологии. Это позволило получить фермент в количестве (1—2)·10⁶ ед. активности в 1 мл культуральной жидкости. Предложен метод препаративного выделения β-лактамазы, значительно упрошенный по сравнению с известн...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1990
Автори:	Сорочинская, Т.В., Черных, С.И., Левитина, Т.Л., Роднин, Н.В.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1990
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Краткие сообщения
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153453
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli / Т.В. Сорочинская, С.И. Черных, Т.Л. Левитина, Н.В. Роднин // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 99-102. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-153453
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1534532019-06-15T01:28:03Z Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli Сорочинская, Т.В. Черных, С.И. Левитина, Т.Л. Роднин, Н.В. Краткие сообщения Разработана система суперсинтеза фермента β-лактамазы в клетках Е. coli по фагозависамой технологии. Это позволило получить фермент в количестве (1—2)·10⁶ ед. активности в 1 мл культуральной жидкости. Предложен метод препаративного выделения β-лактамазы, значительно упрошенный по сравнению с известными ранее. Выход препарата составляет 45 % исходного количества фермента в культуральной жидкости. Препарат форетически гомогенен и для использования в иммуноферментном анализе в дальнейшей очистке не нуждается. Розроблено систему суперсинтезу ферменту β-лактамази в клітинах Е. coli за фагозалежною технологією. Це дозволило отримати фермент у кількості (1–2) · 10⁶ од. активності в 1 мл культуральної рідини. Запропоновано метод препаративного виділення β-лактамази, значно спрощений у порівнянні з відомими раніше. Вихід препарату становить 45 % початкової кількості ферменту у культуральній рідині. Препарат форетично гомогенний і для використання в імуноферментному аналізі подальшого очищення не потребує. The phage-technology for supersynthesis of β-lactamase TEM-1 in E. coli cells has been worked out. It has permited obtaining (1–2) ·10⁶ units of enzyme activity per ml of cultural fluid. The method for wide-scale β-lactamase preparation is suggested, that is much simplier as against those known before. The enzyme recovery is about 45 %. Our preparation is electrophoretically homogenous and may be used in immuno-enzyme assay without further purification. 1990 Article Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli / Т.В. Сорочинская, С.И. Черных, Т.Л. Левитина, Н.В. Роднин // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 99-102. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000277 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153453 377.152.34.088.3:579.852.11 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Краткие сообщения Краткие сообщения
spellingShingle	Краткие сообщения Краткие сообщения Сорочинская, Т.В. Черных, С.И. Левитина, Т.Л. Роднин, Н.В. Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli Биополимеры и клетка
description	Разработана система суперсинтеза фермента β-лактамазы в клетках Е. coli по фагозависамой технологии. Это позволило получить фермент в количестве (1—2)·10⁶ ед. активности в 1 мл культуральной жидкости. Предложен метод препаративного выделения β-лактамазы, значительно упрошенный по сравнению с известными ранее. Выход препарата составляет 45 % исходного количества фермента в культуральной жидкости. Препарат форетически гомогенен и для использования в иммуноферментном анализе в дальнейшей очистке не нуждается.
format	Article
author	Сорочинская, Т.В. Черных, С.И. Левитина, Т.Л. Роднин, Н.В.
author_facet	Сорочинская, Т.В. Черных, С.И. Левитина, Т.Л. Роднин, Н.В.
author_sort	Сорочинская, Т.В.
title	Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli
title_short	Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli
title_full	Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli
title_fullStr	Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli
title_full_unstemmed	Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli
title_sort	получение и очистка β-лактamазы tem-i escherichia coli
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1990
topic_facet	Краткие сообщения
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153453
citation_txt	Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli / Т.В. Сорочинская, С.И. Черных, Т.Л. Левитина, Н.В. Роднин // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 3. — С. 99-102. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT soročinskaâtv polučenieiočistkablaktamazytemiescherichiacoli AT černyhsi polučenieiočistkablaktamazytemiescherichiacoli AT levitinatl polučenieiočistkablaktamazytemiescherichiacoli AT rodninnv polučenieiočistkablaktamazytemiescherichiacoli
first_indexed	2025-07-14T04:58:45Z
last_indexed	2025-07-14T04:58:45Z
_version_	1837597065956294656
fulltext	С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы 1. Xeiv t echn iques for p u r i f y i n g l a r g e D N A s and s t u d y i n g their p r o p e r t i e s a n d packa - g i n g / D. C. S c h w a r t s , W. S a f f r a n , J . Wel sh ct a l . / / C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p Q u a n t . Biol .— 1 9 8 3 , — 4 7 . — P . 189—195. . 2. Pulsed f ield gel e l ec t rophores i s / E. Lai, B. W. Bi r ren , S. M. C l a r k et a l . / / B i o T e c h - niquc — 1989 — 7, N 1,— P. 34—42. 3. Elecirophorciic s e p a r a t i o n of l a r g e D N A m o l e c u l e s by per iodic inve r t ion of the e lec t r ic f i e l d / / G . F. Car le , M. F r a n k , Μ. V. O l s o n et a l / / S c i e n c e . — 1986 .—232 , N 4746,— P. 65—68. 4. Smith H. S., Berezneij R. N u c l e a r m a t r i x - b o u n d deoxyr ibonuc le i c acid s y n t h e s i s : an in vitro s y s t e m / / B i o c h e m i s t r y — 1982 .—21, N 2 6 , — P . 6752—6771. 5. High-resolution s e p a r a t i o n and a c c u r a t e s ize d e t e r m i n a t i o n in pu l sed gel e l ec t ropho- res is of DNA. 1. D N A size s t r a n d a r t s and e f f ec t of a g a r o s e a n d t e m p e r a t u r e / Μ. K. M a t h e w , C. L. Smi th , C. R. C a n t o r ct al. / / Ib id .— 1988.— 27, N 2 6 . — P . 9204— 9210. 6. A simple and r ap id m e t h o d fo r p r e p a r i n g y e a s t c h r o m o s o m e s fo r pu l sed field gel e l e c t r o p h o r e s i s / A l . Bell is , M. P a g e s , G. Ro izes et a l . / / N u c l . Ac ids R e s — 1987.— 15, N 1 6 . — P . 6749. /. Чуриков II. Α., Анащенко Β. Α., Бериташвили Д. Р. О б н а р у ж е н и е гигантских вне- хромосомных Д Н К , с о д е р ж а щ и х мобильные гены д р о з о ф и л ы / / Д о к л . А Н С С С Р . — 1987.— 296, № 2.— С. 457—459. 8. Extranuclear g e n e s / P. Bor t s , Н. F. Tabak , L. A. Grivel l et a l . / / E u k a r y o t i c g e n e s : s t ruc t , act iv. and r e g u l , - L o n d o n , etc. : Acad , p ress , 1983.— P. 71—84. IIri-T м о л е к у л я р . биологии и генетики AIT У С С Р , Киев Получено 22. 11 .89 УДК 377.152.34.088.3:579.852.11 Т. В. Сорочинская, С. И. Черных, Т. Л. Левитина, Н. В. Роднин, 1990 ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА β-Л АКТAMАЗЫ TEM-I Escherichia coli Разработана система суперсинтеза фермента β-лактамазы в клетках Е. coli по фагозави- самой технологии. Это позволило получить фермент в количестве (1—2)-IOq ед. актив- ности в I мл культуральной жидкости. Предложен метод препаративного выделения β-лактамазы, значительно упрошенный по сравнению с известными ранее. Выход препа- рата составляет 45 % исходного количества фермента в культуральной жидкости. Пре- парат форетически гомогенен и для использования в имму нофе рмент но лі анализе в даль- нейшей очистке не нуждается. Введение. В последнее время в различных областях медицинских и биологических ис- следований широкое применение получил и м м у п о ф е р м е н т н ы й анализ ( И Ф А ) . Много- численные м о д и ф и к а ц и и И Ф А п р е д п о л а г а ю т использование к о н ъ ю г а т о в — комплексов антитела и фермента или антигена и фермента . Н а и б о л е е распространенными фермен- тами д л я к о н с т р у и р о в а н и я к о н ъ ю г а т о в я в л я ю т с я щ е л о ч н а я ф о с ф а т а з а , пероксидаза , β- г а л а к т о з и д а з а [1] . Н а р я д у с этими ферментами в настоящее время начинают исполь- з о в а т ь β - л а к т а м а з у [2] . П о своим физико-химическим свойствам этот фермент с мо- л е к у л я р н о й массой 28 500 удобен в работе , поскольку представлен одной субъединицей и термостабилен . К о н ъ ю г а т ы па основе β - л а к т а м а з ы имеют р я д преимуществ перед тра - диционными, а по чувствительности они сравнимы [3] . П р е ж д е всего необходимо от- метить простоту детекции при использовании к о н ъ ю г а т о в на основе β - л а к т а м а з ы . Конт- растность реагента , применяемого д л я прочтения реакции, позволяет в и з у а л ь н о регист- р и р о в а т ь р е з у л ь т а т ы анализа . П о своему химическому составу реагент крайне прост, доступен и п р е д с т а в л я е т собой смесь пенициллина, к р а х м а л а и йода в водном р а с т в о р е KI, к т о м у ж е он не токсичен. Б о л ь ш и н с т в о других субстратов для индикации иммоби- лизованных ферментов , в частности О Ф Д д л я п е р о к с и д а з ы хрена, токсичны, канцероген- ны [4], о б л а д а ю т низкой стабильностью и синтез их з атруднен . К о н ъ ю г а т ы на основе β - л а к т а м а з ы д о в о л ь н о с т а б и л ь н ы — п р и оптимальных условиях х р а п е н и я их актив- ность с о х р а н я л а с ь не менее 18 месяцев [3 ] . Р а з р а б о т к а и создание д и а г н о с т и к у м о в с применением к о н ъ ю г а т о в па основе β- л а к т а м а з ы требует высокоочищенного фермента . Д л я обеспечения значительных коли- ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. G. № 3'7* 9 9 честв β -лактамазы нами был разработан дешевый и экономически выгодный способ по- лучения и очистки фермента. Все известные способы очистки этого фермента основы- ваются па получении его из микроорганизмов, в которых он синтезируется в относи- тельно небольших количествах [5, 6] . По предложенной нами фагозависимой техноло- гии синтез β -лактамазы значительно увеличивается. Высокий уровень фермента позво- ляет упростить способы его очистки. Материалы и методы. Д л я выращивания культуры-продуцента применяли стандарт- ную питательную среду «Аминопептид». Синтез фермента по фагозависимой технологии описан ранее [7]. Штамм-продуцент П. coli \V3101recA~ 13Sup° (pBR322). Источник фага — лизогенный штамм Е. coli RLMlXblaQammRambA. Активность β -лактамазы определяли йодометрическим методом [8]. З а единицу активности принято наименьшее количество фермента, которое инактивирует IO-"7 M пенициллина (60 ед.) за 1 ч при 37 °С в фосфатном буфере (рН 6 ,8—7,0). По окончании процесса ферментации культуральную жидкость осветляли центри- фугированием при 3 ООО об /мин в течение 30 мин на холоду. Фермент высаливали по стандартной методике [9], преципитат осаждали центри- фугированием в течение 1 ч при 3 000 об /мин и растворяли в 1/10 исходного объема фосфатного буфера (0,0067 М, рН 7,0). Обессоливание проводили либо диализом в течение ночи против фосфатного буфе- ра, либо на колонке с сефадексом G-25 ( 3 χ 8 5 см, скорость тока 60 м л / ч ) , уравнове- шенным тем ж е буфером. Дальнейшую очистку осуществляли на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой DE-52 («What- man», Англия) . Фракции после ионообменной хроматографии (ИОХ) обессоливали на колонке с сефадексом G-15 (2 ,5X50 см), уравновешенным 0,005 %-ным раствором аммиака, рН 8,9. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили по методу Вебера — Осбориа [10], используя в качестве стандартных белков бычий сывороточный альбумин (68 000), полиэдрин вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда (28 500), панкреа- тическую Р Н К а з у (14 700). Содержание белка определяли по методу Лоури [ И ] . Результаты и обсуждение. Методами генной инженерии на основе фагового векто- ра /.Plac5CJ857Д ( s H i n d I I I X 2 s I i i n d I I I l 3 ) s R l K 3 0 s R l X 4 0 s R l K 5 ° A ( s R l l a c z - s H a e I I I - l a c z ) U V 5 и плазмиды pCVll был сконструирован фаг Kbla. Введение амбер-мутаций в регулятор- ные гены фага приводит к замедлению развития фага в клетках Е. coli, и фаги с такими мутациями используются для синтеза продуктов генов, клонированных в фаге f 12]. Рекомбинацией in vivo в фаг Xbla были введены амбер-мутации в поздние гены Q и /?, блокирующие лизис бактериальной клетки. Это обеспечивает более длительное функцио- нирование гена bla, что способствует накоплению его продукта — β -лактамазы. Культуру клеток Е. coli, содержащую плазмиду pBR322 с геном bla, з а р а ж а л и фа- ром XblaQaminRambA. Д л я снижения частоты рекомбинации между гомологичными по- следовательностями фага λ и плазмиды pBR322, имеющей место в гене bla, в качестве продуцента был выбран штамм Е. coli W3101recA~\3Sup°. После з аражения культуры Очистка $-лактамазы Purification of β - lac tamase Стадия очистки Содержание белка , мг/мл Общая актив- ность, ед. Удельная ак- тивность, сд/мг белка Выход, % П р и м е ч а н и е . Фракции после И О Х соответствуют представленным на рис. 2, г—з. 100 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № 3 Ε. coli фагом и культивирования в течение 18 ч активность β -лактамазы достигала 1—2 млн ед. в 1 мл культуральной жидкости. При хроматографии фермента на колонке с DE-52 (1 ,5X35 см), уравновешенной 0,0067 M фосфатным буфером (рН 7,0), β -лактамаза не сорбируется на смоле. Однако удельная активность фермента после этой процедуры возрастает в 14 раз, что свиде- тельствуеі о сорбции на колонке большого количества примесных белков. После ^toh частичной очистки препарат β -лактамазы наносили на колонку с DE-52 ( 1 , 5 χ 2 0 см), уравновешенную 0,0067 M фосфатным буфером, рН 7,0. В этих условиях весь белок. Рис. 1. Очистка β -лактамазы на колонке 1 , 5 χ 2 0 см с ДЭАЭ-целлюлозой. (Скорость тока 20 мл/ч. Объем фракции 5 мл. Линейный градиент концентрации фосфатного буфера от 0,0067 до 0,067 M Fig. 1. Pur i f ica t ion of β - lac tamase on DEAE-cellulose DE-52 column (1 .5X20 cm) . F low rate 20 ml /h . Fract ion volume 5 ml. The protein was eluted by the linear g rad ien t of K+-Ka1" phosphate buffer concentra t ion of 0.0067-0.067 M 9pH 7.0) Рис. 2. Электрофорез препаратов β -лактамазы в 10 %-ном ПААГ с DS-Na: а — смесь стандартных белков (см. «Материалы и методы»); б — исходный препарат β -лактама- зы, частично очищенный высаливанием; в — з — фракции после ИОХ 7, 3—7 соответ- ственно Fig. 2. 1 0 % SDS-PAAG electrophoresis of β - lac tamase prepara t ions ; a — cal ibrat ion protein mixture (see «Mater ia ls and methods») ; б — crude l reparat ion of β - lac tamase; б — з—fractions obtained by ion-exchange ch romatography 1, 3, 4, 5, 6, 7, respectively обладающий ферментативной активностью, сорбируется на колонке. Элюцию β-лак- тамазы проводили линейным градиентом концентрации фосфатного буфера от 0,0067 до 0,067 М. Фермент выходит узким пиком, причем максимум активности β -лактамазы не совпадает с максимумом оптической плотности при 280 нм (рис. 1). Электрофорез в ПААГ фракций после ИОХ показал наличие во фракциях 3 и 4 полипептида с молекулярной массой 26 000, а во фракциях 5—7 белка 28 500, причем удельная активность его была выше, чем белка 26 000 (14 и 2,5 млн ед /мг белка соот- ветственно) (рис. 2) . В работе [13] были получены пять форм β -лактамазы с молекулярной массой от 29 500 до 24 000, в том числе и величиной 28 500 и 26 000. Белки с такими ж е значени- ями молекулярной массы были выделены и в наших исследованиях. Предполагается в этой связи, что наличие множественных форм β -лактамазы может быть обусловлено началом синтеза полипептидной цепи на ннициаторных триплетах, расположенных на различных расстояниях от стартового кодопа [13]. Наверное, нельзя исключить и воз- можности ограниченного протеолиза β-лактамазьт, происходящего при ее очистке. Суммарная активность двух форм β -лактамазы (26 000 и 28 500) в наших экспе- риментах составляет 45 % общей активности фермента в культуральной жидкости. В работе \|5] выход фермента после хроматографии па ДЭАЭ- и КМ-целлюлозе составил I S S N 0 2 3 3 - 7 ( 5 5 7 . Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . 1 9 9 0 . Т . 6 . Λ1- 101 5 9 % . Это вполне сопоставимо с нашими результатами (таблица) . Однако выход гомо- генного фермента в известных нам работах [5, 6] ниже, что может быть связано с дополнительными стадиями очистки, которых нам удалось избежать. Таким образом, по предлагаемой нами схеме можно получать препаративные ко- личестиа β - л а к т а и ш ы , ііо:шолиющие п е н о л ь з о н т его в нммунофермептном анализе. P R E P A R A T I O N AND P U R I F I C A T I O N OF Ε. COLI TEM-I β -LACTAMASE Т. V. Sorochinskaуa, S. I. Cher t iykh , Т. L. Levitina, Ν. V. Rodnin Ins t i tu t e of Molecular Biology and Genetics, Academy of Sciences of the Ukra in ian SSR, Kiev S u m m a r у The phage- t echno logy for supersynthes i s of β -1асtamase TEM-I in E. coli cells has been worked out. It lias permited ob ta in ing (1-2) χ 106 uni ts of enzyme activity per ml of cul- tural fluid. The method for wide-scale β - l ac tamase prepara t ion is sugges ted , that is much simplier as aga ins t those known before. The enzyme recovery is about 4 5 % . Our prepara- tion is e lect rophoret ical ly homogenous and may be used in immuno-enzymc assay wit- hout fu r the r pur i f ica t ion . С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы 1. Дзантисв Б. Б., Егоров Α. Μ. Современное состояние и перспективы развития им- муноферментного анализа / / Жури . Всесоюз. хим. о-ва им. Д . I I. Менделеева.— 1982.— 27, № 4 — С. 442—449. 2. Жвирблене А. А., Норейка Ф.-К. M., Садыкин А. Ю. Твердофазный иммунофермент- ный анализ инсулина с использованием β -лактамазы из Bacillus Iicheniforniis 749/с и пероксидазы хрена в качестве м а р к е р о в / / А н т и б и о т и к и и мед. биотехнология.— 1987,—32, № 4 . — С . 279—282. 3. IIммуноферментная индикация вирусов и вирусспецифических антител с использо- ванием конъюгатов на основе β -лактамазы, полученной генноинженерным способом / I I. Г. Харитоненков, В. А. Кордюм, М. Л . Христова и д р . / / Б ю л . экеперим. биологии и медицины,— 1987,— № 5,— С. 627—630. 4. Voller A., Barlnt A., Bijdwall D. Fhizvme i m m u n o a s s a v with special referencies to I -LIS Α-technics // J. Clin. Pathol .— 1978,—31, N 7 . — P . 507—520. 5. Purification and biochemical proper t ies of β - l ac tamase produced by Proteus rcttgeri / K. Hirai , S. Jyobe, M. Inone, S. M i t s u h a s h i / / A n t i m i c r o b a l A g e n t s and Chem.— 1980.— 18, N 5,— P. 687 - 6 9 0 . 6. Purification and some proper t ies of β - l ac t amases f rom Proteus rettgeri and P. incon- slatis / S. Ohya, J. Fu j i i -Kur iyama, M. Yamamoto , S. S u g a r a w a / / Microbiol, and Immonol .— 1980,—24, N 9.— P. 815—824. 7. Ac. 1089119 С С С Р М К И 3 С 1 2 № 9/38 . Способ получения β -лактамазы / В. А. Кордюм, С. И. Черных, Т. В. Сорочинская / / О т к р ы т и я . Изобретения.— 1984.— № 16. 8. Чайковская С. M., Венкина Т. Г. Модифицированный иодометрический метод опре- деления активности β - л а к т а м а з ы / / А н т и б и о т и к и . — 1962.— 7, № 5 . — С. 453—456. 9. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике.— М. : Мир, 1976.— 436 с. 10. Weber КOsborn М. The rel iabil i ty of molecular we igh t de te rmina t ion by dodecyl su l fa te -po lyac ry lamide gel e l e c t r o p h o r e s i s / / J . Biol. Chem.— 1962.— 244, N 8.— P. 4406—4412. 11. Protein measu remen t with the Folin phenol r e a g e n t / О . H. Lowry, N. J . Rosebrough, A. L. Far r , R. J. R a n d a l l / / I b i d . — 1951.— 193, N 1 ,—P. 265—275. 12. Aioire A., Brammar W. J. The use of specialized t r a n s d u c i n g phages in the amplif i - cat ion of enzyme p r o d u c t i o n / / М о ї . and Gen. Genet.— 1976.— 14, N 1.— P. 87—88. 13. Kopylova-Sviridova T. N., Soukavatitsin V. V., Fodor I. Synthes i s of pro te ins coded by p lasmid vec tors of pCV series (AmpRTcR ) and their recombinant der ivat ives ( P D m ) in E. coli minicel ls / / Gene.— 1979.— 7, N 2,— P. 121—139. Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 17 .08 .89 102 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № 3

Получение и очистка β-лактamазы TEM-I Escherichia coli

Репозитарії

Схожі ресурси