Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения

Работа суммирует трехлетний опыт молекулярной диагностики гемофилии А при помощи ПДРФ-анализа и полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. Из 80 семей 75 оказались информативными для ДНК-диагностики. У 18 родственниц пробанда установлено носительство гемофилии А, у 23 – отвергнуто. В 20 случаях на I и...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1991
Автори:	Асеев, М.В., Горностаева, Н.Г., Баранов, В.С.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1991
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Дискуссии
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153488
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения / М.В. Асеев, Н.Г. Горностаева, В.С. Баранов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 2. — С. 92-98. — Бібліогр.: 19 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-153488
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1534882019-06-15T01:25:18Z Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения Асеев, М.В. Горностаева, Н.Г. Баранов, В.С. Дискуссии Работа суммирует трехлетний опыт молекулярной диагностики гемофилии А при помощи ПДРФ-анализа и полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. Из 80 семей 75 оказались информативными для ДНК-диагностики. У 18 родственниц пробанда установлено носительство гемофилии А, у 23 – отвергнуто. В 20 случаях на I и II триместрах беременности проводили пренатальную диагностику этого заболевания. Приведены характерные примеры ДНК-анализа в семьях высокого риска, рассмотрены объективные факторы, затрудняющие пренатальную диагностику гемофилии А, а также наиболее перспективные новые методические подходы, повышающие эффективность молекулярных исследований природы мутации гена фактора VIII. В роботі підсумований трирічний досвід молекулярної діагностики гемофілії А за допомогою ПДРФ-аналізу та полімеразної ланцюгової реакції синтезу ДНК. Із 80 сімей 75 виявилися інформативними для ДНК-ДІагностики. У 18 родичок пробанда встановлена присутність гемофілії А, у 23 – відкинута. У 20 випадках на І та II триместрах вагітності проводили пренатальну діагностику цього захворювання. Приведені характерні приклади ДНК-аналізу в сім'ях високого ризику, розглянуті об'єктивні фактори, що ускладнюють пренатальну діагностику гемофілії А, а також найбільш перспективні нові методичні підходи, які збільшують ефективність молекулярних досліджень природи мутації гену фактору VIIІ. Three years experience in molecular diagnosis of hemophilia A by means of RFLP studies and PCR analysis of FVIII gene is summarised. 75 out of 80 families studied were Tound to be informative for DNA analysis. 18 hemophilia A carriers have been detected and in 23 female relatives the presence of hemophilia A has been rejected. The results of 27 cases of prenatal diagnoses of hemophilia A at the 1st and 2nd trimester of pregnancy are peported. The examples of DNA analysis in some hemophilia A families are presented. The difficulties of molecular studies in HA families are outlined and the options of new molecular approaches for effective detection of factor VIII gene mutations are discussed. 1991 Article Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения / М.В. Асеев, Н.Г. Горностаева, В.С. Баранов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 2. — С. 92-98. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002C4 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153488 577.213.3 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Дискуссии Дискуссии
spellingShingle	Дискуссии Дискуссии Асеев, М.В. Горностаева, Н.Г. Баранов, В.С. Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения Биополимеры и клетка
description	Работа суммирует трехлетний опыт молекулярной диагностики гемофилии А при помощи ПДРФ-анализа и полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. Из 80 семей 75 оказались информативными для ДНК-диагностики. У 18 родственниц пробанда установлено носительство гемофилии А, у 23 – отвергнуто. В 20 случаях на I и II триместрах беременности проводили пренатальную диагностику этого заболевания. Приведены характерные примеры ДНК-анализа в семьях высокого риска, рассмотрены объективные факторы, затрудняющие пренатальную диагностику гемофилии А, а также наиболее перспективные новые методические подходы, повышающие эффективность молекулярных исследований природы мутации гена фактора VIII.
format	Article
author	Асеев, М.В. Горностаева, Н.Г. Баранов, В.С.
author_facet	Асеев, М.В. Горностаева, Н.Г. Баранов, В.С.
author_sort	Асеев, М.В.
title	Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения
title_short	Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения
title_full	Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения
title_fullStr	Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения
title_full_unstemmed	Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения
title_sort	некоторые проблемы диагностики гемофилии а и возможные пути их решения
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1991
topic_facet	Дискуссии
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153488
citation_txt	Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения / М.В. Асеев, Н.Г. Горностаева, В.С. Баранов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 2. — С. 92-98. — Бібліогр.: 19 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT aseevmv nekotoryeproblemydiagnostikigemofiliiaivozmožnyeputiihrešeniâ AT gornostaevang nekotoryeproblemydiagnostikigemofiliiaivozmožnyeputiihrešeniâ AT baranovvs nekotoryeproblemydiagnostikigemofiliiaivozmožnyeputiihrešeniâ
first_indexed	2025-07-14T04:59:25Z
last_indexed	2025-07-14T04:59:25Z
_version_	1837597107467321344
fulltext	УДК 577.213.3 Μ. В. Асеев, Η. Г. Горностаева, В. С. Баранов НЕКОТОРЫЕ ПРОБЛЕМЫ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОФИЛИИ А И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ИХ РЕШЕНИЯ Работа суммирует трехлетний опыт молекулярной диагностики гемофилии А при помо- щи ПДРФ-анализа и полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. Из 80 семей 75 ока- зались информативными для ДНК-диагностики. У 18 родственниц пробанда установлено носительство гемофилии А, у 23 — отвергнуто. В 20 случаях на I и II триместрах бере- менности проводили пренатальную диагностику этого заболевания. Приведены харак- терные примеры ДНК-анализа в семьях высокого риска, рассмотрены объективные факторы, затрудняющие пренатальную диагностику гемофилии А, а также наиболее перспективные новые методические подходы, повышающие эффективность молекулярных исследований природы мутации гена фактора VIII. Введение. Гемофилия А — тяжелое Х-сцепленное наследственное за- болевание, вызываемое мутациями в гене фактора VIII свертывания крови, встречается с частотой 1 : 4—5 тыс. новорожденных мальчиков [1, 2]. Современные клинико-биохимические и иммунологические ме- тоды определения уровня и активности фактора VIII в крови недо- статочны для выявления гетерозиготного носительства и совершенно непригодны для пренатальной диагностики гемофилии А на ранних сроках беременности. В последние годы осуществлено клонирование гена фактора VIII и его частичное секвенирование. Установлено, что ген состоит из 26 экзонов (размерами от 69 до 3 106 пар оснований (п. о . ) ) , 25 интронов и имеет величину 186 тыс. п. о. К настоящему времени для него описано более 20 точечных мутаций, 14 делеций протяженностью от 2 до 145 тыс. п. о. и 5 инсерций [5, 6, 8, 9, 11, 16, 19]. Гетерогенность мутационных изменений, приводящих к заболева- нию, и большие размеры гена существенно влияют и затрудняют пря- мое определение мутаций у пробанда (больного) и его ближайших родственников [16, 18]. Основу молекулярной диагностики гемофилии А в настоящее время составляет анализ полиморфизма длины рестрикционных фраг- ментов ( П Д Р Ф ) с использованием пяти полиморфных свойств для соответствующих рестрикционных эндонуклеаз в интронах фактора VIII , а т акже полиморфных сайтов ДНК-лоуксов, тесно сцепленных с этим геном. Наличие или отсутствие сайта рестрикции позволяет марки- ровать мутантный ген и таким образом проследить передачу «боль- ной» Х-хромосомы в потомстве. Имеется, однако, ряд причин, существенно затрудняющих моле- кулярную диагностику. 1. Ложное отцовство, следствием чего может быть неправильный ответ о носительстве гена гемофилии А. Использование метода геном- ной дактилоскопии для обследования Д Н К родителей и их дочерей позволит исключить эту ошибку. 2. Недостаточная информативность молекулярно-генетических ме- тодов. Трехлетний опыт работы убедил нас в том, что информативны- ми, т. е. пригодными для диагностики, являются лишь 94 % семей вы- сокого риска. Прямой анализ мутаций у больных и их родственников может решить эту проблему [17, 19]. Перспективным является также поиск новых полиморфных сайтов в интронных, нетранскрибируемых частях гена [16]. 3. Примерно в 30 % случаев мутация возникает de novo, т. е. в оогенезе или сперматогенезе матери больного и родителей матери со- ответственно [4, 7] . Анализ трех родословных с изолированными слу- чаями гемофилии А приведен в данной работе. Кроме того, в настоя- © М. В. АСЕЕВ, Н. Г. ГОРНОСТАЕВА, В. С. БАРАНОВ, 1991 92 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИЛАЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. XQ 2. 7-0-852 92 щем сообщении суммированы результаты П Д Р Ф - а н а л и з а семей с вы- соким риском гемофилии А, обсуждаются объективные факторы, за- трудняющие постановку диагноза, и намечены перспективы молеку- лярной диагностики этого заболевания. Материалы и методы. Работа выполнена на 80 семьях, имеющих больных гемофилией А, состоящих на учете в Ленинградском гемофи- лическом центре, Одесском медицинском институте, медико-генетиче- ских центрах Минска, Киева, Кишинева. Все больные подвергались клиническому обследованию; в том числе определялась активность факторов VIII и IX. Д Н К выделяли из лейкоцитов периферической крови по модифицированному бесфенольному методу [1]. Рестрикци- онное расщепление эндонуклеазой TaqI вели 6 ч при 65 °С, качество реакции проверяли на микрофорезе. Рестрикционную Д Н К (10 мкг) каждого члена семьи разделяли с помощью электрофореза в 0,8 %-ной агарозе и переносили на капроновый фильтр «Хийу Калур» (Таллинн) по стандартной методике [13]. Зонд St-14 (3,0 тыс. п. о., фрагмент локуса DXS52) любезно предо- ставлен Д ж . Л. Манделем (Страсбург, Франция) [12]. Зонд выделя- ли из культуры клеток щелочным лизисом с последующим центрифу- гированием в градиенте плотности хлористого цезия в присутствии бромистого этидия, метили в реакции ник-трансляции 3 2 P (удельная активность (2—4) · IO8 имп-мин - 1 · мкг - 1 ) , гибридизовали на фильтрах ( 6 X S S C , 5 х р а с т в о р Денхарда, 0,1 %-ный DS-Na, 100 мкг/мл Д Н К спермы лосося, 10 %-ный декстрансульфат, 18 ч, 65°С) с рестрици- рованной Д Н К на фильтрах по методу [13] и после отмывки экспо- нировали с рентгеновской пленкой в кассетах с усиливающим экраном при 20 °С. Олигопраймеры для проведения полимеразной цепной реакции синтеза Д Н К П Д Р синтезированы во Всесоюзном гематологическом центре Минздрава СССР (Москва) на приборе «Pharmac ia Gene As- sembler» фосфоамидитным методом [3]. Амплификацию проводили в инкубационной среде объемом 50 мкл (67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 6,7 мМ MgCl 2 , Ю мМ меркаптоэтанол; 16,6 мА ( N H ) 2 S O 4 ; 6,7 мкМ ЭДТА, 170 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 4 dNTP (1,0 мМ каждый) , пары праймеров (0,03 мкг каждый) , 1 мкг Д Н К ) . После денатурации в течение 10 мин при 98 °С добавляли 2 ед. активности ДНК-полимеразы Thermus thermopkilus и вели синтез на термоцик- лере («ТесЬпе», Великобритания) . Режим П Ц Р : денатурация—1 мин, 94 °С, отжиг праймеров — 1 мин, 54 °С, синтез Д Н К — 3—5 мин, 73 °С (для амплификации фрагмента 730 п. о., рестрицируемого эндо- нуклеазой HindIII); денатурация — 0,5 мин, 94 °С, отжиг праймеров и синтез — 0,3 мин (для амплификации фрагмента 96 п. о., рестрици- руемого эндонуклеазой XbaI). Обрабатывали рестриктазами непосред- ственно в реакционной среде при 37 °С 3 ч. Полученные таким обра- зом гидролизаты Д Н К разделяли электрофорезом в 7 %-ном полиак- риламидном геле (ПААГ) и тестировали после прокрашивания бро- мистым этидием в УФ-свете (трансиллюминатор, «LKB», Швеция) при длине волны 302 нм. Наличие сайта рестриктазы HindIII определяли по присутствию аллелей 160 и 90 п. о., отсутствие этого сайта приводило к появле- нию аллеля 250 п. о. [31. Существование полиморфного сайта для XbaI во фрагменте 96 п. о. вызывало появление фрагментов длиной 68 и 28 п. о. [12]. Результаты и обсуждение. К настоящему времени молекулярно- генетический анализ проведен в 80 семьях —• 320 человек. Из них ин- формативными оказались 75 семей. Результаты исследований по вы- явлению гетерозиготного носительства и пренатальной диагностики суммированы в таблице. Пренатальная диагностика и диагностика носительства в семьях с гемофилией А не вызывает затруднений в тех случаях, если заболе- вание зарегистрировали в нескольких поколениях либо если женщина ISSN 0233-7657. БИОПОЛИЛАЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. XQ 2. 7-0-852 93 из группы высокого риска имеет два или более больных детей. Анализ полиморфных сайтов для рестрикционных эндонуклеаз внутри интро- нов позволяет проводить диагностику с ошибкой менее 0,2 %. В та- ком случае функциональные и иммунологические методы определения носительства, которые дают ошибку в 10—15 % случаев, используются как дополнительные [4, 16, 17]. Так, в семье Т. (рис. 1, а) сцепление мутантного гена с фраг- ментом 250 п. о. (поли- морфный сайт HindIII) Рис. 1. Пренатальная диагно- стика гемофилии А методом по- лимеразной цепной реакции синтеза Д Н К в семьях высоко- го риска в I триместре бере- менности: а — тестирование по HitidIII-сайту. П л о д мужского пола, диагноз гемофилии А под- твержден. Мутантный аллель сцеплен с аллелем 250 п. о.; б — тестирование по внутриген- \ ному сайту XbaI в семье Б . Плод мужского пола, здоров. Мутантный ген сцеплен с алле- лем 68 п. о. Fig . 1. P r e n a t a l d i agnos i s of hemophil ia A by po lymerase chain react ion in h igh risk fa- milies at the 1st t r imes ter of p r egnancy позволяет провести диагностику носительства у племянницы пробанда, ее дочери и поставить диагноз гемофилии А плоду мужского пола. В семье Б. (рис. Iy б) у женщины с нормальной активностью фак- тора VIII (109 %) двое детей больны гемофилией А. Так как вероят- ность повторной мутации крайне мала, женщина была определена на- ми как носительница, ей была рекомендована пренатальная диагно- стика. Д а н н а я семья была информативной по XbaI-сайту (интрон 22), выявленному методом полимеразной цепной реакции. Сложность ра- боты с этим сайтом состоит в том, что наряду с районом 22 интрона фактора VIII синтезируется фрагмент из другой области генома, но этот фрагмент стабильно не имеет сайта рестрикции для XbaI. Тот факт, что больные дети и плод имеют разные аллели, свидетельствует о том, что женщина является гетерозиготной по этим аллелям и, сле- довательно, семья информативна. Анализ Д Н К , взятой из пуповинной Итоги диагностики носительства и пренатальной диагностики гемофилии А молекулярно-генетическими методами Basic results of carrier detection and prenatal diagnosis of hemophilia A by molecular methods Число информатив- ных семей Определение гетерозиготного носителя гемофилии А Пренатальная диагностика Число информатив- ных семей Установлено Отвергнуто Всего Больных мужских плодов Здоровых мужских плодов Девочек- носительниц 25 18 23 20 12 3 3 94 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИЛАЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Xq 2. 7-0-852 94 вены, позволил установить, что плод мужского пола не будет страдать гемофилией А. В ряде случаев использование П Д Р Ф - а н а л и з а дает возможность определить, у кого именно из родственников пробанда возникла спон- танная мутация. В семье Ш. мать двоих детей является гетерозигот- ной по аллелям полиморфного сайта HindIIIy однако оба ее сына — Рис. 2. ДНК-диагностика в семье Ш. методом полимеразной цепной реакции по внут- ригенному полиморфному сайту HindIII. Мутация гемофилии возникла в оогенезе. По- яснения в тексте Fig . 2. DNA-d iagnos i s in the fami ly Sh. by po lymerase chain react ion method on in t ra - genet ic polymorphic site H ind I I I . Mu ta t i on s p r a n g in oogenes is Рис. 3. П Д Р Ф - а н а л и з в семье С. с использованием внегенного зонда St-14 и рестрикции TaqI. Мутация гемофилии А маркирована аллелем 6,6 тыс. п. о. Наиболее вероятное возникновение мутации в сперматогенезе деда [1]. Пояснения в тексте Fig. 3. R F L P - a n a l y s i s in the fami ly S. with in tergenet ic probe St-14 and endonuc lease T a q l здоровый и больной гемофилией А — несут один и тот же аллель 260 п. о. (рис. 2) . Последнее обстоятельство, а т акже то, что у жен- щины не наблюдалось снижения активности фактора VIII в крови, по- зволяют прийти к заключению о возникновении мутации в оогенезе. Это свидетельствует о том, что в семьях, где мутация возникла de novo, необходимо обследование не только самих больных и их мате- рей, но и их сибсов. С помощью подобного анализа можно избежать ложноположительных ответов о носительстве заболевания в пренаталь- ной диагностике. П Д Р Ф - а н а л и з большой выборки семей со спонтанной формой ге- мофилии А показал, что примерно в 75 % случаев заболевание свя- зано с мутацией, возникшей в сперматогенезе, и только в 2 5 % — в оогенезе [4, 7] . Примером такой семьи является семья С. (рис. 3) , обратившаяся за консультацией в I триместре беременности. Исполь- ISSN 0233-7657. БИОПОЛИЛАЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. XQ 2. 7-0-852 95 зование внутригенных маркеров было невозможно, так как семья оказалась неинформативной по HindIII- и XbaI-сайтам. П Д Р Ф - а н а - лиз с помощью зонда St-14 выявил, что больной получил от матери Х-хромосому здорового деда. Снижение активности фактора VIII у матери, а т акже спонтанный характер мутации дают основание счи- тать, что мутация возникла в сперматогенезе. Это обстоятельство по- зволяет отвергнуть носительство мутации у двух родственниц (теток пробанда) , которые тем не менее имеют аллель 6,6 тыс. п. о., сцепленный с мутантной хромосомой пробанда. Однако в большинстве спорадических случаев гемофили не удается выяснить происхождение му- тации прежде всего из-за невозможности проведе- ния молекулярного анализа Д Н К родителей ма- тери пробанда. Это приводит к фактическому за- вышению ложноположительных диагнозов как в пренатальной диагностике, так и в диагностике носительства. В таком случае молекулярный ана- лиз носит скорее вероятностный характер. Ответ дается исходя из того, какой аллель сцеплен с Х-хромосомой, несущей ген гемофилии А. Приме- V- · P o m является семья П. (рис. 4) . Хотя у матери Рис. 4. П Д Р Ф - а н а л и з в семье высокого риска П. гемофилии А. Полиморфная система St-14/TaqI. Мутантный ген сцеплен с аллелем 4,5 тыс. п. о. Снятие диагноза гетерозиготного носи- тельства мутации у дочери [3]. Пояснения в тексте Fig. 4. R F L P - a n a l y s i s in the f ami ly P. wi th h igh risk of hemo- philia A. Po lymorph ic sys tem S t - 1 4 / T a q l пробанда не была снижена активность фактора VIII, при диагностике носительства у дочери мы исходили из того, что 1) женщина имеет больного сына; 2) мутация возникает преимущественно в сперматоге- незе. Основываясь на этом, был дан ответ дочери о носительстве гена гемофилии А и рекомендована пренатальная диагностика. Такая стра- тегия позволяет избежать ложноположительных диагнозов носитель- ства и уменьшить число больных детей, рожденных вследствие ошиб- ки молекулярного анализа. Таким образом, в семьях с подозрением на спонтанно возникшую мутацию гемофилии А в гаметах матери бо- лее оправданна комплексная диагностика во втором триместре бере- менности с использованием молекулярно-генетических методов и им- мунологического определения уровня факторов VIII, IX и Виллибран- та в крови плода. Перспективным для молекулярной диагностики гемофилии А яв- ляется использование электрофореза двуцепочечной Д Н К в градиен- тном денатурирующем геле и электрофореза одноцепочечной Д Н К в неденатурирующем ПААГ [15, 16]. Оба подхода с успехом применимы для выявления точечных мутаций в достаточно больших фрагментах экзонов. Точное картирование самой мутации, т. е. выявление харак- тера нуклеотидной замены, требует секвенирования амплифицирован- ного участка Д Н К (метод GAWTS) [18, 19]. Установление точной природы мутации в семьях высокого риска с гемофилией А существенно повысит выявление гетерозиготного но- сительства и пренатальной диагностики. Р е з ю м е В роботі підсумований трирічний досвід молекулярної діагностики гемофілії А за допо- могою П Д Р Ф - а н а л і з у та полімеразної ланцюгової реакції синтезу Д Н К . Із 80 сімей 75 виявилися інформативними для ДНК-ДІагностики. У 18 родичок пробанда встановлена 94 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИЛАЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Xq 2. 7-0-852 96 присутність гемофілії А, у 23 — відкинута. У 20 випадках на І та I I триместрах вагіт- ності проводили пренатальну діагностику цього захворювання. Приведені характерні приклади Д Н К - а н а л і з у в сім'ях високого ризику, розглянуті об'єктивні фактори, щ о ускладнюють пренатальну діагностику гемофілії А, а т акож найбільш перспективні но- ві методичні підходи, які збільшують ефективність молекулярних досліджень природи мутації гену фактору V I I L S u mm а r у Three years experience in molecular d iagnos i s of hemophil ia A by means of R F L P s tudies and PGR ana lys i s of F V I I I gene is summar i sed . 75 out of 80 famil ies s tudied were Tound to be in format ive for DNA analysis . 18 hemophil ia A carr iers have been detected and in 23 female relat ives the presence of hemophil ia A has been rejected. The resul ts of 27 cases of p rena ta l d iagnoses of hemophil ia A at the 1st and 2nd t r imester of p r egnancy are peported. The examples of DNA analys is in some hemophil ia A famil ies are presented. The diffi- cul t ies of molecular s tudies in IIA famil ies are out l ined and the opt ions of new molecular approaches for effect ive detection of fac tor VI I I gene muta t ions are discussed. С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы ]. ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи Д Н К зондов / М. В. Асеев, Т. Э. Иващенко, В. Н. Горбунова и д р . / / Б и о п о л и м е р ы и клетка.— 1990.— 6, № 2.— С. 45—52. 2. Баранов В. С. Дородовая диагностика наследственных болезней: современное состоя- ние, реальные возможности и п е р с п е к т и в ы / / В е с т . А М Н СССР.— 1987.— № 4.— С. 44—50. 3. Выявление носителей гемофилии А тестированием полиморфных BcII и HindIII сай- тов методом полимеразной цепной реакции с внутренним контролем расщепления / B. Л. Сурин, Е. Л . Ж у к о в а , А. А. Крутов и др. / / Гематология и трансфузиология.— 1990.— 355, № 3.— С. 3—6. 4. Direet charac ter iza t ion of Fac tor V I I I in p lasma. Detection of a muta t ion a l t e r ing a thrombin c leavage site (a rg in ine 372-hist idine) / M . Arai, H. Inaba , M. Higuchi et al. / / Proc. Nat . Acad. Sci. USA.— 1 9 8 9 . — 8 6 . — P . 4277—4281. 5. Charaeierization of par t ia l deletion of the Fac tor V I I I gene in a haemophi l iac with i n h i b i t o r / B . Bardoni , M. Sampiet ro , M. Romano et al. / / Hum. Genet .— 1988.— 79, N 1 ,—P. 86—88. (). A HindIII R F L P and gene lesion in the coagula t ion fac tor V I I I gene / F. Berna rd , C. Legn an i, S. Volinia et al. / / I b i d . — 7 8 , N 2 , — P . 359—362. 7. RFLP ana lys i s in famil ies with sporadic haemophi l ia A . / / I b i d . — 1987.— 76, N 2.— P. 253—256: 8. Gitscher J. Ma te rna l duplicat ion associated with gene deletion in sporadic hemophil ia / / Amer. J. Hum. Genet.— 1988.— 43,— P. 274—279. 9. Mild hemophil ia A resu l t ing f r o m Arg to Leu subs t i tu t ion in exon 26 of the Fac- tor VI I I g e n e / H . Inaba , M. Fuj inski , H. H. Kazaz ian et a l . / / H u m . Gene t .—1989 .— 81, N 3 , — P . 335—338. 10. Kaufman R. J. Genetic eng inee r ing of Fac tor VI I I / / Na ture .— 1989,— 342, N 9 — P. 207—208. 11. Haemophilia A resu l t ing f r o m de novo inser t ion of Ll sequence represents a novel mechanism for muta t ion in man / H. H. Kazaz ian , Jr. , G. Wong , H. Youssouf ian et al. / / Ibid.— 1988.— 332,— P. 164—166. 12. Kogan S. G., Doherty M., Gitseher J. An improved method for p rena ta l d iagnos i s of genetic diseases by ana lys is of amplif ied DNA sequences appl icat ion to hemophil ia / / New Engl . J. Med.— 1987,—317, N 16 .—P. 985—990. 13. Maniatis T., Fritsh E., Sembrook J. Molecular c loning.— New York : Cold S p r i n g Har- bor Lab., 1989,—420 p. 14. Genetic sc reening for hemophil ia A with a polymorphic DNA probes / I . Oberle, B. Ga- merino, R. Hei l ing et a l . / / N e w Engl . J. M e d . — 1 9 8 5 . — 3 1 2 , N 13 ,—P. 682—686. 15. Rapid and sensi t ive detection of point muta t ion and DNA po lymorph isms us ing the po lymerase chain reaction / M. Ori ta , Y. Suzuki, T. Sekiya et a l . / / G e n o m i c s . — 1989 — 5,— P. 874—879. 16. Use of d e n a t u r a t i n g g rad ien t gel e lectrophoresis to detect point mu ta t i ons in the Fac- tor VI I I g e n e / M . Ъ. T r a g s t m a n , M. Higushi , C. K. Kasper et a l . / / I b i d . — 1990,—6,— P. 293—301. 17. Nonsense and missense muta t ions in hemophil ia A: es t imate of the re la t ive mu ta t ion ra te at CG dinucleot ides / H. Youssouf ian , S. E. Antonorakis , W. Bell et a l . / / A m e r J. Hum. Genet.— 1988,— 42, N 1 .—P. 718—725. 18. Restriction endonuclease m a p p i n g of six novel delet ions of the Fac tor VI I I gene in he- mophil ia A / / H. Youssouf ian , C. K. Kasper , D. G. Phi l l ips et al. / / Hum Genet — 1988,—80, N 1 .—P. 143—148. ISSN 0233-7657. БИОПОЛИЛАЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. XQ 2. 7 - 0 - 8 5 2 97 19. Moderately sever hemophi l ia A resu l t ing f r o m Glu-Gly subs t i tu t ion in exon 7 of Fac- tor I I I gene / H. Youssof ian , C. Wong , S. Aronis et al. / / A m e r . J . Hum. Genet .— 1 9 8 8 , — 4 2 . — P . 867—871. Получено 05.07.90 Н И И акушерства и гинекологии А М Н СССР, Ленинград УДК 576.116.4 О. В. Малышева, В. Н. Горбунова, В. В. Красильников, В. С. Баранов ПДРФ-АНАЛИЗ И СКРИНИНГ ДЕЛЕЦИЙ В СЕМЬЯХ БОЛЬНЫХ МИОДИСТРОФИЕЙ ДЮШЕННА (МДД)* Методами обычной и множественной полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, а так- же б лот-гибридизации по Саузерну исследованы аллельный полиморфизм пяти сайтов ДНК, тесно сцепленных с геном дистрофина, и наличие делеций этого гена у пробандов и в семьях высокого риска. Информативными по одному или нескольким полиморфным сайтам оказались 29 и 36 обследованных семей, т. е. они пригодны для пренатальной диагностики и определения гетерозиготного носительства мутации. У 11 из 32 больных МДД выявлены различные делеции гена дистрофина. Приведены конкретные примеры пренатальной диагностики МДД на ранних сроках беременности. Обсуждаются преиму- щества и недостатки ПДРФ-анализа и метода прямого определения мутаций гена ди- строфина для выявления гетерозиготного носительства и пренатальной диагностики МДД. Введение. Миодистрофия Дюшенна — тяжелое спецленное с полом на- следственное заболевание, встречающееся в среднем у одного из 3 500 новорожденных мальчиков. М Д Д вызывается мутациями в гене дист- рофина, расположенном в коротком плече Х-хромосомы (Хр21.3). На- чиная со второй половины 80-х годов были разработаны молекуляр- но-генетические методы, позволяющие проводить пренатальную диаг- ностику и определять гетерозиготное носительство у женщин из груп- пы высокого риска. В настоящее время существуют два принципиаль- ных подхода в молекулярной диагностике М Д Д : анализ полиморфиз- ма длины рестрикционных фрагментов ( П Д Р Ф ) и прямое определе- ние мутаций в гене дистрофина. Суть первого подхода состоит в том, что в консультируемой семье удается маркировать хромосомы матери по наличию или отсутствию определенных сайтов рестрикции в тесно сцепленных с геном дистрофина локусах Д Н К или внутри самого ге- на. Это делает возможным различить «больную» и «здоровую» хро- мосомы и проследить их наследование в данной семье. Со скидкой на вероятность кроссинговера между маркерным сайтом и мутацией (5— 10 %) этот путь позволяет провести достоверную пренатальную диаг- ностику и выявить гетерозиготное носительство. Второй метод — прямое определение мутации. В настоящее время он может быть использован в 50—70 % семей с М Д Д , где удается обнаружить делеции гена дистрофина у пробанда, и является практи- чески абсолютно достоверным способом пренатальной диагностики. Однако определение гетерозиготного носительства этим способом за- труднено. В данном сообщении представлены данные по изучению П Д Р Ф по пяти полиморфным сайтам в семьях больных М Д Д , а также при- ведены результаты скрининга делеций этого гена у больных. Материалы и методы. Д Н К из лейкоцитов периферической крови и клеток хориона выделяли, как описано ранее [1]. Д л я блот-гибри- * Р а б о т а частично финансируется В О З (Грант G 3 / 1 8 1 / 1 3 9 ) . © о . В. МАЛЫШЕВА, в . Н. ГОРБУНОВА, В. В. КРАСИЛЬНИКОВ, В. С. БАРАНОВ, 1991 98 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИЛАЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. XQ 2. 7-0-852 98

Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения

Репозитарії

Схожі ресурси