Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека

Описана процедура быстрого, чувствительного а точного определения цитомегаловируса (ЦМВ) в тканях и биологических жидкостях человека с помощью термофильной ДНК-по ли ме разы из Thermus thermophilus. Процедура состоит из двух последовательных ПЦР. Первая включает 40 циклов (денатурация ДНК, отжиг пра...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1991
Автори:	Виноградская, Г.Р., Горышин, И.Ю., Новикова, Л.Н., Плуталов, О.В., Башмакова, М.А., Берлин, Ю.А., Цинзерлинг, В.А., Шварц, Е.И., Ланцов, В.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1991
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153530
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека / Г.Р. Виноградская, И.Ю. Горышин, Л.Н. Новикова, О.В. Плуталов, М.А. Башмакова, Ю.А. Берлин, В.А. Цинзерлинг, Е.И. Шварц, В.А. Ланцов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 3. — С. 31-35. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-153530
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1535302019-06-15T01:24:53Z Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека Виноградская, Г.Р. Горышин, И.Ю. Новикова, Л.Н. Плуталов, О.В. Башмакова, М.А. Берлин, Ю.А. Цинзерлинг, В.А. Шварц, Е.И. Ланцов, В.А. Описана процедура быстрого, чувствительного а точного определения цитомегаловируса (ЦМВ) в тканях и биологических жидкостях человека с помощью термофильной ДНК-по ли ме разы из Thermus thermophilus. Процедура состоит из двух последовательных ПЦР. Первая включает 40 циклов (денатурация ДНК, отжиг праймеров и ДНК-полимеризация), выполняемых с двумя праймерами по 20 оснований, консервативная последовательность которых взята из гена MIE (major immediate early) ЦВМ. Вторая реакция включает от 20 до 50 циклов, аналогичных первым, но на основе 20-членных праймеров, фланкирующих внутреннюю часть фрагмента ДНК, намноженного ранее. Конечный фрагмент обнаруживается по окрашиванию бромистым этидием после электрофореза в полиакриламидном геле. Верификация искомой полосы включает ее рестрикционный анализ. С помощью плазмиды рСМ5018, несущей ген MIE вируса, показано, что предлагаемая процедура может выявлять столь малые количества ДНК, как несколько (от 1 до 5) плазмидных молекул. Описана процедура швидкого, чутливого та точного визначення цитомегаловірусу (ЦМВ) у тканинах і біологічних рідинах людини за допомогою термофільної ДНК-полімерази Thermus thermophilus. Процедура складається з двох послідовних ПЦР. У першій реакції проходить 40 циклів (денатурація ДНК, ренатурація праймерів і ДНК-полімерізація), що виконуються з двома праймерами по 20 основ, консервативна послідовність яких узята із гену MIE (major immediate early) ЦМВ. Друга реакція включає від 20 до 50 циклів, що відповідають першим, але на основі 20-членних праймерів, які ампліфікують внутрішню частину фрагменту ДНК (останній намножений раніше). Кінцевий фрагмент виявляється при фарбуванні бромистим етидієм після електрофорезу в поліакриламідному гелі. Веріфікація потрібної смуги провадиться і на·основі рестрикційного аналізу. За допомогою плазміди рСМ5018, що несе ген MIE вірусу, показано, що пропонована процедура може виявляти такі малі кількості ДНК, як декілька (від 1 до 5) плазмідних молекул. A rapid, sensitive and precise procedure of detecting cytomegalovirus (CMV) DNA in human tissue and biological liquid by means of the thermostable DNA-polymerase from Thermus thermophilus is described. The procedure consists of two consecutive PCRs. The-first one includes 40 cycles of denaturation, primer annealing and chain extension with two 20-base primers chosen from the conserved sequence ot MIE (major immediate early) gene of CMV. The second reaction includes from 20 up to 50 cycles consisting of the same steps but with 20-base primers chosen to amplify the internal part of the fragment amplified during the first reaction. The final fragment is detected by the ethidium bromide staining after polyacrylamide gel electrophoresis. Verification of the band includes restriction enzyme analysis. Use of pCM5018 plasmid bearing the CMV MIE gene shows that the proposed procedure can detect as little as several (from 1 to 5) molecules of DNA. 1991 Article Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека / Г.Р. Виноградская, И.Ю. Горышин, Л.Н. Новикова, О.В. Плуталов, М.А. Башмакова, Ю.А. Берлин, В.А. Цинзерлинг, Е.И. Шварц, В.А. Ланцов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 3. — С. 31-35. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002CB http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153530 577.21 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
description	Описана процедура быстрого, чувствительного а точного определения цитомегаловируса (ЦМВ) в тканях и биологических жидкостях человека с помощью термофильной ДНК-по ли ме разы из Thermus thermophilus. Процедура состоит из двух последовательных ПЦР. Первая включает 40 циклов (денатурация ДНК, отжиг праймеров и ДНК-полимеризация), выполняемых с двумя праймерами по 20 оснований, консервативная последовательность которых взята из гена MIE (major immediate early) ЦВМ. Вторая реакция включает от 20 до 50 циклов, аналогичных первым, но на основе 20-членных праймеров, фланкирующих внутреннюю часть фрагмента ДНК, намноженного ранее. Конечный фрагмент обнаруживается по окрашиванию бромистым этидием после электрофореза в полиакриламидном геле. Верификация искомой полосы включает ее рестрикционный анализ. С помощью плазмиды рСМ5018, несущей ген MIE вируса, показано, что предлагаемая процедура может выявлять столь малые количества ДНК, как несколько (от 1 до 5) плазмидных молекул.
format	Article
author	Виноградская, Г.Р. Горышин, И.Ю. Новикова, Л.Н. Плуталов, О.В. Башмакова, М.А. Берлин, Ю.А. Цинзерлинг, В.А. Шварц, Е.И. Ланцов, В.А.
spellingShingle	Виноградская, Г.Р. Горышин, И.Ю. Новикова, Л.Н. Плуталов, О.В. Башмакова, М.А. Берлин, Ю.А. Цинзерлинг, В.А. Шварц, Е.И. Ланцов, В.А. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека Биополимеры и клетка
author_facet	Виноградская, Г.Р. Горышин, И.Ю. Новикова, Л.Н. Плуталов, О.В. Башмакова, М.А. Берлин, Ю.А. Цинзерлинг, В.А. Шварц, Е.И. Ланцов, В.А.
author_sort	Виноградская, Г.Р.
title	Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека
title_short	Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека
title_full	Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека
title_fullStr	Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека
title_full_unstemmed	Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека
title_sort	полимеразная цепная реакция (пцр) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1991
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153530
citation_txt	Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека / Г.Р. Виноградская, И.Ю. Горышин, Л.Н. Новикова, О.В. Плуталов, М.А. Башмакова, Ю.А. Берлин, В.А. Цинзерлинг, Е.И. Шварц, В.А. Ланцов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 3. — С. 31-35. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT vinogradskaâgr polimeraznaâcepnaâreakciâpcrdlâdiagnostikivirusnojinfekciicitomegalovirusčeloveka AT goryšiniû polimeraznaâcepnaâreakciâpcrdlâdiagnostikivirusnojinfekciicitomegalovirusčeloveka AT novikovaln polimeraznaâcepnaâreakciâpcrdlâdiagnostikivirusnojinfekciicitomegalovirusčeloveka AT plutalovov polimeraznaâcepnaâreakciâpcrdlâdiagnostikivirusnojinfekciicitomegalovirusčeloveka AT bašmakovama polimeraznaâcepnaâreakciâpcrdlâdiagnostikivirusnojinfekciicitomegalovirusčeloveka AT berlinûa polimeraznaâcepnaâreakciâpcrdlâdiagnostikivirusnojinfekciicitomegalovirusčeloveka AT cinzerlingva polimeraznaâcepnaâreakciâpcrdlâdiagnostikivirusnojinfekciicitomegalovirusčeloveka AT švarcei polimeraznaâcepnaâreakciâpcrdlâdiagnostikivirusnojinfekciicitomegalovirusčeloveka AT lancovva polimeraznaâcepnaâreakciâpcrdlâdiagnostikivirusnojinfekciicitomegalovirusčeloveka
first_indexed	2025-07-14T05:00:12Z
last_indexed	2025-07-14T05:00:12Z
_version_	1837597157476007936
fulltext	УДК 577.21 Г. Р. Виноградская, И. Ю. Горышин, Л. Н. Новикова, О. В. ІІлуталов, М. А. Башмакова, Ю. А. Берлин, В. А. Цинзерлинг, Е. И. Шварц, В. А. Ланцов ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ: ЦИТОМЕГАЛОВИРУС ЧЕЛОВЕКА Описана процедура быстрого, чувствительного а точного определения цитомегаловиру- са (ЦМВ) β тканях и биологических жидкостях человека с помощью термофильной ДНК-по ли ме разы из Thermus thermophilus. Процедура состоит из двух последователь- ных ПЦР. Первая включает 40 циклов (денатурация ДНК, отжиг праймеров и ДНК- полимеризация), выполняемых с двумя праймерами по 20 оснований, консервативная последовательность которых взята из гена MIE (major immediate early) ЦВМ. Вторая реакция включает от 20 до 50 циклов, аналогичных первым, но на основе 20-членных праймеров, фланкирующих внутреннюю часть фрагмента ДНК, намноженного ранее. Конечный фрагмент обнаруживается по окрашиванию бромистым этидием после элек- трофореза в полиакриламидном геле. Верификация искомой полосы включает ее рестрик- ционный анализ. С помощью плазмиды рСМ5018, несущей ген MIE вируса, показано,, что предлагаемая процедура может выявлять столь малые количества ДНК, как не- сколько (от 1 до 5) плазмидных молекул. Введение. Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) относится к числу широко распространенных заболеваний человека. П о р а ж а я детей ран- него возраста и плод, она может стать причиной умственного недоразвития, глухоты, иммунного дефицита и целого ряда других аномалий [1]. Комплексное применение современных методов выявления М Ц В И (вирусологические, иммунофлюоресцентные, серологические, электрон- но-микроскопические и др.) раскрыло настораживающую картину рас- пространенности Ц М В (лит. см. в [1 ] ) . Оказалось, что от 40 до 100% взрослых людей разных стран имеют антитела к ЦМВ, т. е. были в контакте с данным вирусом или являются его носителями; 0,5—2 % всех новорожденных и 49—60 % детей раннего возраста инфицированы ЦМВ. По данным ВОЗ, частота летальных исходов ( ~ 2 % ) Ц М В И не уступает таковой гриппозных инфекций. Все это свидетельствует о важности развития точных экспресс-ме- тодов диагностики ЦМВИ, особенно для целей диагностики у беремен- ных и внутриутробного плода. Появление нового диагностического приема П Ц Р [2], столь ус- пешно используемого для молекулярного анализа генетических нару- шений у человека, не могло оставить в стороне и диагностику Ц М В [3]. Отметим, что на недавней 89-й Ежегодной встрече Американского общества микробиологов из 20 работ, посвященных диагностике Ц М В , четыре были выполнены с помощью П Ц Р [4—7]. В настоящей работе представлены результаты применения П Ц Р на основе ДНК-полимеразы из Т. thermophilus для отработки эффек- тивного, чувствительного и точного экспресс-метода выявления Ц М В в биологических жидкостях и тканях людей, зараженных вирусом. Ре- зультаты исследования приведены ранее [8]. Материалы и методы. Плазмида рСМ5018 [9] построена на осно- ве бактериального вектора pACYC184 и содержит фрагмент вирусной Д Н К в районе гена MIE. Она не содержит Д Н К человека. В ы д е л е н и е Д Н К и з т к а н е й ч е л о в е к а , приготовлен- ных для стандартных гистологических исследований (фиксированных в формалине, парафинированных), проводили согласно[10] с незначи- тельными модификациями. После удаления парафина образцы нареза- ли на пробы по 50 мг. Пробу помещали в 5 мл буфера ТЕ9 (500 мМ трис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, рН 9,0), содержащего 1 % DS-Na © Г. Р. ВИНОГРАДСКАЯ , и . ю . ГОРЫШКИН, л . Н. НОВИКОВА, о . в . ПЛУТАЛОВ, М. А. БАШМАКОВА, Ю. А. БЕРЛИН, В. А. ЦИНЗЕРЛИНГ, Е. И. ШВАРЦ, В. А. ЛАНЦОВ, 1991 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 3 31 и 500 мкг/мл проназы R («Calbiochem», США), и встряхивали при 48 °С в течение суток. Затем к пробе вновь добавляли проназу R (до 1 мкг/мл) и DS-Na (до 2 %) и продолжали инкубировать еще 40 ч в тех ж е условиях. Д Н К экстрагировали добавлением равного объема сме- си фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (в соотношении 25 : 24 : 1) и дополнительно дважды обрабатывали равным объемом хлороформа. После осаждения Д Н К изопропиловым спиртом ее промывали 70 %- ным этанолом, сушили и ресуспендировали в 100 мкл воды. В ы д е л е н и е Д Н К и з м о ч и . Пробы по 15 мл сохраняли за- мороженными. После оттаивания их центрифугировали (2 мин, 2— 3 тыс. об/мин), к супернатанту добавляли 7,5 мл 30 %-ного полиэтилен- гликоля-6000 («Мегск», Ф Р Г ) , приготовленного в 3 M NaCl, выдержи- вали 30 мин во льду и центрифугировали еще раз в течение 40 мин (10 000 об/мин) при 0°С . Осадок ресуспендировали в 200 мкл ТЕ-буфе- ра (100 мМ трис, 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8,5), содержащего 1 % DS-Na и 0,004 % проназы, и инкубировали в течение 2 ч при 48 °С. После двух экстракций Д Н К добавлением равного объема смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (см. выше) в водную фазу до- бавляли MgC/ 2 в концентрации 10 мМ и 2,5 объема холодного эти- лового спирта. Смесь выдерживали в течение ночи при —20 °С. После центрифугирования и отмывки осадок растворяли в 100 мкл воды. К о н ц е н т р а ц и ю Д Н К в п р о б е определяли методом срав- нения со шкалой стандартов пятна, прокрашенного бромистым эти- дием [11]. П Ц Р проводили в объеме 50 мкл в условиях, отработанных для полимеразы из Т. thermophilus [12]. Реакционная смесь содержала ТЕ-буфер (16,6 мМ (NH 4 ) 2 SO 4 , 67 мМ трис-HCl, рН 8,5—8,8, 6,7 мМ MgCl 2 , 10 мМ β-меркаптоэтапол, 6,7 мкМ ЭДТА) , бычий сывороточ- ный альбумин (170 мкг/мл) , все четыре дезокситрифосфата (1,25 мМ), п р а й м е р ы — 2 пмоль для первой пары праймеров и 10 пмоль для вто- рой пары и 5—10 мкл исследуемой Д Н К . Реакционную смесь покры- вали вазелиновым маслом и выдерживали 5—10 мин при 98 °С. Затем добавляли 1 ед. термофильной полимеразы и запускали реакцию в следующем температурном режиме : 1 мин при 94, 1 мин при 55 и 2 мин при 70—72 °С. Р а с щ е п л е н и е амплифицированной Д Н К рестриктазой BatnHI ( Н П О «Фермент», Вильнюс) проводили в буфере, используе- мом для П Ц Р . Э л е к т р о ф о р е з осуществляли в 6 %-ном полиакриламидном геле. Результаты и обсуждение. Использование П Ц Р для диагностики инфекционного заболевания основано на возможности с ее помощью визуализировать наследственное вещество возбудителя данного заболе- вания с последующей его верификацией. Действительно, применяя П Ц Р можно амплифицировать заданный фрагмент Д Н К , извлечь его и ве- рифицировать различными молекулярными методами, такими как гиб- ридизация с известной меченой последовательностью Д Н К , расщепле- ние амплификата в определенном сайте рестриктазой и д а ж е секвени- рование амплифицированной Д Н К . Ц М В человека относится к семейству ДНК-овых герпетических вирусов [1]. Д л я амплификации мы выбрали фрагмент размером 257 н. п. из конца структурной части гена MIE ЦМВ, нуклеотидная пос- ледовательность которого была опубликована [13]. Структуры левого и правого праймеров выбраны соответственно: S rTGTGTCTGTC- AAGTCTGAGC3' , 5 'TTTCACAGGCGTGACACGTT3' . Амплифицирован- кый фрагмент содержал сайт эндонуклеазной рестрикции BamIII, кото- рый использовали для верификации амплификата. Примеры П Ц Р - а н а л и з а как контрольного (плазмида рСМ5018), т а к и испытуемого (секционный материал: печень человека) материа- л а приведены на рис. 1 (а и б) . Из 14 образцов секционного матери- 32 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 3 3 — 1-129 32 ала, показывавших типичную морфологическую картину цитомегали- ческих клеток, только 9 дали положительный ответ, пример которого представлен на рис. 1. Варьирование экспериментальных условий—• внесение лишь ограниченного количества праймеров на первых циклах амплификации с последующим разбавлением и внесением большего ко- личества праймеров на последующих циклах, увеличение числа циклов амплификации до 100—не дало результата. Более того, при увеличении Рис. 1. Электрофореграммы фрагмента Д Н К ЦМВ после его амплификации с помощью П Ц Р (60 циклов): а—плазмида рСМ5018 (дорожка 1, контроль); секционный мате- риал человека (дорожка 2)\ б— обработка рестриктазой BamHI (дорожка 1) ампли- фнката секционного материала (дорожка 2). M — маркеры молекулярной массы Рис. 2. Электрофореграммы фрагмента Д Н К ЦМВ после его амплификации в двух последовательных ПЦР с внешними (1-я реакция) и внутренними (2-я реакция) прай- мерами: 1—4 — образцы секционного материала человека (4 требует дополнительной амплификации); 5—амплификация Д Н К плазмиды пЦМ5018, направляемая только внутренними праймерами; 6 — то же, что 5, но с внешними праймерами; 7 — м о ч а но- ворожденного (без выделения ДНК) . Л—амплификация за счет внутренних и Б — внешних праймероз: В — предположительно является димером А; Г—димером Б\ Д — предположительно возникает из амплифицированного материала после продолжи- тельной ПЦР числа циклов амплификации сверх 40 искомая полоса Д Н К начинала исчезать и возникала новая полоса на старте гель-электрофореза, что интерпретировалось нами как участие амплифицированной Д Н К (включая и неспецифические зоны) в образовании разветвленных стру- ктур в ходе гомологического спаривания. Чтобы повысить чувствительность анализа, оставаясь в рамках одного метода, решили для тех случаев, где амплификат не выявляет- ся прокрашиванием бромистым этидием, провести его вторичную амплификацию с использованием праймеров, фланкирующих внут- реннюю часть (217 н. п.) амплифицированного фрагмента. Струк- туры левого и правого внутренних праймеров были соответственно: S rCAGTGTCTGAGATAGAGGAAS r ; S rTATTGAGTAGGATTACAGAGS r . Эксперимент проводили по следующей схеме: 40 циклов амплифика- ции на внешних праймерах и от 20 до 70 циклов (в зависимости от ито- га) па внутренних. Типичный результат представлен на рис. 2. Хорошо видны конт- рольные полосы амплификации Д Н К из плазмиды рСМ5018 с помо- щью внутренних (дорожка 5, полоса А) и внешних (дорожка 6, полоса Б) праймеров. Четко видны полосы А в тестируемых пробах секцион- ного материала (дорожки 1—3) и пробе мочи новорожденного (до- рожка 7). В последнем случае клиническая картина Ц М В И была столь выраженной, что для анализа взяли пробу мочи без выделения ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 3 3 — 1-129 3 3 риала, которая показала наличие искомой полосы А лишь при увеличе- нии числа циклов П Ц Р на внутренних праймерах до 70 (данные не приведены). Обращает на себя внимание присутствие дополнительных полос,, видимых на снимке: полосы В и Г интерпретируются нами как димер- ные структуры основных полос. Отметим, что эти структуры могут отражать особенности используемой нами термофильной полимеразы. Полоса Д появляется в тех случаях, когда концентрация амплифици- ровапного материала в реакционной смеси превышает некую допусти- мую величину. Выше мы это уже упоминали. Все образцы, подвергнутые двойной П Ц Р с внешними и внутрен- ними праймерами, были верифицированы с помощью рестрикции эндо- нуклеазой BamHI (данные не приведены). Все 12 образцов, тестированных данным методом (7 образцов секционного материала, 5 прижизненных проб), дали положительный ответ, хотя «сигнал» был различной силы: 6 секционных образцов и моча ребенка в остром периоде Ц М В И диагностировались уже после 20 циклов вторичной П Ц Р , тогда как остальные требовали 50—70 циклов. Было решено оценить чувствительность используемого приема. С этой целью Д Н К плазмиды рСМ5018 (30 мкг/мл) разбавляли от IO5 до IO10 раз. Последнее соответствовало 1—5 молекулам плазмиды в. пробе. При всех разбавлениях метод двойной амплификации дал по- зитивный ответ (при отсутствии сигнала в пробе без плазмиды). Этот эксперимент позволяет сделать два вывода: 1) предлагаемый метод диагностики Ц М В практически не имеет ограничений своей чувствите- льности; 2) в ряде прижизненных проб (моча беременных женщин с вялотекущим заболеванием) концентрация ЦМВ оказалась чрезвычай- но низкой. Высокая чувствительность и точность описываемого экспресс-ме- тода даст возможность применять его для скрининга ЦМВ в популя- ционных исследованиях. Авторы выражают благодарность О. К. Кабоеву за предоставле- ние ДНК-полимеразы из T thermophilics·, В. М. Месянджинову — плаз- миды рСМ5018; В. В. Константинову — за синтез олигонуклеотидов. Р е з ю м е Описана процедура швидкого, чутливого та точного визначення цитомегаловірусу (ЦМВ) у тканинах і біологічних рідинах людини за допомогою термофільної ДНК- полімерази Thermus thermophilus. Процедура складається з двох послідовних П Ц Р . У першій реакції проходить 40 циклів (денатурація ДНК, ренатурація праймерів і ДНК-полімерізація), що виконуються з двома праймерами по 20 основ, консервативна послідовність яких узята із гену MIE (major immediate early) ЦМВ. Друга реакція включає від 20 до 50 циклів, що відповідають першим, але на основі 20-членних прай- мерів, які ампліфікують внутрішню частину фрагменту Д Н К (останній намножений раніше). Кінцевий фрагмент виявляється при фарбуванні бромистим етидієм після електрофорезу в поліакриламідному гелі. Веріфікація потрібної смуги провадиться і на· основі рестрикційного аналізу. За допомогою плазміди рСМ5018, що несе ген MIE ві- русу, показано, що пропонована процедура може виявляти такі малі кількості ДНК, як декілька (від 1 до 5) плазмідних молекул. S u m m a r y A rapid, sensitive and precise procedure of detecting cytomegalovirus (CMV) DNA in human tissue and biological liquid by means of the thermostable DNA-polymerase from Thermus thermophilus is described. The procedure consists of two consecutive PCRs. The first one includes 40 cycles of denaturation, primer annealing and chain extension with two 20-base primers chosen from the conserved sequence ot MIE (major immediate 34 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 3 3 — 1-129 34 early) gene of CMV. The second reaction includes from 20 up to 50 cycles consisting of the same steps but with 20-base primers chosen to amplify the internal part of the f rag- ment amplified during the first reaction. The final f ragment is detected by the ethidium bromide staining after polyacrylamide gel electrophoresis. Verification of the band inclu- des restriction enzyme analysis. Use of pCM5018 plasmid bearing the CMV MIE gene shows that the proposed procedure can detect as little as several (from 1 to 5) mole- cules of DNA. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Самохин П. А. Цитомегаловирусная инфекция у детей.— М. : Медицина, 1987.— 161 с. 2. Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia / R. K. Saiki, St. Schart, F. Faloona et a l . / / Science.— 1985,—230, N 4732.—P. 1350—1354. 3. Detection of cytomegalovirus in urine from newborns by using polymerase chain re- action DNA amplification / G. J. Demmler, G. J. Buffone, C. M. Schimbor, R . A . M a y / / J. Infect. Diseases.— 1988.— 158, N 6 .—P. 1177—1184. 4. Polymerase chain reaction for detection of human cytomegalovirus / J. M. Li, M. A. Morgan, D. Rascon et a l . / / Abstrs Ann. Meet. Amer. Soc. Microbiol.—New Orlean, 1989.—S-10.—P. 372. 5. Fiss E., York Μ. KBrooks G. F. Detection of cytomegalovirus in bronchial lavage and blood specimens by means of the polymerase chain react ion/ / Ib id .— C-176.— P. 422. 6. Forman M., Charache P., Arthur R. The use of polymerase chain reaction for detecti- on of cytomegalovirus in clinical specimens/ / Ibid .— D-238.— P. 122. 7. Use of the polymerase chain reaction technique to detect cytomegalovirus / E. Ro- senberg, J. Keiser, J. Gross et al. // Ibid.— D-239.— P. 122. 8. Использование цепной реакции полимеризации для выявления вируса цитомегалии в тканях человека / Г. Р. Виноградская, И. Ю. Горышин, О. В. Плуталов и др. / / VII Всесоюз. симпоз. «Молекуляр. механизмы генет. процессов». — M., 1990.— С. 2037. 9. Ryger R., Bornkamm G. WFleckenstein В. Human cytomegalovirus sequences with homologies to the cellular g e n o m e / / J . Gen. Virol.— 1984.—65.—P. 1351—1364. 10. Goelz S. E., Hamilton S. R., Vogelstein B. Purificafion of DNA from formaldehyde fixed and paraff in embedded human t i s s u e / / B B R C . - 1985,— 130, N 1.—P. 118— 126. 11. Девис P., Ботстайн ДРот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бакте- рий.— М. : Мир, 1984.— 176 с. 12. Праймерзависимая амплификация двух участков β-глобинового гена человека/ Е. И. Шварц, О. К. Кабоев, А. А. Гольцов и д р . / / Б и о о р г . химия.— 1988.— 14, № П . — С . 1577—1579. 13. Stenberg R. M., Thomsen D. R., Stinski М. F. Structural analysis of the major imme- diate early gene of human cytomegalovi rus / / J . Virol.— 1984.— 49, N 1.— P. 190— 199. Ленинград, ин-т ядер, физики им. Б. П. Константинова Получено 05.07.90 АН СССР Ин-т акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта АМН СССР, Ленинград Ин-т биоорг. химии им. Μ. М. Шемякина АН СССР. Москва Ленинград, педиатр, мед. ин-т Минздрава РСФСР УДК 616-056.7:616.153.922 Н. Б. Должанская, М. Т. Тодорова, A. JI. Шварцман ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСМЫСЛОВОЙ КОНСТРУКЦИИ кДНК РЕЦЕПТОРА ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ ЧЕЛОВЕКА Получена антисмысловая конструкция к ДНК рецептора липопротеинов низкой плотнос- ти (рЛНП) человека. Эта конструкция включает 5'-концевой фрагмент (1,1 тыс. п. н.) кДНК рЛНП и промотор гена металлотионеина мыши и может быть использована для создания трансгенных животных, дефицитных по рЛНП. © Н. Б. ДОЛЖАНСКАЯ, М. Т. ТОДОРОВА, А. Л. ШВАРЦМАН, 1991 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 3 3 — 1-129 35

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека

Репозитарії

Схожі ресурси