RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli

Поливалентные антитела к белку RecA из Е. coli (анти-RecA) специфически взаимодействуют с полипептидами с молекулярными массами 40 000 и 90 000 из пахитенных ядер клеток семенников быка. Как показано методом непрямой иммунофлюоресценции, анти-RecA на нефиксированных препаратах этих ядер выявляют рав...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1991
Автори:	Энгельгардт, П., Ахмедов, А.Т., Ланцов, В.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1991
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153569
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli / П. Энгельгардт, А.Т. Ахмедов, В.А. Ланцов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 3. — С. 13-20. — Бібліогр.: 26 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-153569
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1535692019-06-15T01:32:00Z RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli Энгельгардт, П. Ахмедов, А.Т. Ланцов, В.А. Поливалентные антитела к белку RecA из Е. coli (анти-RecA) специфически взаимодействуют с полипептидами с молекулярными массами 40 000 и 90 000 из пахитенных ядер клеток семенников быка. Как показано методом непрямой иммунофлюоресценции, анти-RecA на нефиксированных препаратах этих ядер выявляют равномерно окрашенные коровые структуры мейотических хромосом с ярко окрашенными узлами (иногда теломерной локализации) в окружении ДНК, прокрашенной йодистым пропидием. Эта картина предполагает связывание анти-RecA с компонентами синаптонемального комплекса, четко выраженное в поздних ре комбинационных узлах в ходе образования хиазм. В соматических клетках анти-RecA окрашивают ядро слабее и диффузно, а в сперматозоидах антиген выявляется, как правило, в спинной и акросомальной части головки. Предварительная обработка препаратов ядер тритоном X-100 и 2 M NaCl несколько снижает интенсивность свечения, но сохраняет коровые структуры, тогда как обработка ДНКазой I с последующей экстракцией 2 M NaCl вызывает заметную диссоциацию антигена. Полівалентні антитіла до білка RecA із E coli (анти-RecA) специфічно взаємодіють з поліпептидами, що мають молекулярну масу 40 000 і 90 000, із пахітенних ядер клітин сім'янників бика. Як показано методом непрямої імунофлюоресценції, анти-RecA на нефіксованих препаратах цих ядер виявляють рівномірно зафарбовані корові структури мейотичних хромосом із яскраво зафарбованими вузлами (іноді тіломірної локалізації) в оточенні ДНК, що пофарбована йодистим пропідієм. Ця картина передбачає зв'язування анти-RecA з компонентами сінаптонемального комплексу, яке чітко виражене в пізніх рекомбінаційних вузлах при утворенні хіазм. У передмейотичних клітинах aнти-RесА фарбують ядро слабше і дифузно, а в сперматозоїдах антиген виявляється, як правило, в спинній та акросомальній частині голівки. Попередня обробка препаратів ядер тритоном Х-100 і 2 M NaCl трохи знижує інтенсивність свічення, але зберігає корові структури, тоді як обробка ДНКазою І з подальшою екстракцією 2 M NaCl викликає помітну дисоціацію антигену. Polyvalent antibodies to RecA protein of E. coli (anti-RecA) interect specifically with 40-and 90-kDa polypeptides from pachylene nuclei of bull testes. As it was shown by the indirect immunofluorescence technique, using of the anti-RecA in unfixed isolated nuclei at different mciotic stags revealed the uniform staining of fin ineiotic chromosome cores with bright staining dots (sometimes of telomeric localization) surrounded by DNA counterstaing with propidium iodide. This picture suggests binding of anii-RecA with components of synaptonemal complexes that is expressed more brightly in the recombination nodules during chiasma formation. The staining by anti-RecA was more feeble and difiusible in premeiotic cells. In spermatozoa antigenes are revealed in the dorsal or acrosome-like material of their heads. 1991 Article RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli / П. Энгельгардт, А.Т. Ахмедов, В.А. Ланцов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 3. — С. 13-20. — Бібліогр.: 26 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002C8 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153569 577.21:575 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
description	Поливалентные антитела к белку RecA из Е. coli (анти-RecA) специфически взаимодействуют с полипептидами с молекулярными массами 40 000 и 90 000 из пахитенных ядер клеток семенников быка. Как показано методом непрямой иммунофлюоресценции, анти-RecA на нефиксированных препаратах этих ядер выявляют равномерно окрашенные коровые структуры мейотических хромосом с ярко окрашенными узлами (иногда теломерной локализации) в окружении ДНК, прокрашенной йодистым пропидием. Эта картина предполагает связывание анти-RecA с компонентами синаптонемального комплекса, четко выраженное в поздних ре комбинационных узлах в ходе образования хиазм. В соматических клетках анти-RecA окрашивают ядро слабее и диффузно, а в сперматозоидах антиген выявляется, как правило, в спинной и акросомальной части головки. Предварительная обработка препаратов ядер тритоном X-100 и 2 M NaCl несколько снижает интенсивность свечения, но сохраняет коровые структуры, тогда как обработка ДНКазой I с последующей экстракцией 2 M NaCl вызывает заметную диссоциацию антигена.
format	Article
author	Энгельгардт, П. Ахмедов, А.Т. Ланцов, В.А.
spellingShingle	Энгельгардт, П. Ахмедов, А.Т. Ланцов, В.А. RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli Биополимеры и клетка
author_facet	Энгельгардт, П. Ахмедов, А.Т. Ланцов, В.А.
author_sort	Энгельгардт, П.
title	RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli
title_short	RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli
title_full	RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli
title_fullStr	RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli
title_full_unstemmed	RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli
title_sort	reca-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку reca из escherichia coli
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1991
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153569
citation_txt	RecA-подобные белки в ядрах клеток высших: выявление коровых структур пахитенных хромосом в изолированных нефиксированных бычьих мейотических ядрах с помощью антител к белку RecA ИЗ Escherichia coli / П. Энгельгардт, А.Т. Ахмедов, В.А. Ланцов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 3. — С. 13-20. — Бібліогр.: 26 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT éngelʹgardtp recapodobnyebelkivâdrahkletokvysšihvyâvleniekorovyhstrukturpahitennyhhromosomvizolirovannyhnefiksirovannyhbyčʹihmejotičeskihâdrahspomoŝʹûantitelkbelkurecaizescherichiacoli AT ahmedovat recapodobnyebelkivâdrahkletokvysšihvyâvleniekorovyhstrukturpahitennyhhromosomvizolirovannyhnefiksirovannyhbyčʹihmejotičeskihâdrahspomoŝʹûantitelkbelkurecaizescherichiacoli AT lancovva recapodobnyebelkivâdrahkletokvysšihvyâvleniekorovyhstrukturpahitennyhhromosomvizolirovannyhnefiksirovannyhbyčʹihmejotičeskihâdrahspomoŝʹûantitelkbelkurecaizescherichiacoli
first_indexed	2025-07-14T05:01:34Z
last_indexed	2025-07-14T05:01:34Z
_version_	1837597243177172992
fulltext	УДК 577.21:575 П. Энгельгардт, А. Т. Ахмедов, В. А. Ланцов RecA-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ В ЯДРАХ КЛЕТОК ВЫСШИХ: ВЫЯВЛЕНИЕ КОРОВЫХ СТРУКТУР ПАХИТЕННЫХ ХРОМОСОМ В ИЗОЛИРОВАННЫХ НЕФИКСИРОВАННЫХ БЫЧЬИХ МЕЙОТИЧЕСКИХ ЯДРАХ С ПОМОЩЬЮ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ RecA ИЗ ESCHERICHIA COLI Поливалентные антитела к белку RecA из Е. coli (анти-RecA) специфически взаимодей- ствуют с полипептидами с молекулярными массами 40 000 и 90 000 из пахитенных ядер клеток семенников быка. Как показано методом непрямой иммунофлюоресценции, ан- ти-RecA на нефиксированных препаратах этих ядер выявляют равномерно окрашенные коровые структуры мейотических хромосом с ярко окрашенными узлами (иногда тело- мерной локализации) в окружении ДНК, прокрашенной йодистым пропидием. Эта кар- тина предполагает связывание анти-RecA с компонентами синаптонемального комплекса, четко выраженное в поздних ре комбинационных узлах в ходе образования хиазм. В соматических клетках анти-RecA окрашивают ядро слабее и диффузно, а в сперма- тозоидах антиген выявляется, как правило, в спинной и акросомальной части головки. Предварительная обработка препаратов ядер тритоном X-IOO и 2 M NaCl несколько снижает интенсивность свечения, но сохраняет коровые структуры, тогда как обработка ДНКазой I с последующей экстракцией 2 M NaCl вызывает заметную диссоциацию антигена. Введение. Изучение гомологической рекомбинации у прокариот шло от гена к ферменту. Сейчас, через 25 лет после открытия гена гесА, в зна- чительной мере изучен уникальный фермент — гомологическая синап- таза ReeA, обладающая рядом активностей для обеспечения процесса обмена нитями между взаимодействующими Д Н К [1]. При исследованиях гомологической рекомбинации у высших эука- риот, стимулируемых, в частности, и задачами генотерапии, исполь- зуют другую методологию — от фермента к гену. Достаточно скоро обнаружилось при этом, что существуют как минимум два класса фер- ментов, которые могут выполнять функции гомологических синаптаз: АТР-зависимые [2—5] и АТР-независимые [6—10]. Такое разнообразие ферментов, очевидно, связано с тем, что у высших определяются по крайней мере три генетически различимых иерархических уровня узнавания гомологии [11]: 1) синапс ДНК, по- добно тому как это протекает при рекомбинации у прокариот; 2) спа- ривание хромосом, осуществляемое синаптонемальным комплексом (CK); 3) гомологическое узнавание лишь полностью, а не частично гомологичных хромосом, что необходимо для мейоза эукариот со слож- ными гибридными полиплоидными геномами. Оставляя в стороне третий уровень, остановимся на первых двух. Недавнее исследование группы Хотта [10], выполненное на спермато- генетических клетках мыши, позволяет предположить следующее. В профазе первого мейотического деления, на наиболее драматических с точки зрения рекомбинации стадиях — зиготене и пахитене — на опре- деленное время появляется белок m-rec — АТР-зависимая синаптаза, которая может обслуживать первый молекулярный уровень узнавания. Другая АТР-пезависимая синаптаза — белок mAi-rec, возникая в ран- ней профазе, остается активным на более поздних стадиях и обнару- живается даже в сперматидах и сперматозоидах. Он может обеспе- чивать второй уровень, являясь компонентом CK. Недавно в литературе обозначился новый подход к поиску RecA- подобных белков у высших: по реакции с антителами к белку ReeA из Е. colt (анти-/?есЛ). Так был найден белок KIN [12], структура которо- го на протяжении 150 аминокислот на N-конце гомологична на 66 % белку ReeA из Pseudomonas aeruginosa (R. Devoret, личное сообщение), а также упомянутый белок mAi-rec [10]. В настоящей работе мы применили анти-ReeA для анализа пахи- © П. Э Н Г Е Л Ь Г А Р Д Т , А. Т. АХМЕДОВ, В. А. Л А Н Ц О В , 1991 I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Nb 3 2 — і-129 тенных ядер, выделенных из сперматогенетических клеток быка. Наш препарат анти-/?всЛ оказался прекрасным интермедиатом для визуали- зации коровых структур пахитенных хромосом, что позволяет пред- положить наличие RecA-подобных белков в составе CK- Кроме того, мы обнаружили, что два белка с молекулярной массой 40 000 и 90 ООО из тех же клеток эффективно реагируют с анти-ReeA. Материалы и методы. Материалом исследования служили семен- ные железы быков, свежие или замороженные при —70 °С. Ткани гомогенизировали, клеточные ядра выделяли и фракциони- ровали в ступенчатом градиенте плотности сахарозы, как описано ранее [13]. Белок ReeA получали по методу Кокса и др. [14]. Для иммуниза- ции к 100 мкг белка ReeA добавляли 3 мкг однонитчатой Д Н К из тиму- са крупного рогатого скота, смешивали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и вводили кроликам подкожно. Цикл состоял иа четырех инъекций с недельными интервалами. После трех недель отды- ха его повторяли. Иммуноглобулины выделяли осаждением сульфатом аммония с последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [15]. Антитела дополнительно очищали, добавляя к ним суммарный препа- рат клеточных белков Escherichia coli Z905 (штамма, дефектного πα белку RecA) [16], и использовали в дальнейшем во всех эксперимен- тах по иммуноскринингу. В качестве контроля применяли иммуногло- булиновую фракцию, выделенную из крови неиммунизированных кро- ликов, а также антитела к так называемым интрацистернальным вирусным частицам А-типа (анти-IAP) (Энгельгардт, неопубликован- ные данные). И м м у н о б л о т и н г б е л к о в . Белки фракционировали элек- трофорезом в градиентном (8—16%) полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии DS-Na [17], после чего их в трис-глициновом буфере Лэммли переносили на нитроцеллюлозный фильтр ВА85 («Schleicher und Schull», ФРГ) в аппарате «Trans-blot cell» («Віо-Rad», США) в течение 2 ч при 0,12 А. Белки на фильтре окрашивали 0,2 %-ным раствором Понсо («BDH Chemicals», Англия) в течение 5 мин, 4 раза споласкивали водой и каждую дорожку разрезали вдоль на три поло- сы. Полосы выдерживали 1 ч в ТСТ-буфере (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05 % твина-20), затем инкубировали 12 ч с анти-RecA (разбавление 1 / 300—600) в ТСТ-буфере. От несвязавшихся антител фильтры отмывали 3—4 раза по 10 мин ТСТ-буфером и инкубировали 1 ч с антителами к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена («DAKO», Дания) , в ТСТ-буфере. Фильтры снова отмывали 3—4 раза по 5—10 мин ТСТ-буфером и окрашивали ди- аминобензидином («Sigma», США) в соответствии с инструкцией фир- мы-изготовителя. И м м у н о ф л ю о р е с ц е н т н а я м и к р о с к о п и я . Выделенные нефиксированные ядра сорбировали па свежеприготовленные пластин- ки слюды [18] и обрабатывали по непрямому иммунофлюоресцентному методу. Один из каждой пары препаратов инкубировали 1 ч с анти- RecAf другой—с контрольными антителами. После промывки ТСТ-бу- фером в течение 15—20 мин препараты инкубировали 1 ч с антителами к иммуноглобулинам кролика, меченными флюоресцеинизотиоционатом («Sigma», США). Препараты просматривали в микроскопе «Opton» (ФРГ) и фотографировали на пленку «Kodak» (США). Результаты и обсуждение. Специфичность анти-RecA проверяли по их реакции с клеточными белками штамма Е. coli AB1157 (гесА+) и штамма Z905 (ArecA)1 содержащего делецию в гене гесА. Бакте- риальные клетки лизировали в буфере Лэммли, суммарные клеточные белки фракционировали электрофорезом и после переноса на нитро- целлюлозные фильтры тестировали на связывание с анти-RecA (см. «Материалы и методы»). Как видно из приведенного па рис. 1 иммуноблотинга, среди бел- ков из штамма ABl 157 наш препарат анти-RecA выявляет одну основ- 14 I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Nb 3 2 — і-129 Ііую зону, совпадающую по электрофоретической подвижности с тако- вой очищенного белка RecA из Е. Coli1 и несколько минорных зон с меньшими молекулярными массами (дорожки I1 2). Последние, по-ви- димому, являются продуктами деградации белка RecA и отмечались ранее в аналогичных экспериментах другими авторами [12]. Действи- тельно, с белками штамма Z905 анти-RecA не дают неспецифической реакции (дорожка 3). На рис. 2 представлены иммуноблотинг белков пахитенных ядер, выделенных из семенников быка. Видно, что анти-RecA специфически реагируют с белками, молекулярные массы которых составляют около I - t Zd 4 ' • і ImA 1 Рис. 1. Иммуноблотинг суммарных клеточных белков Ε. coli: 1—20 мкг суммарного белка штамма ABl 157 (гесА + )\ 2— 5 нг очищенного белка RecA из Е. coli; 3 — 30 мкг суммарного белка штамма Z905 (Δ гесА) Рис. 2. Иммуноблотинг белков пахитенных ядер, выделенных из семенников быка: I t 5 —исходные выделенные ядра; 2 — ядра, обработанные 0,2%-ным тритоном Х-100; 3— ядра, обработанные ДНКазой I (500 ед. акт/мл) и 2 M NaCl; 4 — 5 нг очищенного белка RecA из Е. coli. Фильтры 1—4 инкубировали с анти-RecA1 фильтр 5 — с анти- IAP. Стрелками обозначены положения белков-маркеров; цифрами — их молекуляр- ные массы · IO3 40 000 и 90 000. Низкомолекулярные белки (13 000—20 000) также окрашиваются анти-RecA1 но эта реакция — неспецифическая. Такие, вероятно, гистоновые белки реагируют, причем столь же эффективно, и с анти-IAP (дорожка 5). Однако последние не дают реакции с бел- ками размером 40 000 и 90 000. Следует отметить, что описанные выше белки сохраняются и после обработки пахитенных ядер 0,2 %-ным тритоном Х-100, а также ДНАазой I (500 ед, акт/мл) с последующей экстракцией 2 M NaCl (см. рис. 2, дорожки 2, 3). Достаточно очевидно, что обнаруженные нами белки отличаются от белка KIN (120 000), выявленного также с помощью поливалент- ных антител к белку RecA из Е. coli в культурах соматических клеток ряда млекопитающих [12]. Менее очевидно их отличие от рибо- нуклеотидредуктазы, представленной у млекопитающих двумя моно- мерами величиной 45 000 и 88 000 [19]. Этот вопрос возникает в связи с тем, что аналог этого фермента из дрожжей взаимодействует с поли- валентными анти-RecA [20, 21]. Однако рибонуклеотидредуктазы в клетках млекопитающих имеют не ядерную, а цитоплазматическую локализацию [22]. Локализацию антигена, узнаваемого анти-RecA1 изучали на нефик- I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Nb 3 2 — і-129 Рис. 3. Иммунофлюоресцеиция нефиксированных ядер, выделенных из бычьих семенни- ков. Препараты инкубировали 1 ч с стти-RecA (разбавление 1 /200—1/500) : а — па- хитенные ядра, стрелкой отмечено ядро соматической клетки; б, в — коровые структу- ры пахитенных ядер с гипотетическими рекомбинационными узлами; препарат в допол- нительно окрашен флюоресцентным красителем для выявления Д Н К — й о д и с т ы м про- пидием (РІП; 0,5—1 м к г / м л ) ; г — сперматозоиды; а, г, — Х1500; б, в — Х 1 9 0 0 16 ISSN 0233-7(>Л7. Г)! І О " О Л 11 .V EFbI M КЛЕТКА. 1991. Т. 7. N° 3 сировапных препаратах ядер, выделенных из клеток бычьих методом непрямой иммунофлюоресценции (рис. 3). Характе] ления антигена в ядрах соматических клеток, а также в яд] находящихся на разных стадиях мейоза, существенно pa3J: соматических клетках ядро окрашивается анти-RecA от слабо и однородно. Более ярко, как правило, светится ядр Рис. 4. Иммунофлюоресценции нефиксированных пахитенных ядер по •0,2 %-ным тритоном X-100, затем Д Н К а з о й I (200 ед. а к т / м л ) (а) и , экстракции 2 M NaCl (б). Препараты инкубировали 1 ч с анти-RecA 1/200) и дополнительно окрашивали И П (0,5—1 м к г / м л ) ; а — Х1900 ; С переходе к пахитене в ядрах четко выявляются коровьи хромосом, что предполагает формирование латеральных sj (рис. З, а) . В ранней пахитене коровые структуры содерж тящиеся точки, имеющие в ряде случаев теломерную J (рис. 3, б). В отдельных ядрах выявляются только светяі Размеры и локализация этих точек дают основания предт это так называемые рекомбинационные узлы, возникак образования хиазм. В поздней пахитене рекомбинаци исчезают. I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Nb 3 2 — і-129 При дополнительном окрашивании препаратов флюоресцентным красителем, специфичным для ДНК,— йодистым пропидием — компо- ненты CK, имеющие зеленое свечение, обнаруживаются в окружении ДНК, светящейся красным цветом (рис. 3, в). Клетки конечных этапов сперматогенеза (сперматиды и спермато- зоиды) обнаружили иное распределение флюоресценции. В спермато- зоидах антиген выявлялся по чрезвычайно яркому свечению дорсаль- ной или акросомальной областей головки (рис. 3, г), что предполагает транспортировку антигена сперматозоидами. Взаимодействие анти-RecA с ядерными структурами мейотических клеток быка строго специфично: обработка препаратов иммуноглобу- линами неиммунизированных кроликов, а также анти-IAP, реаги- рующими на иммуноблотах с гистоповыми белками, не вызывает све- чения ядер. Предварительная обработка препаратов тритоном X-IOO и 2 M NaCl несколько снижает интенсивность свечения, однако регистрируемые структуры CK в пахитенных ядрах сохраняются. При обработке пре- паратов ядер ДНКазой I коровые структуры хромосом утрачивают четкость, а ядра окружает светящееся галло, образованное диссоции- рованным антигеном (рис. 4, а). Последующая экстракция 2 M NaCl усиливает этот эффект (рис. 4, б). О степени влияния ДНКазы I сви- детельствует отсутствие красного свечения после окрашивания препа- ратов йодистым пропидием. Необходимо отметить, что структуры CK четко выявляются анти- ReeA лишь на препаратах нефиксированных ядер, при фиксации же ядра приобретают диффузную окраску. Обнаруженные нами белки, специфически реагирующие с анти- RecA, как по молекулярным массам, так и по локализации отличаются от описанных ранее компонентов CK- Так, моноклональные антитела к выделенным CK крысы обнаруживают два белка с молекулярными массами 30 ООО и 33 ООО, входящих в состав коровых структур мейоти- ческих хромосом [23—25]. Поливалентные антитела к топоизомера- зе I I—одному из компонентов остова митотических хромосом — взаимодействуют с коровыми структурами пахитенных ядер, но не с рекомбинационными узлами [26]. Кроме того, все эти антигены не вы- являются в сперматозоидах. В цитированной выше работе [10] описан белок mAi-ree (40 000),. выделенный из половых клеток мыши, который реагирует с поливалент- ными антителами к белку ReeA из Е. coli. Этот белок способен ката- лизировать АТР-независимый перенос нити ДНК, т. е. по своим фер- ментативным свойствам напоминает рекомбиназную активность, опи- санную нами в ядрах клеток семенников крысы [9]. Хотя авторы не выявили в ядрах мейотических клеток структур, описанных в настоя- щей работе, с учетом всех наших наблюдений кажется весьма вероят- ным, что обнаруженный нами антиген представляет собой АТР-неза- висимую синаптазу размером 40 000. В настоящее время мы проводим исследования, направленные на выяснение природы антигенов, выявляемых анти-RecA и предположи- тельно являющихся компонентами CK- Авторы благодарят Е. А. Намсараева за предоставление препарата белка RecA из Е. coli; Е. И. Шварца — за помощь в иммунизации жи- вотных; А. А. Зверева — за помощь в подготовке иллюстративного ма- териала к печати. Р е з ю м е Полівалентні антитіла до білка RecA із E coli (анти-RecA) специфічно взаємодіють з поліпептидами, що мають молекулярну масу 40 000 і 90 000, із пахітенних ядер клітин сім'янників бика. Як показано методом непрямої імунофлюоресценції, анти-RecA на 18 I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ11? З- нефіксованих препаратах цих ядер виявляють рівномірно зафарбовані корові структу- ри мейотичних хромосом із яскраво зафарбованими вузлами (іноді тіломірної локалі- заці ї ) в оточенні Д Н К , що пофарбована йодистим пропідієм. Ц я картина передбачає зв 'язування антu-RecA з компонентами сінаптонемального комплексу, яке чітко вира- жене в пізніх рекомбінаційних вузлах при утворенні хіазм. У передмеііотпчних кліти- нах aHTu-RесА фарбують ядро слабше і дифузно, а в сперматозоїдах антиген виявля- ється, як правило, в спинній та акросомальній частині голівки. Попередня обробка препаратів ядер тритоном Х-100 і 2 M NaCl трохи знижує інтенсивність свічення, але зберігає корові структури, тоді як обробка Д Н К а з о ю І з подальшою екстракцією 2 M NaCl викликає помітну дисоціацію антигену. S u m m а г у Po lyva len t ant ibodies to RecA protein of Ε. coli ('d\\V\-RecA) interect specifically wi th 40- and 90-kDa polypept ides f rom pachytene nuclei of bull testes. As it w a s shown by the indirect immunof luorescence technique, u s ing of the anW-RecA in unf ixed isolated nuclei at d i f ferent meiotic s t a g s revealed the un i form s t a in ing of fin meiotic chromosome cores wi th br ight s t a in ing dots (somet imes of telomeric localizat ion) su r rounded by DNA coun- t e r s t a ing with propidium iodide. This picture s u g g e s t s b ind ing of anii-RecA wi th compo- nents of synap tonemal complexes that is expressed more br ight ly in the recombinat ion nodules du r ing chiasrna format ion . The s t a in ing by Znix-RecA w a s more feeble and dif- fus ib le in prcrneiotic cells. In spermatozoa an t igenes are revealed in the dorsal or acro- some-like mater ia l of their heads . С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы 1. Cox Μ. M., Lehman I. R. Enzymes of general recombinat ion/ /Ann. Rev. Biochem.—- 1987.— 56.— P. 229—262. 2. Kenne K., Ljungquist S. A. A DNA-recombinogenic activity in human cells / / N u c l . Acids Res.— 1984.— 12, N 7 . — P 3057—3068. 3. General recombination mechanisms in extracts of meiotic c e l l s / Y . Hotta, S. Tabata, R. A. Bouchard et a l . / / C h r o m o s o m a . — 1985.—93, N 2 . — P . 140—151. 4. Cassuto E., Lightfoot L.-A., Howard-Flanders P. Partial purification of an activity from human cells that promotes homologous pairing and the formation of heterodup- Iex DNA in the presence of A T R / / М о ї . and. Gen. Genet.— 1987.—208, N 1 .—P. 10—14. 5. Characterization of an ATP-dependent DNA strand transferase from human c e l l s / D. Ganea, P. Moore, L. Checuri, R. Kucherlapat i / /Mol and Cell Biol.— 1987,— 7, N 9.— P. 3124—3130. 6. Hsieh P., Meyn M. SCamerini-Otero R. D. Partial purification and characterization of a recombinase from human c e l l s / / C e l l . — 1986.—44, N 3 . — P . 885—894. 7. Lopez B., Rousset S., Coppey J. Homologous recombination intermediates between two duplex DNA catalyzed by human cell ex trac t s / /Nuc l . Acids Res.— 1987.— 15, N 14.—P. 5643—5655. 8. Moore S. P., Rich A., Fishet R. The human recombination strand exchange process / / Genome.— 1989.—31, N 1 .—P. 45—52. 9. Изучение рекомбинационной активности в экстрактах клеток млекопитающих / А. Г. Ахмедов, Е. А. Намсараев, Ε. М. Зайцева и др. / / Биополимеры и клетка.— 1990.— 6, № 2.— С. 38—45. 10. ATP-independetit strand transfer protein from murine spermatocytes, spermatids, and spermatozoa / A. Higashitani, S. Tabata, T. Ogawa et a l . / / E x p . Cell. Res.— 1990.— 186, N 2 . — P . 317—323. 11. Giroux C. N. Chromosome synapsis and meiotic recombination/ /Genet ic recombina- t i o n / E d s R. Kucherlapati, G. Smith.— Washington: Amer. Soc. Microbiol., 1988.—- P. 465—496. 12. KIN, a mammalian nuclear protein immunologically related to E. coli RecA prote in / J. F. Angulo, P. L. Moreau, R. Maunoury et a l . / / M u t a t . Res.— 1989.—217, N 2.— P. 123—134. 13. Hotta Y., Stern H. Meiotic protein in spermatocytes of mammals // Nature New Biol.— 1971.—234, N 1 .—P. 883—886. 14. Cox M. M., McEntee K., Lehman I. R. A simple and rapid procedure for the large scale purification of the recA protein of E. coli / / J. Biol. Chem.— 1981.— 256, N 9.— P. 4676—4678. 15. Жатон Ж-К, Брандт Д. Ч., Вассалли П. Выделение и характеристика иммуногло- булинов, антител и их полипептидных цепей / / Методы исследований в иммуноло- гии,—М. : Мир, 1981.—С. 58—82. 16. Клонирование и характеристика гена гесА из P. aeruginosa / Ε. Η. Зайцев, Ε. Μ. Зайцева, И. В. Бахланова и д р . / / Г е н е т и к а . — 1 9 8 6 . — 22, JVb П . — С . 2721 — 2727. I S S N 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 3 2 * 19 17. Lacmmli U. К. Cleavage of s t ructural proteins dur ing the assembly of the head of bacter iophage T 4 / / N a t u r e . — 1970.—227, N 5289 .—P. 680—685. 18. Granules 25—30 nm in diameter: Basic const i tuent of the nuclear matrix, chromoso- me scaffold, and nuclear e n v e l o p e / P . Engelihardt, U. P lagens , I. B. Zbarsky, I. S. Filatova / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1982. — 79, N 22 ,—P. 6937— 6940. 19. Thelander L., Berg P. Isolation and character izat ion of expressible cDNA clones en- coding the Ml and M2 subunits of mouse ribonucleotide r e d u c t a s e / / М о ї . and Cell. Biol.— 1986,—6, N 10.— P. 3433—3442. 20. A yeast protein ana logous to E. coli RecA protein whose cellular level is enhanced af ter U V - i r r a d i a t i o n / / J . F. Angulo, J. Schwencke, P. L. Moreau et a l . / / M o l . and Gen. Genet .—1985,— 20, N 1.— P. 120—124. 21. Elledge S., Davis R. Identif ication and isolation of the gene encoding the small su- bunit of ribonucleotide reductase f rom 5. cerevisiae: DNA damagc-inducible gene re- quired for mitotic viability // Мої. and Cell. Biol.— 1987.—7, N 7 . — P . 2783—2793. 22. Localization of ribonucleotide reductase in mammal ian ce l l s /Y . Engs t rom, B. Ro- zell, И.-А. Hanson ct a l . / / E M B O J.— 1984.—3, N 3 , — P . 863—867. 23. Identification of two ma jo r components of the lateral elements of synaptonemal complexes of the r a t / C . Heyting, P. B. Moens, W. van Raamsdonk et a l . / / E u r . J . Cell. Biol.— 1987,—43, N 1 .—P. 148—154. 24. Tivo ma jo r components of synaptonemal complexes are specific for meiotic prophase nuclei / C. Heyting, R. J. Dettmers, A. J. J. Dietrich et a l . / / C h r o m o s o m a . — 1988 — 96, N 2 — P. 325—332. 25. Synaptonemal complex ant igen location and conservation / P. B. Moens, C. Hey- ting, A. J. J. Dietrich et al. / / J . Cell. Biol.— 1987.— 105, N 1 .—P. 93—103. 26. Moens P. B., Earnshaw W. C. Anti- topoisomerase II recognizes meiotic chromosome co rc s / /Ch romosoma .— 1989,—9<3, N 2.— 317—322. Отдел вирусологии Ун-та, Хельсинки Получено 05.07.90 Ленингр. ин-т ядер, физики им. Б. П. Константинова АН СССР, Гатчина У Д К 577.152.1 A. JI. Шварцман, А. Ковальская, М. И. Страхова, В. С. Гайцхокн ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ АЛЬФА ι - АНТИТРИПСИНА Проведено сравнение трех различных методов ДНК-диагностики наследственной недо- статочности альфа\-антитрипсина (AT), основанных на анализе Z-мутации во фрагменте экзона V гена AT, амплифицированного в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Пока- зано, что методы гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидами, альтер- нативного праймирования и прямого секвенирования выявляют гетеро- и гомозиготное носительство Z-аллеля и могут быть использованы для пренатальной диагностики на- следственной недостаточности AT. Введение. Наследственная недостаточность AT встречается с частотой 1/1000—1/2000 в популяциях людей белой расы в Северной Америке и Европе [1, 2]. В подавляющем большинстве случаев заболевание обусловлено единичной аминокислотной заменой в позиции 342Glu^Lys полниептидпой цепи AT [1, 2]. У 15—17% носителей этой мутации (Z-аллеля) наблюдается развитие в детском возрасте гепатита и про- грессирующего цирроза почени, но в большинстве случаев в более позднем возрасте развивается первичная эмфизема легких [2, 3]. За последнее время накоплен большой опыт пренатальной диагностики AT [2—6]. Однако не все использованные при этом методы представляют- ся адекватными. Так, исследование полиморфизма длин рестрикцион- пых фрагментов, неравновесно сцепленного с Z-аллелем гена AT, ха- рактеризовалось рядом существенных ограничений, связанных, в пер- вую очередь, с необходимостью предварительного скрининга популяции, © А. Л. Ш В А Р Ц М А Н , А. КОВАЛЬСКАЯ, М. И. СТРАХОВА, В. С. ГАЙЦХОКИ, 1991 20 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Nb 3 2 — і-129

Репозитарії

Схожі ресурси