Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии

Гамма-облучением семян и гаплоидных протопластов Nicotiana tabacum индуцированы хлорофиллдефектные мутанты с различным фенотипом. Для части из них доказан цитоплазматический или геномный тип наследования хлорофиллдефектности. Опыты по слиянию протопластов N. tabacum, Atropa belladonna, Hyoscyamus ni...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1991
Автори:	Зубко, М.К., Зубко, Е.И., Капранов, Ф.В.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1991
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Клеточная биология
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153604
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии / М.К. Зубко, Е.И. Зубко, Ф.В. Капранов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 72-79. — Бібліогр.: 15 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-153604
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1536042019-06-15T01:27:45Z Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии Зубко, М.К. Зубко, Е.И. Капранов, Ф.В. Клеточная биология Гамма-облучением семян и гаплоидных протопластов Nicotiana tabacum индуцированы хлорофиллдефектные мутанты с различным фенотипом. Для части из них доказан цитоплазматический или геномный тип наследования хлорофиллдефектности. Опыты по слиянию протопластов N. tabacum, Atropa belladonna, Hyoscyamus niger и Scopolia carniolica показали, что мутанты типа albina могут быть успешно вовлечены в программы по близкородственной и отдаленной соматической гибридизации. Предложена простая и эффективная методика для слияния протопластов, лишенных хлорофилла. Описані експерименти по індукції хлорофілдефектних мутантів тютюну за допомогою гамма-опромінення насіння та гаплоїдних протопластів. Для частини з них доведено цитоплазматичний чи геномний. тип успадкування хлорофілдефектності. Досліди по злиттю протопластів N. tabacum, A. belladonna, ?. niger і S. camiolica. показали, що мутанти типу albina можуть бути успішно використані у програмах по близькоспорід- неній та віддаленій соматичній гібридизації. Запропонована проста і ефективна методика для злиття протопластів, що не мають хлорофілу. Chlorophyll deficient Nicotiana tabacum mutants with the different phenotypes were induced using gamma-irradiation of seeds and haploid protoplasts. Cytoplasmic or genomic type of chlorophyll-deficiency inheritance has been shown for part of them. Experiments on protoplast fusion for N. tabacum, Atropa belladonna, Hyoscyamus niger and Scopolia carniolica have conformed the possibility to involve albino mutants in projects on close related and remout somatic hybridization. Simple and effective procedure for fusion of chlorophyll-less protoplasts is proposed. 1991 Article Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии / М.К. Зубко, Е.И. Зубко, Ф.В. Капранов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 72-79. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002E4 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153604 575.224+576.5 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Клеточная биология Клеточная биология
spellingShingle	Клеточная биология Клеточная биология Зубко, М.К. Зубко, Е.И. Капранов, Ф.В. Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии Биополимеры и клетка
description	Гамма-облучением семян и гаплоидных протопластов Nicotiana tabacum индуцированы хлорофиллдефектные мутанты с различным фенотипом. Для части из них доказан цитоплазматический или геномный тип наследования хлорофиллдефектности. Опыты по слиянию протопластов N. tabacum, Atropa belladonna, Hyoscyamus niger и Scopolia carniolica показали, что мутанты типа albina могут быть успешно вовлечены в программы по близкородственной и отдаленной соматической гибридизации. Предложена простая и эффективная методика для слияния протопластов, лишенных хлорофилла.
format	Article
author	Зубко, М.К. Зубко, Е.И. Капранов, Ф.В.
author_facet	Зубко, М.К. Зубко, Е.И. Капранов, Ф.В.
author_sort	Зубко, М.К.
title	Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии
title_short	Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии
title_full	Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии
title_fullStr	Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии
title_full_unstemmed	Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии
title_sort	индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1991
topic_facet	Клеточная биология
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153604
citation_txt	Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии / М.К. Зубко, Е.И. Зубко, Ф.В. Капранов // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 72-79. — Бібліогр.: 15 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT zubkomk indukciâhlorofilldefektnyhmutantovtabakamarkerovdlâkletočnojinženerii AT zubkoei indukciâhlorofilldefektnyhmutantovtabakamarkerovdlâkletočnojinženerii AT kapranovfv indukciâhlorofilldefektnyhmutantovtabakamarkerovdlâkletočnojinženerii
first_indexed	2025-07-14T05:03:03Z
last_indexed	2025-07-14T05:03:03Z
_version_	1837597336858001408
fulltext	S u m m a r y The possibilities of application of some cell engineering methods for grape breeding were studied. The method of microclonal propagation in vitro using adventitious shoot forma- tion by 6-benzylaminopurine allows to multiply genetically identical plant material. The methods of plant regeneration from callus tissues via organogenesis or somatic embryo- genesis can be recommended for creation of new genotypes in particular tetraploids. The frequency of polyploid plant formation can be increased by mutagenic t reatments of forming or embryogenic calli with gamma-rays or colchicine. СПИСОК Л И Т Е Р А Т У Р Ы 1. Monette P. L. Grapevine (Vitis vinifera L.) / /Biotechnol. Agr and Forest. Crops II — 1988,—6.—P. 3—37. 2. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobac- co tissue cul tures / /Phys io l . Plant.— 1962— 15, N 3.—P. 473—497. 3. Harris R. F., Stevenson J. H. In vitro propagation of Vitis // Vi t i s— 1982 — 21 N 1,— P. 22—33. 4. Chee R., Pool R. M., Bucher D. A method for large scale in vitro propagation of Vitis// N. Y. Food and Life Sci. Bull.— 1984.—N 109.—P. 1—9. 5. Cheng Z. M., Reisch B. /. Shoot regeneration from petioles and leaves of VitisXlab- ruscana «Catawba» // Plant Cell Repts.— 1989,—8,—P. 403—406. 6. Clog EBass P., Walter B. Plant regeneration by organogenesis in Vitis rootstock spec ies / /P lan t Cell Repts.— 1990,—8, N 3 ,—P. 726—728. 7. Vilaplana M., Mullins M. S. Regeneration of grapevines (Vitis spp.) in vitro: for- mation of adventitious buds on hypocotyls and cotyledons of somatic embryos // J. Plant Physiol.— 1989.— 134, N 3.— P. 413—419. 8. Krul W. R., Worley /. F. Formation of adventitious embryos in callus cultures of «Seyval», a French hybrid g r a p e / / J . Amer. Soc. Hort. Sci.— 1977.— 102, N 3 — P. 360—363. 9. Stamp /. A., Meredith C. P. Somatic embryogenesis from leaves and anthers of gra- pevine // Sci. Hort.— 1988.— 35,— P. 235—250. 10. Endogenous gibberellin-like substances in somatic embryos of grape (Vitis vinife- raxVitis rupestris) in relation to embryogenesis and the chilling requirement for subsequent development of mature embryos / K. Takeno, M. Koshioka, R. P. Pharis et a l . / / P l a n t Physiol.— 1983.—73, N 3 ,—P. 803—808. 11. Соматический эмбриоидогенез в культуре ткани винограда / А. О. Марченко, П. Я. Голодрига, В. П. Клименко, Η. М. Пивень // Физиология и биохимия культ, раст.— 1987.— 19, JMb 4.—С. 408—411. 12. Марченко А. О. Индуцированный эмбриоидогенез в культуре ткани винограда : Ав- тореф. дис.... канд. биол. наук.— Казань, 1990.— 16 с. Ин-т клеточ. биологии и генет. инженерии АН УССР, Получено 14.01.91 Киев УДК 575.224+576.5 М. К. Зубко, Е. И. Зубко, Ф. В. Капранов ИНДУКЦИЯ ХЛОРОФИЛЛДЕФЕКТНЫХ МУТАНТОВ ТАБАКА - МАРКЕРОВ ДЛЯ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ Гамма-облучением семян и гаплоидных протопластов Nicotiana tabacum индуцированы хлорофиллдефектные мутанты с различным фенотипом. Для части из них доказан цитоплазматический или геномный тип наследования хлорофиллдефектности. Опыты по слиянию протопластов N. tabacum, Atropa belladonna, Hyoscyamus niger и Scopolia саг- niolica показали, что мутанты типа albina могут быть успешно вовлечены в программы по близкородственной и отдаленной соматической гибридизации. Предложена простая и эффективная методика для слияния протопластов, лишен- ных хлорофилла. © м . к . Зубко, Е. И. Зубко, Ф. В. Капранов, 1991. 72 ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVo 4 72 Введение. Технология соматической гибридизации предполагает раз- личные системы отбора гибридных продуктов. Один из наиболее рас- пространенных подходов — метод генетической комплементации, осно- ванный на восстановлении в гибридном геноме неаллельных мутаций партнеров, что сопровождается определенным фенотипическим эффек- том [1]. Исторически первый и до сих пор применяемый способ гене- тической маркировки связан с использованием хлорофиллдефектных мутантов [2—5 и др.] . Несмотря на то, что табак по-прежнему оста- ется излюбленным объектом для клеточно-инженерных исследований, для него имеется немного таких мутантов (особенно геномных) с хо- рошими культуральными свойствами. Принятие новых программ по асимметрической гибридизации N. tabacum с близкородственными и отдаленными партнерами побудило нас к проведению опытов по ин- дукции хлорофильных (в частности ядерных) мутантов этого вида с целью дальнейшего их использования для отбора неполовых гибридов. В качестве мутагенного фактора мы предпочли гамма-облучение, объ- ектами служили гаплоидные протопласты и семена табака . Посредст- вом соматической гибридизации изучали особенности наследования хлорофиллдефектности у некоторых из полученных мутантов. Материалы и методы. Р а с т и т е л ь н ы й м а т е р и а л : 1) семена N. tabacum, сорт Лехия, полученные после самоопыления; 2) асептические растения N. tabacum андрогенетических гаплоид- ных линий 773-4р-4 и 773-4р-2 (любезно предоставлены Г. В. Изманом, Всесоюз. Н И И табака и махорки, Краснодар) ; 3) асептические растения двойного мутанта N. tabacum DSR-A15, сочетающего пластомные мутации хлорофиллдефектности и устойчиво- сти к стрептомицину [6] (любезно предоставлен П. Малигой, Се- гед, В Н Р ) ; 4) семена красавки A. belladonna (Берлин, Ф Р Г ) , скополии 5. саг- niolica (Роттердам, Нидерланды) и белены черной И. niger (Мар- бург, Ф Р Г ) . Д л я выделения протопластов использовали ткани асептических растений. Нарезанные «елочкой» листья (0,4—0,8 г) помещали на по- верхность ферментной смеси (5 мл на чашку Петри диаметром 8 см) , приготовленной на солевой среде W5 [7J. Растворы, используемые для ферментации листьев красавки и скополии, содержали 0,6 % Onozuka R10, 0 ,4% Macerozyme RlO и 0 , 2 % Driselase («Serva», Ф Р Г ) . Ткани табака и белены ферментировали этой же смесью, разбавленной в 1,5— 2 раза средой W5, в течение 15—18 ч при температуре 26 °С. Затем к содержимому чашки добавляли 5 мл свежей среды W5 и фильтровали его с помощью пастеровской пипетки в ценрифужную пробирку через воронку с ситом (поры размером 60—80 мкм). После центрифугирова- ния в течение 2 мин при 600 об/мин осадок протопластов из хлорофилл- дефектных мутантов, ресуспендированный в 0,8—1 мл среды W5, ис- пользовали для слияний. Протопласты из тканей хлорофиллдефектных мутантов, выделенные таким способом, не требуют дополнительной очистки. Осадок протопластов, полученных из зеленых листьев, ресус- пендировали в 0,8—1 мл среды W5 и наслаивали на поверхность 0,5 M раствора сахарозы, 5—7 мл которого предварительно помещали в от- дельную центрифужную пробирку. После центрифугирования в течение 3 мин при 800 об/мин жизнеспособные протопласты остаются на грани- це растворов сахароза — W5. Их следует собрать пастеровской пипет- кой и дважды отмыть средой W5. Д л я слияния протопласты достаточ- но отмыть один раз. М у т а г е н е з с е м я н . Воздушно-сухие семена табака сорта Ле- хия облучали в дозе 1 000 Гр на кобальтовой установке и после по- верхностной стерилизации высевали на среду MC [8], разбавленную в 3 раза и содержащую 1 мг/л БАП. Через 2 недели проростки индиви- дуально переносили на среду MC. В дальнейшем отбирали пестролист- ные растеньица, отделяли от них листья с наиболее выраженными сек- торами хлорофиллдефектности, ранили лезвием и помещали на среду ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVo 4 73 MC с 0,05 мг/л ИУК И 1,5 мг/л БАП — для регенерации побегов с це- лью расхимеривания. М у т а г е н е з п р о т о п л а с т о в . Свежевыделенные протопласты гаплоидных линий 773-4р-4, 773-4р-2 и 745-6 (около 0,5· IO6 клеток каж- дой линии), один раз отмытые и ресуспендированные в 3 мл среды W5, подвергали гамма-облучению в дозе 10—15 Гр. После облучения их отмывали еще раз в 10 мл среды W5 и культивировали на жидкой среде КЗ [9] при плотности около IO4 клеток в 1 мл в термостате при ИУК, 1,5 мг/л БАП, 20 г/л сахарозы и 0,8 % агара Difco, уве- личивая количество чашек при этом в 5—8 раз. Заплавленные колонии культивировали при интенсивном освещении — около 2 000 лк. Через 2—4 недели среди зеленых протоклонов отбирали бесцветные колонии и переносили их индивидуально на среду того же состава (но с 30 г / л сахарозы) . С л и я н и е п р о т о п л а с т о в «в и н т е р ф а з е». Часто приме- няемый для слияния протопластов метод Менцеля [10] модифицирован нами специально для тех случаев, когда, по крайней мере, один из партнеров представлен протопластами, лишенными хлорофилла. Моди- фикация касается процедурно-технической части метода; химическая его сторона может оставаться без изменений. Ниже приводим обобщен- ный вариант методики. На дно пробирки объемом 10—12 мл с закручивающейся крышкой (фирма «Flow», Англия) помещают 0,4 мл раствора полиэтилен- гликоля ( 3 0 % ПЭГ-4000, 0,3 M глюкозы и 66 мМ CaCl2) . При этом минимальном объеме верхняя граница раствора ПЭГ занимает макси- мальную площадь, определяемую диаметром пробирки. Отмытые один раз протопласты обоих партнеров следует объединить в равных соот- ношениях и отмыть их совместно еще раз средой W5. Осажденные про- топласты (общее кличество — 5-Ю5—IO6 клеток), ресуспендированные в 0,5 мл среды W5, надо аккуратно (по стенке пробирки) наслоить пас- теровской пипеткой на поверхность раствора ПЭГ (рис. 1: слияние про- топластов «в интерфазе»: а — смесь родительских протопластов, насло- енная на поверхность раствора ПЭГ (до центрифугирования); б — уп- лотнение протопластов с образованием интерфазы на границе раство- ров ПЭГ — W5 (после центрифугирования)) . Аккуратно, не встряхивая пробирку, центрифугировать ее содержимое при 800 об/мин в течение 20—40 с (не более), снижая затем обороты ротора постепенно (в тече- ние 30—40 с) до полной его остановки. Смесь протопластов в виде тон- кого слоя располагается в интерфазе, на границе растворов ПЭГ — W5 (см. рис. 1 ,6 ) . В этих условиях достигается хороший контакт клеток между собой и с раствором ПЭГ, что важно для эффективного слияния. Сразу после окончания центрифугирования следует оставить пробирку неподвижной и начать отсчет времени слияния, которое длится 10— 15 мин в зависимости от количества протопластов. По истечении этого времени в пробирку аккуратно (по стенке) добавляется 0,5 мл буфер- ного раствора с высоким рН, состоящего из компонентов А и Б. (Рас- Рис. 1 26 °С. Через неделю, ког- да начались массовые де- ления, к культуре добав- ляли 1/5 часть (от на- чального объема) свежей :реды и продолжали культивирование на рас- сеянном свету. Еще через 2 недели культуру раз- бавляли свежей средой, увеличивая количество чашек в 2 раза. Спустя неделю микроколонии за- плавляли в агаризован- ную среду MC с 0,05 мг/л 74 ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVo 4 74 Рис. 2 твор А содержит 0,4 M глюкозу, 66 мМ CaCl2 и 10 % ДМСО. Раствор Б включает 0,3 M глицин, рН 10,5 (доведенный N a O H ) . Оба раствора хранятся замороженными каждый отдельно. Они объединяются (9 объ- емных частей раствора А и одна часть раствора Б) и стерилизуются фильтрованием непосредственно перед слиянием протопластов.) При этом надо стремиться не разрушить слой протопластов в интерфазе. Через 15 мин инкубации с буфером смесь протопластов необходимо отмыть средой W5, добавляя ее в пробирку с помощью пастеровской пипетки довольно сильной струей, чтобы перемешать слой ПЭГ, нахо- дящийся на дне пробирки. Во избежание повреждения протопластов струю отмывочной среды следует выливать по стенке на 2—3 см выше уровня бу- ферного раствора. Вполне достаточно одной отмывки в 10 мл среды W5 при щадя- щем режиме центрифугиро- вания (400 об/мин, в тече- ние 1 — 1,5 мин). После уда- ления надосадочной жидко- сти осадок протопластов, слегка ресуспендированный в 1,5—2 мл культуральной среды, переносят в чашку Петри диаметром 8 или 10 см (в зависимости от количества протопластов), куда предварительно наливают соответствен- но 5 или 8 мл этой же культуральной среды. Культивируют протопла- сты в рекомендуемых для конкретных культур условиях. В описываемых здесь экспериментах продукты слияния культиви- ровали на среде SW [5]. О т б о р г и б р и д н ы х к л о н о в . Поскольку среди партнеров по слияниям всегда были протопласты хлорофиллдефектной линии табака , гибридные колонии определяли по восстановлению у них способности к позеленению на регенерационной среде, аналогичной по составу та- ковой для регенерации протоклонов в опытах по мутагенезу. Цитологический анализ проводили согласно стандартной методике [11] — н а давленых препаратах фиксированных корешков или прото- пластов. Протопласты фиксировали на 3—4-й день культивирования (после начала массовых делений) в течение 4—5 ч, после чего окраши- вали орсеином. Результаты и обсуждение, Гамма-облученные протопласты гапло- идных линий табака в наших опытах начинали делиться через неделю (на 2—4 дня позднее контрольных). Колонии, образовавшиеся из про- топластов линий 773-4р-2 и 773-4р-4, на всех этапах культивирования были достаточно рыхлыми, что в дальнейшем несколько затрудняло от- бор клонов, лишенных хлорофилла. Протоклоны линии 745-6 прояви- ли способность к регенерации растеньиц на стадии небольших коло- ний (2—3 мм в диаметре) , практически минуя стадию каллусогенеза. Среди них не обнаружено ни одного хлорофильного мутанта. В опыте с гаплоидной линией 773-4р-4 отобрано более 15 бесцветных клонов, большинство из которых после пересадки на свежую регенерационную среду с 30 г/л сахарозы постепенно приобрели зеленую окраску. Толь- ко два оказались хлорофиллдефектными. Один из них, неспособный к регенерации, со временем погиб. От другого в течение месяца были по- лучены альбиносные побеги. Растения этой линии, обозначенной на- ми ФМ, хорошо кустятся на среде с 0,5—1 мг/л БАП и растут на без- гормональной среде. Их листьях снежно-белого цвета, несколько удли- ненные. На рис. 2 изображен хлорофиллдефектный мутант табака (ФМ), индуцированный гамма-облучением гаплоидных протопластов. Прежде чем использовать мутанты в качестве маркеров при сома- ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVo 4 75 тической гибридизации, важно знать характер наследования их мута- ций. Когда нет возможности осуществить генетический анализ, альтер- нативный ему подход может состоять в проведении комплементацион- ного анализа путем слияния протопластов. Ранее нами показано, что характер контроля хлорофиллдефектности у мутантов неизвестной при- роды можно установить, имея в качестве тестера пластомный хлоро- филлдефектный мутант [12]. Логика этих экспериментов сводится к тому, что при слиянии протопластов геномного и пластомного мутантов (если они достаточно близ- ки филогенетически) в гиб- ридных клетках всегда име- ет место восстановление биосинтеза хлорофилла; ежели оба мутанта — плас- томные, зеленые клоны не возникают, хотя это потен- циально возможно в случае рекомбинации хлоропласт- ной Д Н К , что, однако, про- исходит весьма редко [13]. Д л я анализа получен- ного мутанта ФМ мы слива- ли протопласты этой линии с протопластами пластомно- го хлорофиллдефектного му- танта /)5/?-Л15. После пере- несения микроколоний на регенерационную среду час- тота комплементации, оце- ниваемая как отношение зе- леных клонов к общему их количеству, составляла око- ло 2 %. Гибридные расте- ния, регенерированные из более тридцати зеленых кло- нов, стабильно поддержива- ют зеленую окраску (рис. 3: комплементация по биосин- тезу хлорофилла у сомати- ческих гибридов (в) между мутантом ФМ (а) и плас- томным мутантом DSR-A15 (б ) ) . Факт комплементации в данном случае свидетельствует о том, что хлорофиллдефектность ли- нии ФМ — ядерная рецессивная мутация. Кариотип мутанта ФМ (2я = 48) представлен диплоидным набо- ром хромосом (рис. 4), хотя в культуре протопластов изредка появ- ляются полиплоидные клетки. Анафаза такой клетки приведена на рис. 5. В опыте по мутагенезу протопластов линии 773-4р-2 (15 Гр) мы пошли по более тщательному пути отбора бесхлорофильных клонов. После того как большинство зеленых колоний достигло на жидкой ре- генерационной среде размеров 1,5—3 мм в диаметре, их выбраковыва- ли с помощью стерильной лопатки, чтобы обогатить популяцию мелки- ми колониями, среди которых, как мы заметили в предыдущем экспе- рименте, чаще встречаются бесхлорофильные клоны. Отобрано более 50 бесцветных протоклонов, среди которых после перенесения на ага- ризованную среду идентифицированы четыре хлорофиллдефектных му- танта, к настоящему времени находящихся в стадии регенерации. В дальнейшем планируются опыты по анализу этих мутантов. В связи с некоторыми трудностями отбора хлорофиллдефектных Рис. 4 74 ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVo 4 76 мутантов (см. выше) в данном случае не представляется возможным точно определить частоту их возникновения, однако, по косвенным оценкам, она составляет не менее Ю - 5 в каждом из двух опытов. Другой наш подход к мутагенезу связан с облучением семян. Со- гласно литературным данным, обработка семян химическими мутагена- м и — достаточно эффективный метод индукции цитоплазматических му- таций. В то ж е время незначительная часть пестролистных растений после его применения яв- ляется результатом мути- рования генома [14]. Учитывая преимущест- венную эффективность гамма-облучения в отно- шении действия на ге- ном, мы индуцировали хлорофильные мутанты, подвергая семена табака облучению массирован- ными дозами (1 ООО Гр) с последующим восста- новлением облученного материала in vitro. Усло- вия восстановления рас- тений после применения высоких доз определены Рис. 5 Рис. 6 высоких доз определены нами в предыдущих экспериментах [15]. При работе с небольшой выборкой восстановленных гамма-пророст- ков (около 100) удалось индуцировать несколько пестролистных расте- ний, отличающихся по степени пестролистности и окраске секторов. Д л я расхимеривания отобраны четыре растения с хорошо выраженны- ми зонами хлорофиллдефектности. У двух из них мутантные секторы имели бледно-зеленую окраску, у двух — белую. Д в а растения со свет- ло-зелеными секторами и одно — с белыми не удалось расхимерить ни черенкованием, ни регенерацией побегов из листьев. Пестролистность этих растений проявлялась также у потомства первого поколения пос- ле самоопыления (рис. 6: пестролистные растения /ч-мутантов табака , индуцированных облучением семян). Изложенное свидетельствует о цитоплазматическом контроле хлорофиллдефектности у изученных растений. Четвертое пестролистное растение (Nt-IQOa) оказалось сложной химерой, сочетающей мутантные ткани разных типов. При черенкова- нии этой линии выщепились растения желтого цвета (^MOOi/), на ко- торых время от времени появляются зеленые участки, что характерно для цитоплазматических мутантов. Н а регенерационной среде из пест- ролистных листьев линии Nt-IOOa получены однородные растения еще ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVo 4 77 трех фенотипов: хлорофиллдефектный альбиносный мутант RAOOa (рис. 7, а ) ; светло-зеленый мутант RAOOg (рис. 7, б — слева) и зеленое растение дикого типа (рис. 7 , 5 — справа) . Несомненно, зеленые растения (см. рис. 7, б) произошли из тканей дикого типа. Растения RAOOa и RAOOg стабильно сохраняют однород- ную окраску. Поскольку среди хлорофильных мутантов наибольший интерес для клеточно-инженерных исследований представляют именно альбиносные линии, мы изучали в опы- тах по слиянию протопла- стов альбина-мутант RAOOa. При аналитическом слия- нии в комбинации с плас- томным мунтатом DSR-A15, повторенном в трех незави- симых опытах, не было об- наружено ни одного зелено- го клона. Это согласуется с пластомным контролем хло- рофиллдефектности у линии RAOOa. В независимых экс- периментах по межродовой гибридизации R- IOOa с кра- савкой, беленой и скополи- ей отобраны соответственно 11, 3 и 7 зеленых клонов, из которых в дальнейшем ре- генерированы гибридные растения зеленого цвета (рис. 8: зеленые растения соматических гибридов та- бака R-IOOa с A. belladonna (α), Η. niger (б) и S. car- niolica (β ) ) . Ни одно из них не выщепляло белых секто- ров, что могло бы свиде- тельствовать о сегрегации пластид и, следовательно, подтверждать пластомную природу мутанта /?-100а. Тем не менее результаты комплементационного ана- лиза не дают повода сомне- ваться в этом. С другой сто- роны, отсутствие пестро- листных растений RAOOa при регенерации из исход- ного пестролистного мутан- та R-100, а т а к ж е после гибридизации с красавкой, беленой и скополи- ей наводит на мысль о более сложной природе мутанта /?-1 OOa. В частности, можно предположить, что мутация контролируется пла- стомом и геномом одновременно. В пользу такого предположе- ния, кроме вышеизложенного, косвенно свидетельствует еще одно об- стоятельство. Предварительное изучение гибридных растений из комби- нации с красавкой, беленой и скополией дает основания полагать, что все они являются не только цибридами, но и в разной степени асим- метрическими ядерными гибридами. Отсюда следует, что в комплемен- тацию мутанта R-IOOa вносят вклад цитоплазматические и ядерные де- терминанты. Неизбежность этого может быть обусловлена двойной му- тацией линии /?-1 OOa. Однако это — предмет дальнейших исследований. Отличаясь высокой митотической активностью в культуре прото- Рис. 8 78 ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVo 4 78 пластов, хорошим ростом и регенерационной способностью, хлорофилл- дефектные мутанты табака ФМ и R-IOOa представляют интерес для последующих клеточно-инженерных экспериментов. Р е з ю м е Описані експерименти по індукції хлорофілдефектних мутантів тютюну за допомогою гамма-опромінення насіння та гаплоїдних протопластів. Для частини з них доведено цитоплазматичний чи геномний. тип успадкування хлорофілдефектності. Досліди по злиттю протопластів N. tabacum, A. belladonna, Η. niger і S. camiolica. показали, що мутанти типу albina можуть бути успішно використані у програмах по близькоспорід- неній та віддаленій соматичній гібридизації. Запропонована проста і ефективна методика для злиття протопластів, що не мають хлорофілу. S u m m a r y Chlorophyll deficient Nicotiana tabacum mutants with the different phenotypes were induced using gamma-irradiation of seeds and haploid protoplasts. Cytoplasmic or geno- mic type of chlorophyll-deficiency inheritance has been shown for part of them. Experi- ments on protoplast fusion for N. tabacum, Atropa belladonna, Hyoscyamus niger and Scopolia camiolica have conformed the possibility to involve albino mutants in projects on close related and remout somatic hybridization. Simple and effective procedure for fusion of chlorophyll-less protoplasts is proposed. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Глеба Ю. Ю., Зубко М. К. Теоретические и прикладные аспекты клеточной инже- нерии растений//Итоги науки и техники.— М. : ВИНИТИ, 1988.— (Сер. Биотех- нология; Т. 9).— С. 3—72. 2. Melchers G., Labib G. Somatic hybridization of plants by fusion of protoplasts. Se- lection of light-resistant hybrids of «haploid» sensitive varieties of tobacco/ /Mol Gen. Genet.— 1974.— 135, N 2,—P. 277—294. 3. Глеба Ю. Ю., Бутенко P. Г., Сытник К. Μ. Слияние протопластов и парасексуальная гибридизация Nicotiana tabacum L. // Докл. АН СССР.— 1975.— 221, № 5 . — С. 1196—1198. 4. Schieder О. Hybridization experiments with protoplasts from chlorophyll deficient mutants of some Solanaceous spec ies / /P lanta .— 1977.— 137.— P. 253—257. 5. Somatic hybridization in potato: use of gamma-irradiated protoplasts of Solanum pinnatiseptum in genetic reconstruction / V. A. Sidorov, M. K. Zubko, A. A. Kuchko et al. // Theor. and Appl. Genet.— 1987,—74, N 3—P. 364—368. 6. Svab Z., Maliga P. Nicotiana tabacum mutants with chloroplast encoded streptomycin resistance and pigment deficiency//Ibid.— 1986—72, N 5 — P. 637—643. 7. Medgyesy P., Menczel LMaliga P. The use of cytoplasmic streptomycin resistance chloroplast t ransfer from Nicotiana sylveslris and isolation of their somatic hybrids/ / Мої. and Gen. Genet.— 1980,— 179, N 3 ,—P. 693—698. 8. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with to- bacco tissue cu l ture / /Phys io l . Plant.— 1962— >15, N 3,—P. 473—497. 9. Plant protoplast fusion and growth of intergenetic hybrid cells / K. N. Kao, F. Cons- tabel, M. R. Michayluk, 0 . L. G a m b o r g / / P l a n t a — 1 9 7 4 , — 120, N 1.—P. 215—227. 10. Streptomycin resistant and sensitive somatic hybrids of Nicotiana tabacum+Nicotiana knightiana, correlation of resistance to N. tabacum p l a s t i d s /L . Menczel, F. Nagy, Z. R. Kiss, P. Maliga // Theor. and Appl. Genet.—1981.—59, N 2 — P . 191—195. 11. Дарлингтон С. Д., ла Кур JJ. Φ. Хромосомы, методы работы.— М. : Атомиздат, 1980.— 182 с. 12. Анализ мутаций хлорофиллдефектности у растений при помощи слияния прото- пластов /В . А. Сидоров, М. К. Зубко, М. П. Коломиец, И. К. Комарницкий//Гене- тика.— 1987,—23, № 2.— С. 311—316. 13. Medgyesy P., Fejes E., Maliga P. Interspecific chloroplast recombination in a Nico- tiana somatic hybrid / /Proc . Nat. Acad. Sci. USA.— 1985,—82, N 24.—P. 6960--6964. 14. Efficient induction and selection of chloroplastencoded antibiotic-resistant mutants in Nicotiana / R. Fluhr, D. Aviv, E. Galun, M., E d e l m a n / / I b i d . — N 10.—P. 1485— 1489. 15 Зубко M К., Зубко Ε. И., Глеба Ю. Ю. Восстановление жизнеспособности пророст- ков in vitro Ц Докл. АН СССР.— 1990.—313, № 2.—С. 453—457. Rh-т клеточ. биологии и генет. инженерии АН УССР, Получено 14.01.91 Киев ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. JVo 4 79

Индукция хлорофиллдефектных мутантов табака – маркеров для клеточной инженерии

Репозитарії

Схожі ресурси