Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят

Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят

Представлены результаты исследований свойств высокомоле­кулярной АТР-зависимой протеиназы, выделенной из эритро­идных клеток крови поросят раннего возраста. Молекулярная масса протеиназы составляет 700 ± 50 кДа, наивысшая актив­ность проявляется при рН 8,5. Активность фермента снижа­ется под влияние...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2000
1. Verfasser: Антоняк, Г.Л.
Format: Artikel
Sprache:Ukrainian
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2000
Schriftenreihe:Биополимеры и клетка
Schlagworte:
Структура и функции биополимеров
Online Zugang:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153637
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят / Г.Л. Антоняк // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 6. — С. 487-494. — Бібліогр.: 40 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-153637
record_format dspace
spelling irk-123456789-1536372019-06-15T01:30:37Z Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят Антоняк, Г.Л. Структура и функции биополимеров Представлены результаты исследований свойств высокомоле­кулярной АТР-зависимой протеиназы, выделенной из эритро­идных клеток крови поросят раннего возраста. Молекулярная масса протеиназы составляет 700 ± 50 кДа, наивысшая актив­ность проявляется при рН 8,5. Активность фермента снижа­ется под влиянием ингибиторов сериновых и цистеиновых протеиназ и возрастает в присутствии додецилсульфата натрия и линолевой кислоты. Активность протеиназы дости­ гает высокого урвня в пролиферирующих эритробластах кос­тного мозга и уменьшается при созревании эритроидных клеток. В эритроидных клетках новоржденных и 30-суточных поросят активность протеиназы более высокая, чем в клет­ках 5–10-суточных животных. Обсуждается роль высокомолекулярной АТР-зависимой протеиназы в функциональной ак­тивности эритроидных клеток. Представлено результати досліджень властивостей высокомолекулярно! АТР-залежної протеїна­зи, виділеної з еритроїдних клітин крові поросят раннього віку. Молекулярна маса протеїнази становить 700±50 кДа, найвища активність виявляється при рН 8,5. Активність ферменту знижується під впливом інгібіторів серинових і цистеїнових протеїназ та підвищується за присутності додецилсульфату натрію і лінолевої кислоти. Активність протеїнази досягає високого рівня в проліферуючих еритробластах кісткового мозку та зменшується при дозріванні еритроїдних клітин. В еритроїдних клітинах новонароджених і 30-добових поросят активність протеїнази є вищою, ніж у клітинах 5–10-добових тварин. Обговорюється роль високомолекулярної АТР-залежної протеїнази у функціональній активності еритроїдних клітин. The present article reports the characterization of high-molecular-mass ATP-dependent proteinase from the erythroid ceils of neonatal piglets. The enzyme was purified by DEAE-Toyopearl 650M, Toyopearl HW-55 gel filtration and hydroxyapatite chromato-graphies. The molecular mass of enzyme has been found to be 700±50 kDa by gel filtration, the optimum activity was observed at around pH 8.5. The enzyme hydrolysed synthetic substrate Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA and showed proteolytic activity towards casein and several o ther proteins in the presence of ATP. The degradation of the protein substrates was stimulated by 0.05 % sodium dodecyl sulfate and linoleic acid. The casein-hydrolyzing activity decreased in the presence of phenylmethylsulfonylfluoride and n-chloromer-curibenzoic acid. T he enzyme activity reached high levels in the proliferating erythroblasts of animal bone marrow and decreased as the cells matured. The high levels of the proteinase activity were observed in the erythroid cells of newborn piglets, whereas in the cells of 10-days-old animals the enzyme activity was significantly lower. A role of ATP-dependent high-molecular-mass proteinase in functional activity of animal erythroid cells in the neonatal period discussed. 2000 Article Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят / Г.Л. Антоняк // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 6. — С. 487-494. — Бібліогр.: 40 назв. — укр. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.00058E http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153637 591.3:599.731 uk Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Ukrainian
topic Структура и функции биополимеров
Структура и функции биополимеров
spellingShingle Структура и функции биополимеров
Структура и функции биополимеров
Антоняк, Г.Л.
Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят
Биополимеры и клетка
description Представлены результаты исследований свойств высокомоле­кулярной АТР-зависимой протеиназы, выделенной из эритро­идных клеток крови поросят раннего возраста. Молекулярная масса протеиназы составляет 700 ± 50 кДа, наивысшая актив­ность проявляется при рН 8,5. Активность фермента снижа­ется под влиянием ингибиторов сериновых и цистеиновых протеиназ и возрастает в присутствии додецилсульфата натрия и линолевой кислоты. Активность протеиназы дости­ гает высокого урвня в пролиферирующих эритробластах кос­тного мозга и уменьшается при созревании эритроидных клеток. В эритроидных клетках новоржденных и 30-суточных поросят активность протеиназы более высокая, чем в клет­ках 5–10-суточных животных. Обсуждается роль высокомолекулярной АТР-зависимой протеиназы в функциональной ак­тивности эритроидных клеток.
format Article
author Антоняк, Г.Л.
author_facet Антоняк, Г.Л.
author_sort Антоняк, Г.Л.
title Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят
title_short Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят
title_full Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят
title_fullStr Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят
title_full_unstemmed Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят
title_sort властивості високомолекулярної атр-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 2000
topic_facet Структура и функции биополимеров
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153637
citation_txt Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят / Г.Л. Антоняк // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 6. — С. 487-494. — Бібліогр.: 40 назв. — укр.
series Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv AT antonâkgl vlastivostívisokomolekulârnoíatrzaležnoíproteínazizeritroídnihklítinporosât
first_indexed 2025-07-14T05:04:28Z
last_indexed 2025-07-14T05:04:28Z
_version_ 1837597425691262976
fulltext ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 2000. Т. 16. № 6 Властивості високомолекулярної АТР-залежної протеїнази з еритроїдних клітин поросят Г. Л. Антоняк Інститут землеробства і біології тварин УААН, Львів Вул. В. Стуса, 38, Львів, 084, Україна Представлено результати досліджень властивостей высокомолекулярно! АТР-залежної протеїна­ зи, виділеної з еритроїдних клітин крові поросят раннього віку. Молекулярна маса протеїнази становить 700±50 кДа, найвища активність виявляється при рН 8,5. Активність ферменту знижується під впливом інгібіторів серинових і цистеїнових протеїназ та підвищується за присутності додецилсульфату натрію і лінолевої кислоти. Активність протеїнази досягає високого рівня в проліферуючих еритробластах кісткового мозку та зменшується при дозріванні еритроїдних клітин. В еритроїдних клітинах новонароджених і 30-добових поросят активність протеїнази є вищою, ніж у клітинах 5-Ю-добових тварин. Обговорюється роль високомолекуляр- ної АТР-залежної протеїнази у функціональній активності еритроїдних клітин. Вступ. Процеси протеолізу відіграють важливу роль у функціональній активності організму тварин і людини, забезпечуючи не лише обмін білкових молекул і поповнення амінокислотного пулу клі­ тин, але й активацію проферментів, утворення пептидних гормонів та інших біологічно активних поліпептидів [1—5]. У ряді експериментальних робіт встановлено стимулюючий вплив АТР на інтенсивність внутрішньоклітинного розщеплення білків [6, 7 ]. У клітинах тварин і людини виявлено протеолітичні системи, які функціонують за уча­ стю цього або інших макроергічних фосфатів. Се­ ред АТР-залежних внутрішньоклітинних протеаз важливе місце посідає високомолекулярний комп­ лекс під назвою «мультикаталітична протеїназа», виявлений в більшості типів клітин тварин і люди­ ни [8, 9] . Показано, що цей комплекс може ло­ калізуватися як у цитоплазмі, так і в ядрі клітин, а його субстратами є недовговічні внутрішньо­ клітинні білки, рецептори, фактори транскрипції [10—12]. У зв'язку з цим вважають, що високомо- лекулярна протеїназа виконує регуляторну роль у клітинах, для яких характерна висока швидкість проліферації і диференціації [2, 7, 9, 13]. Роль високомолекулярної протеїнази в гемопоезі — про­ цесі, при якому відбувається постійне утворення і © Г. Л. АНТОНЯК, 2000 диференціювання клітин, а також у змінах білко­ вого складу еритроцитів при їхньому дозріванні на даний час з'ясована мало [14, 15], що зумовлює актуальність проведення експериментальних робіт у цьому напрямку. З огляду на вищевикладене в представленій роботі досліджувалися властивості ферменту, виді­ леного з еритроїдних клітин поросят, та змін ак­ тивності протеїнази, пов'язаних з віком тварин, а також при дозріванні еритробластів до функціо­ нально активних клітин крові. Матеріали і методи. Для досліджень викори­ стовували гемопоетичну тканину кісткового мозку і кров новонароджених, 1, 3, 5, 10 і 30-добових поросят. Кістковий мозок виділяли зі стегнових кісток після декапітації та обезкровлення тварин. Гемопо­ етичну тканину вимивали розчином А, який мі­ стив: 0,3 М лактозу, 0,002 М EDTA, 0,153 М NaCl, 0,005 М MgCl2 [16, 17]. Тканину кісткового мозку суспендували в десятикратному об'ємі розчину А за допомогою шприца і голки № 25 та фільтрували через потрійний шар нейлону для усунення агре­ гатів клітин. Суспензію клітин центрифугували протягом 5 хв при 3000 об/хв і тричі промивали розчином А з наступним центрифугуванням за тих же умов. Всі маніпуляції проводили при темпера­ турі 0—4 °С. Отримані клітини повторно суспенду­ вали в розчині А і фракціонували в градієнті 487 АНТОНЯК Г. Л. густини фіколу-верографіну методом [17]. Фрак­ цію, в якій містилися еритробласти, промивали розчином А, центрифугували при 3000 об/хв про­ тягом 5 хв і використовували в дослідах. Для отримання окремих популяцій еритробластів сус­ пензію еритроїдних клітин фракціонували в гра­ дієнті густини сахарози на колонці (1,5 * ЗО см) з використанням 30, 24, 18, 12 і 6 %-х розчинів дисахариду [18]. Після цитологічного аналізу в клітинах одержаних фракцій досліджували актив­ ність протеїнази. Для виділення еритроїдних клітин з крові тва­ рин застосовували скляну колонку, заповнену су­ мішшю а-целюлози і мікрокристалічної целюлози у співвідношенні 1:1 [19]. Ретикулоцити отримува­ ли фракціонуванням суспензій еритроїдних клітин крові в градієнті густини сахарози згідно з вище­ вказаним способом. При цьому клітини суспенду­ вали в 0,85 % NaCl (1:10) і вносили в колонку в об'ємі 0,5 мл. На суспензію клітин нашаровували по 2 мл ЗО, 24, 18, 12 і 6 %-х розчинів сахарози. Клітини двох верхніх фракцій об'єднували і по­ вторно фракціонували. Для досліджень активності протеїнази використовували верхню фракцію, яка містила 90 % ретикулоцитів. Для видалення ендогенного АТР еритро'щні клітини кісткового мозку і крові інкубували в присутності 20 мМ 2-деоксиглюкози і 0,2 мМ 2,4- динітрофенолу [20]. Лізис клітин здійснювали 2,5 мМ Na-фосфатним буфером (рН 7,5) шляхом трикратного заморожування і відтаювання в рідко­ му азоті. Лізати центрифугували при 15000 об/хв протягом ЗО хв на рефрижераторній центрифузі, надосадову рідину використовували для досліджень активності ферменту. Очищення ферменту з еритроїдних клітин кро­ ві 10-добових поросят здійснювали згідно з мето­ дом, розробленим у роботі [21 ], в нашій модифі­ кації. Для цього зразки периферійної крові відби­ рали у тварин, яким за 5 днів перед дослідом проводили кровопускання. Виділення еритроїдних клітин і їхній лізис здійснювали методом, описаним вище. Процедура очищення протеїнази включала такі етапи: фракціонування сульфатом амонію, іо­ нообмінна хроматографія на DEAE-Toyopearl 650М (10 мМ трис-НСІ буфер, рН 7,5; для елюції фер­ менту застосовували лінійний градієнт концент­ рації 0—0,4 М NaCl), гель-фільтрація на Тоуореагі HW-55 (0,1 М Na-фосфатний буфер, рН 7,0), хроматографія на гідроксилапатиті (5 мМ Na-фос­ фатний буфер, рН 7,0; для елюції ферменту засто­ совували лінійний градієнт концентрації 5— 300 мМ фосфату). Отримані білкові фракції з про­ теолітичною активністю діалізували проти 5 мМ Na-фосфатного буферу, концентрували і викори­ стовували для досліджень властивостей ферменту. Протеолітичну активність у лізатах еритроїдних клітин та в препаратах ферменту, одержаних на окремих стадіях очистки, визначали за інтенсив­ ністю розщеплення 1 4С-метилказеїну або немічених білкових субстратів у присутності АТР та за інтен­ сивністю гідролізу синтетичного пептидного суб­ страту Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA [21 ]. При дослідженні інтенсивності гідролізу 1 4 С- метилказеїну інкубаційна суміш містила 100 мкг , 4С-метилказеїну (50000 розпадів за хвилину), 5 мкг очищеного ферменту або аліквоту лізату клітин з відомою концентрацією білка, 2 мМ АТР, 2 мМ MgCl2, 20 мМ трис-НСІ буфер, рН 8,5. Об'єм проби становив 1 мл. Інкубацію проводили протя­ гом 1 год при температурі 37 °С Реакцію зупиняли додаванням 1 мл 20 %-го розчину трихлороцтової кислоти. Радіоактивність аліквоти супернатанту вимірювали на сцинтиляційному лічильнику LKB у середовищі ЖС-8. Активність протеїнази виражали в одиницях активності в перерахунку на 1 мг білка, приймаючи за одиницю активності інтен­ сивність протеолізу 1 мкг казеїну за 1 год. При дослідженні інтенсивності протеолізу немічених білкових субстратів (казеїну, гемоглобіну, інсуліну, альбуміну, гексокінази, гліцеральдегідфосфатдегід- рогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, лактат­ дегідрогенази) їхній вміст у реакційній суміші ста­ новив 1 мг/мл. Концентрації інших компонентів реакційної суміші були такими ж, як і при дослід­ женні інтенсивності гідролізу 1 4С-метилказеїну. Активність протеїнази виражали в мікрограмах субстрату, гідролізованого за 1 хв у перерахунку на 1 мг білка. При дослідженні інтенсивності гідролізу синте­ тичного пептидного субстрату Suc-Leu-Leu-Val- Tyr-MCA (0,02 мМ) активність ферменту виража­ ли в пікомолях продукту реакції, утвореного за 1 хв у перерахунку на 1 мг білка. При вивченні впливу інгібіторів і активаторів на активність протеїнази застосовували такі реа­ генти: 0,1 мМ п-хлормеркурибензоат, 1 мМ феніл- метилсульфонілфторид, 0,01 %-й соєвий інгібітор трипсину, 1 мМ азид натрію, 1 мМ ванадат амонію, 1 мМ молібдат амонію, 1 мМ КС1, 1 мМ NaCl, 1 мМ CuS0 4 , 1 мМ СаС12, 1 мМ HgCl, 1 мМ ZnS0 4 , 1 мМ FeS0 4 , 10 мМ EDTA, 0,1 мМ лінолеву кислоту, 0,05 %-й додецилсульфат натрію. При дослідженні впливу нуклеозидфосфатів на актив­ ність ферменту в реакційну суміш замість 2 мМ АТР вносили відповідно 2 мМ СТР, GTP, ІТР, ADP, AMP або сАМР. Молекулярну масу протеїнази визначали мето- 488 дом гель-фільтрації на колонці з Toyopearl HW-65 із застосуванням білків-маркерів тиреоглобуліну (669 кДа), уреази (545 кДа), феритину (440 кДа), каталази (240 кДа), альдолази (158 кДа). Білкові зони ідентифікували спектрофотометрично при 280 нм. При дослідженні впливу рН на активність фер­ менту величину рН інкубаційного середовища змі­ нювали в діапазоні 6,0—10,0. Вплив температури на активність протеїнази вивчали шляхом інкубації реакційної суміші при температурах 20, ЗО, 40, 50 і 60 °С Результати та обговорення. В процесі експери­ ментальних робіт вивчено деякі властивості високо- молекулярної протеїнази, виділеної з лізатів ерит­ роїдних клітин периферійної крові поросят 10-ден­ ного віку. Після очистки фракціонуванням сульфатом амонію, іонообмінної хроматографії на DEAE-Toyopearl 650М (при рН 7,5), гель-фільт­ рації на Toyopearl HW-55 та хроматографії на гідроксилапатиті досягнуто 116-разового очищення протеїнази (табл. 1). В отриманій після останньої стадії очистки білковій фракції виявлялася АТР-за- лежна протеолітична активність відносно казеїну, а також гідролітична активність відносно синтетич­ ного пептидного субстрату Suc-Leu-Leu-Val-Tyr- MCA, який застосовується при дослідженнях ак­ тивності високомолекулярних мультикаталітичних протеїназ [9, 21, 22]. За результатами гель-фільтрації, молекулярна маса протеїнази становить 700±50 кДа. Подібною молекулярною масою характеризується фермент, виділений з клітин печінки (згідно з результатами окремих авторів: 650; 700; 720—760 кДа) [6, 23 ], гіпофізу (700 кДа) [24] та ретикулоцитів (700— 1000 кДа) [22], тоді як молекулярна маса про­ теїнази з м'язової тканини становить 800— 1300 кДа [25]. ВЛАСТИВОСТІ АТР-ЗАЛЕЖНОЇ ПРОТЕЇНАЗИ З КЛІТИН ПОРОСЯТ Виявлено, що оптимальний рівень рН для про­ теолітичної активності ферменту становить 8,5. Проте діапазон рН каталітичної дії протеїнази є широким, зокрема, при рН 7,0 і 9,0 виявляється відповідно 60 і 80 % протеолітичної активності [15]. Згідно з результатами досліджень, фермент характеризутєься значною термостабільністю, а найвища активність виявляється при 45—50 °С Деякі автори вважають, що високомолекулярні протеїнази перебувають у клітинах у латентній формі, а дія високої температури є одним із фак­ торів, що зумовлюють зміни в конформації моле­ кул і активацію цих ферментів [9, 26 ]. При аналізі впливу окремих катіонів на ак­ тивність протеїнази в присутності аніонів СГ або S O / встановлено, що інтенсивність гідролізу М С - метилказеїну знижується під впливом іонів К + і Na + (табл. 2). Іони Hg + також пригнічують ак­ тивність ферменту, проте в присутності 2-меркап- тоетанолу активність протеїнази частково віднов­ люється, що свідчить про наявність в активному центрі ферменту сульфгідрильних груп. Разом з тим здійснений нами інгібіторний ана­ ліз не дає можливості віднести протеазу до жодного з відомих типів протеолітичних ферментів згідно з номенклатурою Мак-Дональда і Баретта [27 ]. Так, у присутності в середовищі інкубації я-хлормерку- рибензоату (л-ХМБ) — інгібітора протеїназ цис- теїнового типу — фермент зазнає лише часткової інактивації (залишкова активність становить 29 % ) . Подібне явище спостерігається і під впли­ вом інгібіторів серинових протеїназ фенілметил- сульфонілфториду (ФМСФ) та соєвого інгібітора трипсину (залишкова активність становить 41 та 55 % відповідно) (табл. 2). В попередніх дослід­ женнях встановлено, що при одночасній наявності в середовищі 0,1 мМ /і-ХМБ і 1 мМ ФМСФ фермент виявляє близько 10 % своєї максимальної Таблиця J Очищення протеїнази з еритроїдних клітин периферійної крові поросят 10-добового віку 489 АНТОНЯК Г. Л. •Протеолітичну активність визначали за присутності в середовищі 10 мМ 2-меркаптоетанолу. АТР-залежної протеолітичної активності відносно казеїну в лужній області рН [15]. Отримані ре­ зультати дають підставу стверджувати, що фер­ мент належить до мультикаталітичних АТР-залеж- них протеїназ [6]. Слід відмітити, що протеїназа виявляє гідро­ літичну активність відносно казеїну не лише при наявності АТР в середовищі, але й за присутності інших макроергічних фосфатів, зокрема, GTP, СТР і ADP. Проте, казеїнолітична активність фер­ менту за присутності в інкубаційному середовищі 2 мМ СТР або ADP була значно нижчою, ніж активність протеїнази в присутності 2 мМ АТР або 2 мМ GTP (табл. 3). Разом з тим активність протеїнази пригнічувалася під впливом сполук ва­ надію і молібдену (табл. 2), які, як відомо, є інгібіторами активності клітинних АТРаз [22, 25]. Це свідчить, з одного боку, про певну роль гідро­ лізу макроергічних зв'язків нуклеозидфосфатів у механізмі активації протеїнази, а з іншого — про наявність у молекулі ферменту субодиниць, яким притаманна АТРазна активність. Виявлене в про­ цесі досліджень зниження активності ферменту під впливом EDTA (табл. 2), очевидно, зумовлюється здатністю останнього утворювати хелатний комп­ лекс з іонами Mg 2 +, що веде до руйнування не­ обхідного для функціональної активності протеї­ нази ATP/Mg 2 +-KOMiuieKcy. Згідно з отриманими даними активність фер­ менту різко зростає у присутності в середовищі лінолевої кислоти (табл. 2). Згідно з даними літе­ ратури, підвищення активності під впливом ліно­ леату та інших жирних кислот є характерним і для високомолекулярної протеїнази, виділеної з м'язо­ вої тканини [28 ]. Оскільки концентрація лінолеату в еритроцитах свиней значно перевищує рівень цієї сполуки в еритроцитах інших видів ссавців [29 ], то ця кислота, ймовірно, може відігравати певну роль у молекулярних механізмах регуляції активності протеїнази в клітині. Значне підвищення активності ферменту спо­ стерігається за присутності додецилсульфату нат­ рію при застосуванні його у невисокій концентрації (0,05 %) (табл. 2). Подібною властивістю характе­ ризується високомолекулярна протеїназа, виділена з ретикулоцитів кроля, скелетного м'яза щура та інших джерел, проте механізм активації протеїназ під впливом додецилсульфату натрію на даний час 490 ВЛАСТИВОСТІ АТР-ЗАЛЕЖНОЇ ПРОТЕЇНАЗИ З КЛІТИН ПОРОСЯТ Таблиця З Інтенсивність гідролізу 14С-метилказеїну за присутності нуклеозидфосфатів (п-З) не з'ясований [21, 26]. Згідно з результатами роботи [21 ], активуючий вплив цієї сполуки не зумовлюється стимуляцією дисоціації молекули ферменту на субодиниці. Можливо, в даному ви­ падку дія активатора спричиняє зміни в конфор­ мації молекули протеїнази, що полегшує доступ субстрату до активних центрів ферменту і сприяє більш ефективному протеолізу. При дослідженні розщеплення окремих біл­ кових субстратів, у тому числі ферментів, за уча­ стю АТР-залежної протеїнази встановлено, що найвищу гідролітичну активність протеїназа вияв­ ляє відносно казеїну і гліцеральдегідфосфатдегід- рогенази. Активність протеолізу гемоглобіну, гек­ сокінази і піруваткінази є значно нижчою, а інсу­ лін, альдолаза і альбумін практично не розщеп­ люються за участю вказаного ферменту. За наши­ ми даними, відповідними субстратами протеїнази є й денатуровані молекули білків, зокрема, гемог­ лобіну (п = 3): Субстрат Гідроліз субстрату, % Казеїн 100 Казеїн* 35 Гемоглобін 54 Гемоглобін* ЗО Альбумін сироватки крові 2 Гексокіназа 65 Гліцеральдегідфосфат- дегідрогеназа 100 Піруваткіназа 50 Лактатдегідрогеназа 5 Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа 10 Альдолаза 2 Інсулін 5 Зірочками позначено білки, денатуровані під впливом гідроперекису третинного бутилу. Для з'ясування питань стосовно функцій про­ теїнази в клітинах досліджували зміни активності ферменту в еритроїдних клітинах поросят у зв'язку з віком, а також при дозріванні еритробластів кісткового мозку до функціонально активних ерит­ роцитів. Встановлено, що серед досліджуваних по­ пуляцій еритроїдних клітин найвищою активністю протеїнази характеризуються проліферуючі ерит­ робласти, в яких інтенсивність гідролізу Suc-Leu- Leu-Val-Tyr-MCA є майже в 9 разів вищою, ніж у зрілих еритроцитах (табл. 4). Отримані результа­ ти, а також дані літератури щодо високого рівня експресії молекул протеїнази в проліферуючих мієлоїдних клітинах [30, 31 ] можуть свідчити про специфічну роль цього ферменту в процесах пролі­ ферації клітин. Виявлено, що активність АТР-залежної про­ теїнази є високою в популяціях еритроїдних клітин новонароджених поросят, проте поступово знижує­ ться до 10-ї доби після народження (табл. 5). У подальшому розвитку активність досліджуваної протеїнази підвищується і досягає вірогідних змін у клітинах 30-добових тварин (р < 0,001) (табл. 5). Таким чином, експериментально доведено при­ сутність у клітинах еритроїдного ряду свині АТР- залежної протеолітичної системи, активність якої сягає значного рівня в еритробластах та знижує­ ться при їхньому дозріванні. Каталітична актив­ ність ферменту зменшується під впливом інгібі­ торів серинових і цистеїнових протеїназ та підви­ щується за присутності додецилсульфату натрію і лінолевої кислоти. Субстратами протеїнази є такі білки, як казеїн, гемоглобін, гліцеральдегідфосфат- дегідрогеназа, гексокіназа, піруваткіназа. Актив- 491 АНТОНЯК Г. Л. Таблиця 4 Інтенсивність АТР-залежного розщеплення 14С-метилказеїну і гідролізу Suc-Leu-Leu- Val-Tyr-MCA в еритроїдних клітинах свині (М±т, п-5) Вірогідність відмінностей у показниках між суміжними фракціями клітин: *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001. Таблиця 5 Вікові зміни активності АТР-залежної протеїнази в еритроїдних клітинах кісткового мозку і крові поросят (нг субстрату• хв'1 • мг білка'1, М±т, п-5) Вірогідність відмінностей у показниках між суміжними віковими групами тварин: *р < 0,05—0,001. ність АТР-залежної протеїнази є високою в ерит­ роїдних клітинах новонароджених поросят, проте зменшується протягом неонатального періоду. Ви­ явлені зміни можуть зумовлюватися низкою фак­ торів, зокрема, зниженням інтенсивності еритропо- езу в тварин у неонатальному періоді та гормо­ нальною перебудовою в організмі новонароджених [32—35]. Водночас висока активність досліджува­ ного ферменту в проліферуючих еритроїдних клі­ тинах, а також дані літератури щодо ролі АТР-за­ лежної протеолітичної системи в регуляції окремих ланок у механізмі мієлопоезу [30, 31, 36] свідчать про те, що протеїназа має важливе значення в процесах гемопоезу та в функціональній активності кровотворних клітин. У ряді досліджень показано, що АТР-залежна протеїназа відіграє функціональ­ ну роль в елімінації білків зі зміненою структурою, які утворюються в клітинах при деяких фізіологіч­ них і патологічних станах організму [37—39]. У зв'язку з цим можна зробити припущення про те, що фермент бере участь і в деградації модифіко­ ваних білкових молекул, які утворюються в кліти­ нах новонароджених тварин внаслідок оксидацій- ного стресу [34, 35]. Не виключено, що цей фер- 492 ВЛАСТИВОСТІ АТР-ЗАЛЕЖНОЇ ПРОТЕЇНАЗИ З КЛІТИН ПОРОСЯТ мент бере участь і в змінах білкового складу еритробластів при їхньому дозріванні, на що вказу­ ють результати досліджень інших авторів стосовно здатності АТР-залежної протеїнази до розщеплен­ ня нативних білків [40]. Г. Л. Антоняк Свойства высокомолекулярной АТР-зависимой протеиназы из эритроидных клеток поросят Резюме Представлены результаты исследований свойств высокомоле­ кулярной АТР-зависимой протеиназы, выделенной из эритро­ идных клеток крови поросят раннего возраста. Молекулярная масса протеиназы составляет 700 ±50 кДа, наивысшая актив­ ность проявляется при рН 8,5. Активность фермента снижа­ ется под влиянием ингибиторов сериновых и цистеиновых протеиназ и возрастает в присутствии додецилсульфата натрия и линолевой кислоты. Активность протеиназы дости­ гает высокого урвня в пролиферирующих эритробластах кос­ тного мозга и уменьшается при созревании эритроидных клеток. В эритроидных клетках новоржденных и 30-суточных поросят активность протеиназы более высокая, чем в клет­ ках 5—10-суточных животных. Обсуждается роль высокомо­ лекулярной АТР-зависимой протеиназы в функциональной ак­ тивности эритроидных клеток. И. L. Antonyak Properties of high-molecular-mass ATP-dependent proteinase from the erythroid cells of piglets Summary The present article reports the characterization of high-molecular- mass ATP-dependent proteinase from the erythroid cells of neonatal piglets. The enzyme was purified by DEAE-Toyopearl 650M, Toyopearl HW-55 gel filtration and hydroxyapatite chromato­ graphies. The molecular mass of enzyme has been found to be 700±50 kDa by gel filtration, the optimum activity was observed at around pH 8.5. The enzyme hydrolysed synthetic substrate Suc-Leu- Leu-Val-Tyr-MCA and showed proteolytic activity towards casein and several other proteins in the presence of ATP. The degradation of the protein substrates was stimulated by 0.05 % sodium dodecyl sulfate and linoleic acid. The casein-hydrolyzing activity decreased in the presence of phenylmethylsulfonylfluoride and n-chloromer- curibenzoic acid. The enzyme activity reached high levels in the proliferating erythroblasts of animal bone marrow and decreased as the cells matured. The high levels of the proteinase activity were observed in the erythroid cells of newborn piglets, whereas in the cells of 10-days-old animals the enzyme activity was significantly lower. A role of ATP-dependent high-molecular-mass proteinase in functional activity of animal erythroid cells in the neonatal period is discussed. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Bond J. S., Butler P. E. Intracellular proteases / / Ann. Rev. Biochem.—1987.—56.—P. 333—364. 2. Сологуб Л. І., Пашковська I. С, Антоняк Г. Л. Протеази клітин та іх функції.—К.: Наук, думка, 1992.—194 с. 3. Jarett L., Kiechle F. L., Parker J. C. Chemical mediator or mediators of insulin action, response to insulin and mode of action / / Fed. Proc—1982.—41, N 11.—P. 2730—2735. 4. Сологуб Л. /., Пашковська I. С, Сухорська 1. Е., Антоняк Г. Л. Роль протеолізу в постгрансляційних модифікаціях біологічно активних пептидів і поліпептидів / / Укр. біохім. журн.—1991.—63, № 5.—С. 3—14. 5. Сологуб Л. И., Пашковская И. С, Антоняк Г. Л. Участие протеиназ в инвазии злокачественных опухолей / / Экс- перим. онкология.—1992.—14, № 6.—С. 7—13. 6. Rivett A. J. High molecular mass intracellular proteases / / Biochem. J.—1989.—263, N 2.—P. 625—633. 7. Gronostajski P. M., Pardee А. В., Goldberg A. L. The ATP-dependence of the degradation of short- and long-lived proteins in growing fibroblasts / / J. Biol. Chem.—1985.— 260.—P. 3344—3349. 8. Dahlmann В., Kopp E. The multicatalytic proteinase (pro- some) is ubiquitous from eukaryotes to archaebacteria / / FEBS Lett.—1989.—251, N 1.—P. 125—131. 9. Orlowski M. The multicatalytic proteinase complex, a major extralysosomal proteolytic system / / Biochemistry.—1990.— 29, N 45.—P. 10289—10297. 10. Reits E. A. J., Benham A. M., Plougastel В., Neefies J., Trowsdale J. Dynamics of proteasome distribution in living cells / / EMBO J.—1997.—16, N 20.—P. 6087—6094. 11 . Hicke L. Ubiquitin-dependent internalization and down-regula­ tion of plasma membrane proteins / / FASEB J.—1997.—11, N 14.—P. 1215—1226. 12. Palombella К / . , Rando 0., Goldberg A. Ubiquitin and the proteasome are required for processing of the NF-kB I precursor and the activation of NF-kB //Cell.—1994.—78.— P. 773—785. 13. Peters J. M. Proteasomes: protein degradation machines of the cell / / TIBS.—1994.—19, N 9.—P. 377—382. 14. Harris J. R. Some high molecular-weight oligomeric proteins and enzymes of reticulocytes and erythrocytes / / Blood Cell Biochemistry / Ed. J. R. Harris.—New York: Plenum press, 1990.—Vol. 1.—P. 251—298. 15. Антоняк Г. Л., Снітинський В. В., Сологуб Л. /., Верні- ковська Я. І. Дослідження властивостей високомолеку- лярної АТФ-залежної протеїнази еритроїдних клітин сви­ ней / / Тези доп. Міжнар. симпоз. «Біологічні механізми старіння».—Харків, 1996.—С. 13. 16. Стародуб Н. Ф., Назаренко В. И. Гетерогенная система гемоглобина.—К.: Наук, думка, 1987.—200 с. 17. Harrison F. L., Beswick Т. М., Chesteron С. J. Separation of haemopoietic cells for biochemical investigation / / Biochem. J.—1981.—194.—P. 789—796. 18. Сизова И. А., Каменская В. В., Феденков В. И. Безаппара­ турный способ фракционирования красных клеток крови в градиенте плотности сахарозы / / Изв. Сиб. отд-ния. АН СССР.—1980.—3, № 15.—С. 119—122. 19. Beutler К, West D., Війте К. G. The removal of leukocytes and platelets from whole blood / / J. Lab. Clin. Med.—1976.— 88, N 2. —1976. 20. Rapoport S., Dubiel W.t Muller M. Proteolysis of mitochondria in reticulocytes during maturation is ubiquitin-dependent and is accompanied by a high rate of ATP hydrolysis / / FEBS Lett.—1985.—180, N 2.—P. 249—252. 21. Ishiura S., Sano M., Kamakura JC, Sugita H. Ingensin — a high molecular weight protease from rabbit reticulocyte lysate / / FEBS Lett—1985.—189.—P. 119—123. 22. Hough R., Pratt G., Rechsteiner M. Purification of two high molecular weight proteases from rabbit reticulocyte lysate III. Biol. Chem.—1987.—262, N 17.—P. 8303—8317. 23. Tanaka K., Li R., Ichichara A. A high molecular weight protease in the cytosol of rat liver / / J. Biol. Chem.—1986.— 261, N 32.—P. 15197—15203. 24. Wilk S., Orlowski M. Evidence, that pituitary cation-sensitive neutral endopeptidase is a multicatalytic protease complex II J. Neurochem.—1983.—40.—P. 842—849. 493 АНТОНЯК Г. Л. 25. Dahlmann В., Kuehn L, Rutschmann М., Reinauer Я Purificatin and characterization of a multicatalytic high-mole- cular mass proteinase from rat skeletal muscle / / Biochem. J.—1985.—228, N 1.—P. 161 — 170. 26. Coux O.y Tanaka JC, Goldberg A. L. Structure and functions of the 20 S and 26 S proteasomes / / Annu. Rev. Biochem.— 1996.—65.—P. 801—847. 27. McDonald J. JC An overview of protease specificity and catalytic mechanisms: aspects related to nomenclature and classification / / Histochem. J.—1985.—17.—P. 773—785. 28. Dahlmann В., Rutschmann M.t Kuehn L, Reinauer Я. Activation of the multicatalytic proteinase from rat skeletal muscle by fatty acids or sodium dodecyi sulfate / / Biochem. J.—1985.—228, N 1.—P. 171 — 177. 29. Wessels J. M. C , Veerkamp J. H. Some aspects of the osmotic lysis of erythrocytes. III. Comparison of glycerol permeability and lipid composition of red blood cell membranes from eight mammalian species / / Biochim. et biophys. acta.—1973.— 291.—P. 190—196. Shono Af., Tamura Т., Gasuda #., Tanaka K., Jshihara A. Regulation of gene expression of proteasomes (multi-proteases complexes) during growth and diferentiation of human hema- topoetic cells / / J. Biol. Chem.—1992.—267, N 25.— P. 18100—18109. 31. Kumatori A., Tanaka 1С, Inamura N., Sone S., Ogura Т., Matsumoto T, Tachikawa Т., Shin S., Ichihara A. Abnormally high expression of proteasome in human leukemic cells / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1990.—87, N 18.—P. 7071—7075. 32. Антоняк Г. Л. Влияние тироксина и инсулина на процесс кроветворения у животных в неонатальном периоде разви­ тия / / Цитология.—1999.—41, № 6.—С. 512—516. 33. Антоняк Г. Л., Снітинський В. В., Данчук В. В., Бабич Я. О.у Іскра Р. Я., Бальковський В. В., Кректун Б. В., Бучко О. М. Вплив екзогенних гормонів на функціональну актив­ ність ендокринних залоз поросят у неонатальному періоді онтогенезу / / Вісн. Білоцерків. держ. аграр. ун-ту.— 1998.—5, № 1.—С. 150—153. 34. Girard J., Ferre P. Metabolic and hormonal changes around birth / / Biochemical Development of the Fetus and Neonate / Ed. С. T. Jones.—New York etc.: Elsevier, 1982.—P. 517— 551. 35. Biochemical development of the fetus and neonate / Ed. С. T. Jones.—New York etc.: Elsevier, 1982.—685 p. 36. Антоняк Г. Л. Роль протеолитических ферментов в функ­ циональной активности нейтрофильных гранулоцитов / / Успехи соврем, биологии.—1999.—119, № 5.—С. 475— 485. 37. Hams J. R. Some high molecular-weight oligomeric protems and enzymes of reticulocytes and elythrocytes / / Blood Cell Biochemistry / Ed. J. R. Harris.—New York, etc.: Plenum Press, 1990.—V. 1—P. 251—298. degradation / / Ann. Rev. Biochem.—1992.—61.—P. 761 — 807. 39. Bush К Т., Goldberg A. L., Nigam S. K. Proteasome inhibition leads to a heatshock response, induction of endoplasmic reticulum chaperons and thermotolerance / / J. Biol. Chem.— 1997.—272, N 14.—P. 9086—9092. 40. Ciechanover A., Schwartz A. L The ubiquitin-mediated pro­ teolytic pathway: mechanisms of recognition of the proteolytic substrate and involvement in the degradation of native cellular proteins / / FASEB J.—1994.—8.—P. 182—191. УДК 591.3:599.731 Надійшла до редакції 30.06.99 494

Ähnliche Einträge