Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов

В работе рассмотрены основные способы денуклеинизации биомассы дрожжей: гидролиз эндонуклеазами, взаимодействие с хаотропными солями, кислотная обработка. Показано, что при взаимодействии белков и нуклеиновых кислот определяющую роль играют гидрофобные взаимодействия. Для предотвращения соосаждения...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1990
Hauptverfasser:	Головина, Т.И., Солошенко, В.М., Безруков, М.Г.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1990
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Структура и функции биополимеров
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153688
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов / Т.И. Головина, В.М. Солошенко, М.Г. Безруков // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 4. — С. 69-75. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-153688
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1536882019-06-15T01:28:46Z Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов Головина, Т.И. Солошенко, В.М. Безруков, М.Г. Структура и функции биополимеров В работе рассмотрены основные способы денуклеинизации биомассы дрожжей: гидролиз эндонуклеазами, взаимодействие с хаотропными солями, кислотная обработка. Показано, что при взаимодействии белков и нуклеиновых кислот определяющую роль играют гидрофобные взаимодействия. Для предотвращения соосаждения в изоэлектрической точке белков и нуклеиновых кислот последние должны быть гидролизованы до олигонуклеотидов с молекулярной массой около 800 и переведены в гидрофильное состояние, возможно, за счет отщепления гидрофобных оснований. Показано, что оптимальным способом достижения этого результата является кислотная обработка. Розглянуто основні способи денуклеїнізації біомаси дріжджів: гідроліз ендонуклеазами, взаємодія з хаотропними солями, кислотна обробка. Показано, що при взаємодії білків і нуклеїнових кислот визначальну роль відіграють гідрофобні взаємодії. Для запобігання соосадженню в ізоелектричній точці білків і нуклеїнових кислот останні повинні бути гідролізовані до олігонуклеотидів з молекулярною масою близько 800 і переведені в гідрофільний стан, можливо, за рахунок відщеплення гідрофобних основ. Показано, що оптимальним способом досягнення цього результату є кислотна обробка. Extracts of the yeast components and the model mixtures of the glutelins and nucleic acids have been investigated in the paper. It is shown that hydrophobic bonds play a main role in the interaction between the nucleic acids and proteins. The haotrophic salts should be in the system to avoid the coprecipitation of the proteins and nucleic acids at the isoelectric point. Another way is to hydrolyze the nucleic acids to the oligonucleotides with the molecular mass of 800 – 1000 dalton and to transform them to the «hydrophilic» state due to separation of purine bases. The most convenient method for it is an acid treatment. 1990 Article Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов / Т.И. Головина, В.М. Солошенко, М.Г. Безруков // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 4. — С. 69-75. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000280 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153688 577.112.4:577.113.4 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Головина, Т.И. Солошенко, В.М. Безруков, М.Г. Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов Биополимеры и клетка
description	В работе рассмотрены основные способы денуклеинизации биомассы дрожжей: гидролиз эндонуклеазами, взаимодействие с хаотропными солями, кислотная обработка. Показано, что при взаимодействии белков и нуклеиновых кислот определяющую роль играют гидрофобные взаимодействия. Для предотвращения соосаждения в изоэлектрической точке белков и нуклеиновых кислот последние должны быть гидролизованы до олигонуклеотидов с молекулярной массой около 800 и переведены в гидрофильное состояние, возможно, за счет отщепления гидрофобных оснований. Показано, что оптимальным способом достижения этого результата является кислотная обработка.
format	Article
author	Головина, Т.И. Солошенко, В.М. Безруков, М.Г.
author_facet	Головина, Т.И. Солошенко, В.М. Безруков, М.Г.
author_sort	Головина, Т.И.
title	Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов
title_short	Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов
title_full	Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов
title_fullStr	Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов
title_full_unstemmed	Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов
title_sort	разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1990
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153688
citation_txt	Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов / Т.И. Головина, В.М. Солошенко, М.Г. Безруков // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 4. — С. 69-75. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT golovinati razdeleniebelkovinukleinovyhkomponentovbiomassydrožžej1vzaimodejstvieglutelinovojfrakciibelkovinukleinovyhkomponentov AT sološenkovm razdeleniebelkovinukleinovyhkomponentovbiomassydrožžej1vzaimodejstvieglutelinovojfrakciibelkovinukleinovyhkomponentov AT bezrukovmg razdeleniebelkovinukleinovyhkomponentovbiomassydrožžej1vzaimodejstvieglutelinovojfrakciibelkovinukleinovyhkomponentov
first_indexed	2025-07-14T05:10:02Z
last_indexed	2025-07-14T05:10:02Z
_version_	1837597782526918656
fulltext	3. Юсупов Μ. M., Спирин А. С. Исследование поверхности рибосом и рибосомных суб- частиц Е. coli методом тритиевой бомбардировки//Биохимия.— 1986. — 51, № 11.— С. 1858—1867. 4. Гогия 3. В., Юсупов М. M., Спирина Т. Н. Структура рибосом Thermus thermophilus. Метод выделения и очистки рибосом//Молекуляр. биология. — 1986. — 20, JVb 2 .— С. 519—526. 5. Purification of the 30S ribosomal p ro t e in s / /S . J. S. Hardy, G. G. Kurland, P. Voynow et al. / /Biochemistry. — 1969. )—S, N 7. — P. 2897—2905. 6. Kanny / . W., Lambert J. M., Traut R. R. Crossrlinking of ribosomes using 2-iminothio- Iane and identification of cross-linked proteins by diagonal polyacrylamide / sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis//Meth. Enzymol. — 1979. — 59. — P. 539—650. 7. Crystallization of 70S ribosomes and 30S ribosomal subunits from Thermus thermophi- lus / C. D. Trakhanov, Μ. M. Yusupov, S. Ch. Agalarov et a l . / / F E B S Lett.— 1987.— 220, N 2 — P . 319—322. 8. Yusupov M. M., Spirin A. S. Are there proteins between ribosomal subunits? / / Ibid.— 1986. — 197, N 2. — P. 229—233. Ин-т белка АН СССР, Пущино Получено 21.08.89 Ин-т молекуляр. генетики АН СССР, Москва У Д К 577.112.4:577.113.4 © Т. И. Головина, В. М. Солошенко, М. Г. Безруков, 1990 РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КОМПОНЕНТОВ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ. 1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЛУТЕЛИНОВОЙ ФРАКЦИИ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КОМПОНЕНТОВ В работе рассмотрены основные способы денуклеинизации биомассы дрожжей: гидро- лиз эндонуклеазами, взаимодействие с хаотропными солями, кислотная обработка. По- казано, что при взаимодействии белков и нуклеиновых кислот определяющую роль иг- рают гидрофобные взаимодействия. Для предотвращения соосаждения в изоэлектри- ческой точке белков и нуклеиновых кислот последние должны быть гидролизованы до олигонуклеотидов с молекулярной массой около 800 и переведены в гидрофильное со- стояние, возможно, за счет отщепления гидрофобных оснований. Показано, что опти- мальным способом достижения этого результата является кислотная обработка. Введение. Биомасса микроорганизмов обычно содержит от 6 до 15 % нуклеиновых кислот. Белковые продукты пищевого назначения, полу- ченные из микробной биомассы, согласно требованиям ФАО-ВОЗ, дол- жны содержать не более 2 % нуклеиновых кислот [1]. Поэтому стадия разделения белков и нуклеиновых кислот имеет определяющее значение. Принципиально возможным способом разделения таких компонен- тов является их фазовое распределение. Так, белки типа глобулинов и глутелинов могут быть переведены в твердую фазу путем изоэлектри- ческого осаждения, а нуклеиновые кислоты оставлены в растворе, если они предварительно подвергнуты ферментативному или химическому гидролизу [2, 3], а также при наличии в системе хаотропных солей [4]. Настоящая работа посвящена исследованию механизмов взаимо- действия глутелиновой фракции белков и нуклеиновых кислот в про- цессе выделения из биомассы микроорганизмов. Материалы и методы. Работу проводили с нативной биомассой пекарских дрож- жей Saccharomyces cerevisiae, имеющей состав (%): белок — 48, нуклеиновые кисло- ты — 8, липиды — 10, углеводы — 20. Для выделения внутриклеточных компонентов 10%-ную суспензию биомассы дрожжей дезинтегрировали на баллистическом дезинтеграторе MJI-I (СКБ БП АН СССР, Пущино), рН дезинтегрированной биомассы доводили до нужного значения 1 н. HCl или NaOH, суспензию выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин и отделяли осадок центрифугированием. Экстракты являлись объектом даль- нейшего исследования. ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. Ka 4 69 В качестве модельных веществ использовали казеин по Гаммерстену производ- ства НПО «Биолар» (СССР) и препарат Р Н К из дрожжей рода Torula производства фирмы «Sigma» (США), содержащий 90 % нуклеиновых кислот, 4 % белка и 6 % солей. Модельные системы получали следующим образом: навеску белка (10 г) или пре- парат РНК (1 г) суспендировали в 100 г воды, доводили рН до нужного значения, вы- держивали при комнатной температуре в течение 60 мин, отделяли нерастворимую часть последовательным центрифугированием и фильтрацией на микрофильтре с диамет- ром пор 0,45 мкм фирмы «Sartorius» (ФРГ). Изоэлектрическую точку полученных систем определяли методом нефеломет- рии [9]. Молекулярную массу (м. м.) определяли методом гель-фильтрации на калиброван- ных колонках с сефадексами G-50 (размером 12X810 мм при скорости элюции 1,3 мл / мин) и G-200 (размером 12X780 мм при скорости элюции 0,25 мл/мин). В ка- честве элюэнта использовали 0,09 M раствор NaCl, рН 8,0. Эффлюэнт анализировали при 280 нм на анализаторе типа «Fracto-scan» (США). Разделение компонентов по гидрофобности проводили методом ВЭЖХ на хрома- тографе типа «Laboratorne pristroj» (ЧССР) с колонками, наполненными гидрофоб- ным носителем «Сепарон С-18». Скорость элюции 0,2 мл/мин. В качестве элюэнта ис- пользовали 25 %-ный водный раствор изопропилового спирта. Белок определяли микрометодом Кьельдаля [6]; нуклеиновые кислоты — по мето- ду Спирина [7]. Результаты и обсуждение. Исследована степень экстрагируемости белка и нуклеиновых кислот из биомассы дрожжей, подвергнутой меха- Рис. 1. Профили экстрагируемости белка ( I ) t нуклеиновых кислот (2) из дезинтеграта дрожжевой биомассы и профиль растворимости препарата Р Н К (3) Fig. 1. Profiles of extraction of protein (7), nucleic acids (2) from yeast biomass and profile of solvability of RNA preparation (5) Рис. 2. Хроматограмма белков (/) и нуклеиновых кислот (2), содержащихся в экстрак- те внутриклеточных компонентов, полученном при рН 8,0 из дезинтеграта биомассы Fig. 2. Chromatogram of proteins (1) and nucleic acids (2) contained in the extract of intracellular components and produced at pH 8.0 from yeast biomass нической дезинтеграции. Данные рис. 1 показывают, что как белок, так и нуклеиновые кислоты имеют минимальную степень экстракции в ин- тервале рН 3—5. На рис. 2 представлены хроматограммы белка и нуклеиновых кис- лот в дрожжевом экстракте, из которых следует, что оба типа компо- нентов содержат фракции с м. м. 140 000—180 000 и 1 000. При доведении рН экстракта от величины 8,0 до 4,5 из него выпа- дает осадок глутелиновой фракции белка и все высокомолекулярные 70 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. Ka 4 70 нуклеиновые кислоты. В растворе остаются только компоненты нуклеи- новой природы с м. м. 1 ООО. Из рис. 1 видно, что профиль экстрагируемости нуклеиновых кис- лот из дрожжевой биомассы принципиально отличается от профиля растворимости препарата РНК («Sigma»). Последний плохо растворим в сильнокислых условиях при рН 1—3, а в интервале рН 4—12 его рас- творимость возрастает до 100 %. На рис. 3 представлены хроматограммы растворов препарата Р Н К («Sigma»), полученных при различных рН, свидетельствующие о том, что при рН 1,0 в раствор переходят только олигонуклеотиды с м. м. около 800. Это соответству- ет ди- и/или тринуклеоти- дам. При рН 3,7 и 8,0 в раствор переходят как оли- гонуклеотиды, так и нуклеи- новые кислоты с м. м. 20 000. Рис. 3. Хроматограммы водных растворов препарата Р Н К («Sig- ma») при рН: а — 1 , 0 ; 6 — 3,7; в — 8,0 (колонки с сефадексами G-50 размером 12X810 мм) Fig. 3. Chromatograms of aqueous solutions of RNA preparation («Sigma») at pH:a — 1.0; б — 3.7; в — 8.0 (coliirms with Sephadex G-50 with size of 12X810 mm) Различия в растворимости высокоочищенного препарата РНК и экстрагируемости нуклеиновых кислот из дрожжей могут быть связа- ны с тем, что в последнем случае нуклеиновые кислоты переходят в раствор в виде комплекса с белком, а при рН, соответствующем изо- электрической точке глутелиновой фракции белка, соосаждаются с ней. Для выяснения механизма образования комплекса мы исследовали модельную систему, включающую казеин (типичный глутелин) и Р Н К («Sigma»). Раствор казеина с рН 8,0 смешивали с растворами пре- парата РНК, полученными при рН 1,0 и 8,0. По методу [9] определили изоэлектрическую точку системы. После установления рН изоэлектри- ческой точки отделяли осадок и оценивали количественное содержание нуклеиновых кислот в жидкой фазе и их молекулярно-массовое рас- пределение. Из даннных таблицы видно, что нуклеиновые кислоты, раствори- мые при рН 1,0, с казеином не соосаждаются, тогда как из раствора, полученного при рН 8,0, с белком соосаждается около 80 % РНК. При этом белково-нуклеотидный копреципитат выпадает в осадок при рН 3,7, что значительно ниже изоэлектрической точки казеина (рН 4,5). Влияние солей и мочевины на соосаждение казеина и РНК («Sigma») при ρH 3>7 The influence of the salts on the coprecipttation of the proteins and nucleic components with ρH 3.7 Количество РНК, остающееся в надосадочной жидкости, после осаждения комплекса, мг Исследуемая система Общее Фракции м. м. 20 000 Фракций м. м. 800 Раствор РНК без казеина 850 510 340 Раствор Р Н К с казеином 170 — 170 Раствор Р Н К с казеином в присутствии 0,5 M NaCl " 178,5 — 178,5 Раствор Р Н К с казеином в присутствии 0,5 M Na2HPO4 275,4 91,8 183,6 Раствор Р Н К с казеином в присутствии 8 M мочевины 459 255 204 70 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. Ka 4 71 Аналогичное снижение рН изоэлектрической точки было отмечено на- ми ранее в работе [10] для концентратов дрожжевого белка с различ- ным содержанием нуклеиновых кислот. Полученный результат можно объяснить увеличением суммарного отрицательного заряда при комп- лексообразовании белковой молекулы с рибонуклеиновой КИСЛОТОЙ. В ІіаСТ0ЯЩЄ0 Время большинство исследователей считают, что гид- ролиз нуклеиновых кислот до низкомолекулярных олигомеров являет- ся достаточным для предотвращения их соосаждения с глутелиновой фракцией белка [2—4]. Исходя из полученных данных можно было бы Рис. 4. Хроматограмма оли- гонуклеотидов с м.м. 800, выделенных из препарата РНК («Sigma»), получен- ная на хроматографе типа «Laboratorne pristroj» (ЧССР) с колонками, на- полненными гидрофобным носителем «Сепарон С-18»: 1,2 — растворимые при рН 8,0 и 1,0 соответственно; 3 — после обработки при рН 1,0 (70 °С) в течение 1 ч Fig. 4. Chromatogram of oligonucleotides with m. w. 800 extracted from RNA preparation («Sigma») obtained on «Laboratorne pristroj» chro- matograph (CzSR) with columns filled with hydrophobic carrier «Separon C-18»: 2 — soluble at pH 8.0 and 1.0, respectively; 3 — after treatment with pH 1.0 (70 °С) for 1 h предположить, что величина, м. м. 800—1 000 (ди- и/или тринуклеоти- ды) является тем критическим значением, ниже которого нуклеиновые компоненты перестают соосаждаться с белком. Однако мы установили, что из щелочного раствора с рН 8,0 пре- парата РНК («Sigma») с казеином соосаждается не только высокомо- лекулярная РНК, но и часть олигонуклеотидов с м. м. 800 (таблица). Эти результаты позволяют предположить, что степень гидролиза не является единственным фактором, обусловливающим способность нуклеиновых компонентов соосаждаться с белком. Многие авторы полагают, что образование нуклеопротеидных ком- плексов обусловлено электростатическими взаимодействиями амино- групп белков и фосфатных групп нуклеиновых кислот [11]. С другой стороны, существует ряд работ, показывающих преобла- дающее значение гидрофобных связей при белково-нуклеотидном взаи- модействии [8, 12]. Это подтверждается возможностью разрушения об- разующихся комплексов с помощью органических и неорганических агентов, изменяющих структуру воды, в частности хаотропных солей [4]. Мы исследовали процессы соосаждения казеина и РНК («Sigma») в присутствии NaCl (нейтральная соль), Na2HP04 (хаотропная соль) и мочевины (модификатор гидрофобных взаимодействий). Эксперимент осуществляли следующим образом. Растворы казеи- на и РНК, имеющие рН 8,0 и содержащие один из указанных компо- нентов, смешивали и доводили рН до изоэлектрической точки. Осадок отделяли и в надосадочной жидкости определяли содержание нуклеи- новых кислот. Далее надосадочную жидкость подвергали гель-фильтра- ции на колонке с сефадексом G-50 и определяли содержание фракций Р Н К с м. м. 20 000 и 800. Из таблицы видно, что наименьшее количество РНК соосаждается с казеином в присутствии мочевины. Фосфат натрия обладает более слабым диссоциирующим воздействием, a NaCl практически не влияет на соосаждение белка и нуклеиновых кислот. Полученные данные подтверждают предположение о существен- ном вкладе гидрофобных связей в образование нуклеопротеидных комплексов. 72 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. № 4 Интересно отметить, что в присутствии NaCl с казеином полно- стью соосаждается фракция РНК с м. м. 20 000 и 50% фракции с м. м. 800. В присутствии фосфатов или мочевины с казеином соосаждается только 80 % высокомолекулярной фракции Р Н К и около 40 % низко- молекулярной. Мы предположили, что осаждающаяся и неосаждающаяся с казеи- ном низкомолекулярные фракции РНК различаются по гидрофобности. Для подтверждения этого был использован метод ВЭЖХ. Растворы РНК («Sigma») с рН 1,0 и 8,0 были пропущены через колонку с сефа- дексом G-50, отобраны фракции олигонуклеотидов с м. м. 800 и под- вергнуты хроматографии на носителе «Сепарон С-18». Олигонуклеотиды, растворимые при рН 8,0, по гидрофобности де- лятся на три фракции по времени удерживания: 324, 408 и 588 с (рис. 4). Олигонуклеотиды, растворимые при рН 1,0, а также оста- ющиеся в растворе после осаждения казеина, содержат только две фракции с временем удерживания 324 и 408 с. Наиболее гидрофоб- ная фракция с временем удерживания 588 с в этих условиях в раствор не переходит. Таким образом, в случае взаимодействия продуктов гид- ролиза нуклеиновых кислот с белком именно гидрофобность определяет их способность соосаждаться с белком. Структурные особенности, обусловливающие различия в гидрофоб- ности олигонуклеотидов, мы выяснили при кислотной обработке пре- парата РНК («Sigma»). После инкубации в течение 60 мин при рН 1,0 и температуре 70 °С происходит 100 %-ное растворение препарата. При этом хроматограмма раствора, полученная на сефадексе G-50, по- казывает наличие только олигонуклеотидов с м. м. 800 и компонентов с м. м. около 150. На «Сепароне С-18» олигонуклеотиды с м. м. 800 де- лятся по гидрофобности на две фракции с временем удерживания 324 и 408 с (рис. 4). Полученные данные можно объяснить тем, что при кислотной об- работке происходит не только гидролиз каркаса РНК, но и расщепле- ние N-гликозидных связей. По литературным данным [8], в первую очередь отщепляются наиболее гидрофобные пуриновые основания, тогда как связи с более гидрофильными пиримидиновыми основания- ми практически не гидролизуются. Таким образом, можно предположить, что гидрофобные олигонук- леотиды содержат как пуриновые, так и пиримидиновые основания. Гидрофильные продукты расщепления нуклеиновых кислот, очевидно, содержат в основном пиримидиновые основания. Это предположение согласуется с литературными данными о том, что наибольший вклад в гидрофобные взаимодействия белков и нуклеи- новых кислот вносят гетероциклы пуриновых азотистых оснований. Обобщая полученные результаты, можно сделать заключение о том, что для предотвращенния соосаждения нуклеиновых кислот с глу- телиновой фракцией белка необходим гидролиз их до олигонуклеоти- дов с м. м. 800—1 000 и перевод в гидрофильное состояние за счет от- щепления пуриновых азотистых оснований. С практической стороны мы исследовали процессы соосаждения глутелиновой фракции белка и нуклеиновых кислот из экстракта внут- риклеточных компонентов дрожжей после кислотного, ферментативного гидролизов и в присутствии фосфатов. Ферментативный гидролиз проводили за счет активации эндонук- леаз, путем инкубации дезинтеграта дрожжевой биомассы при рН 6,0 и температуре 55 °С [4]. После инкубации экстрагировали внутрикле- точные компоненты при рН 8,0 и осаждали глутелиновую фракцию белка. Остаточное содержание нуклеиновых компонентов в осадке бел- ка составило 3 %. Для кислотного гидролиза рН экстракта внутриклеточных компо- нентов, полученного из дезинтеграта биомассы при рН 8,0, доводили до 1,0, экстракт инкубировали при 70 °С, после чего осаждали глутели- ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. Ka 4 73 новую фракцию белка в изоэлектрической точке. Остаточное содержа- ние нуклеиновых кислот в осадке составляло 1 %. Для диссоциации нуклеопротеидного комплекса без гидролиза нук- леиновых кислот в экстракт внутриклеточных компонентов дрожжей, полученный при рН 8,0, вносили NaH2PO4 до концентрации 0,5 М, вы- держивали при комнатной температуре в течение 30 мин и осаждали глутелиновую фракцию белка. Остаточное содержание нуклеиновых кислот в осадке составляло 2,6 %. Из полученных данных видно, что наилучшие результаты по сни- жению содержания нуклеиновых компонентов в препарате глобулино- вой фракции белка дрожжей достигаются после кислотной обработки. Ферментативный гидролиз менее эффективен. Это, по-видимому, свя- зано с тем, что эндонуклеазы не гидролизуют N-гликозидных связей, а химический гидролиз в слабощелочных условиях практически не про- исходит. С точки зрения остаточного содержания нуклеиновых компонентов осаждение глутелиновой фракции белка в присутствии фосфатов так- же менее эффективно по сравнению с кислотной обработкой. Однако этот метод позволяет параллельно с глутелиновой фракцией получать высокомолекулярные нуклеиновые кислоты. Основываясь на полученных данных, можно сделать следующие выводы: — существенное значение при взаимодействии белков типа глуте- линов и нуклеиновых кислот имеют гидрофобные связи. Взаимодейст- вию белков и нуклеиновых кислот как высокомолекулярных, так и низ- комолекулярных препятствуют хаотропные соли и мочевина; — для предотвращения соосаждения белков и нуклеиновых кислот наиболее удобным методом является кислотная обработка, приводящая к гидролитической модификации нуклеиновых кислот с уменьшением их молекулярной массы и гидрофобности, но практически не затрагива- ющая белковые вещества. SEPARATION OF PROTEINS AND NUCLEIC COMPONENTS OF THE YEAST BIOMASS. I. AN INTERACTION OF THE GLUTELIN FRACTION OF PROTEINS AND NUCLEIC COMPONENTS Т. I. Golovina, V. M. Soloshenko, M. G. Bezrukov All-Union Research Institute Sintezbelok S u m m a r y Extracts of the yeast components and the model mixtures of the glutelins and nucleic acids have been investigated in the paper. It is shown that hydrophobic bonds play a main role in the interaction between the nucleic acids and proteins. The haotrophic salts should be in the system to avoid the cop- recipitation of the proteins and nucleic acids at the isoelectric point. Another way is to hydrolyze the nucleic acids to the oligonucleotides with the molecular mass of 800—1000 dalton and to t ransform them to the «hydrophilic» state due to separation of purine ba- ses. The most convenient method for it is an acid treatment. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Высоцкий В. Г. Медико-биологические проблемы пищевого белка микробиологическо- го синтеза / / Использование биомассы микроорганизмов для пищевых целей. — Пу- щино: ОНТИ НЦБИ, 1985.—С. 89. 2. А. с. 161299 ЧССР. Способ получения нативного микробного белка с низким содер- жанием нуклеиновых кислот / 3. Фенцл, Ф. Махек, В. Ш и л л и н г е р / / K v a s n y Pru- mysl. — 1986. — 32, N 11.1—С. 278—279. 3. Пат. 4.133.904 США. Способ обработки белка одноклеточных / Д. С. Стиир, X. Л. Вильяме. — 09.01.1979. 4. Pamodaran S., Kinsella Υ. Е. The use of chaotropic salf for separation of ribonucleic acids and proteins from yeasts nucleoprote ins / /Biotechnol . and Bioeng. — 1983. — 25, N 3. — P . 761—770. 74 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. Ka 4 74 5. Альбертсон П. О. Разделение клеточных частиц и макромолекул. — М. : Мир, 1974.— 381 с. 6. Бабаян Т. JI., Безруков М. Г. Метаболиты-индукторы автолиза дрожжей // Acta bio- technol. — 1985. — 5, № 3. — С. 279—284. 7. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеино- вых кислот / / Биохимия. — 1958. — 23, № 5. — С. 656—662. 8. Schwenke К. D.,Prahl L. Functional properties of plant proteins / / Die Nahrung. — 1981. —25. N 1.—P. 59—69. 9. Krumphanzl V., Rehacek Z. Modern biotechnology.—Paris: UNESCO, 1984.—527 p. 10. Sergeev V. A., Solosenko V. MBezrucov M. G. Vergleichscharacteristik von Isolaten der Gesamteiweibe der Hefe in Abhangigkeit von den Bedingungen ihrer Abschei- ding / / Acta Biotechnol. — 1984. — 4, N 2. — S. 105—115. 11. Шабарова 3. Α., Богданов Α. Α. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. — М. : Химия, 1978.— 584 с. 12. McCormick D. В. Interactions of flavins with aminoacid r e s idues / /Pho tochem. and Photobiol. — 1974. —261, N 15. — P. 169—182. ВНИИсинтезбелок, Москва Получено 25.08.89 УДК 577.113.4 © И. А. Назаренко, JI. В. Мацкова, 1990 ВЛИЯНИЕ НУКЛЕОТИДНОГО СОСТАВА ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИДОВ НА ОКРАШИВАНИЕ СЕРЕБРОМ В ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЯХ Описан простой и хорошо воспроизводимый метод окрашивания тРНК и гомополири- бонуклеотидов серебром в денатурирующих ПААГ, чувствительность которого на три порядка превышает таковую при окрашивании этих по лину кле от ид о в метиленовым си- ним. Предложенный способ позволяет избирательно окрашивать серебром нуклеино- вые кислоты в присутствии примесей белков. Исследована зависимость эффективности окрашивания полинуклеотидов и цвета образовавшихся комплексов от нуклеотидного состава. Так, поли(Ь) и поли(1) окрашиваются наиболее ярко, тогда как поли(и) де- монстрирует негативное окрашивание. Введение. Постоянно растущий интерес исследователей к выявлению и характеризации бесконечно малых количеств белков и полинуклеоти- дов определил развитие целого ряда высокочувствительных методов окрашивания этих молекул. Одним из таких методов является окра- шивание белков и нуклеиновых кислот в гелях серебром. По чувстви- тельности данный метод сравним с радиоактивным мечением биомо- лекул. Окрашивание белков в ПААГ серебром, изначально предложен- ное Мерилом и др. [1], позволяет обнаружить в DS-Na-ΠΑΑΓ в 100 раз меньшее количество белка, чем обычно используемый метод окрашива- ния белков кумасси бриллиантовым голубым R-250. Позднее были опубликованы различные модификации метода, различающиеся по сложности выполнения, воспроизводимости и числу стадий [2—7]. Одна из модификаций метода окрашивания белков в ПААГ сереб- ром [3] была использована рядом исследователей для окрашивания Д Н К в полиакриламидных [8, 9] и агарозных [10] гелях, а также для обнаружения двуспиральной РНК [11]. Оказалось, что серебро явля- ется в 10—100 раз более эффективным реагентом для окрашивания двуспиральных нуклеиновых кислот, чем бромистый этидий. Несмотря на многочисленные исследования в области окрашива- ния биополимеров серебром, механизм этой реакции до сих пор оста- ется невыясненнным. В частности, не объяснена зависимость эффектив- ности окрашивания и цвета получаемого комплекса от аминокислотно- го состава белков [12—14]. Влияние нуклеотидного состава Д Н К и РНК на окрашивание серебром не описано. В данной работе предло- жена простая, хорошо воспроизводимая и высокочувствительная про- цедура окрашивания серебром тРНК и полирибонуклеотидов различ- ного состава в ПААГ, содержащих 7 M мочевину. Исследовано влия- ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1990. Т. 6. Ka 4 75

Разделение белков и нуклеиновых компонентов биомассы дрожжей. 1. Взаимодействие глутелиновой фракции белков и нуклеиновых компонентов

Institution

Ähnliche Einträge