Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы

Из ядерного экстракта зрелых зародышей Zea mays выделена и частично очищена АТР-независимая ДНК-топоизомераза предположительно I типа. Релаксация отрицательно суперспирализованной ДНК плазмиды pBR322 не ингибируется ЭДТА, новобиоцином и налидиксовой кислотой, активируется ионами магния и полиаминами...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1987
Hauptverfasser:	Карпенчук, К.Г., Руденко, Г.Н.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1987
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Структура и функции биополимеров
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153764
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы / К.Г. Карпенчук, Г.Н. Руденко // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 2. — С. 77-82. — Бібліогр.: 23 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-153764
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1537642019-06-15T01:25:26Z Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы Карпенчук, К.Г. Руденко, Г.Н. Структура и функции биополимеров Из ядерного экстракта зрелых зародышей Zea mays выделена и частично очищена АТР-независимая ДНК-топоизомераза предположительно I типа. Релаксация отрицательно суперспирализованной ДНК плазмиды pBR322 не ингибируется ЭДТА, новобиоцином и налидиксовой кислотой, активируется ионами магния и полиаминами (спермидином и кадаверином), ингибируется SH-специфическими реагентами и ауринтрикарбоновой кислотой. З ядерного екстракту зрілих зародків Zea mays виділено і частково очищено АТР-незалежну ДНК-топоізомеразу, імовірно, I типу. Релаксацію негативно суперспіралізованої ДНК плазміди pBR322 не інгібують ЕДТА, новобіоцин і налідиксова кислота, активують іони магнію і поліамін (спермідин і кадаверин), пригнічують SH-специфічні реагенти та ауринтрикарбонова кислота. ATP-independent presumably type I DNA topoisomerase was partially purified from the nuclear extract of Zea mays mature embryos by separation in the polyethylene glycol-ammonium sulphate system with 2 M NaCl and by salt gradient elution from CM-Sepha-dex. The ability of enzyme to relax negative supercoils of plasmid pBR322 DNA was detected in the presence of EDTA, being however markedly stimulated by the magnesium ions and polyamines (spermidine and cadaverine). The reaction proceeded via either processive or distributive mechanism depending on the ionic strength of the enzyme assay mixture. Novobiocin and nalidixic acid (both at 100 u.g/ml) did not inhibit the enzyme activity. Modification with p-hydroxymercuribenzoate or iodoacetamide completely abolished the DNA topoisomerase activity, thus indicating the presence of essential cysteine residues in the enzyme molecules. The DNA topoisomerase activity was found to be completely depressed by the preparation of potent inhibitor of polynucleotide-binding proteins – aurintricarboxylic acid in partially polymerized form. Magnesium ions partially restored the DNA topoisomerase activity in the presence of aurintricarboxylic acid. 1987 Article Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы / К.Г. Карпенчук, Г.Н. Руденко // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 2. — С. 77-82. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001D8 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153764 577.152.5 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Карпенчук, К.Г. Руденко, Г.Н. Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы Биополимеры и клетка
description	Из ядерного экстракта зрелых зародышей Zea mays выделена и частично очищена АТР-независимая ДНК-топоизомераза предположительно I типа. Релаксация отрицательно суперспирализованной ДНК плазмиды pBR322 не ингибируется ЭДТА, новобиоцином и налидиксовой кислотой, активируется ионами магния и полиаминами (спермидином и кадаверином), ингибируется SH-специфическими реагентами и ауринтрикарбоновой кислотой.
format	Article
author	Карпенчук, К.Г. Руденко, Г.Н.
author_facet	Карпенчук, К.Г. Руденко, Г.Н.
author_sort	Карпенчук, К.Г.
title	Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы
title_short	Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы
title_full	Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы
title_fullStr	Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы
title_full_unstemmed	Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы
title_sort	ядерная днк-топоизомераза зародышей кукурузы
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1987
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153764
citation_txt	Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы / К.Г. Карпенчук, Г.Н. Руденко // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 2. — С. 77-82. — Бібліогр.: 23 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT karpenčukkg âdernaâdnktopoizomerazazarodyšejkukuruzy AT rudenkogn âdernaâdnktopoizomerazazarodyšejkukuruzy
first_indexed	2025-07-14T05:14:26Z
last_indexed	2025-07-14T05:14:26Z
_version_	1837598052780605440
fulltext	УДК 577.152.5 ЯДЕРНАЯ ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗА ЗАРОДЫШЕЙ КУКУРУЗЫ К. Г. Карпенчук, Г. Н. Руденко Введение. Важнейшие молекулярно-генетические процессы в клетках про- и эукариот — транскрипция, репликация, рекомбинация и, по-ви- димому, транспозиция — включают переходы отдельных типов топологи- ческих состояний Д Н К (суперспиральное, релаксированное, катениро- ванное, заузленное, частично денатурированное) и их сочетаний. Различные клетки содержат специальный аппарат для регуляции топологических переходов ДНК, представленный ферментами — ДНК- топоизомеразами и некоторыми другими, и структурными белками — индукторами топологических переходов [1—4]. Ядерные геномы эукариот (животных и дрожжей) обслуживаются ДНК-топоизомеразами I и II [1, 2, 9]. В клетках высших растений идентифицированы эукариотическая ДНК-топоизомераза I из ткани семян пшеницы [10] и прокариотическая ДНК-топоизомераза I из хло- ропластов шпината [11], а также две ДНК-топоизомеразы из ткани соцветий цветной капусты [12]. Растительная клетка содержит три различные генетические систе- мы — ядро, хлоропласты и митохондрии. Необходимо для каждой из этих систем в отдельности идентифицировать аппарат регуляции топо- логических состояний ДНК. В данной работе описаны выделение и час- тичная характеристика АТР-независимой ДНК-топоизомеразы из ядер высшего растения — кукурузы. Показано существенное стимулирование релаксации супервитков Д Н К ферментом в присутствии полиаминов и ингибирование активности препаратом ауринтрикарбоновой кислоты. Материалы и методы. В ы д е л е н и е и о ч и с т к а Д Н К-т о п о и з о м е р а з ы и з я д е р з а р о д ы ш е й к у к у р у з ы . Семена кукурузы Zea mays (сорт Добруджанка) замачивали в дистиллированной воде в течение 12 ч и извлекали из них зародыши. Дальнейшие операции проводили на холоду. Зародыши гомогенизировали в 50 мМ трис-HCl, рН 7,8, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтаноле и 0,1 мМ фенилмстилсульфо- нилфториде— буфере А, который использовали при всех дальнейших манипуляциях с ядрами, ядерным экстрактом и при очистке фермента. Гомогенат зародышей осветляли центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин, повторяли промывку ядер в том же режиме и дважды — в присутствии 0,1 % тритона Х-100 для разрушения пластид и митохондрий. Затем отмывали осадок от неионного детергента и наслаивали па 0,75 Μ сахарозу с последующим центрифугированием при 4000 g в течение 15 мин. Осадок от- мывали от сахарозы, лизировали 30 мин 2 Μ NaCl при помешивании. Дальнейшую очистку активности ДНК-топоизомеразы из экстракта ядер кукурузы проводили, как описано для экстракта ткани соцветий цветной капусты [12]. Нуклеиновые кислоты удаляли из ядерного экстракта добавлением полиэтиленгликоля 6000 («Мегск», ФРГ) до 10 % и центрифугированием при 53000 g в течение 20 мин. Осадок повторно экстра- гировали 2 Μ NaCl. Полученные надосадочные жидкости смешивали с сухим сульфа- том аммония до 55 % насыщения, собирали осадки белков на границе раздела фаз полиэтиленгликоля и солевого раствора после центрифугирования при 20000 g в тече- ние 20 мин и диализовали против буфера А. Растворимые белки отделяли центрифуги- рованием при 20000 g в течение 20 мин и наносили на колонку карбоксиметил-сефадек- са С-25 (2,5X2,5 см), уравновешенного буфером А. Элюцшо белков проводили линей- ным градиентом (0—1 М) концентрации КС1 с буфером А в объеме 120 мл и собирали фракции 3 мл. О π ρ е д е л е н и е ρ е л а к с и ρ у ю щ е й а к т и в н о с т и ф е р м е н т а . Активность ДНК-топоизомеразы определяли в объеме 25 мкл стандартной инкубационной смеси, содержащей 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ КС1, 0,14 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина («Koch Light», Англия) и 0,2 мкг суперспиралыюй Д Н К плазмиды pBR322 (НПО «Биохимреактив», г. Олайне), с добавлением 5 мкл получен- ных хроматографических фракций и инкубацией при 37 °С в течение 1 ч. Реакцию ос- танавливали добавлением DS-Na до 2 % и прогреванием при 65 °С. Д Н К из смеси переосаждали этанолом и анализировали электрофорезом в 1 %-ной агарозе с 40 мМ Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1987, т. 3, Л1> 2 77 трис-ацетатом, рН 8,3, 2 мМ ЭДТА гіри 40 В в течение 18 ч. Гели окрашивали броми- стым этидием и фотографировали в ультрафиолете. П р и г о т о в л е н и е и н г и б и т о р о в и в о з м о ж н ы х к о ф а к т о р о в ДНК- т о п о и з о м е р а з ы . Исходные растворы 10 мМ ATP («Reanal», ВНР) , 10 мМ спер- мидина-ЗНС1 и 10 мМ кадаверина-2НС1 («Serva», ФРГ), 50 мМ йодацетамида («Sig- ma», США), 5 мМ ауринтрикарбоновой кислоты («Fluka», Швейцария), новобиоцина (500 мкг/мл) («Boehringer Mannheim», ФРГ), 100 мМ MgCl2 (осч, СССР) и бромисто- го этидия (1 мг/мл) («Serva», ФРГ) готовили на деионизованной воде. Налидиксовую кислоту и п-оксимеркурибензоат натрия («Serva», ФРГ) растворяли в минимальном объеме 1 Μ NaOH, нейтрализовали разбавленной НС1 и разбавляли до конечной кон- центрации 500 мкг/мл и 10 мМ соответственно. С п е к т р ы п о г л о щ е н и я разбавленных водных растворов ауринтрикарбоновой кислоты в диапазоне 280—560 нм регистрировали па спектрофотометре Gilford-250 (Англия). Результаты и обсуждение. В первой серии экспериментов были определены фракции элюата ядерного экстракта кукурузы с СМ-сефа- декса, содержащие ДНК-топоизомеразную активность. В исходном ядерном экстракте эта активность не обнаружена. Элюция ДНК-топо- изомеразы кукурузы с катионита происходит в диапазоне концентра- ций 0,25—0,5 Μ КС1, что свидетельствует о наличии небольшого поло- жительного заряда молекул фермента. Представленная на рис. 1 (см. вклейку) картина получена при использовании стандартной инкубаци- онной смеси с добавлением ионов магния. Проведение аналогичного анализа с теми же фракциями в присутствии АТР не обнаружило ни дополнительных фракций с АТР-зависимой релаксирующей активно- стью, ни заметных изменений активности локализованных фракций АТР-независимой ДНК-топоизомеразы (результат не приведен). Активные фракции были использованы для изучения свойств со- держащейся в них частично очищенной ДНК-топоизомеразы. На рис. 2 (см. вклейку) показана кинетика релаксации суперспиральной Д Н К выделенным ферментом в зависимости от длительности инкубации. Из- вестно [15], что реакция релаксации супервитков Д Н К ДНК-топоизо- меразой I из ядер клеток млекопитающих в зависимости от ионной силы может протекать либо по процессивному механизму, при котором моле- кулы фермента не диссоциируют с Д Н К до полной ее релаксации, либо по дистрибутивному механизму, когда молекулы ДНК-топоизомеразы после единичного акта реакции перераспределяются на другие молеку- лы ДНК. При молярном недостатке ДНК-топоизомеразы в инкубацион- ной среде по отношению к субстрату — суперспиральной ДНК, проте- кание реакции по одному из этих механизмов дает различные картины кинетики релаксации ДНК. При дистрибутивном действии происходит постепенная релаксация всех молекул суперспиральной ДНК, что и наблюдается на рис. 2. Иная картина релаксации Д Н К ядерной ДНК-топоизомеразой кукурузы в случае процессивного действия фермента (рис. 3, см. вклейку): часть молекул Д Н К полностью ре- лаксируется при сохранении значительной доли исходной суперспираль- ной ДНК. Активность фермента полностью ингибируется модификацией цис- теиновых остатков п-оксимеркурибензоатом (рис. 3), а также йода- цетамидом (результат не приведен), что свидетельствует о существен- ном значении SH-группы или групп для активности фермента. Ингибиторы бактериальной ДНК-гиразы и эукариотических ДНК- топоизомераз II типа (налидиксовая кислота и новобиоцин) в высоких концентрациях не предотвращали релаксацию супервитков Д Н К изу- чаемым ферментом, однако степень релаксации в их присутствии была несколько ниже, чем в контрольной пробе (рис. 3). При этом новобио- цин оказывал более сильное влияние на распределение топоизомеров релаксированной Д Н К по сравнению с налидиксовой кислотой. При добавлении ионов магния наблюдается существенное стимулирование активности ДНК-топоизомеразы кукурузы (рис. 4, см. вклейку), кото- 78 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1987, т. 3, Л1> 2 78 рое сохраняется в присутствии налидиксовой кислоты и новобиоцина (рис. 3). Еще более значительное по сравнению с ионами магния стимули- рование активности ДНК-топоизомеразы наблюдается при добавлении в стандартную инкубационную смесь полиаминов— кадаверина и спер- мидина (рис. 4). Кадаверин (2,5-диаминопентан) оказывает наиболее выраженное стимулирующее влияние на скорость релаксации супер- спиральной ДНК. Было изучено влияние на активность ДНК-топоизомеразы кукуру- зы препаратов ауринтрикарбоновой кислоты (рис. 5), которая является Рис. 5. Ингибирование ядерной ДНК-топоизомеразы кукурузы препаратом ауринтри- карбоновой кислоты: контрольная Д Н К (1, 15) и Д Н К после инкубации с ферментом в присутствии 10 мМ MgCl2 и 4 (2), 5 (3) и 10 мкМ (4) ауринтрикарбоновой кислоты; 10 мМ MgCl2 (5); 0,5 (6); 1 (7); 2,5 (5); 3 (9); 4 (10) \ 5 (11), 10 (12) и 25 мкМ (13) ауринтрикарбоновой кислоты; в стандартной инкубационной смеси (14) Fig. 5. Inhibition of the Zea mays nuclear DNA topoisomerase by the preparation of au- rintricarboxylic acid: control DNA (1, 15), and DNA after incubation with the enzyme in the presence of 10 mM MgCl2 and 4 (2), 5 (5) and 10 μΜ of aurintricarboxylic acid (4)\ 10 mM MgCl2 alone (5); in the presence of 0.5 (6); 1 (7); 2.5 (5); 3 (5); 4 (10); 5 (11)\ 10 (12) and 25 μΜ of aurintricarboxylic acid (13) and in standard assay mixture without inhibitor (14) ингибитором полинуклеотидсвязывающих белков и ферментов [16—18]. Внесение этого соединения в стандартную инкубационную смесь с ДНК- топоизомеразой кукурузы вызывает полное подавление активности фер- мента при пороговой концентрации ингибитора около 10 мкМ. При более низких концентрациях ингибитора картина релаксации супервит- ков Д Н К практически не отличается от контрольной, без красителя. Внесение в реакционную смесь ионов магния оказывает влияние на характер ингибирования ДНК-топоизомеразы кукурузы ауринтрикар- боновой кислотой. В частности, в присутствии ионов магния и 10 мкМ ингибитора наблюдается частичная релаксация супервитков ДНК, однако при снижении концентрации ауринтрикарбоновой кислоты до 5 и 4 мкМ ее ингибирующее воздействие все еще сказывается. Ранее было показано, что и коммерческие, и полученные лабора- торным синтезом препараты красителя представляют собой смесь моно- мера ауринтрикарбоновой кислоты и продуктов его олигомеризации, причем именно полимерными продуктами определяется ингибирующая активность препаратов трифенилметанового красителя [16, 17]. В табл. 1 суммированы спектральные характеристики свежеприготовленного рас- твора ауринтрикарбоновой кислоты в сопоставлении с аналогичными свойствами фракционированного препарата [17]. Наличие пиков погло- щения ауринтрикарбоновой кислоты при 305 нм свидетельствует о на- личии в растворе мономера-красителя, а плеча при 450 нм и максимума при 520 нм — продуктов его полимеризации с различным числом зве- ньев мономера [17]. При хранении водных растворов ингибитора на- блюдается сдвиг первого максимума в длинноволновую область (312 нм), что указывает на постепенную полимеризацию молекул кра- сителя, в согласии с наличием свободнорадикальных свойств у аурин- трикарбоновой кислоты [17]. Равновесное распределение топоизомеров релаксированной Д Н К может быть получено комбинированным действием эндонуклеазы и Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1987, т . 3, Л1> 2 79 ДНК-лигазы (см. обзор [3]). Образование топоизомеров кольцевой Д Н К в наших экспериментах под действием именно ДНК-топоизомера- зы подтверждается образованием полного спектра топоизомеров ДНК—• от суперспиральной до релаксированной (при дистрибутивном действии фермента), и появлением топоизомеров релаксированной Д Н К в отсут- ствие ионов магния и АТР, необходимых для активности лигаз. Т а б л и ц а 1 Спектральные характеристики препаратов ауринтрикарбоновой кислоты Spectral characteristics of the preparations of aurintricarboxylic acid Препарат Алюминон (ауринтрикарбоновая кис- лота, аммонийная соль) («Fisher Scientific», США) Ауринтрикарбоновая кислота, аммо- нийная соль («Fluka», Швейцария) Изученные ДНК-топоизомеразы подразделяются, во-первых, на два типа по механизму промежуточного расщепления Д Н К и, во-вторых, на про- и эукариотические, что отражается в их кофакторных потреб- ностях и чувствительности к ингибиторам [1]. Для классификации ядерной ДНК-топоизомеразы из зародышей кукурузы мы сопоставили ее свойства с уже идентифицированными ДНК-топоизомеразами эука- риот (табл. 2). Возможные примеси пластид, которые содержат прока- риотические ДНК-топоизомеразы [И], сведены к минимуму выделени- ем ядер из бесцветной ткани зрелых зародышей кукурузы, а также про- мывками ядер в присутствии неионного детергента. Выделенная из ядерного экстракта зародышей кукурузы ДНК-топоизомераза облада- ет активностью в отсутствие ионов магния. Этим свойством среди изу- ченных ферментов данной группы обладают лишь эукариотические ДНК-топоизомеразы I типа из ядер млекопитающих и дрожжей [1, 9, 15], а также эукариотическая ДНК-топоизомераза I, экстрагированная из ткани семян пшеницы [10]. Подобно ДНК-топоизомеразам I из ядер животных и дрожжей ядерная ДНК-топоизомераза кукурузы стиму- лируется ионами магния, ингибируется блокированием цистеиновых ос- татков и осуществляет релаксацию супервитков по дистрибутивному или процессивному механизму в зависимости от ионной силы. Актив- ность ДНК-топоизомеразы кукурузы, в отличие от эукариотических ядерных ДНК-топоизомераз II типа, не требует доноров энергии, не подавляется высокими концентрациями налидиксовой кислоты и ново- биоцина, а также ЭДТА. Эти свойства позволяют предварительно клас- сифицировать выделенный фермент как эукариотическую ДНК-топо- изомеразу I типа. Отсутствие фракции АТР-зависимой ДНК-топоизомеразы в ядерном экстракте кукурузы, подобной ферменту из цветной капусты [12], может быть связано с различиями в процедуре выделения и/или низкой актив- ностью этого фермента в покоящейся ткани зрелого зародыша кукуру- зы по сравнению с быстроделящейся тканью соцветий цветной капусты. Влияние высоких концентраций налидиксовой кислоты на распре- деление топоизомеров релаксированной Д Н К в присутствии ядерной ДНК-топоизомеразы кукурузы, описанное ранее для ДНК-топоизо- меразы I из ооцитов вьюна [2], возможно, обусловлено связыванием 80 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1987, т. 3, Л1> 2 80 этого ингибитора с расплетенными участками суперспиральной Д Н К [19]. Полиамины — кадаверин и спермидин — оказывают стимулиру- ющее влияние на активность ДНК-топоизомеразы кукурузы в концент- рациях, вызывающих конденсацию отдельных молекул Д Н К и, не ис- ключено, их агрегацию (см. обзор [20]). Эти биогенные амины присут- ствуют и в растительных клетках [20]. Ввиду возрастающего внимания к аспектам регуляции топологии Д Н К про- и эукариот представляет интерес поиск ингибиторов ДНК- Т а б л и ц а 2 Влияние ингибиторов и кофакторов на активность ДНК-топоизомераз эукариот Effect of inhibitors and со factors on the activity of eukaryotic DNA topoisomerases Тип и источник ДНК-топоизоме- разы Релаксация суперспиральной ДНК ферментами в присутствии различ- ных веществ в инкубационной смеси АТР Нали- Без АТР ЭДТА M g + 2 Спер- мидин SH-pea- генты Ново- биоцин диксо- вая Спер- мидин кисло- та Бро- мис- тый этидий П р и м е ч а н и е . « + » — наличие и «—» — отсутствие реакции; « ± » — частичное инги- бирование. топоизомераз I типа. Было обнаружено неспецифическое ингибирование ДНК-топоизомераз I химической модификацией цистеиновых (табл. 2) и тирозиновых остатков [21], а также сорбцией на гепарин [22]. Нами впервые показано подавление активности эукариотической ДНК-топо- изомеразы препаратами ауринтрикарбоновой кислоты. Известно [16, 18], что ауринтрикарбоновая кислота является мощным ингибитором панкреатической РНКазы А, РНК-полимеразы, С^-репликазы и 1ас- репрессора Е. coli. Причем для полимераз ауринтрикарбоновая кисло- та была ингибитором лишь на стадии инициации, не оказывая сущест- венного влияния на элонгацию цепей [16]. Механизм действия ингиби- тора, по-видимому, заключается в блокировании полинуклеотидсвязы- вающих участков белков. Методами ЯМР-спектроскопии показано, что олигомеры ауринтрикарбоновой кислоты связывают лизиновые и гисти- диновые остатки, в основном, в активном центре РНКазы А [18]. Наши данные позволяют предполагать, что ауринтрикарбоновая кислота может оказаться полезной для ингибирования ДНК-топоизо- мераз и других ДНК-модифицирующих ферментов при изучении топо- логических форм ДНК. Авторы выражают признательность И. М. Ундрицову и Р. П. Ва- шакидзе за полезные советы. 80 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1987, т. 3, Л1> 2 81 NUCLEAR DNA TOPOISOMERASE FROM THE ΖΕΑ MAYS EMBRYOS K. G. Karpenchuk, G. N. Rudenko N. G. Kholodny Institute of Botany, Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev S u m m a r y ATP-independent presumably type I DNA topoisomerase was partially purified from the nuclear extract of Zea mays mature embryos by separation in the polyethylene glycol- ammonium sulphate system with 2 Μ NaCl and by salt gradient elution from CM-Sepha- dex. The ability of enzyme to relax negative supercoils of plasmid pBR322 DNA was de- tected in the presence of EDTA, being however markedly stimulated by the magnesium ions and polyamines (spermidine and cadaverine). The reaction proceeded via either pro- cessive or distributive mechanism depending on the ionic strength of the enzyme assay mixture. Novobiocin and nalidixic acid (both at 100 μg/ml) did not inhibit the enzyme activity. Modification with p-hydroxymercuribenzoate or iodoacetamide completely abo- lished the DNA topoisomerase activity, thus indicating the presence of essential cysteine residues in the enzyme molecules. The DNA topoisomerase activity was found to be completely depressed by the preparation of potent inhibitor of polynucleotide-binding pro- teins — aurintricarboxylic acid in partially polymerized form. Magnesium ions partially restored the DNA topoisomerase activity in the presence of aurintricarboxylic acid. 1. Gellert M. DNA topoisomerases / /Ann. Rev. Biochem.— 1 9 8 1 5 0 . — P . 879—910. 2. ДНК-топоизомеразы животных клеток / К. А. Кафиани, И. Б. Бронштейн, И. И. Гро- мова и др . / /Молекуляр . биология.— 1985.—19, № 2.— С. 438—449. 3. Bauer W. R. Structure and reactions of closed duplex D N A / / A n n . Rev. Biophys. and Bioengin.— 1978.—7.—P. 287—313. 4. Wang J. C., Peck L. J., Becherer K. DNA supercoiling and its effect on DNA structure and f u n c t i o n / / C o l d Spring Harbor Symp. Quant. Biol.— t982.—47.— P. 85—91. 5. Wang / . C. Unwinding of the promoter and the modulation of transcription by DNA supercoi l ing / /Promoters . Structure and Function / Eds R. L. Rodriguez, M. J. Cham- berlin — New York: Praeger Publ., 1982.—P. 229—241. 6. Stirdivant S. M., Grossland L. D., Bogorad L. DNA supercoiling effects on in vitro transcription of two maize chloroplast genes d i f f e r en t ly / /P roc . Nat. Acad. Sci. USA.— 1985.—82, N 15.—P. 4886—4890. 7. Richardson S. Μ. H., Higgins C. F., Lilley D. M. J. The genetic control of DNA su- percoiling in Salmonella tуphimurium / / EMBO J.—1984—3, N 8,—P. 1745—1752. 8. Native supercoiling of DNA: The effects of DNA gyrase and omega protein in E. со- І і / S. M. Mirkin, E. N. Zajtsev, I. G. Panyutin, V. I. Lyamichev / /Мої . and Gen. Ge- net.— 1984.—196, N 3.—P. 508—512. 9. Goto Т., Laipis P. The purification and characterization of DNA topoisomerases I and II of the yeast S. cerevisiae // J. Biol. Chem.— 1984.—259, N 16.—P. 10422—10429. 10. Purification and characterization of wheat germ DNA topoisomerase I (nicking-clo- sing e n z y m e ) / W . S. Dynan, J. J. Jendrisak, D. A. Hager, R. R. Bu rges s / / I b id .— 1981.—256, N 11.—P. 5860—5865. 11. Siedlecki J., Zimmerman W., Weissbach A. Characterization of a prokaryotic topoiso- merase I activity in chloroplast extracts from sp inach / /Nuc l . Acids Res.— 1983.— 11, N 5.—P. 1523—1536. 12. Fukata H., Fukasawa H. Isolation and partial characterization of two distinct DNA topoisomerases from cauliflower in f lo rescence / / J . Biochem.— 1982.—91, N 4 . — P. 1337—1342. 13. Reeves R. Transcriptionally active ch romat in / /BBΑ.— 1984.—782, N 4 — P . 343—393. 14. Drosophila DNA topoisomerase I is associated with transcriptionally active regions of the g e n o m e / G . Fleischmann et a l . / / P N A S . — 1984.—81, N 22.—P. 6958—6962. 15. McConaughy B. L., Young L. S., Champoux J. J. The effect of salt on the binding of the eukaryotic DNA nicking-closing enzyme to DNA and chromatin / / Biochim. et biophys. acta.— 1981.—655, N 1.—P. 1—8. 16. Blumenthal Т., Landers T. A. The inhibition of nucleic acid-binding proteins by au- rintricarboxylic acid / / Biochem. and Biophys. Res. Communs.— 1973—55, N 3.— P. 680—688. 17. Gonzalez R. G., Blackburn B. /., Schleich T. Fractionation and structural elucidation of the active components of aurintricarboxylic acid, a potent inhibitor of protein nucleic acid in teract ions/ /Biochim. et biophys. acta.— 1979.—562, N 3.— P. 534. 18. Gonzalez R. G., Haxo R. S. / / Biochemistry.— 1980.—19, N 18.—P. 4299—4303. 19. Chen L. L., Pernet A. G. // PNAS.— 1985.— 82, N 2,—P. 307—311. 20. Tabor C. W., Tabor tf.//Annu. Rev. Biochem.— 1976.—45.—P. 285—306. 21. Klevan L., Tse Y.-C. / / Biochim. et biophys acta.— 1983.—745, N 1.—P. 175—180. 22. Inhibition of topoisomerase I by heparin / K. Ishii, A. Katase, T. Andoh et a l . / / B i o - chem. and Biophys. Res. Communs.— 1982.—104, N 2 — P. 541—547. 23. Liu L. F., Miller K. G. // PNAS.— 1981.— 78, N 6.—P. 3487—3491. Ин-т ботаники им. Η. Г. Холодного АН УССР, Киев Получено 26.11.85 82 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА, 1987, т. 3, Л1> 2 82

Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукурузы

Institution

Ähnliche Einträge