Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий
Изучено наличие систем модификации-рестрикции ДНК у 19 штаммов агробактерий, в том числе авирулентных производных октопиновых и нопалиновых штаммов, полученных излечиванием вирулентных штаммов агробактерий от Ti-плазмид, а также природных изолятов авирулентных агробактерий. Показано, что отличительн...
Gespeichert in:
| Datum: | 1987 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1987
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153780 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий / Т.В. Стефанишина, И.Г. Богдарина, Я.И. Бурьянов // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 3. — С.128-131.— Бібліогр.: 4 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-153780 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1537802019-06-15T01:28:59Z Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий Стефанишина, Т.В. Богдарина, И.Г. Бурьянов, Я.И. Краткие сообщения Изучено наличие систем модификации-рестрикции ДНК у 19 штаммов агробактерий, в том числе авирулентных производных октопиновых и нопалиновых штаммов, полученных излечиванием вирулентных штаммов агробактерий от Ti-плазмид, а также природных изолятов авирулентных агробактерий. Показано, что отличительной особенностью октопиновых штаммов агробактерий, а также их излеченных авирулентных производных является наличие в них систем модификации-рестрикции ДНК со специфичностью, соответствующей R·EcoRII. Вивчено наявність систем модифікації-рестрикції ДНК у 19 штамів агробактерій, у тому числі авірулентних похідних октопінових і нопалінових штамів, отриманих внаслідок вилікування вірулентних штамів агробактерій від Ti-плазмід, а також природних ізолятів авірулентних агробактерій. Показано, що відмінною особливістю октопінових штамів агробактерій, а також їхніх вилікуваних авірулентних похідних є наявність у них систем модифікації-рестрикції ДНК зі специфічністю, яка відповідає R·EcoRII. The DNA modification-restriction systems have been studied for their presence in 19 Agrobacieria strains, including the virulent ones with 77-plasmids of various classes, the avirulent octopine and nopaline strain derivatives obtained by curing the Agrobacteria virulent strains from 77-plasmids as well as natural isolates of avirulent Agrobacteria. It is shown that the presence of the DNA modification-restriction system with EcoRIl specificity is a characteristic feature of the Agrobacteria octopine strains and of their cured avirulent derivatives. The Agrobacteria nopaline strains, their cured avirulent derivatives, and most of the Agrobacteria natural avirulent strains contain the DNA modification-restriction systems different from EcoRIl. The chromosomal nature of these characters is shown. 1987 Article Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий / Т.В. Стефанишина, И.Г. Богдарина, Я.И. Бурьянов // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 3. — С.128-131.— Бібліогр.: 4 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001DF http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153780 547.063.32 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Краткие сообщения Краткие сообщения |
| spellingShingle |
Краткие сообщения Краткие сообщения Стефанишина, Т.В. Богдарина, И.Г. Бурьянов, Я.И. Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий Биополимеры и клетка |
| description |
Изучено наличие систем модификации-рестрикции ДНК у 19 штаммов агробактерий, в том числе авирулентных производных октопиновых и нопалиновых штаммов, полученных излечиванием вирулентных штаммов агробактерий от Ti-плазмид, а также природных изолятов авирулентных агробактерий. Показано, что отличительной особенностью октопиновых штаммов агробактерий, а также их излеченных авирулентных производных является наличие в них систем модификации-рестрикции ДНК со специфичностью, соответствующей R·EcoRII. |
| format |
Article |
| author |
Стефанишина, Т.В. Богдарина, И.Г. Бурьянов, Я.И. |
| author_facet |
Стефанишина, Т.В. Богдарина, И.Г. Бурьянов, Я.И. |
| author_sort |
Стефанишина, Т.В. |
| title |
Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий |
| title_short |
Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий |
| title_full |
Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий |
| title_fullStr |
Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий |
| title_full_unstemmed |
Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий |
| title_sort |
поиск систем модификации-рестрикции днк у агробактерий |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1987 |
| topic_facet |
Краткие сообщения |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153780 |
| citation_txt |
Поиск систем модификации-рестрикции ДНК у агробактерий / Т.В. Стефанишина, И.Г. Богдарина, Я.И. Бурьянов // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 3. — С.128-131.— Бібліогр.: 4 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT stefanišinatv poisksistemmodifikaciirestrikciidnkuagrobakterij AT bogdarinaig poisksistemmodifikaciirestrikciidnkuagrobakterij AT burʹânovâi poisksistemmodifikaciirestrikciidnkuagrobakterij |
| first_indexed |
2025-07-14T05:15:05Z |
| last_indexed |
2025-07-14T05:15:05Z |
| _version_ |
1837598094239203328 |
| fulltext |
Краткие
сообщения
УДК 547.063.32
ПОИСК СИСТЕМ МОДИФИКАЦИИ-РЕСТРИКЦИИ ДНК
У АГРОБАКТЕРИЙ
Т. В. Стефанишина, И. Г. Богдарина, Я. И. Бурьянов
Вирулентные агробактерии, содержащие 77-плазмиды, на основе кото-
рых созданы векторы для введения чужеродных генов в растительные
клетки, широко используются в качестве реципиентов плазмидных Д Н К
в системах конъюгации и трансформации. В связи с этим был изучен
один из аспектов, определяющих реципиентные возможности агробакте-
рий — наличие систем модификации-рестрикции у ряда штаммов этих
микроорганизмов.
Характеристика штаммов агробактерий, использованных в работе
Characterization of the Agrobacteria strains studied
Штамм Плазмиды
Роди-
тельс-
кий
штамм
Вирулентность,
катаболизм опинов Источник получения штамма
С58 РТІС58, РАІС58 C58 one, noc Phabagen collection
С58-С9 ρ At С 58 C58 one" ~> n o c -
— « —
C58-C9Bt і pTiBt, pAtC58 C58 one, осе Получен нами
LBA672 pTiB6S3: :pTiC58,
PAtC58
C58 one, noc, oec Phabagen collection
8934 щ РТІ8934, pAt8934 8934 one, noc Ин-т микробиологии и ви-
8933 pTi8933, ρ At893$ 8933 one, noc русологии АН УССР
К14 pTiK14 K14 one, noc Ин-т биохимии и физио-
логии микроорганизмов
АН СССР
LBA4012 pTiAchS Ас/г 5 one, oec Phabagen collection
LBA4011 — Ас/г 5 one" occ~ «
LBA4301 — Ac hS one" ~,"occ~ «
Bt3 В t one" occ~ Получен нами
Bt pTiBt В t one, осе Ин-т микробиологии и ви-
8628 РТІ8628, pAt8628 8628 ocn, осе русологии АН УССР
8466 pAr8466 8466 one" осе «
Университет, г. Брно 1000 pTHOOO 1000 one, осе
«
Университет, г. Брно
1058 pTH058 1058 one, осе «
2835 pTi2835, ρ At2835 2835 one, осе «
2055 pAt2055 2055 one" «
B6 рТіВб, pAtB6 B6 one, осе J. Lippincott, США
Характеристика штаммов агробактерий, использованных в работе,
приведена в таблице. Агробактерии выращивали в среде УЕВ [1]. Бак-
териальную Д Н К выделяли по методу [2] с некоторыми модификация-
ми. Гидролиз Д Н К рестриктазами ΜυαΙ и EcoRII проводили при
37 °С в течение 1—2 ч в реакционной среде, содержащей 50 мМ трис-
НС1, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитол, 1 мкг
Д Н К и 2 ед. фермента. Электрофорез Д Н К проводили в аппарате для
горизонтального электрофореза в 0,7 %-ном агарозном геле и трис-бо-
ратном буфере (89 мМ трис, 89 мМ борная кислота, 2,5 мМ ЭДТА,
рН 8,3) при напряжении 5 В/см. В основе определения ферментов моди-
128 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1987.—т. З, N° З
фикации-рестрикции Д Н К изошизомеров и изометиломеров известных
рестриктаз и ДНК-метилаз лежит анализ устойчивости бактериальных
Д Н К из различных штаммов агробактерий к определенной рестрикта-
зе. Этот метод позволяет по устойчивости бактериальной Д Н К к дан-
ной рестриктазе судить о наличии в клетке ДНК-модифицирующего
фермента со специфичностью, соответствующей этой рестриктазе. Выде-
ление эндопуклеазной активности проводили по методу [3].
В работе использованы 19 штаммов агробактерий (таблица), в том
числе вирулентные штаммы, содержащие П-плазмиды различных клас-
Рис. 1. Электрофорез ДНК агробактерий в 0,7 %-ном геле агарозы: 1, 3, 6 — ДНК
штаммов A. tumefaciens В6, Bt, 1000 соответственно, не обработанная R· EcoRIl; 2, 4,
7 — та же ДНК, но обработанная R· EcoRIl; 5 — ДНК A. tumefaciens (штамм Bt), об-
работанная R-Mval
Fig. 1. 0.7 % agarose gel electrophoresis of Agrobacteria DNA: 1, 3, 6—DNA from Agro-
bacterium tumefaciens strains B6, Bt, 1000, respectively, not digested by the restriction
endonuclease EcoRIl·, 2, 4, 7—DNA from the same Agrobacteria strains digested by the
restriction endonuclease EcoRIl·, 5 — DNA from Agrobacterium tumefaciens (strain Bt)
digested by the restriction endonuclease Mval
Рис. 2. Электрофорез ДНК агробактерий в 0,7 %-ном геле агарозы: 1, 3, 5, 7 — ДНК
штаммов A. tumefaciens С58, 8934, 8933 и К14 соответственно, не обработанная
R-EcoRIl; 2, 4, 6, 8 — та же ДНК, но обработанная R-EcoRIl
Fig. 2. 0.7 % agarose gel electrophoresis of Agrobacteria DNA: I, 3, 5, 7 — DNA from
Agrobacterium tumefaciens strains C58, 8934, 8933 and K14, respectively, not digested by
the restriction endonuclease EcoRIl; 2, 4, 6, 8—DNA from the same Agrobacterium tu-
mefaciens strains digested by the restriction endonuclease EcoRIl
сов, авирулентные производные октопиновых и нопалиновых штаммов,
полученные путем излечивания вирулентных штаммов агробактерий от
77-плазмид, а также природные изоляты авирулентных агробактерий.
Изучение устойчивости Д Н К этих штаммов агробактерий к ре-
стриктазе EcoRIl, которая является изошизомером рестриктаз AiuBI и
AtuII, обнаруженных в двух штаммах Agrobacterium tumefaciens В6806
и ID 135 [4], показало, что Д Н К из всех штаммов агробактерий, содер-
жащих октопиновые 77-плазмиды, а также излеченных авирулентных
производных октопиновых штаммов, оказались устойчивыми к рестрик-
тазе EcoRIl. О наличии сайтов узнавания для R·EcoRIl в Д Н К ана-
лизируемых штаммов судили по гидролизу этой Д Н К рестриктазой
Mval, R-Mval является изошизомером рестрикционной эндонуклеазы
EcoRIl, которая в отличие от R· EcoRIl способна гидролизовать Д Н К ,
метилированную со специфичностью, соответствующей R-EcoRIl. Ти-
пичные электрофореграммы, полученные после обработки рестриктазой
EcoRIl Д Н К октопиновых штаммов, приведены на рис. 1. Д Н К же
всех остальных штаммов агробактерий, в том числе нопалиновых и их
производных, подвергалась гидролизу рестриктазой EcoRIl (рис. 2).
Эти данные свидетельствуют о наличии, по крайней мере, у изучен-
ных октопиновых штаммов агробактерий, а также у их авирулентных
производных системы модификации Д Н К со специфичностью, соответ-
ствующей R· EcoRIl. Так как большинство известных ДНК-метилаз
является компонентом систем модификации-рестрикции Д Н К , то с вы-
сокой степенью вероятности эти штаммы содержат не только метила-
зу, но и соответствующую рестриктазу. Действительно, в двух произ-
вольно взятых для анализа штаммах агробактерий — Bt и Віз — нами
129 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1987.—т. З, N° З
б ы л а о б н а р у ж е н а р е с т р и к т а з н а я а к т и в н о с т ь со с п е ц и ф и ч н о с т ь ю , соот -
в е т с т в у ю щ е й р е с т р и к ц и о н н о й э н д о н у к л е а з е EcoRIl. В ы д е л е н и е р е с т р и к -
ц и о н н о й э н д о н у к л е а з ы п р о в о д и л и г е л ь - ф и л ь т р а ц и е й ( у л ь т р а г е л ь А с А
44, « L K B » , Ш в е ц и я ) ч а с т и ч н о о ч и щ е н н о г о б е с к л е т о ч н о г о э к с т р а к т а , по-
л у ч е н н о г о по м е т о д у [3]. В к а ч е с т в е с у б с т р а т а д л я т е с т и р о в а н и я ре-
с т р и к т а з н о й а к т и в н о с т и и с п о л ь з о в а л и Д Н К pBR322 и ф а г а λ (рис . 3 ) .
Рис. 3. Электрофорез ДНК pBR322 (Ε. coli В834) и фага λ в
0,7 %-ном геле агарозы: I — ДНК pBR322, обработанная
R-EcoRIl; 2 — ДНК pBR322y обработанная рестриктазной актив-
ностью, выделенной из A. tumefaciens (штамм Bt); 4 — ДНК фа-
га λ, обработанная R-EcoRIl; 5 — ДНК фага λ, обработанная
рестриктазной активностью, выделенной из A. tumefaciens
(штамм Bt)
Fig. 3. 0.7 % agarose gel electrophoresis of pBR322 and λ phage
DNA: 1 — DNA of pBR322 digested by the restriction endonuclease
EcoRIl; 2 — DNA of pBR322 digested by the restriction endonucle-
ase obtained from Agrobacterium tumefaciens (strain Bt); 4 —
DNA of λ phage digested by the restriction endonuclcase EcoRIl;
5—DNA of λ phage digested by the restriction endonuclease ob-
tained from Agrobacterium tumefaciens (strain Bt)
Тот ф а к т , что не т о л ь к о все о к т о п и н о в ы е ш т а м м ы , но и и з л е ч е н н ы е
а в и р у л е н т н ы е их п р о и з в о д н ы е с о д е р ж а т с и с т е м ы м о д и ф и к а ц и и - р е с т р и к -
ции EcoRIl, с в и д е т е л ь с т в у е т о х р о м о с о м н о й п р и р о д е этих п р и з н а к о в .
Н о п а л и н о в ы е ш т а м м ы а г р о б а к т е р и й , их и з л е ч е н н ы е а в и р у л е н т н ы е
п р о и з в о д н ы е , а т а к ж е б о л ь ш и н с т в о е с т е с т в е н н ы х а в и р у л е н т н ы х ш т а м -
мов а г р о б а к т е р и й с о д е р ж а т иные, чем EcoRIl, с и с т е м ы м о д и ф и к а ц и и -
р е с т р и к ц и и . Т а к , и звестно , что в к л е т к а х ш т а м м а С 5 8 о б н а р у ж е н а ре-
с т р и к т а з а AtuAI, я в л я ю щ а я с я и з о ш и з о м е р о м R-Bcll [4].
Т а к и м о б р а з о м , н а л и ч и е Д Н К - м е т и л а з ы со с п е ц и ф и ч н о с т ь ю RX
XEcoRII и с о о т в е т с т в у ю щ е й ей э н д о н у к л е а з ы р е с т р и к ц и и я в л я е т с я от-
л и ч и т е л ь н о й о с о б е н н о с т ь ю ш т а м м о в , с о д е р ж а щ и х 7 7 - п л а з м и д ы октопи-
нового т и п а , а т а к ж е а в и р у л е н т н ы х п р о и з в о д н ы х этих ш т а м м о в агро-
б а к т е р и й .
SEARCH FOR THE MODIFICATION-RESTRICTION SYSTEMS
IN AGROBACTERIA DNA
Т. V. Sicfanishina, I. G. Bogdarina, Ya. I. Burіуanου
Institute of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms,
Academy of Sciences of the USSR, Pushchino, Moscow Region
S u m m a г у
The DNA modification-restriction systems have been studied for their presence in 19 Ag-
robacieria strains, including the virulent ones with 77-plasmids of various classes, the
avirulent octopine and nopaline strain derivatives obtained by curing the Agrobacteria
virulent strains from 77-plasmids as well as natural isolates of avirulent Agrobacteria.
It is shown that the presence of the DNA modification-restriction system with EcoRIl
specificity is a characteristic feature of the Agrobacteria octopine strains and of their cu-
red avirulent derivatives. The Agrobacteria nopaline strains, their cured avirulent deriva-
tives, and most of the Agrobacteria natural avirulent strains contain the DNA modifica-
tion-restriction systems different from EcoRIl. The chromosomal nature of these cha-
racters is shown.
1. Characterization of different plaque forming and defective temperature phages in Ag-
robacterium strains / G. Vervliet, M. Holsters, H, Teuchy et a l . / / J . Gen. Virol.—
1975.—26, N 1.—P. 33—48.
130 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1987.—т. З, N° З
'2. Identification and characterization of large plasmids in Rhizobium meliloti using aga-
rose gel electrophoresis / F. Gasse, C. Boucher, J. S. Julliot et al. / / J. Gen. Microbi-
ol.— 1979.—113, N 2.—P. 229—242.
3. Schleif R. Assaying of organisms for the presence of restriction endonucleases / /Me th .
Enzymol.— 1980.—65.— P. 19—23.
4. Roberts R. J. Restriction and modification enzymes and their recognition sequences / /
Nucl. Acids Res.— 1985.—13.—SuppL—P. 165—199.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 21.04.86
.Ин-т биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, Пущино
УДК 547.963.3
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ КОНФОРМЕРОВ
ДЕАЦИЛИРОВАННОЙ тРИК С 80S РИБОСОМАМИ
Б. С. Негру цкий, А. В. Ельская
Неактивные в аминоацилировании конформеры т Р Н К выделены из пе-
чени кроликов при некоторых состояниях, связанных с изменением био-
синтеза белка в организме [1—3]. Изучены активационные параметры
их ренатурации in vitro [4] и особенности образования комплекса с лей-
пил-тРНК-синтетазой [5]. Целью настоящей работы было исследование
взаимодействия указанных конформеров т Р Н К с рибосомами из печени
кролика. Эта з адача актуальна и интересна, поскольку особенности вза-
имодействия т Р Н К с эукариотическими рибосомами до настоящего вре-
мени изучены крайне мало. Кроме того, исследование связывания био-
логически неактивных конформеров т Р Н К с рибосомами может дать
информацию о принципиальной возможности их ингибирующего дейст-
вия на белковый синтез на этапе трансляции.
П р е п а р а т ы т Р Н К из печени голодавших 10—12 сут и контрольных
кроликов получали, как описано ранее [5]. Суммарный препарат т Р Н К
из печени голодавших животных содержит смесь активных и неактив-
ных в аминоацилировании т Р Н К (тРНКа+н), а из печени контрольных
животных — активные конформеры ( т Р Н К а ) . Д е а ц и л и р о в а н и е т Р Н К
проводили по методу [6]. 40S и 60S субчастицы рибосом из печени кро-
л и к а получали, как описано в [7]. [ 1 4 С]фенилаланил-тРНК с удельной
активностью 1520 пмолей [ 1 4 С]фенилаланина на 1 ед. А2бо, обогащенная
T P H K p h e и суммарная т Р Н К , лишенная фенилаланиновой т Р Н К
(тРНК~ Р І 1 е ) , были получены по методу [8]. Связывание аминоацил-
т Р Н К с рибосомами изучали в системе, предложенной Ниренбергом и
Л е д е р о м [9]. Смесь в объеме 50 мкл содержала 0,02 Μ трис-HCl , рН 7,6,
0,1 Μ NH4C1, 0,02 Μ MgCl 2 , 5 пмолей 40S и 7,5 пмолей 60S субчастиц
рибосом, 20 пмолей [ 1 4 С]фенилаланил-тРНК, различные количества де-
ацилированной т Р Н К и в ряде случаев 2 мкг п о л и ( и ) . [ 1 4 С]фенилала-
н и л - т Р Н К добавляли после преинкубации смеси при 4 °С в течение
10 мин и затем инкубировали пробы еще 45—75 мин при той ж е темпе-
ратуре. Образовавшиеся комплексы сорбировали на нитроцеллюлозные
фильтры с диаметром пор 0,45 мкм.
Одним из способов исследования взаимодействия деацилированной
т Р Н К с рибосомами является определение ее ингибиторного действия
на связывание с рибосомами аминоацил- либо пептидил-тРНК [10, 11].
В настоящей работе взаимодействие рибосом с различными конформе-
рами т Р Н К оценивали по степени ингибирования связывания [14С]фе-
нилаланил-тРНК- Предварительно были определены оптимальные для
матричнозависимого и безматричного связывания количества фенилала-
н и л - т Р Н К и время инкубации.
Н а рис. 1, α представлены результаты исследования ингибирующе-
го действия различных конформеров т Р Н К на поли (U) - зависимое свя-
зывание ф е н и л а л а н и л - т Р Н К с 80S рибосомами. Видно, что тРНКа+н
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1987.—т. 3, № 3 131
|