Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу
Впервые выделена «обратная гираза» из анаэробной архебактерии. Показано, что для работы фермента необходимы АТФ и ионы Na⁺ и Mg²⁺. Полученный препарат топоизомеразы нечувствителен к действию кислорода....
Збережено в:
| Дата: | 1988 |
|---|---|
| Автор: | |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1988
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153815 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу / А.И. Слесарев // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 1. — С. 28-34. — Бібліогр.: 25 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-153815 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1538152019-06-15T01:30:13Z Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу Слесарев, А.И. Структура и функции биополимеров Впервые выделена «обратная гираза» из анаэробной архебактерии. Показано, что для работы фермента необходимы АТФ и ионы Na⁺ и Mg²⁺. Полученный препарат топоизомеразы нечувствителен к действию кислорода. Вперше виділена «зворотний гіраза» з анаеробної архебактерии. Показано, що для роботи ферменту необхідні АТФ і іони Na⁺ і Mg²⁺. Отриманий препарат топоізомерази нечутливий до дії кисню. Topoisomerase able to introduce positive supercoils into a closed circular DNA has been first found and partially purified from anaerobic archaebacterium. The topoisomerase fraction obtained by chromatography on phosphocellulose contains two polypeptides with molecular weights 108000 and 135000. ATP, ions Na⁺ and Mg²⁺ are needed for the enzyme functioning. Desulfurococcus topoisomerase is not inhibited by O₂. 1988 Article Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу / А.И. Слесарев // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 1. — С. 28-34. — Бібліогр.: 25 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00020E http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153815 547.963.32 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Слесарев, А.И. Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу Биополимеры и клетка |
| description |
Впервые выделена «обратная гираза» из анаэробной архебактерии. Показано, что для работы фермента необходимы АТФ и ионы Na⁺ и Mg²⁺. Полученный препарат топоизомеразы нечувствителен к действию кислорода. |
| format |
Article |
| author |
Слесарев, А.И. |
| author_facet |
Слесарев, А.И. |
| author_sort |
Слесарев, А.И. |
| title |
Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу |
| title_short |
Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу |
| title_full |
Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу |
| title_fullStr |
Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу |
| title_full_unstemmed |
Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу |
| title_sort |
положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1988 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153815 |
| citation_txt |
Положительная топоизомеразная активность, обнаруженная у новой экстремально термофильной анаэробной архебактерии, восстанавливающей серу / А.И. Слесарев // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 1. — С. 28-34. — Бібліогр.: 25 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT slesarevai položitelʹnaâtopoizomeraznaâaktivnostʹobnaružennaâunovojékstremalʹnotermofilʹnojanaérobnojarhebakteriivosstanavlivaûŝejseru |
| first_indexed |
2025-07-14T05:16:31Z |
| last_indexed |
2025-07-14T05:16:31Z |
| _version_ |
1837598184252112896 |
| fulltext |
УДК 547.963.32
ПОЛОЖИТЕЛЬНАЯ ТОПОИЗОМЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ,
ОБНАРУЖЕННАЯ У НОВОЙ ЭКСТРЕМАЛЬНО ТЕРМОФИЛЬНОЙ
АНАЭРОБНОЙ АРХЕБАКТЕРИИ, ВОССТАНАВЛИВАЮЩЕЙ СЕРУ *
А. И. Слесарев j
Введение. Топологическое состояние Д Н К играет важную роль в функ-
ционировании ее в клетке. У эукариот суперспирализация Д Н К явля-
ется необходимым этапом в формировании ДНК-гистоновых комплек-
сов, и тем самым она вовлечена в организацию хромосом [1]. У про-
кариот суперспирализованное состояние Д Н К сопряжено с торсион-
ным напряжением, важным для процессов репликации, транскрипции,
генетической рекомбинации [2].
Топоизомеразы являются ферментами, контролирующими сверхспи-
ральное состояние Д Н К в клетке. У бактерий такой контроль осуще-
ствляется «антагонистическим» действием ферментов двух типов: топо-
изомеразы I (ω-белок), которая релаксирует отрицательно суперспи-
рализованную Д Н К [3], и топоизомеразы II (ДНК-гиразы), вводящей
отрицательные супервитки в релаксированную кольцевую замкнутую
(кз) Д Н К [4—6]. У эукариот функции топоизомераз до конца не вы-
яснены: хотя у них и присутствуют топоизомеразы типов I и II, отри-
цательной топоизомеразной активности пока не обнаружено.
До недавнего времени все работы, где исследовали влияние топо-
логического состояния Д Н К на фундаментальные клеточные процессы,
свидетельствовали в пользу отрицательной сверхспирализации Д Н К в
клетках прокариот [2, 5, 7] и эукариот [8—10]. Обнаружение топоизо-
меразы в клетках Sulfolobus acidocaldarius, названной «обратной гира-
зой» и способной создавать положительные супервитки как в релакси-
рованной, так и в отрицательно суперспирализованной кз ДНК, заста-
вило пересмотреть это представление [И —13]. Наконец, Надал и др.
[14] прямо показали, что Д Н К существует в положительном супер-
спиральном состоянии в геноме вирусоподобной частицы SSV-1, при-
сутствующей в клетках Sulfolobus. Организм, на котором были выпол-
нены эти работы, является экстремальной термоацидофильной архе-
бактерией, т. е. относится к обособившейся филогенетической ветви
организмов, существенно отличающейся как от эубактерий, так и от
эукариот [15, 16].
В настоящей работе сообщается об обнаружении и некоторых свой-
ствах обратной гиразы из клеток Desulforococcus amylolyticus.
Материалы и методы. D. amylolyticus — новая экстремально термофильная ана-
эробная серуредуцирующая архебактерия [17]. Она выделена из горячих источников
Камчатки, растет в интервале температур от 68 до 97 °С, с оптимумом при 92 °С и
рН 6,4. Клетки выращивали во флаконах объемом 0,5 л из-под культуральных сред
фирмы «Gibco» при температуре 92 °С в течение 20 ч в среде, содержащей 0,2 % дрож-
жевого экстракта («Difco», США), 2 г /л пептона («Difco», США), 0,33 г/л NHUC1,.
0 :33 г/л MgCl 2 -2H 2 0, 0,33 г /л СаС12-6Н20, 0,33 г/л КН 2 Р0 4 , 1,5 г/л NaHC0 3 , 2 мл/л
микроэлементов Липперта [18]. Анаэробные условия создавали по методу Хангейта
[19]. В качестве восстанавливающего агента использовали Na2S в концентрации
0,5 г/л. Около 3 г биомассы, полученной из 10 л культуральной среды, суспендировали
в 20 мл буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,6 Μ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 %
глицерина, 1 мМ ФМСФ, 1 мкг/мл лейпептина («Serva», ФРГ) , 10 мМ 2-меркаптоэта-
нол («Ferak», ФРГ) . Клетки разрушали ультразвуком. Лизат центрифугировали в те-
чение 2 ч при 40000 об/мин в ультрацентрифуге Ж-62 (СССР). К надосадочной жид-
кости по каплям добавляли 20 %-ный полимин Π (рН 7,5) до концентрации 0,3 % при
непрерывном перемешивании в ледяной бане. Преципитат удаляли центрифугированием
при 5000 об /мин в течение 1 ч. Далее к супернатанту добавляли сульфат аммония
* Представлена членом редколлегии М. Д. Франк-Каменецким
28 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988. — Т. 4, № 1
(65 % от насыщения), центрифугировали и осадок растворяли в буфере, содержащем
50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 % глицерина, 1 мМ спермидин («Serva», ФРГ) , 1 мМ
ФМСФ, 1 мМ лейпептин, 10 мМ 2-меркаптоэтанол (буфер А), и диализовали против
этого же буфера. Полученную фракцию наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой
(«Pharmacia», Швеция) объемом 20 мл, уравновешенную буфером А. и элюировали
линейным градиентом концентрации NaCl: 0,01—0,5 Μ.
Стандартная реакционная система (объем 20 мкл) для исследования топоизоме-
разной активности содержала 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 150 мМ NaCl r
Рис. 1. Топоизомеразная активность фракций, полученных хроматографией на ДЭАЭ-
целлюлозс: 1-я дорожка справа — контрольная Д Н К pBR322\ остальные дорожки по-
казывают активность каждой фракции
Fig. 1. Fractionation of topoisomerase activities on DEAE-cellulose. Right lane: DNA
pBR322 control, other lanes show the activity in each fraction of the column (from right
to left)
Рис. 2. Топоизомеразная активность фракций, полученных хроматографией фракции
II на фосфоцеллюлозе: 1-я дорожка справа — контрольная Д Н К pBR322\ остальные
дорожки показывают активность каждой фракции
Fig. 2. Fraction II phosphocellulose column chromatography. Right lane: DNA pBR322
control; other lanes show the activity in each fraction of the cojumn (from right to left)
І мМ дитиотреитол («Serva», ФРГ) , 1 мМ АТФ («Sigma», США), 15 мкг/мл отрица-
тельно суперспирализованной Д Н К плазмиды pBR322. По 2 мкл каждой фракции, вы-
шедшей после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, инкубировали в системе при 80 °С
в течение 30 мин. Реакцию прекращали, быстро охлаждая смесь до комнатной темпе-
ратуры и добавляя 1/5 объема 5 %-ного DS-Na, 50 мМ ЭДТА, 50 %-ного глицерина,
0,5 %-ного бромфенолового синего. Продукты топоизомеризации анализировали элек-
трофорезом в 1 %-ной агарозе в буфере, содержащем 40 мМ трис-ацетат, 2 мМ
ЭДТА, рН 8,0.
Фракции 10—18, вышедшие после ДЭАЭ-хроматографиИ (рис. 1), объединили и
приготовили сульфатную фракцию 1, 65 % от насыщения. Осадок фракции 1 раствори-
ли в 20 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,1 Μ NaCl, 1 мМ спермидин,
1 мМ ФМСФ, 1 мкг/мл лейпептина, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 20 % глицерина (буфер
Б), и диализовали против этого же буфера. Препарат наносили на колонку объемом
8 мл с фосфоцеллюлозой Р-11 («Whatman», Англия), уравновешенную буфером Б, про-
мывали двумя объемами того же буфера и элюировали 60 мл линейного градиента кон-
центрации NaCl: 0,1—0,8 Μ. Активные фракции (рис. 2) объединяли и диализовали
против буфера В: 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50%-ный глицерин, 1 мМ спермидин, 1 мМ
дитиотреитол, 0,5 Μ NaCl. Дальнейшую работу вели с этим препаратом.
Белковый состав фракций, получающихся в ходе очистки, анализировали в поли-
акриламидном геле (ПААГ) в присутствии DS-Na согласно рекомендациям фирмы
«LKB» (Швеция), используя систему для горизонтального электрофореза «Multiphor».
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.— Т. 4, № ι 29
Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда [2-0], применяя бычий сыворо-
точный альбумин в качестве стандарта.
Для анализа топоизомеров, образующихся в результате инкубации плазмиды
pBR32'2 с фосфоцеллюлозной фракцией топоизомеразы, использовали метод двухмерно-
го электрофореза в 1 %-й агарозе [21]. Вначале электрофорез проводили в одном на-
правлении в течение 14—16 ч при напряженности электрического поля 1,5—2 В/см,
затем гель инкубировали 4 ч в электродном буфере в присутствии 2 мкг/мл хлорохина
и вели электрофорез в ортогональном направлении в течение 8—10 ч при той же на-
пряженности электрического поля. Во втором направлении подвижность положитель-
ных топоизомеров увеличивается из-за повышения суперспиральной плотности при свя-
зывании с хлорохином, а подвижность отрицательных топоизомеров уменьшается, так
как хлорохин релаксирует отрицательно суперспирализованную ДНК.
Результаты и обсуждение. Д л я обнаружения топоизомеразпой ак-
тивности в качестве субстрата использовали отрицательно суперспи-
рализованную Д Н К pBR322. В неочищенном экстракте интересующая
активность не обнаруживалась (по-види-
мому, из-за присутствия нуклеаз), но
после хроматографии сульфатной фрак-
ции на ДЭАЭ-целлюлозе выявлена ре-
лаксирующая активность в составе двух
Рис. 3. Белковый состав ДЭАЭ-целлюлозной (а,
1 мкг фракции II) и фосфоцеллюлозной (б,
1 мкг) фракций, полученный с помощью электро-
фореза в градиенте пористости ПААГ (7 = 4—
—22,5 %) в присутствии DS-Na. В качестве мар-
керов молекулярной массы (указана · Ю - 3 ) ис-
пользовали трансферрин, человеческий альбумин
и тяжелую цепь человеческого гамма-глобулина
(в), а также РНК-полимеразу Thermoplasma aci-
dophilum (г)
Fig. 3. Proteins in the DEAE-cellulose fraction (a,
1 μ^ of fraction II) and in phosphocellulose fra-
ction (б, 1 μ£) of the topoisomerase. SDS-electro-
phoresis performed in pore gradient of polyacryla-
mide (T = 4—22.5 %). Transferrin, albumin (hu-
man) , γ-globulin Η-chain (human) (в) and Ther-
moplasma acidophilum RNA-polymerase (г) were
used as molecular weight s tandards
пиков: 1 — ф р а к ц и и 6—9\ 2 — фракции 10—18 (рис. 1). Фракции вто-
рого пика далее хроматографировали на фосфоцеллюлозе. Наличие
релаксирующей активности показано в интервале 0,6—0,7 Μ NaCl
(фракции 13—15, рис. 2).
На рис. 3 приведена электрофореграмма фракций топоизомеразы
на разных стадиях очистки. Как видно из рисунка, фосфоцеллюлозная
фракция содержит два полипептида с молекулярными массами 135000
и 108000. Для сравнения отметим, что обратная гираза, которую выде-
лили из клеток 5. acidocaldarius, является полипептидом с молекуляр-
ной массой 132000 [12]. Пока нельзя сказать, какой из двух белков
является ответственным за положительную топоизомеразную актив-
ность. Возможно, эффект обусловлен их совместным действием.
На рис. 4 показаны результаты анализа методом двухмерного
электрофореза Д Н К плазмиды pBR322y инкубированной с разными
количествами фосфоцеллюлозной фракции топоизомеразы. На рис. 4, в,
видно, что наряду с набором отрицательных топоизомеров, получаю-
щихся в результате релаксации неразрешаемых в 1%-ной агарозе топо-
изомеров с высокой отрицательной суперспиральной плотностью, при-
сутствует и ветвь положительных топоизомеров. Молярное отношение
фермента к субстрату в этом случае не превышает 0,1. При большей
3 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988. — Т. 4, № 1
концентрации фермента (молярное отношение=6—7) вся Д Н К ока-
зывается положительно суперспирализована (рис. 4, г) .
Следует отметить, что температура инкубации была 80 °С, а элек-
трофорез проводили при 20 °С. Суперспиральная плотность ДНК, как
Рис. 4. Двухмерный электрофорез в 1 %-ной агарозе (разделение в первом направлении
вели сверху вниз, во втором — справа налево): а — контрольная Д Н К pBR322 (0,3 мкг);
видимые полосы: отрицательно суперспирализованная Д Н К (нижняя полоса), открытая
кольцевая Д Н К (средняя полоса), отрицательно суперспирализованная димерная Д Н К
(верхняя полоса); б—релаксированная Д Н К pBR322\ видна ветвь отрицательно супер-
спирализованных топоизомеров; в — Д Н К pBR322 (0,3 мкг), инкубированная с 1,5 нг
фосфоцеллюлозной фракции Desulfurococcus топоизомеразы; видны ветви отрицатель-
ных и положительных топоизомеров; г — Д Н К pBR322 (0,3 мкг), инкубированная с
0,1 мкг фосфоцеллюлозной фракции Desulfurococcus топоизомеразы; присутствуют толь-
ко положительные топоизомеры
Fig. 4. Two-dimensional electrophoresis in a 1 % agarose gel. Separation in the first di-
mension was from top to bottom; in the second — from right to left: a — DNA pBR322
(0.3 p.g) control; three visible bands are, respectively, negative supercoiled DNA (lower
band) , open circular DNA (middle band), negative supercoiled dimer DNA (upper band) ;
б—relaxed DNA pBR322\ visible branch is negative supercoiled topoisomers; в — DNA
pBR322 (0.3 ^ig) after incubation with 1.5 ng of phosphocellulose fraction of Desulfuro-
coccus topoisomer'ase; the left part of arch contains positive supercoiled topoisomers, the
right part of arch contains negative supercoiled topoisomers; г — DNA pBR322 (0.3 μg)
af ter incubation with 0.1 μg of phosphocellulose fraction of Desulfurococcus topoisomera-
se; there are only positively supercoiled topoisomers
известно, зависит от температуры [22], и на pBR322 при уменьшении
температуры на 60 °С сбрасывается примерно девять положительных
супервитков (эта оценка получена экстраполяцией зависимости угла
вращения спирали от температуры іна область высоких температур; Ли
и Бауэр [23] показали, что это справедливо, по меньшей мере, вплоть
до 65 °С). Поэтому в реакционных условиях Д Н К более положительно
суперспирализована, чем в условиях электрофореза и, например, еще
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.— Т. 4, № ι 31
разрешаемый 9-й положительный топоизомер (в первом направлении)
при 80 °С был 18-м.
Выше уже указывалось, что реакцию проводили обычно при 80 °С,
хотя оптимальной температурой роста D. amylolyticus является 92 °С.
Это объясняется тем, что при температуре ниже 65 °С активности не
наблюдалось, а при 90 °С в Д Н К образовывались открытые кольца в
заметных количествах.
На рис. 5 и 6 представлены зависимости топоизомеразной актив-
ности от концентрации АТФ, Mg2+, Na+. Как видно из приведенных
Рис. 5. Зависимость топоизомеразной активности от концентрации АТФ и M g 2 + : 1 —
контрольная Д Н К pBR322\ 2—8 — концентрация АТФ 10; 1; 0,5; 0,1; 0,01; 0,001; 0 мМ
соответственно; 9—16 — концентрация MgCl2 50; 20; 10; 5; 1; 0,2; 0,04; 0 мМ соответ-
ственно. Реакционная смесь содержала 0,3 мкг Д Н К и 1,5 нг фермента
Fig. 5. Effects of ATP and Mg2+ on the topoisomerase activity: 1 — DNA pBR322 control;
2-8 — ATP concentration: 10.0; 1.0; 0.5; 0.1; 0.01; 0.001; .0.0 mM, respectively; 9-16 —
ЛЦСІ2 concentration: 50.0; 20.0; 10.0; 5.0; 1.0; 0.2; 0.04; 0.0 mM, respectively. 0.3 μg of
DNA was incubated with 1.5 ng of enzyme in the standard assay mixture
данных (рис. 5), реакция является АТФ-зависимой, и минимальной
концентрацией АТФ, при которой еще наблюдается активность, явля-
ется 1 мкМ. В отсутствие ионов Mg2+ и Na+ реакция не идет, равно
как и при их высокой концентрации
(рис. 5, 6). В качестве оптимальных кон-
центраций выбрали следующие: АТФ —
0,5—1,0 мМ; Mg2+ —5—10 мМ; Na+ —
200—300 мМ.
Рис. 6. Зависимость топоизомеразной активности
от концентрации Na + : 1 — контрольная Д Н К
pBR322; 2—7 — концентрация NaCl 50; 100; 125;
175; 250; 380 мМ соответственно. Реакционная
смесь содержала 0,3 мкг Д Н К и 1,5 нг фермента
Fig. 6. Effect of Na+ on the topoisomerase activity:
7 —DNA pBR322 control; 2-7 — NaCl concentra-
tion: 50; 100; 125; 175; 250; 380 mM, respectively,
0.3 fig of DNA was incubated with 1.5 ng of
enzyme in the standard assay mixture
В описанных выше экспериментах в качестве субстрата использо-
вали отрицательно суперспирализованную Д Н К pBR322. Интересно
было проверить, проявляет ли фермент истинную положительную топо-
изомеразную активность, т. е. действует ли он на релаксированную
и незначительно положительно сверхспирализованную ДНК. На рис. 7
приведен результат такой проверки. Д Н К релаксировали топоизоме-
разой I из ростков пшеницы («Serva», ФРГ) в буфере, содержащем
50 мМ трис-HCl, рН 7,9, 50 мМ NaCi, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол,
20%-ный глицерин. В результате получился набор из четырех отрица-
тельно суперспирализованных топоизомеров (рис. 7 ,6 ) . После инкуба-
ции этого препарата с фосфоцеллюлозной фракцией обратной гиразы
32 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1988. — Т. 4, № 1
отрицательные топоизомеры исчезают и появляются четыре положи-
тельных топоизомера (рис. 7, а) . Следует подчеркнуть, что в условиях
инкубации фермент действует на уже изначально положительно супер-
спирализованный субстрат (как уже отмечалось выше, при переходе
от комнатной температуры к температуре инкубации в Д Н К pBR322
появляются примерно 9 дополнительных топоизомеров и наоборот).
В этих опытах молярное отношение фермента к субстрату равня-
лось 5—7. Дополнительные положительные топоизомеры (по сравнению
с контролем) не появлялись, если это отношение было меньше 0,1
Рис. 7. Действие фермента на релаксированную Д Н К pBR322: а — релаксированная
Д Н К (0,3 мкг); б — Д Н К после инкубации с ОД мкг фермента
Fig. 7. Enzyme action on the relaxed DNA pBR322: a —relaxed D'NA (0.3 μg ) ; б — DNA
after incubation with 0.1 μg of enzyme
(результаты не приведены), хотя для проявления активности на отри-
цательно суперспирализованном субстрате такого количества фермента
было достаточно. Различие в действии фермента на отрицательно су-
перспирализованный и релаксированный субстраты можно было бы
объяснить, предположив, что по мере увеличения положительной супер-
спиральной плотности Д Н К способность фермента связываться с ней
падает. На это указывают и авторы работы [11].
Следует отметить еще одно свойство нашего препарата. Организм,
из которого его получили, является строгим анаэробом, и можно было
ожидать, что в присутствии О2 активности не будет наблюдаться, как
это имеет место в случае с РНК-полимеразой из D. mucosus [24]. Од-
нако этого не произошло. Все стадии выделения проходили в обычных
условиях, и препарат сохранял активность на протяжении нескольких
месяцев в аэробной атмосфере.
На сегодняшний день положительная топоизомеразная активность
обнаружена в клетках Sulfolobus и в клетках миеломы S107 [25].
Эти данные вместе с результатами, изложенными в работе, позволяют
предположить, что явление положительной суперспирализации не носит
единичного характера и, возможно, является альтернативным механиз-
мом регуляции и экспрессии генов [13, 14]. В литературе по это-
му вопросу обсуждается также и возможная роль положительной су-
перспирализации в стабилизации Д Н К в высокотемпературных ус-
ловиях (для Sulfolobus — это 80 °С). В нашем случае последняя воз-
можность особенно привлекательна, так как D. amylolyticus растет
вплоть до 97 °С.
Автор глубоко признателен С. А. Козявкину за полезные обсужде-
ния при написании статьи, К. А. Серовой и В. М. Копылову — за вни-
мание к работе и практическую помощь при подготовке статьи к пуб-
ликации.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.— Т. 4, № ι 33
POSITIVE TOPOISOMERASE ACTIVITY REVEALED IN A NEW EXTREME-
THERMOPHILIC ANAEROBIC ARCHAEBACTERIUM, REDUCING SULFUR
A. I. Slesarev
In s t i t u t e of Molecu la r Genet ics , Academy of Sciences of the U S S R , Moscow
S u m m a r y
Topoisomerase able to introduce positive supercoils into a closed circular DNA has been
first found and partially purified from anaerobic archaebacterium. The topoisomerase
fraction obtained by chromatography on phosphocellulose contains two polypeptides with
molecular weights 108000 and 135000. ATP, ions Na+ and Mg2+ are needed for the
enzyme functioning. Desulfurococcus topoisomerase is not inhibited by O2.
1. Gellert M. DNA topoisomerases / /Ann. Rev. Biochem.— 1983.—50.—P. 879—910.
2. Грагеров A. #., Миркин С. Μ. Влияние сверхспирализации Д Н К на основные гене-
тические процессы у прокариот / / Молекуляр. биология.— 1970.— 14, № 1.— С. 8—
34.
3. Wang J. С. Interaction between DNA and an Escherichia coli protein ω / / J . Мої.
Biol.— 1971.— 55, N 3.— P. 523—533.
4. DNA gyrase: An enzyme that introduces superhelical turns into DNA / M. Gellert,
K. Mizuuchi, Μ. H. O'Dea, H. A. N a s h / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1976.—73,
N 11.—P. 3872—3876.
5. Pruss G. J., Manes S. H., Drlica K. Escherichia coli DNA topoisomerase I mutants:
increased supercoiling is corrected by mutations near gyrase genes / /Ce l l .— 1982.—
31, N 1.— P. 35—42.
6. Menzel R., Gellert M. Regulation of the genes for E. coli DNA gvrase: homeostatic
control of DNA supercoiling / / Ibid.— 1983.— 34, N 1.— P. 105—113.'
7. DiNardo S., Voelkel A. K., Sternglanz R. Escherichia coli DNA topoisomerase I mu-
tants have compensatory mutations in DNA gyrase genes / / Ib id .— 1982.— 31, N 1.—
P. 43—51.
8. Harland R. M., Weinlraub H., McKnight S. L. Transcription of DNA injected into
Xenopus oocytes is influenced bv template topo logy/ /Nature .— 1983.— 302, N 5903.—
P. 38—43.
9. Ryoji M., Worcel A. Chromatin assembly in Xenopus oocytes in vivo studies / / Cell.—
1984.— 37, N 1.—P. 21—32.
10. Glikin G. C., Ruberti L, Worcel A. Chromatin assemblv in Xenopus oocytes: In vitro
studies / / Ibid.— P. 33—41.
11. Kikuchi Α., Asai K. Reverse gyrase — a topoisomerase which introduces positive su-
perhelical turns into D N A / / Nature.— 1984.—309, N 5970.—P. 677—681.
12. High positive supercoiling in vitro catalized by an ATP and polyethylene glycol-sti-
mulated topoisomerase from Sulfolobus acidocaldarius / P. Forterre G. Mirambeau,
K. Jaxel et al. / / The EMBO J.— 1985 , - 4, N 8.— P. 2123—2128.
13. Nakasu S., Kikuchi A. Reverse gyrase; ATP-dependent type I topoisomerase from
Sulfolobus / / Ibid.— N 10,— P. 2705—2710.
14. Positive supercoiled DNA in a virus-like particle of an archaebacterium / M. Nadal,
G. Mirambeau, P. Forterre et a l . / / N a t u r e . — 1986.—321, N 6067.—P. 256—258.
15. Woese C. R., Fox G. E. Phylogenetic structure of the procaryotic domain: The primarly
kingdoms / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1977.—74, N 11,—P. 5088—5090.
16. Прангишвилли Д. А. Молекулярная биология архебактерий//Молекуляр. биоло-
гия.— 1983.— 17, № 2,— С. 234—248.
17. Desulfurococcus amylolyticus новый вид экстремально-термофильной архебактерии
из гидротерм / Е. А. Бонч-Осмоловская, А. И. Слесарев, М. А. Мирошниченко,
Т. П. Светличная / / Д о к л . АН СССР.— 1986.—290, № 5.—С. 1259—1263.
18. Lippert К. D. Uber das Vitamin В12 Bediifnis phototropher Schwefelbacter ien/ /Arch.
Microbiol.— 1966.—55, N 4,—S. 245—248.
19. Hungate R. E. A roll tube method for cultivation of strict anaefobes / / Method in
mi:robiology / Eds J. R. Norris, D. W. Ribbons —New York: Acad, press, 1969.—
Vol. 3B.— P. 117—132.
20. Bradford Μ. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye b i n d i n g / / A n a l . Biochem,--
1976.— 72, N 3.— P. 248—254.
21. Lee C.-H. Unwinding of double-stranded DNA helix by dehydra t ion / /P roc . Nat.
Acad. Sci. USA.— 1981.— 78, N 5.—P. 2838—2842.
22. Depew R., Wang J. Conformational fluctuations of DNA helix / / Ibid.—1975.—72,
N і 1.— P. 4275—4279.
23. Lee F. S., Bauer W. R. Temperature dependence of the gel electrophoretic mobility of
superhelical D N A / / N u c l . Acids Res.— 1985.— 13, N 5.—P. 1665—1682.
24. DNA-dependent RNA polymerases of thermophilic archaebacteria / D. Prangishvilli,
W. Zilling, A. Gierl et a l . / / E u r . J. Biochem.—1982.— 122, N 3,—P. 471—477.
25. Lazo P. A. Formation of positive supercoiled DNA bv a nuclear factor from myeloma
ce l l / /Biochem. J.— 1985.— 231, N 1.—P. 185—188.
Ин-т молекуляр. генетики АН СССР, Москва Получено 29.12.86.
34 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988. — Т. 4, № 1
|