Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом
Исследовано взаимодействие Ecodam-метилазы с 20-членным олигонуклеотидным дуплексом, содержащим участок узнавания фермента. Методами гель-фильтрации и ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы обнаружено увеличение молекулярной массы фермента в присутствии олигонуклеотидного субстрата п...
Gespeichert in:
| Datum: | 1987 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1987
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153917 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом / Н.И. Речкунова, В.В. Зиновьев, Э.Г. Малыгин, Ю.А.Горбунов, С.Г. Попов, В.Ф. Нестеренко, Я.И. Бурьянов // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 3. — С. 152-154.. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-153917 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1539172019-06-15T01:29:06Z Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом Речкунова, Н.И. Зиновьев, В.В. Малыгин, Э.Г. Горбунов, Ю.А. Попов, С.Г. Нестеренко, В.Ф. Бурьянов, Я.И. Краткие сообщения Исследовано взаимодействие Ecodam-метилазы с 20-членным олигонуклеотидным дуплексом, содержащим участок узнавания фермента. Методами гель-фильтрации и ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы обнаружено увеличение молекулярной массы фермента в присутствии олигонуклеотидного субстрата по сравнению с исходным ферментом на величину, большую молекулярной массы субстрата. Максимальное значение молекулярной массы комплекса наблюдали при эквимолярном соотношении фермента и субстрата. Полученные результаты подтверждают образование димерной формы фермента в присутствии субстрата. Досліджено взаємодію Ecodam-метилази з 20-членним олігонуклеотидним дуплексом, що містить ділянку упізнавання ферменту. Методами гель-фільтрації та ультрацентрифугування у градієнті щільності сахарози виявлено збільшення молекулярної маси ферменту за присутності олігонуклеотидного субстрату в порівнянні з вихідним ферментом на величину, більшу молекулярної маси субстрату. Максимальне значення молекулярної маси комплексу спостерігали при еквімолярному співвідношенні ферменту і субстрату. Отримані результати підтверджують утворення димерної форми ферменту за присутності субстрату. The Ecodam-methylase has been investigated for its interaction with the 20-base oligonucleotide duplex containing the enzyme recognition site. An increase of the enzyme molecular weight was detected by the gel-filtration and sucrose density gradient centrifugation methods. The maximal value of the molecular complex weight was observed when concentrations of the enzyme and the substrate were equal. The results obtained prove the formation of the dimeric enzyme form in the substrate presence. 1987 Article Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом / Н.И. Речкунова, В.В. Зиновьев, Э.Г. Малыгин, Ю.А.Горбунов, С.Г. Попов, В.Ф. Нестеренко, Я.И. Бурьянов // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 3. — С. 152-154.. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001E7 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153917 577.323 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Краткие сообщения Краткие сообщения |
| spellingShingle |
Краткие сообщения Краткие сообщения Речкунова, Н.И. Зиновьев, В.В. Малыгин, Э.Г. Горбунов, Ю.А. Попов, С.Г. Нестеренко, В.Ф. Бурьянов, Я.И. Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом Биополимеры и клетка |
| description |
Исследовано взаимодействие Ecodam-метилазы с 20-членным олигонуклеотидным дуплексом, содержащим участок узнавания фермента. Методами гель-фильтрации и ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы обнаружено увеличение молекулярной массы фермента в присутствии олигонуклеотидного субстрата по сравнению с исходным ферментом на величину, большую молекулярной массы субстрата. Максимальное значение молекулярной массы комплекса наблюдали при эквимолярном соотношении фермента и субстрата. Полученные результаты подтверждают образование димерной формы фермента в присутствии субстрата. |
| format |
Article |
| author |
Речкунова, Н.И. Зиновьев, В.В. Малыгин, Э.Г. Горбунов, Ю.А. Попов, С.Г. Нестеренко, В.Ф. Бурьянов, Я.И. |
| author_facet |
Речкунова, Н.И. Зиновьев, В.В. Малыгин, Э.Г. Горбунов, Ю.А. Попов, С.Г. Нестеренко, В.Ф. Бурьянов, Я.И. |
| author_sort |
Речкунова, Н.И. |
| title |
Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом |
| title_short |
Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом |
| title_full |
Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом |
| title_fullStr |
Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом |
| title_full_unstemmed |
Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом |
| title_sort |
димеризация ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1987 |
| topic_facet |
Краткие сообщения |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153917 |
| citation_txt |
Димеризация Ecodam-метилазы, индуцированная олигонуклеотидным субстратом / Н.И. Речкунова, В.В. Зиновьев, Э.Г. Малыгин, Ю.А.Горбунов, С.Г. Попов, В.Ф. Нестеренко, Я.И. Бурьянов // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 3. — С. 152-154.. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT rečkunovani dimerizaciâecodammetilazyinducirovannaâoligonukleotidnymsubstratom AT zinovʹevvv dimerizaciâecodammetilazyinducirovannaâoligonukleotidnymsubstratom AT malyginég dimerizaciâecodammetilazyinducirovannaâoligonukleotidnymsubstratom AT gorbunovûa dimerizaciâecodammetilazyinducirovannaâoligonukleotidnymsubstratom AT popovsg dimerizaciâecodammetilazyinducirovannaâoligonukleotidnymsubstratom AT nesterenkovf dimerizaciâecodammetilazyinducirovannaâoligonukleotidnymsubstratom AT burʹânovâi dimerizaciâecodammetilazyinducirovannaâoligonukleotidnymsubstratom |
| first_indexed |
2025-07-14T05:20:13Z |
| last_indexed |
2025-07-14T05:20:13Z |
| _version_ |
1837598416434102272 |
| fulltext |
11. Обратная транскриптаза из печени крыс: происхождение и вероятные функции/
В П. Томсонс, Г. Б. Пыринова, Н. П. Корохов и др. / / Докл. АН СССР.— 1983.—
272, № 6.—С. 1498—1501.
12. РНК-зависимая ДНК-полимераза из печени крыс / Г. Б. Пыринова, В. П. Томсонс,
Η. Н. Блинова, Р. И. Салганик//Молекуляр. биология.— 1984.—18, № 3.— С. 743—
750.
13. Шеррер к. Выделение РНК И изучение ее свойств с помощью центрифугирования
в градиенте плотности сахарозы//Методы вирусологии и молекуляр. биологии.—
М. : Мир, 1972.— С. 337—354.
14. Букринский М. И., Крамеров Д. А. Особенности транскрипции генов интрацистер-
нальных А-частиц//Вопросы вирусологии.— 1984—29, № 3,—С. 345—350.
15. Clemens Μ. J. Purification of eukaryotic messenger RNA//Transcription and transla-
tion, a practical approach / Eds B. D. Hames, S. J. Higgins —Oxford; Washington:
IRL press, 1984,— P. 211—230.
16. Маниатис ΤФрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование — М. : Мир, 1984.—
479 с.
17. Исследование трансляции полисомной поли-А-содержащей РНК печени крыс в бес-
клеточной белоксинтезирующей системе из зародышей пшеницы / С. Я. Головин,
В. Н. Чесноков, Η. Н. Блинова и д р . / / И з в . Сиб. отд-ния АН СССР.—1981,—
№ 2.—С. 115—121.
Ин-т цитологии и генетики Сиб. отд-ния АН СССР, Получено 03.06.86
Новосибирск
Ин-т биоорг. химии Сиб. отд-ния АН СССР, Новосибирск
У Д К 577.323
ДИМЕРИЗАЦИЯ Ecodam-метилазы,
ИНДУЦИРОВАННАЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫМ СУБСТРАТОМ
Н. И. Речкунова, В. В. Зиновьев, Э. Г. Малыгин, Ю. А. Горбунов,
С. Г. Попов, В. Ф. Нестеренко, Я. И. Бурьянов
Введение. При исследовании взаимодействия Ecodam-метилазы (К.Ф.2.1.1) с синтети-
ческими олигпнуклеотидными субстратами, содержащими различные дефекты в струк-
туре участка узнавания, было показано, что взаимодействие фермента с субстратом
происходило эффективно только в тех случаях, когда в обеих цепях участка узнавания
сохранялись GA-последовательности [1]. Эти данные позволили предположить, что
фермент-субстратный комплекс обладает симметрией второго порядка. Поскольку из-
вестно, что Ecodam-метилаза является мономерным белком [2], и ее первичная после-
довательность не содержит сколь-либо значимых гомологии [3], возникло предположе-
ние, что фермент способен образовывать симметричные олигомерные структуры в при-
сутствии субстрата. При изучении комплексообразования Ecodam-метилазы с синтети-
ческими олигонуклеотидами в растворе методом малоуглового рентгеновского рассея-
ния наилучшее соответствие между экспериментальными и расчетными данными было
получено для модели, учитывающей взаимодействие двух молекул фермента с молеку-
лой субстрата [4].
В настоящей работе методами гель-фильтрации и ультрацентрифугирования в гра-
диенте плотности сахарозы показано увеличение молекулярной массы фермента в при-
сутствии субстрата на величину, большую молекулярной массы субстрата.
Материалы и методы. Есосіат-метилазу выделяли, как описано в [5]. Олигонуклсо-
тиды синтезировали по триэфирному методу [6]. Ультрацентрифугирование проводили
в линейном градиенте плотности сахарозы 10—30 % [2]. Раствор сахарозы готовили в
буфере А (20 мМ К-фосфат, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ) с добавлением NaCl и
олигонуклеотидов до определенной концентрации. На градиент наслаивали 0,5 нмоль
Ecodam-метилазы в объеме 100 мкл. После центрифугирования градиент раскапывали
на фракции по 100 мкл и определяли активность фермента в каждой фракции. Для
этого отбирали аликвоты (20 мкл) и добавляли в каждую по 6 мкг ДНК спермы ло-
сося и 60 пмоль 3H-AdoMct. Смесь инкубировали 1 ч при 37 °С, дальнейшие процедуры
проводили, как описано ранее [1]. Молекулярную массу фермента определяли по ме-
тоду [7]. Положение маркерных белков в градиенте после центрифугирования опреде-
ляли по оптической плотности при 280 нм, измерения выполняли на микроспектрофото-
метре «Обь». Гель-фильтрацию проводили на колонке ( / = 1 0 см, ύί —0,3 см) с сефакри-
лом S-200 [8].
152 БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА.— 1987.—т. 3, №> 3
Результаты и обсуждение. Ранее было показано, что Есосіат-метилаза независимо
от концентрации белка в растворе является мономером с молекулярной массой около
25 ООО [5]. В присутствии S-аденозилметионина молекулярная масса фермента не изме-
няется [2], однако определение ее в присутствии ДНК не проводили. Мы ис-
пользовали в качестве субстрата 20-членный олигонуклеотидный дуплекс
5'-CAGTTTAGGATCCATTTCAC, в центре которого содержится участок узнавания фер-
GTCAAATCCTAGGTAAAGTG
мента GATC. Было обнаружено, что при центрифугировании Ecodam-метилазы в гра-
диенте плотности сахарозы, содержащем равномерно распределенный по объему 20-
членный дуплекс, наблюдается увеличение молекулярной массы фермента по сравне-
нию с градиентом без субстрата. По результатам центрифугирования молекулярная
Определение молекулярной массы Ecodam-метилазы ме-
тодом ультрацентрифугирования в градиенте плотности
сахарозы (10—30 %): 1 — нативный фермент в 0,1 Μ
NaCl; 2 — фермент в присутствии 1 мкМ 20-членного
дуплекса; 3 — фермент в присутствии 1 мкМ 20-членно-
го дуплекса в 0,1 Μ NaCl. Использованные маркерные
белки: а — бычий сывороточный альбумин (68 ООО); б —
овальбумин (45 ООО); в — химотрипсиноген (25 ООО);
г — миоглобин (17 800)
Determination of the molecular weight of Ecodam-methy-
lase by centrifugation in the sucrose density gradient
(10-30 %): 1 — native enzyme in 0.1 Μ NaCl; 2 — enzy-
me in the presence of double-stranded 20-hase long
deoxyribooligonucleotide; 3 — enzyme in the presence of
double-stranded 20-base long deoxyribooligonucleotide in
0.1 Μ NaCl. The used marker proteins: a — bovine serum
albumin (68 000); 6 — ovalbumin (45 000); в — chimo-
Irypsinogen (25 000); г —myoglobin (17 800)
масса Ecodam-метилазы равна 25 000 (рисунок), что соответствует литературным дан-
ным [5]. Добавление в градиент субстрата в концентрации 1 мкМ приводит к кажу-
щемуся увеличению молекулярной массы фермента до 46 000. Следует отметить, что
центрифугирование в отсутствие NaCl приводит к инактивации фермента, тогда как
при добавлении субстрата активность фермента сохраняется и кажущаяся молекуляр-
ная масса его равна 51 000. Уменьшение концентрации субстрата в градиенте до
0,1 мкМ, а также использование в качестве субстрата более короткого самокомплемен-
тарного октануклеотида 5'CGGATCCG в концентрации 1 мкМ (в расчете на дуплекс)
приводит к наблюдаемой молекулярной массе фермента 30 000—31 000 (данные не
приведены).
При гель-фильтрации Ecodam-метилазы на колонке с сефакрилом S-200, уравно-
вешенной буфером для элюции, содержащим 1 мкМ 20-членный дуплекс и 0,1 Μ NaCl,
подвижность фермента соответствует значению молекулярной массы 46 000, что пол-
ностью совпадает с результатом, полученным методом ультрацентрифугирования в гра-
диенте плотности сахарозы. Гель-фильтрация не позволяет установить молекулярной
массы фермента в отсутствие субстрата, поскольку имеет место аномальная подвиж-
ность фермента, что, возможно, связано с повышенным сродством фермента к носителю.
Наблюдаемое увеличение молекулярной массы Ecodam-метилазы в присутствии
субстрата на величину, большую молекулярной массы субстрата (•—• 14 000), можно
объяснить, учитывая равновесие между димерной формой фермента, связанного с
субстратом (E2S), И свободным ферментом (Е). Значение молекулярной массы комп-
лекса определяется соотношением количества фермента, находящегося в комплексе, и
свободного фермента. Таким образом, полученные результаты не противоречат возмож-
ности образования димерной формы фермента и согласуются с ранее полученными дан-
ными по исследованию взаимодействия Ecodam-метилазы с олигонуклеотидными cv6-
стратами методом малоуглового рентгеновского рассеяния [4].
Б И О П О Л И М Е Р Ы II К Л Е Т К А — 1987.—Т. 3, № 3 153
DIMERIZATION OF ECODAM-METHYLASE INDUCED
BY THE OLIGONUCLEOTIDE SUBSTRATE
N. I. Rechkunova, V. V. Zinoviev, E. G. Malygin, Yu. A. Gorbunov,
S. G. Popov, V. F. Nesterenko, Ya. I. Buriyanov
Ail-Union Research Institute of Molecular Biology, Koltsovo, Novosibirsk Region
Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms,
Academy of Sciences of the USSR, Pushchino, Moscow Region
S u m m a r y
The Ecodam-methylase has been investigated for its interaction with the 20-base oligo-
nucleotide duplex containing the enzyme recognition site. An increase of the enzyme mo-
lecular weight was detected by the gel-filtration and sucrose density gradient centrifu-
gation methods. The maximal value of the molecular complex weight was observed when
concentrations of the enzyme and the substrate were equal. The results obtained prove
the formation of the dimeric enzyme form in the substrate presence.
1. Действие ДНК-метилазы Ecodam на однонитчатые последовательности и синтетиче-
ские олигонуклеотиды / В. В. Зиновьев, Ю. А. Горбунов, С. Г. Попов и д р . / / М о л е -
куляр. биология.— 1985,—19, № 4.—С. 947—953.
2. Herman G. ΕModrich Ρ. Escherichia coli dam methylase. Physical and catalytic
properties of the homogeneous e n z y m e / / J . Biol. Chem.— 1982.—257, N 5.— P. 2605—
2612.
3. Brooks J. E., Blumenthal Ε. M., Gingeras T. R. The isolation and characterization of
the Escherichia coli DNA adenine methylase (dam) g e n e / / N u c l . Acids Res.— 1983.—
11, N 3.—P. 837—851.
4. Исследование стехиометрии комплексов при взаимодействии Ecodam-метилазы с суб-
стратами методом малоуглового рентгеновского рассеяния / В. В. Зиновьев, Ф. В. Ту-
зиков, Э. Г. Малыгин и др. / / Конформационные изменения биополимеров в раство-
рах : Материалы VI симпоз. (Тбилиси, 20—22 ноября 1985 г.).— Тбилиси, 1985.—
С. 56.
5. Бурьянов Я. И., Захарченко В. #., Баев А. А. Выделение, очистка и некоторые
свойства адениновой ДНК-метилазы Ecodam / / Д о к л . АН СССР.— 1981.—259, № 6.—
С. 1492—1495.
6. Hirose Т., Grea R., Itakura К. Rapid synthesis of trideoxyribonucleotide blocks / / Tet-
rahedron Lett.— 1978.— N 28.— P. 2449—2452.
7. Martin R. G., Ames B. N. A method for determining the sedimentation behavior of en-
zymes: application to protein m i x t u r e s / / J . Biol. Chem.— 1961.—236, N 5.— P. 1372—
1379.
8. Siegel L. M., Monty K. G. Determination of molecular weights and fractional ratios
of proteins in impure systems by use of gel filtration and density gradient centrifuga-
t ion / /Biochim. et biophys. acta.— 1966—112, N 2.—P. 346—362.
ВНИИ молекуляр. биологии, Кольцово Новосиб. обл. Получено 10.09.86
Ин-т биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР,
Пущино Москов. обл.
У Д К 576.315.42 + 577.175.642
ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ АДФ-РИБОЗИЛИРОВАНИЯ
В ХРОМАТИНЕ МОЗГА КРОЛИКА ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭСТРАДИОЛА
Г. А. Паносян, Э. Г. Саркисян, Э. С. Геворкян, Л. В. Карабашян
Известно, что ряд внутриядерных процессов зависит от степени АДФ-рибозилировапия
ядерных белков [1—3]. Несмотря на возрастающий интерес исследователей к этой
посттрансляционной модификации белков, ее роль в осуществлении основных функций
ядра остается неясной. Идентификация АДФ-рибозилированных белков, определение
уровня их модификации при различных функциональных состояниях клетки является
необходимым для понимания физиологического значения этого процесса. Изменение
степени АДФ-рибозилирования ядерных белков может сказаться на суперструктуре
хроматина и привести к изменению уровня его транскрибируемости. В этом аспекте
возможная взаимосвязь между уровнем АДФ-рибозилирования белков хроматина и
процессом гормональной активации генома представляется весьма вероятной.
154 Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА,— 1987,— т. З, .V-
|