Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro
В результате исследований, проведенных в условиях влияния фосфорорганического пестицида хлорофоса на хроматин клеток печени крыс in vivo (введение животным ) и in vitro (добавление к фракциям хроматина), выяснены некоторые молекулярные механизмы генотоксического действия этого яда. Противоположная н...
Saved in:
| Date: | 1996 |
|---|---|
| Main Authors: | , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1996
|
| Series: | Биополимеры и клетка |
| Online Access: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153925 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro / Е.Л. Левицкий, Ю.И. Губский, Р.Г. Примак, А.Г. Горюшко, А.Н. Марченко // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 3. — С. 77-90. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-153925 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1539252019-06-15T01:29:14Z Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro Левицкий, Е.Л. Губский, Ю.И. Примак, Р.Г. Горюшко, А.Г. Марченко, А.Н. В результате исследований, проведенных в условиях влияния фосфорорганического пестицида хлорофоса на хроматин клеток печени крыс in vivo (введение животным ) и in vitro (добавление к фракциям хроматина), выяснены некоторые молекулярные механизмы генотоксического действия этого яда. Противоположная направленность изменений под влиянием хлорофоса ряда показателей, характеризующих структуру хроматина in vivo и in vitro, позволяет утверждать, что введенный животным яд, скорее всего, модифицируется до ряда свободнорадикальных метаболитов, которые, в свою очередь, являются пусковым механизмом свободнорадикального повреждения хроматина вследствие изменения интенсивности переокисления входящих в его состав липидов, Перекисное повреждение хроматина выражается прежде всего в изменении структуры его ДНК и гистоновых белков, что влечет за собой искажение точности реализации генетической информации. В транскрипционно активном хроматине при этом снижается репликативная и растет транскрипционная активность, следствием чего является увеличение скорости включения метки в белки репрессированной фракции В модификацию функциональной активности хроматина, вызванную гено-токсическим действием хлорофоса, вносят свой вклад как изменение его матричных свойств, так и нарушение ферментативного аппарата репликации и транскрипции. У результаті досліджень, здійснених в умовах впливу фосфорорганічного пестициду хлорофосу на хроматин клітин печінки щурів in vivo (введення тваринам) та in vitro (додавання до фракцій хроматину), виявленодеякі молекулярні механізми генотоксичної дії цієї отрути. Протилежна направленість змін під впливом хлорофосу ряду показників, що характеризують структуру хроматину in vivo та in vitro, дозволяє стверджувати, що введена тваринам отрута, скоріш, за все, модифікується до ряду вільнорадикальних метаболітів, які, у свою чергу, є пусковим механізмом вільнорадикального пошкодження хроматину внаслідок зміни інтенсивності переокислення ліпідів, що входять до його складу. Перекисне пошкодження хроматину виражається, перш за все, у структурових змінах його ДНК та гістонових білків, що робить недостовірною реалізацію генетичної інформації. У транскрипційно активному хроматині при цьому знижується реплікативна та підвищується транскрипційна активність, що призводить до збільшення швидкості включення мітки у білки репресованої фракції. У модифікацію функціональної активності хроматину, яка зумовлена генотоксичною дією хлорофосу, роблять свій внесок як зміни його матричних властивостей, так і порушення ферментативного апарату реплікації та транскрипції. The in vivo (injections into rats) and in vitro (addition to the rat liver chromatin fractions) researches of genotoxic action of phosphororganic pesticide chlorophose perrnitted to reveal some molecular mechanisms of this one. The opposite direction of the changes of some parameters which are characterize the chromatin structure in vivo and in vitro permit to confirm that the poison which is injected to animals probably is modificated to a number of the free radical products, they are in them turn the starting mechanism of the free radical chromatin damage in result in the change of chromatin-bound lipids peroxidation. The developing in result of this the peroxidating chromatin damage is expressed first of all as its DNA and histories structure changes which involves the distortion of the genetic information realization. In this conditions the replicative activity is decreased and the transcriptional one is increased in the transcriptionally active chromatin which involves the increased label incorporation in the proteins of the repressed chromatin fraction. The change of the chromatin functional activity under the chlorophose genotoxic influence is depended on as the modification of the chromatin temp late features as the change of the replication and transcriptional enzymic apparatus. 1996 Article Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro / Е.Л. Левицкий, Ю.И. Губский, Р.Г. Примак, А.Г. Горюшко, А.Н. Марченко // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 3. — С. 77-90. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000431 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153925 615.357.631:577.157 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| description |
В результате исследований, проведенных в условиях влияния фосфорорганического пестицида хлорофоса на хроматин клеток печени крыс in vivo (введение животным ) и in vitro (добавление к фракциям хроматина), выяснены некоторые молекулярные механизмы генотоксического действия этого яда. Противоположная направленность изменений под влиянием хлорофоса ряда показателей, характеризующих структуру хроматина in vivo и in vitro, позволяет утверждать, что введенный животным яд, скорее всего, модифицируется до ряда свободнорадикальных метаболитов, которые, в свою очередь, являются пусковым механизмом свободнорадикального повреждения хроматина вследствие изменения интенсивности переокисления входящих в его состав липидов, Перекисное повреждение хроматина выражается прежде всего в изменении структуры его ДНК и гистоновых белков, что влечет за собой искажение точности реализации генетической информации. В транскрипционно активном хроматине при этом снижается репликативная и растет транскрипционная активность, следствием чего является увеличение скорости включения метки в белки репрессированной фракции В модификацию функциональной активности хроматина, вызванную гено-токсическим действием хлорофоса, вносят свой вклад как изменение его матричных свойств, так и нарушение ферментативного аппарата репликации и транскрипции. |
| format |
Article |
| author |
Левицкий, Е.Л. Губский, Ю.И. Примак, Р.Г. Горюшко, А.Г. Марченко, А.Н. |
| spellingShingle |
Левицкий, Е.Л. Губский, Ю.И. Примак, Р.Г. Горюшко, А.Г. Марченко, А.Н. Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro Биополимеры и клетка |
| author_facet |
Левицкий, Е.Л. Губский, Ю.И. Примак, Р.Г. Горюшко, А.Г. Марченко, А.Н. |
| author_sort |
Левицкий, Е.Л. |
| title |
Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro |
| title_short |
Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro |
| title_full |
Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro |
| title_fullStr |
Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro |
| title_full_unstemmed |
Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro |
| title_sort |
молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. исследования in vivo и in vitro |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1996 |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/153925 |
| citation_txt |
Молекулярные механизмы генотоксического действия хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro / Е.Л. Левицкий, Ю.И. Губский, Р.Г. Примак, А.Г. Горюшко, А.Н. Марченко // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 3. — С. 77-90. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT levickijel molekulârnyemehanizmygenotoksičeskogodejstviâhlorofosaissledovaniâinvivoiinvitro AT gubskijûi molekulârnyemehanizmygenotoksičeskogodejstviâhlorofosaissledovaniâinvivoiinvitro AT primakrg molekulârnyemehanizmygenotoksičeskogodejstviâhlorofosaissledovaniâinvivoiinvitro AT gorûškoag molekulârnyemehanizmygenotoksičeskogodejstviâhlorofosaissledovaniâinvivoiinvitro AT marčenkoan molekulârnyemehanizmygenotoksičeskogodejstviâhlorofosaissledovaniâinvivoiinvitro |
| first_indexed |
2025-07-14T05:20:37Z |
| last_indexed |
2025-07-14T05:20:37Z |
| _version_ |
1837598441796009984 |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1996. Т. 12. № 3
Молекулярные механизмы генотоксического действия
хлорофоса. Исследования in vivo и in vitro
Е, Л. Левицкий, Ю. И. Губский, Р. Г. Примак*,
А. Г. Горюшко, А. Н. Марченко
Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины
252057 Киев, ул. Эжена Потье, 14
В результате исследований, проведенных в условиях влияния фосфорорганическо-
го пестицида хлорофоса на хроматин клеток печени крыс in vivo (введение живо-
тным ) и in vitro (добавление к фракциям хроматина), выяснены некоторые моле-
кулярные механизмы генотоксического действия этого яда. Противоположная
направленность изменений под влиянием хлорофоса ряда показателей, характе-
ризующих структуру хроматина in vivo и in vitro, позволяет утверждать, что
введенный животным яд, скорее всего, модифицируется до ряда свободноради-
кальных метаболитов, которые, в свою очередь, являются пусковым механиз-
мом свободнорадикального повреждения хроматина вследствие изменения ин-
тенсивности переокисления входящих в его состав липидов, Перекисное повреж-
дение хроматина выражается прежде всего в изменении структуры его ДНК и
гистоновых белков, что влечет за собой искажение точности реализации генети-
ческой информации. В транскрипционно активном хроматине при этом снижа-
ется репликативная и растет транскрипционная активность, следствием чего
является увеличение скорости включения метки в белки репрессированной фрак-
ции В модификацию функциональной активности хроматина, вызванную гено-
токсическим действием хлорофоса, вносят свой вклад как изменение его матрич-
ных свойств, так и нарушение ферментативного аппарата репликации и транс-
крипции.
Введение. В загрязнении окружающей среды фосфорорганическим соедине-
ниям (ФОС) принадлежит весьма значительное место, что обусловлено
широким применением этих веществ в промышленности, сельском хозяйст-
ве и быту. Ранее нами было показано повреждающее действие ФОС на
фракции репрессированного (РХ) и транскрипционно активного (TAX)
хроматина печени крыс в условиях in vivo (при отравлении животных)
[1—3]. Генотоксическое действие ФОС проявлялось в модификации свобод-
норадикальных реакций переокисления хроматинсвязанных липидов (ПОЛ)
и изменении структурно-функциональной организации РХ и TAX.
Однако при этом остался невыясненным ряд важных вопросов. Прежде
всего, для доказательства свободнорадикальной природы повреждений хро-
матина под влиянием ФОС необходимы сведения о соотношении во времени
изменений ГІОЛ и параметров, характеризующих структурно-функциональ-
ную организацию хроматина. Необходимо также выяснить, различается ли
степень генотоксических повреждений РХ и TAX, учитывая различную
структурно-функциональную организацию этих фракций [4] и различное
•Correspondence address.
© Е. Л. ЛЕВИЦКИЙ, ю . и . ГУБСКИЙ Р. Г ПРИМАК, А. Г. ГОРЮШКО, А. Н. МАРЧЕНКО, 1996
77
ЛЕВИЦКИЙ Е Л И ДР
содержание в них липидов [5 ], являющихся субстратом ПОЛ [6 ]. Необхо-
димо также ответить на вопрос, какие из основных компонентов хроматина
(ДНК, белки, липиды) изменяют свою структурную организацию при
действии на хроматин ФОС. И, наконец, обусловлено ли генотоксическое
действие ФОС опосредованным или непосредственным влиянием на ядер-
ный геном?
Целью настоящей работы и Явилось исследование этих вопросов на
примере генотоксического действия одного из представителей ФОС — хло-
рофоса (ХФ).
Материалы и методы. В работе использовали крыс-самцов линии
Вистар трехмесячного возраста (150—200 г), содержащихся в стандартных
условиях вивария.
В опытах in vivo ХФ вводили внутримышечно в дозе 260 мг/кг массы
тела животного, что сответствует 1 ЛД50 для данной популяции животных
[3]. Анализ проводили через 10 мин, 2 и 24 ч после введения яда.
Фракции РХ и TAX из интактных и интоксицированных животных
выделяли по методу [7 ] с некоторыми модификациями, как описано в [4 J,
Функциональную активность хроматина оценивали по его репликативной
и транскрипционной активности в условиях in vivo. Оценивали также
скорость синтеза белков, входящих в состав РХ и TAX. 14С-оротат
(900 МБк/ммоль, «Reanal», Венгрия) и 14С-лейцин (1,9 ТБк/моль, «Изо-
топ», СССР) вводили внутрибрюшинно за 30 мин до декапитации в дозе 1,0
и 1,3 МБк/кг массы тела соответственно. 3Н-тимидин (848 ТБк/моль,
«Изотоп», СССР) вводили внутрибрюшинно за 1 ч до декапитации в дозе
236 МБк/кг массы тела. Радиоактивность определяли по методу [5].
Результаты выражали в расп/мин на 1 мг ДНК или белка хроматина.
Остальные модели и методы исследования фракций хроматина при
действии ХФ in vivo описаны ранее [1—6, 8]. В исследованиях in vitro
ХФ добавляли непосредственно к РХ и TAX (концентрация по белку
2,28 мг/мл) до конечных концентраций 105 и 107 М и инкубировали в
течение 1 ч при 37 °С. Для определения вклада отдельных компонентов
хроматина (ДНК, белки, липиды) в процесс взаимодействия с ядом исполь-
зовали модельные системы, содержащие коммерческие препараты ДНК
(1 мг/мл), ЧСА (3 мг/мл) («Serva», Германия) и липосомы из лецитина
(10 мг/мл). Условия взаимодействия этих систем с ХФ in vitro аналогичны
таковым для РХ и TAX,
Для изучения воздействия ХФ на состояние ПОЛ в липосомах из
лецитина в условиях in vitro липосомы с индексом окисленносги липида
0,315 и те же липосомы при добавлении ХФ в концентрации 10 7 и 10° М
выдерживали при 37 °С, отбирая через 10 мин и 24 ч аликвоты растворов
для измерения спектров поглощения в области 200—250 нм.
Полученные экспериментальные данные обрабатывали методами непа-
раметрической статистики [9],
Результаты и обсуждение. Ядерный хроматин клеток млекопитающих
содержит небольшое количество липидов, отличающихся по составу от
липидов мембран [10 |. Состав хроматинсвязанных липидов изменяется под
действием повреждающих факторов [11, 12]. Подобные изменения сопро-
вождаются модификацией интенсивности липопереокисления хроматинсвя-
занных липидов [13 ]. Ранее была показана специфика реакций спонтанного
и индуцированного ПОЛ в РХ и TAX по сравнению с аналогичными
реакциями в биомембранах [14], что в ряде случаев вызывало свободнора-
дикальное повреждение хроматина [131.
В условиях интоксикации животных ХФ также наблюдается модифика-
ция интенсивности реакций НАДФН- и аскорбат-индуцированного (оцени-
ваемого по скорости накопления одного из конечных продуктов переокисле-
78
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ХЛОРОФОСА
ния — малонового диальдегида и его производных, табл. 1) и спонтанного
(оцениваемого по концентрации промежуточных продуктов липопереокис-
ления — диеновых конъюгатов, табл. 2) ПОЛ. Первоначально изменения
ПОЛ обнаруживаются во фракции TAX: через 10 мин после введения яда в
этой фракции наблюдается рост интенсивности реакций индуцированного
НАДФН ПОЛ, а также спонтанного ПОЛ (концентрации диеновых конъю-
гатов в гептановом и изопропанольном слоях липидного экстракта, куда
экстрагируются нейтральные липиды и фосфолипиды соответственно). С
увеличением времени интоксикации степени модификации ПОЛ в хромати-
Габлица I
Скорость накопления малонового диальдегида и его производных во фракциях хроматина
печени интактных и интоксицированных хлорофосом крыс (нмоль/мг белка за 2 ч, п=Ь—9)
П р и м е ч а н и е . Значения НЗП, НЗП, Л и АЗП приведены с учетом вычитания
соответствующих значений неинициированного контроля из суммарной величины данного
показателя; НЗП — НАДФН-зависимое ПОЛ; НЗП, А — его составляющая, зависимая от
нагревания; АЗП — аскорбат-зависимое ПОЛ; *р < 0,05 (по сравнению с контролем).
Таблица 2
Содержание диеновых конъюгатов во фракциях хроматина печени интактных и
интоксицированных хлорофосом крыс ( нмоль! мг белка, пг-4—6)
П р и м е ч а н и е . См. табл. 1.
79
ЛЕВИЦКИЙ Е. Л. И ДР.
не возрастает: теперь уже изменения обнаруживаются и в РХ. Через 2 ч
после введения животным яда интенсивность спонтанного ПОЛ снижается
как в TAX, так и в РХ (за счет переокисления нейтральных липидов
хроматина, см. табл. 2). Интенсивность реакций НАДФН-индуцированного
и неинициированного ПОЛ резко повышена по сравнению с контролем в РХ
через 2 и 24 ч после введения ХФ, а аскорбат-индуцированного ПОЛ —
снижена через 24 ч в TAX (см. табл. 1). При этом степень изменения
индуцированного под влиянием ХФ ПОЛ в эти сроки интоксикации намного
более выражена в РХ по сравнению с TAX. Таким образом, отравление
экспериментальных животных ХФ приводит к выраженной модификации
реакций спонтанного и индуцированного ПОЛ во фракциях РХ и TAX
печени крыс, изменения в этом случае обнаруживаются раньше в активной
фракции хроматина. Однако с течением времени интоксикации степень
выраженности изменений ПОЛ нарастает быстрее в низкоактивной фрак-
ции, причем пик этих изменений находится в пределах 2 ч после введения
животным яда. Несортветствие в ряде случаев между направленностью
изменений спонтанного и индуцированного ПОЛ в хроматине под влиянием
ХФ (см. табл. 1 и 2) может быть обусловлено возможными резкими
сдвигами в жирнокислотном составе входящих в состав фракций хроматина
липидов под влиянием интоксикации ХФ, что было показано нами ранее на
Таблица 3
Включение меченых предшественников синтеза нуклеиновых кислот (расп/ мин на 1 мг
ДНК) и белков (расп! мин на 1 мг белка) во фракциях хроматина печени интактных и
интоксииированньїх в течение 24 ч крыс (rtr4—l3)
П р и м е ч а н и е . См. табл. 1.
80
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ХЛОРОФОСА
примере интоксикации тетрахлорметаном и Е-гиповитаминоза [12]. Пере-
кисная модификация структурно-функциональной организации фракций
хроматина проявляется в резком изменении его функциональной активно-
сти через 24 ч после введения животным ХФ (табл. 3). Под влиянием яда
более чем в 2 раза снижается интенсивность синтеза ДНК и приблизительно
в 1,5 раза возрастает величина транскрипционной активности в TAX, что
сопровождается увеличением в 1,3 раза уровня включения 14С-лейцина в
белки РХ. Подобные нарушения функциональной активности фракций
хроматина под влиянием интоксикации животных ХФ хорошо коррелируют
с изменениями активности ферментов синтеза ДНК и РНК в хроматине —
ДНК- и РНК-полимераз (табл. 4 и 5). Через 10 мин и 24 ч после введения
яда экспериментальным животным в TAX снижается тотальная ДНК-поли-
меразная активность вследствие уменьшения активности репликативной
ДНК-полимеразы а и репаративной ДНК-полимеразы р. Увеличение транс-
крипционной активности TAX через 24 ч после введения ХФ (см. табл. 3)
обусловлено ростом активности РНК-полимеразы I, ответственной за синтез
рибосомной РНК в хроматине (см. табл. 5). В РХ через 2 ч после введения
животным яда обнаружены разнонаправленные изменения активности эндо-
генных РНК-полимераз: увеличение — для РНК-полимеразы I и сниже-
ние — для РНК-полимеразы II, в результате чего суммарная РНК-полиме-
разная активность этой фракции остается неизменной во все исследованные
сроки после введения животным яда (см. табл. 5). Степень транскрипцион-
ной активности РХ в условиях интоксикации животных также остается
неизменной (см. табл. 3).
В основе перекисной модификации функций хроматина, вызванной
интоксикацией животных ХФ, могут лежать нарушения структуры основ-
ных его компонентов: ДНК, белков и липидов. Под влиянием интоксикации
через 24 ч после введения животным яда увеличивается доля TAX и
соответственно снижается — РХ (табл. 6), что является одной из предпосы-
лок увеличения транскрипционной активности TAX (см. табл. 3) наряду с
возрастанием активности эндогенных РНК-полимераз (см. табл. 5). Во
фракциях РХ через 24 ч после введения животным ХФ снижается отноше-
Л Е В И Ц К И Й £ Л И ДР
ние белок/ДНК (см. табл. 6). Не исключено, что подобное снижение может
быть вызвано уменьшением количества РНК-полимеразы II, активность
которой в этот период интоксикации почти в 10 раз меньше по сравнению
с контролем (см. табл. 5). Подобные общие нарушения структуры РХ и TAX
могут быть вызваны изменением структуры их отдельных компонентов.
В табл. 7 приведены результаты нуклеазного зондирования фракций
хроматина эндо- и экзогенными ДНКазами через 24 ч после введения яда
экспериментальным животным. ДНК обеих фракций хроматина отравлен-
ных животных отличается по чувствительности к расщеплению как эндо-,
так и экзогенными нуклеазами по сравнению с ДНК контрольных. Так, в
условиях интоксикации животных ДНК TAX расщепляется эндогенными
ДНКазами хроматина в 1,5 раза менее интенсивно по сравнению с
контролем. Менее чувствительной оказывается ДНК TAX печени интокси-
цированных животных по сравнению с контрольными и в условиях перева-
ривания экзогенными ДНКазами. Так, кратковременное переваривание
ДНКазой I (5 мин) при комнатной температуре расщепляет 10,5 % ДНК
печени контрольных крыс и не приводит к появлению кислоторастворимой
Таблица 6
Соотношение между фракциями и отношение белок/ ДНК в хроматине печени интактных и
интоксицированных хлорофосом крыс(пг6—9)
М< >ЛЬК УЛЯРНЫН МЕХАНИЗМЫ ЛЕЙС I ВИЯ ХЛОРОФОС А
радиоактивности у интоксицированных. В условиях более жесткого перева-
ривания ДНКазой I (15 мин, 37 °С) степень переваривания ДНК TAX
увеличивается и не отличается у. контрольных и отравленных животных.
Сравнивая эти результаты, можно сделать вывод о том, что в данном случае
подобная «компактизация» структуры ДНК TAX в условиях интоксикации
ХФ не имеет жестких структурных ограничений и, вероятно, обусловлена
либо незначительной суперспирализацией нуклеосомной (линкерной) ДНК,
либо образованием сшивок ДНК — белок. Подобное предположение под-
тверждается результатами расщепления ДНК TAX Брнуклеазой, избира-
тельно переваривающей однонитчатые участки ДНК. В условиях интокси-
кации ХФ количество этих участков снижается по сравнению с контролем
как в нативной, так и в денатурированной ДНК. Если в первом случае
фактор повышенной спирализации может вносить свой вклад в повышение
степени устойчивости ДНК TAX интоксицированных животных к фермен-
ту, то в условиях денатурации, приводящей к исчезновению вторичной
структуры, имеет значение только количество сшивок ДНК— белок. Тем
не менее, в компактизации структуры ДНК TAX в условиях интоксикации,
по-видимому, участвуют оба эти фактора, о чем свидетельствует меньшая
величина различий в устойчивости к расщеплению Брнуклеазой между
контрольными и опытными образцами в условиях денатурации и без нее (в
4,4 и 5,3 раза соответственно), хотя вклад в этот процесс увеличения
суперспирализации оказывается незначительным.
Что касается фракции РХ, то, наоборот, интоксикация животных ХФ
приводит к релаксации структуры ДНК этой фракции (см. табл. 7). Причем
здесь, во-первых, различия между контрольными и опытными животными
не столь очевидны, как в случае TAX, и, во-вторых, они обусловлены, по
всей вероятности, ослаблением ДНК-белковых контактов при интоксикации
ХФ (поскольку различия в чувствительности к Sj-нуклеазе проявляются
только в условиях денатурации). При действии ХФ на организм в РХ
увеличивается количество как двуспиральной ДНК (свободной от связи с
белками), так и потенциально односпиральных участков (проявляющихся в
условиях денатурации), которые в интактном хроматине недоступны дейст-
вию фермента ввиду структурных ограничений, обусловленных увеличени-
ем степени спирализации.
Структурная компактизация ДНК в составе TAX и релаксация в
составе РХ в условиях отравления животных ХФ подтверждается результа-
тами флюоресцентного зондирования этих фракций бромистым этидием
(табл. 8). Так, константа связывания зонда с РХ отравленных животных
выше по сравнению с интактными в 1,4 раза с одновременным уменьшени-
ем числа мест связывания (в 1,3 раза). Это свидетельствует о релаксации
структурной упаковки ДНК, сопровождающейся образованием более проч-
ных по сравнению с контролем комплексов, по-видимому, в результате
увеличения степени электрического взаимодействия катиона бромистого
этидия с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК. В TAX
интоксикация ХФ не приводит к достоверным изменениям константы и
числа мест связывания с бромистым этидием. Вероятно, структурная ком-
пактизация ДНК TAX в условиях интоксикации животных ХФ не сказыва-
ется на степени встраивания зонда, так как ДНК в составе TAX менее
доступна взаимодействию с бромистым этидием (см. табл. 8) ввиду более
интенсивных относительно РХ ДНК-белковых контактов [4 ].
Таким образом, результаты проведенныхх исследований свидетельству-
ют о том, что при интоксикации животных ХФ вызывает значительные
нарушения структурной организации ДНК в составе обеих фракций хрома-
тина. В целом эти нарушения проявляются в структурной релаксации ДНК
в TAX и ее компактизации — в РХ, что может быть вызвано изменением
83
ЛЕВИЦКИЙ Е Л. И ДР
Таблица 8
Физико-химические характеристики фракций хроматина интактных и интоксицированных
хлорофосом крыс ( пгЗ—Л)
П р и м е ч а н и е . См. табл. 1.
степени спирализации и количества ДНК-белковых контактов. При этом
генотоксическое действие ХФ проявляется в большей мере на ДНК TAX по
сравнению с РХ, что находит свое отражение в изменении функциональной
активности TAX, прежде всего, процессов репликации и транскрипции (см.
табл. 3—5).
Что касается белкового компонента хроматина, то в условиях интокси-
кации животных ХФ наблюдается некоторое «разрыхление» структуры
белков РХ и TAX, о чем свидетельствуют данные собственной белковой
флюоресценциии (рисунок). Подтверждением этих данных являются ре-
зультаты флюоресцентного зондирования отдельных групп белков хромати-
на — гистонов и негистоновых белков в условиях отравления животных ХФ
(см. табл. 8). Результаты флюоресцентного зондирования гистоновых белков
флюорескамином показывают, что интоксикация ХФ приводит к возраста-
нию степени встраивания зонда в гистоны РХ и TAX в 1,7 и 1,2 раза
соответственно. Из этого следует, что структура гистоновых белков под
влиянием ХФ претерпевает такие изменения, в результате которых количе-
ство доступных для флюорескамина положительно заряженных є-ами-
ногрупп лизиновых остатков возрастает.
Относительно негистоновых белков, то приведенные в табл. 8 константы
Интенсивность собственной белковой флюо-
ресценции препаратов фракций хроматина
печени интактных и интоксицированных в
течение 2 ч крыс: 1, 2 — РХ; 3, 4 — TAX;
А 3 — контроль; 2, 4 — опыт
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ХЛОРОФОСА
тушения акриламидом, рассчитанные из графиков Штерна — Фольмера,
свидетельствуют о том, что интоксикация животных ХФ приводит к
некоторому возрастанию данного показателя в обеих фракциях хроматина,
т. е. к разрыхлению структуры этих белков, обеспечивающему большую
доступность молекул тушителя флюоресцентным центрам.
Липиды хроматина, являющиеся одним из основных его компонентов
14, 10, 111 и участвующие в формировании структуры нуклеопротеидного
комплекса [15], первыми отвечают изменением реакций перекисного окис-
ления на интоксикацию ХФ (см. табл. 1, 2). Тем не менее, структура
липидного бислоя при этом изменяется незначительно. Так, при введении
ХФ в условиях in vivo эксимеризация пирена во фракциях хроматина
составляла: в РХ 36 и 28 усл. ед. (контроль и опыт соответственно), в TAX
— 40 и 50. Не исключено, что основные структурные перестройки ХФ
вызывает в условиях in vivo в липидах биомембран клеток-мишеней, где,
возможно, происходит его превращение с образованием активных метаболи-
тов, которые в дальнейшем приводят к повреждению ядерного хроматина,
как было показано нами ранее на примере тетрахлорметана [16].
Подтверждением предположения о том, что не сам хлорофос, а его
активные метаболиты вызывают повреждения ядерного хроматина клеток-
мишеней в условиях in vivo, являются результаты экспериментов, в которых
ХФ добавляли непосредственно к фракциям РХ и TAX. Они свидетельству-
ют о разнонаправленное™ изменений in vivo и in vitro под влиянием яда
ряда физико-химических показателей, характеризующих структуру хрома-
тина.
В табл. 9 приведены физико-химические характеристики фракций
хроматина, отражающие модификации состояния различных его компонен-
тов при добавлении ХФ in vitro. Как можно видеть, ДНК хроматина не
претерпевает существенных изменений под воздействием ХФ, поскольку
степень встраивания бромистого этидия в TAX не изменяется, а в РХ
наблюдается лишь некоторая тенденция к ее снижению. Тем не менее, в
условиях in vivo (см. табл. 8) аналогичные показатели под влиянием ХФ
заметно изменяются.
Таблица 9
Влияние экзогенного хлорофоса на физико-химические характеристики фракции
изолированного хроматина (rv-5 )
f '
ЛЕВИЦКИЙ E. Л. И ДР
Общая структура белкового компонента хроматина, оцениваемая по
интенсивности собственной белковой флюоресценции, под влиянием экзо-
генного ХФ так же, как и в условиях in vivo (см. рисунок), нарушается
незначительно. Однако, если in vivo наблюдалось небольшое возгорание
флюоресценции в обеих фракциях хроматина печени интоксицированных
животных по сравнению с интактными, то in vitro подобное возгорание
регистрируется только в TAX, в то время как в РХ, наоборот,, этот
показатель снижается. 1
Состояние негистоновых белков при воздействии ХФ на хроматин in
vitro также практически не изменяется, поскольку различия в константах
Штерна — Фольмера (при тушении собственной флюоресценции акрилами-
дом), характеризующих подвижность этих белков, находятся в пределах
ошибки эксперимента как в РХ, так и в TAX. При этом вероятность
переноса энергии с белка на пирен, а также доля белков, участвующих в
этом процессе, тоже остаются без изменения в обеих фракциях хроматина,
свидетельствуя о том, что расстояние между белковыми хромофорами и
местами локализации молекул пирена, так же как и состав белков,
остаются неизменными. Однако в условиях in vivo константа тушения
акриламидом под влиянием интоксикации ХФ достоверно изменялась в
обеих фракциях хроматина (см. табл. 8).
Наиболее существенные ^изменения в условиях in vitro претерпевают
шстоновые белки: степень встраивания флюорескамина уменьшается для
РХ в 4,8 раза, для TAX — в 11,5 раза при инкубации с ХФ (10 7 М), причем
дальнейшее увеличение его концентрации уже не сказывается на встраива-
нии зонда. Интересно отметить, что если несколько изменить условия
эксперимента и образцы фракций хроматина сначала проинкубировать с
флюорескамином, а затем добавлять к ним ХФ, то наблюдается несколько
иная картина по сравнению с вышеописанной, где первичной была обработ-
ка ХФ. В этом случае интенсивность флюоресценции флюорескамина
уменьшается по сравнению с контрольными значениями (см. табл. 9) в РХ
всего на 1,9 и 3,8 %, а в TAX — на 5,6 и 8,4 % при добавлении ХФ до
концентрации 107 и 10° М соответственно. Из этого следует, что места
связывания в гистоновых белках хрматина заняты флюорескамином и
становятся практически недоступными для ХФ. Последнее обстоятельство
доказывает принципиальную возможность защиты гистоновых белков хро-
матина от высокотоксичного воздействия ХФ. Если сравнить данные резуль-
таты с опытами in vivo (см. табл. 8), то можно видеть, что различия в
показателях, характеризующих структурное состояние гистоновых белков
под влиянием ХФ в этих двух сериях экспериментов, носят прямо противо-
положный характер.
Липидная составляющая фракций хроматина при добавлении ХФ in
vitro, так же как и в опытах in vivo (см. табл. 8), претерпевает незначи-
тельные изменения, носящие разнонаправленный характер: в РХ наблюда-
ется тенденция к возрастанию интенсивности полосы эксимеров пирена, а
в TAX — к ее снижению. Это происходит вследствие того, что ХФ вызывает
незначительное снижение микровязкости липидов в РХ и некоторое ее
увеличение — в TAX. Изменения этих же показателей при действии ХФ in
vivo имеют противоположную направленность. В условиях действия ХФ на
хроматин in vivo в нем изменяется в значительной степени интенсивность
процессов ПОЛ (см. табл. 1 и 2), Протекание процессов ПОЛ в модельных
системах под действием экзогенного ХФ, в отличие от влияния последнего
на эти процессы в хроматине ъ условиях in vitro, нарушается незначитель-
но. В табл. 10 приведены значения оптической плотности спиртовых
растворов лецитина, приготовленных из липосом в отсутствие ХФ и после
24 ч инкубации с ХФ. Из приведенных данных следует, что ХФ in vitro
86
вызывает разнонаправленные изменения ПОЛ в липосомах: в концентрации
107 М он ингибирует процесс ПОЛ, при этом индекс окисленности (/)
ниже, чем для липосом в отсутствие ХФ через 24 ч инкубации. В то же
время для липосом, инкубированных в среде ХФ при концентрации 10 5 М,
имеет место значительное повышение величины / , свидетельствующее о
накоплении продуктов ПОЛ. Таким образом, из проведенных исследований
следует, что ХФ, в отличие от влияния на процессы ПОЛ хроматина в
условиях in vivo, в модельных системах в зависимости от концентрации
вызывает неоднозначные изменения этих реакций. Индукция ПОЛ наблю-
дается только в условиях высоких концентраций экзогенного ХФ, которые
вряд ли присутствуют в клетках-мишенях.
Для объективной оценки полученных нами результатов по взаимодей-
ствию ХФ с компонентами хроматина в составе его фракций дополнительно
были проведены эксперименты по взаимодействию яда с модельными
системами in vitro. В качестве модели ДНК, входящей в состав фракций
хроматина, был взят коммерческий препарат ДНК тимуса теленка, белков
- ЧСА, а липидной составляющей — фосфатйдилхолиновые липосомы.
Результаты влияния экзогенного ХФ на физико-химические характеристи-
ки модельных систем приведены в табл. 11. Как можно видеть, в случае
коммерческого препарата ДНК ХФ при малых концентрациях не влияет
заметно на значения кажущихся констант ассоциации и числа мест связы-
вания с бромистым этидием и лишь при концентрации яда 10 5 М рассмат-
риваемые показатели возрастают. Это гюдтверж.<а-.:т /данные о том. что в
Н 7
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ Д Е Й С Т В И Я Х Л О Р О Ф О С А
Габлица 10
Величины оптических плотностей DiV> и D2j>i растворов лецитина в спирте, а пшкже индексы
окис;и?нности 1 до и после инкубации в среде с хлорофосом (п-5)
Условия эксперимента Спектральные параметры
П:і2 __»233 у-р233/р212
Липосомы, 10 мин 1,05 0,33 0,315
Липосомы + 10 7 М хлорофос, 24 ч 0,81 0,28 0,346
Липосомы + 10 5 М хлорофос, 24 ч 0,81 0,41 0,505*
Липосомы, 24+ч (контроль) 0,955 0,34 0,373
П р и м е ч а н и е. См. табл. 1
Таблица И
Влияние экзогенного хлорофоса на физико-химические характеристики модельных систем
(п-5)
^иггем^в* Показатель Концентрация хлорофоса. М
0 II}"7 10 5
ДНК Константа связывания с броми-
стым этидием, г • л 32С4 28±3 68± 10*
Число мест связывания с броми-
стым этидием, моль/мг 6 5 <У,
ЧСА Константа Штерна—Фольме-
ра, М ! 5,5 8,4 7,5
Липосомы Интенсивность полосы эксиме-
ров пирена, усл. ед. 81 67 67
П р и м е ч а н и е . См. табл. 1.
ЛЕВИЦКИЙ Е Л И ДР
отличие от условий in vivo в условиях in vitro ДНК не является мишенью
для действия ХФ.
Воздействие ХФ на ЧСА сопровождается незначительным увеличением
значений констант Штерна — Фольмера тушения акриламидом, т. е. и в
модельных системах белки (так же^как негистоновые белки в составе
фракций хроматина) не подвержены действию этого яда.
В липосомах под действием ХФ наблюдается некоторое уменьшение
интенсивности полосы эксимеров пирена, аналогично подобному эффекту в
TAX. По-видимому, структура липидного бислоя в РХ и TAX под влиянием
как эндо-, так и экзогенного ХФ не претерпевает значительных перестроек,
хотя вызываемые метаболитами ХФ in vivo изменения интенсивности
реакций спонтанного и индуцированного переокисления хроматинсвязанных
липидов являются одним из первичных звеньев в сложной цепи молекуляр-
ных событий, определяющих генотоксический эффект ХФ in vivo. Подобный
вывод вытекает из данных о том, что модификация реакций ПОЛ в
хроматине под влиянием введенного животным ХФ предшествует по време-
ни нарушению его структурно-функциональной организации.
Таким образом, результаты проведенных исследований позволили обна-
ружить некоторые молекулярные механизмы генотоксического действия
ХФ. Введенный экспериментальным животным яд метаболизируется, по
всей вероятности, по аналогии с тетрахлорметаном [16] в мембранах
эндоплазматического ретикулума клеток печени. Как следствие, возникают
свободнорадикальные метаболиты самого ХФ и, возможно, кислорода,
вызывающие дальнейшее развитие свободнорадикальной патологии, моди-
фицируя реакции спонтанного и индуцированного переокисления хроматин-
связанных липидов. Происходящее при этом перекисное повреждение хро-
матина реализуется, кроме того, за счет прямого связывания свободноради-
кальных метаболитов ХФ с гистоновыми белками хроматина. В результате
этого изменяется структура нуклеопротеидного комплекса, что находит свое
отражение в структурной релаксации ДНК в РХ и ее компактизации — в
TAX. Вызываемое структурными пертурбациями нуклеопротеидного комп-
лекса свободнорадикальное искажение функциональной активности TAX
неоднозначно, оно характеризуется снижением репликативной и увеличени-
ем транскрипционной активности, что влечет за собой интенсификацию
синтеза белков РХ. Не исключено, что в подобную модификацию функци-
ональной активности хроматина вносят свой вклад как изменения ,его
матричных свойств, так и структурные нарушения ферментативного аппа-
рата репликации и транскрипции.
Итак, проведенные исследования позволили ответить на вопросы, сфор-
мулированные в начале работы:
1. Изменения реакций ПОЛ в хроматине под влиянием введенного
экспериментальным животным ХФ предшествуют по времени нарушению
структурно-функциональной организации ядерного генома, что наряду с
полученными ранее данными о непосредственном влиянии этих реакций на
такую организацию [17] является доказательством свободнорадикальной
природы генотоксического действия данного яда.
2. Фракция TAX в большей степени подвержена генотоксическому
действию ХФ по сравнению с РХ.
3. Мишенями генотоксического действия введенного животным ХФ
являются ДНК и гистоновые белки хроматина.
4. Генотоксическое действие, вероятно, опосредуется его свободноради-
кальными метаболитами, а также свободными радикалами кислорода, обра-
зующимися в условиях интоксикации в мембранах эндоплазматического
ретикулума печени.
88
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ХЛОРОФОСА
Є. Л. Левицький, Ю. I. Губський, Р. Г. Примак, Г. Г. Горюшко, О. М. Марченко
Молекулярні механізми генотоксичної дії хлорофосу. Дослідження in vivo та in vitro
Резюме
У результаті досліджень, здійснених в умовах впливу фосфорорганічного пестициду хлорофосу на
хроматин клітин печінки щурів in vivo (введення тваринам) та in vitro (додавання до фракцій
хроматину), виявленодеякі молекулярні механізми генотоксичної дії цієї отрути. Протилежна
направленість змін під впливом хлорофосу ряду показників, що характеризують структуру
хроматину in vivo та in vitro, дозволяє стверджувати, що введена тваринам отрута, скоріш, за
все, модифікується до ряду вільнорадикальних метаболітів, які, у свою чергу, є пусковим
механізмом вільнорадикального пошкодження хроматину внаслідок зміни інтенсивності
переокислення ліпідів, що входять до його складу. Перекисне пошкодження хроматину
виражається, перш за все, у структурових змінах його ДНК та гістонових білків, що робить
недостовірною реалізацію генетичної інформації. У транскрипційно активному хроматині при
цьому знижується реплікативна та підвищується транскрипційна активність, що призводить
до збільшення швидкості включення мітки у білки репресованої фракції. У модифікацію
функціональної активності хроматину, яка зумовлена генотоксичною дією хлорофосу, роблять
свій внесок як зміни його матричних властивостей, так і порушення ферментативного апарату
реплікації та транскрипції
Е. L. Levitsky, Yu. I. Gubskiy, R. G. Primak, A. G. Goryushko, A. N. Marchenko
The molecular mechanisms of genotoxic action of chlorophose. The in vivo and in vitro investigations
Summary
The in vivo (injections into rats) and in vitro (addition to the rat liver chromatin fractions) researches of
genotoxic action of phosphor organic pesticide chlorophose perhiitted to reveal some molecular
mechanis ms of this one. The opposite direction of the changes of some parameters which are characterize the
chromatin structure in vivo and in vitro permit to confirm that the poison which is injected to animals
probably is modificated to a number of the free radical products, they are in them turn the starting
mechanism of the free radical chromatin damage in result in the change of chromatin-bound lipids
peroxidation. The developing in result of this the peroxidating chromatin damage is expressed first of all as
its DNA and histones structure changes which involves the distortion of the genetic information realization.
In this conditions the replicative activity is decreased and the transcriptional one is increased in the
transcriptionally active chromatin which involves the increased label incorporation in the proteins of the
repressed chromatin fraction. The change of the chromatin functional activity under the chlorophose
genotoxic influence is depended on as the modification of the chromatin template features as the change of
the replication and transcriptional enzymic apparatus.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Губський Ю. I., Левицький Є. Л., Примак Р. Г. Біохімічні механізми пошкодження
ядерного хроматину хлорофосом / / Укр. біохім. з'їзд: Тез. доп.— Київ: Вид-во УСГА,
1992.—С. 31.
2 Губский Ю. ИЛевицкий Е. Л., Примак Р. Г. и др. Изменение структуры и реакций
липопереокисления хроматина печени под влиянием 0,0-диметил-0-2,2-дихлорвинилфос-
фата / / Укр. биохим. журн.—1992.—64, №.—С. 89—91.
3. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Примак Р. Г. и др. Молекулярные механизмы
повреждения хроматина печени хлорофосом в условиях введения веропамила и атропина
/ / Биополимеры и клетка.—1993.—9, № 4.—С. 32—39.
4. Левицкий Е. Л., Губский Ю. И., Чабанный В. Н. и др. Биохимическая характеристика
фракций транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс / /
Там же.—С. 13—21.
5. Губский Ю. И., Левицкий Е. ЛГольдштейн И. Б. и др. Функциональная активность
фракционированного хроматина печени крыс при однократном введении тетрахлорметана
/ / Вопр. мед. химии. —1989.—35, № 4.—С. 119—124.
6. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Гольдштейн Н. Б. и др. Перекисное окисление липидов
фракций хроматина печени крыс / / Докл. АН УССР. Сер. Б. —1989.—№ 2.—С. 70—72.
7. Чихиржина Г. И., Домкина Л. К., Чигарева Н. Г. и др. Солюбилизация хроматина Са2+,
Mg2+-3aBHCHMbiM фактором. Активность труднорастворимого хроматина / / Молекуляр.
биология.—1976.—10, № 6.—С. 1303—1310.
8 Примак Р. Г., Горюшко А. Г., Левицкий Е. Л. и др. Изучение конформационных
* характеристик транскрипционно активного и репрессированного хроматина с помощью
89
ЛЕВИЦКИЙ Е. Л. И ДР
флюоресцентных зондов / / Биополимеры и клетка.—1994.—10, № 1.—С. 41—46.
9. Аїимарин И. П., Васильев Н. #., Амбросов В. А. Быстрые методы статистической
обработки и планирование экспериментов.—Л.: Изд-во ЛГУ, 1975.—78 с.
10. Казначеев Ю. С., Кулагина Т. П., Маркевич Л. И. и др. О метаболизме липидов тимуса
и печени крыс / / Молекуляр. биология.—1984. —18, № 3.—С. 607—612.
11 Казначеев Ю. С., Коломийцева И. К, Кулагина Т. П. и др. Обновление хроматинсвязан-
ных и мембранных липидов печени и тимуса у-облученных крыс / / Биохимия. —1984.—
49, № 2.—С. 2008—2011.
12 Губский Ю. ИЛевицкий Е. ЛВолков Г. Л. Жирнокислотный состав фракций
хроматина печени крыс в условиях стимуляции перекисного окисления липидов / / Укр.
биохим. журн.—1991.—63, № 1.—Є. 87—91.
13. Губский Ю. И., Левицкий Е. ЛПримак Р. Г. и др. Изменение структурного состояния
фракционированного хроматина печени при активации перекисного окисления липидов
/ / Биополимеры и клетка.—1991.—7, і№ 3.—С. 89—94.
14. Губский Ю. ИЛевицкий Е. Л. Механизмы перекисного окисления липидов фракций
хроматина печени крыс / / Укр. биохим. журн.—1993.—65, № 5.—С. 112—115.
15. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Примак Р. Г. и др. Конформационные характеристики
и упаковка эндогенных липидов фракций транскрипционно активного и репрессирован-
ного хроматина / / Там же.—1991.—63, № 2.—С. 83—89.
16- Губский Ю. И., Левицкий Е. ЛЖила В. А. и др. Молекулярные механизмы повреждения
фракционированного хроматина печени тетрахлорметаном /./ Вопр. мед. химии. —1992.—
38.—С. 54—58.
17. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Гольдиїтейн Я. Б. и др. Перекисное окисление липидов
и эндогенная ДНК-полимеразная активность фракций изолированного хроматина печени
крыс / / Бюл. эксперим. биологии и медицины.—1989.—57, № 3.—С. 296—298.
УДК 6 15 357 631 :577 157 Поступила в редакцию 01.09.95
90
|