Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота

Определяли содержание триптофанил-тРНК синтетазы в экстрактах поджелудочной железы и печени крупного рогатого скота, крысы, кролика и человека, используя метод прямого радиопммуноблотинга с ¹²⁵I-меченным моноклональным антителом. В поджелудочной железе крупного рогатого скота, но не других организмо...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1988
Hauptverfasser:	Фаворова, О.О., Заргарова, Т.А., Рукосуев, В.С., Берестень, С.Ф.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1988
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Клеточная биология
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154112
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота / О.О. Фаворова, Т.А. Заргарова, В.С. Рукосуев, С.Ф. Берестень // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 6. — С. 290-297. — Бібліогр.: 16 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-154112
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1541122019-06-16T01:26:35Z Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота Фаворова, О.О. Заргарова, Т.А. Рукосуев, В.С. Берестень, С.Ф. Клеточная биология Определяли содержание триптофанил-тРНК синтетазы в экстрактах поджелудочной железы и печени крупного рогатого скота, крысы, кролика и человека, используя метод прямого радиопммуноблотинга с ¹²⁵I-меченным моноклональным антителом. В поджелудочной железе крупного рогатого скота, но не других организмов, обнаружено необычно высокое содержание триптофанил-тРНК синтетазы – около 0,2 % суммарного белка. По данным непрямого иммунофлюоресцентного метода, триптофанил- тРНК синтетаза в поджелудочной железе крупного рогатого скота преимущественно локализована в ее экзокринной части. Визначали вміст триптофаніл-тРНК синтетази в екстрактах підшлункової залози і печінки великої рогатої худоби, щура, кроля і людини, використовуючи метод прямого радіоімуноблотингу з ¹²⁵I-міченим моноклональним антитілом. У підшлунковій залозі великої рогатої худоби, але не інших організмів, виявлено незвичайно високий вміст триптофаніл-тРНК синтетази – близько 0,2 % сумарного білка. За даними непрямого імунофлуоресцентного методу, триптофаніл-тРНК синтетаза у підшлунковій залозі великої рогатої худоби переважно локалізована в її екзокринній частині. he content of tryptophanyl-tRNA synthetase has been determined in human, bovine, rat and rabbit liver and pancreatic extracts by direct radioimmunoblotting with ¹²⁵I-labelled monoclonal antibody. It was in bovine but not in other pancreas that the unusually high amount of tryptophanyl-tRNA synthetase was estimated (about 0.2 %). According to the indirect immunofluorescent method, bovine tryptophanyl-tRNA synthetase is located in exocrinic part of the pancreatic gland. 1988 Article Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота / О.О. Фаворова, Т.А. Заргарова, В.С. Рукосуев, С.Ф. Берестень // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 6. — С. 290-297. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00023B http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154112 577.152.6 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Клеточная биология Клеточная биология
spellingShingle	Клеточная биология Клеточная биология Фаворова, О.О. Заргарова, Т.А. Рукосуев, В.С. Берестень, С.Ф. Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота Биополимеры и клетка
description	Определяли содержание триптофанил-тРНК синтетазы в экстрактах поджелудочной железы и печени крупного рогатого скота, крысы, кролика и человека, используя метод прямого радиопммуноблотинга с ¹²⁵I-меченным моноклональным антителом. В поджелудочной железе крупного рогатого скота, но не других организмов, обнаружено необычно высокое содержание триптофанил-тРНК синтетазы – около 0,2 % суммарного белка. По данным непрямого иммунофлюоресцентного метода, триптофанил- тРНК синтетаза в поджелудочной железе крупного рогатого скота преимущественно локализована в ее экзокринной части.
format	Article
author	Фаворова, О.О. Заргарова, Т.А. Рукосуев, В.С. Берестень, С.Ф.
author_facet	Фаворова, О.О. Заргарова, Т.А. Рукосуев, В.С. Берестень, С.Ф.
author_sort	Фаворова, О.О.
title	Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота
title_short	Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота
title_full	Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота
title_fullStr	Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота
title_full_unstemmed	Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота
title_sort	межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-трнк синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1988
topic_facet	Клеточная биология
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154112
citation_txt	Межвидовые и межорганные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы у млекопитающих: аномально высокое содержание в поджелудочной железе крупного рогатого скота / О.О. Фаворова, Т.А. Заргарова, В.С. Рукосуев, С.Ф. Берестень // Биополимеры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 6. — С. 290-297. — Бібліогр.: 16 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT favorovaoo mežvidovyeimežorgannyevariaciivsoderžaniitriptofaniltrnksintetazyumlekopitaûŝihanomalʹnovysokoesoderžanievpodželudočnojželezekrupnogorogatogoskota AT zargarovata mežvidovyeimežorgannyevariaciivsoderžaniitriptofaniltrnksintetazyumlekopitaûŝihanomalʹnovysokoesoderžanievpodželudočnojželezekrupnogorogatogoskota AT rukosuevvs mežvidovyeimežorgannyevariaciivsoderžaniitriptofaniltrnksintetazyumlekopitaûŝihanomalʹnovysokoesoderžanievpodželudočnojželezekrupnogorogatogoskota AT berestenʹsf mežvidovyeimežorgannyevariaciivsoderžaniitriptofaniltrnksintetazyumlekopitaûŝihanomalʹnovysokoesoderžanievpodželudočnojželezekrupnogorogatogoskota
first_indexed	2025-07-14T05:39:26Z
last_indexed	2025-07-14T05:39:26Z
_version_	1837599625193717760
fulltext	Клеточная биология УДК 577.152.(3 МЕЖВИДОВЫЕ И МЕЖОРГАННЫЕ ВАРИАЦИИ В СОДЕРЖАНИИ ТРИПТОФАНИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ: АНОМАЛЬНО ВЫСОКОЕ СОДЕРЖАНИЕ В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА * О. О. Фаворова, Т. А. Заргарова, В. С. Рукосуев, С. Ф. Берестень Введение. Аминоацил-тРНК синтетазы играют ключевую роль в син- тезе белков, катализируя высокоспецифическое образование аминоацил- тРНК [1]. Кроме реакции аминоацилирования, ряд синтетаз катали- зирует синтез динуклеотида диаденозин-5',5'"-Р1 ,Р4-тетрафосфата (Ар4А), который, по-видимому, включается в контроль синтеза Д Н К и клеточной пролиферации [2]. Известно, что различные органы и тка- ни характеризуются разными уровнями активности аминоацил-тРНК синтетаз [3], что может быть связано как с интенсивностью белкового синтеза и аминокислотным составом синтезируемых белков [4], так и с предполагаемыми регуляторными функциями ферментов этой группы. Использование иммунохимических методов позволяет прямо определять количество белка, которое далеко не во всех случаях совпадает с уров- нем ферментативной активности. Определение количества триптофанил- т Р Н К синтетазы в различных органах крупного рогатого скота, про- веденное с использованием поликлональных антител против бычьего фермента, выявило крайне высокое содержание триптофанил-тРНК синтетазы в поджелудочной железе — 2—3% растворимых белков [5, 6]. Это количество, по данным работы [5], примерно в 100 раз превышало содержание фермента в таких органах крупного рогатого скота, как печень, почки, сердце, что привело к предположению о вы- полнении триптофанил-тРНК синтетазой в поджелудочной железе, помимо аминоацилирования тРНК, каких-то дополнительных неизвест- ных функций. Целью этой работы было установить, является ли гиперпродукция триптофапил-тРНК синтетазы в поджелудочной железе общим свойст- вом различных видов животных. Для иммунохимического анализа ис- пользовали мопоклональные антитела Ам1 против бычьей триптофа- нил-тРНК синтетазы, с высокой специфичностью узнающие триптофа- нил-тРНК синтетазы прокариот, архебактерий и эукариот [7, 8]. Материалы и методы. Материалами исследования служили поджелудочная желе- за и печень крупного рогатого скота, крысы, кролика и человека, свежие или заморо- женные при —70 °С. Получение и очистка индивидуальной триптофанил-тРНК синтетазы из поджелу- дочной железы быка описано в [9], моноклональных антител Ам1 — в [7]. Монокло- на льные антитела к I и III типам коллагена человека любезно предоставлены Г. Л. Идельсоном (ВКНЦ АМН СССР). 1251-мечение Ам1 (удельная активность (1—5) · 106 имп·мин - 1 ·мкг - 1 ) проводили конъюгацией с N-сукцинимидил-З-(4-окси, 5-[1251] иодофенил)пропионатом (реактив * Представлена членом редколлегии Л. Л. Киселевым. 290 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.—Т. 4, № б Болтона—Хантера), как описано в [10]. Реактив получали с использованием хлорами- на Τ по методу [11]. Р а д и о и м м у н о б л о т и н г т р и п т о ф а н и л-т Р Н К с и н т е т а з ы в э к с т - р а к т а х т к а н е й . Ткани мелко нарезали ножницами и гомогенизировали в ручном стеклянном гомогенизаторе в буфере А (20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 25 мМ сахароза, 150 мМ КС1, 0,2 мМ ЭДТА, 0,2 мМ 2-меркаптоэтанол), к которому в ряде случаев добавляли тритон Х-100 до 0,5 %, или в RIPA-буфере (20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1 %-ный ΝΡ40, 1 %-ный дезоксихолат Na, 0,1 %-ный DS-Na, 0,15 Μ NaCl). Не- посредственно перед использованием во все буферы добавляли ингибиторы протеаз: 0,3 мМ диизопропилфторфосфат и 2,5 мМ фенилметилсульфонилфторид. Гомогенаты тканей центрифугировали 30 мин при 15000 об/мин на «Eppendorf 5414» или 1 ч при 105000 g на «Spinco» в случае экстракции буфером А. Содержание белков в экстрактах определяли по [12] или [13], используя бычий сывороточный альбумин как стандарт. Белки надосадочных жидкостей разделяли электрофорезом в градиентном (7—22 %) полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии DS-Na [14] (пластины 9X12 см, тол- щина геля 1 мм), после чего их подвергали электропереносу в буфере (25 мМ трис, 192 мМ глицин, рН 8,3, 20 % (по объему) этанола) на нитроцеллюлозный фильтр ВА85 («Schleicher und Schiill», ФРГ) в аппарате «Trans-blot cell» («Віо-Rad», США) в течение ночи (30 В; 0,1 А). Полноту переноса контролировали прокраской геля Кумасси. Фильтр выдерживали 1 ч в TBS (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,15 Μ NaCl), содержащем 0,1 %-ный твин-20 (Т-буфер), затем инкубировали 1 ч с 2 мл [1251]Ам1 (106 и м п - м и н - ^ м л - 1 ) в Т-буфере. От несвязавшегося [1251]Ам1 фильтр отмывали 3 раза по 5 мин Т-буфером, 1 раз в течение 30 мин RIPA-буфером, споласкивали TBS, высушивали и подвергали радиоавтографии на пленке РТ-1 («Тасма», СССР). Участки фильтра, совпадающие с полосами радиоавтографа, вырезали и просчитывали в толуоль- ном сцинтилляционном счетчике. И м м у н о ф л ю о р е с ц е н т н а я м и к р о с к о п и я . Кусочки тканей на фильтро- вальной бумаге быстро погружали в жидкий азот, переносили в криостат и получали серийные срезы толщиной 5 мкм. Нативные срезы или срезы, фиксированные в течение 5 мин в 9 6 % -ном этаноле, ацетоне, 4 %-ном формальдегиде, обрабатывали по непря- мому иммунофлюоресцентному методу. Наилучшие результаты были получены при фиксации этанолом. Один из двух срезов инкубировали с Ам1, другой (контроль- ный)— с моноклональными антителами к I и III типам коллагена в концентрации 0,1 мг/мл в течение 1 ч. После промывки TBS в течение 10 мин срезы инкубировали 1 ч с антителами к иммуноглобулинам мыши, меченными флюоресцеинизотиоцианатом («Sigma», США). Гистологическая структура, в частности наличие островков Лангер- ганса, прослеживалась при окраске тех же или серийных срезов гематоксилин-эозином. Срезы просматривали в микроскопе «Orthoplan» («Leitz», ФРГ) и фотографировали на пленку РФ-3. Результаты и обсуждение. Авторы работы [5] использовали для определения количества триптофанил-тРНК синтетазы в экстрактах либо иммуноблотинг с проявлением антигена непрямым иммуноперо- ксидазным методом и последующим сканированием, либо электроим- мунный анализ по Лореллу [15]. Если первый из этих методов поз- воляет проводить только полуколичественные оценки, то второй обеспечивает количественное определение при работе или с полиспе- цифической антисывороткой и чистым антигеном, или с мопоспецифи- ческой сывороткой при использовании антигена в смеси с другими, тогда как Саллафранк и др. [5] использовали оба компонента имму- нохимической реакции в неочищенном виде. Поскольку получепные ими результаты могут иметь принципиальное значение, нам представлялось целесообразным применить для определения содержания триптофанил- тРНК синтетазы более падежный и адекватный метод. Мы использова- ли прямой радиоиммуноблотинг разделенных электрофорезом в де- натурирующих условиях белков с 1251-меченным моноклональным анти- телом Ам1, контролируя полноту переноса белков с геля на нитроцеллюлозу. Количество аминоацил-тРНК синтетазы в отдельных образцах определяли по радиоактивности связавшегося [1251]Ам1, ра- ботая в линейной области калиброзочной кривой, построенной с ис- пользованием очищенной триптофапил-тРНК синтетазы (рис. 1). 291 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.—Т. 4, № б В работе [5] определяли содержание триптофанил-тРНК синте- тазы в растворимой фракции поджелудочной железы крупного рогатого скота. По данным иммуноморфологического определения [6], этот фермент в культивируемых клетках почки быка выявлен также в поли- сомах, прикрепленных к грубому эндоплазматическому ретикулуму и к наружным ядерным мембранам. На рис. 1, а, приведены данные по содержанию триптофанил-тРНК синтетазы в супернатанте гомогената Рис. 1. Взаимодействие с 1251- мечснным моноклональным ан- тителом Ам1 триптофанил- тРНК синтетазы из поджелу- дочной железы крупного рога- того скота после разделения электрофорезом в ПААГ в присутствии DS-Na: a — имму- ноблотинг экстрактов железы в буфере А (1, 2), в буфере А с 0,5%-ным тритоном Х-100 (3, 4) и RIPA-буфере (5, 6); на дорожки наносили по 10 (1, 3> 5) и 20 мкг (2, 4, 6) экстраги- рованного белка; центрифуги- ровали гомогенаты при 105000 (1, 2) и 10000 g (3—6); 7—9— очищенная триптофанил-тРНК синтетаза (2, 20 и 100 нг соот- ветственно) ; экспозиция пленки РТ-1 12 ч; б — калибровочная кривая, построенная по связы- ванию [1251]Ам1 очищенной триптофанил-тРНК синтетазой (по данным рис. 1, а) Fig. 1. Interaction of 125I-label- led monoclonal antibody Ami with beef pancreas trypto-pha- nyl-tRNA synthetase after SDS polyacrylamide gel electrophore- sis: a) immuno.blotting of pan- creatic extracts in buffer A ( / and 2), buffer A plus 0 .5% Triton X-100 (3 and 4) and RIPA-buffer (5 and 6); homo- genates were centrifuged at 105000 g ( / , 2) and 10000 g (3-6); 1, 3 and 5—10 μg of total protein; 2, 4 and 6—20 μg of total protein; 7, 8 and 9 — purified tryptophanyl- tRNA synthetase (2, 20 and 100 ng, respectively); film exposure 12 h; 6) calibration curve plotted from the data of (a) on binding of purified tryptophanyl-tRNA synthetase with [ 1 2 5 I ]Ami. Т а б л и ц а 1 Содержание триптофанил-тРНК синтетазы в различных экстрактах поджелудочной железы крупного рогатого скота * Tryptophanyl-tRNA synthetase content in various extracts of bovine pancreas Белок фрак- ции, мкг/мг ткани Триптофанил-тРНК синтетаза Экстракция Белок фрак- ции, мкг/мг ткани нг/мкг экстра- гированного белка (%) нг/мг ткани Надосадочная фракция гомогената в А (при 105000 g) буфере 11,2 2,39 (0,24) 26,8 Надосадочная фракция гомогената в А в присутствии 0,5 % -ного тритона (при 10000 g) буфере Х-100 14,4 1,62 (0,16) 23,3 Надосадочная фракция гомогената в буфере (при 10000 g) RIPA- 30,4 0,81 (0,08) 24,6 * Рассчитано из данных рис. 1 для одной и той же железы. 2 9 2 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.—Т. 4, № б (при 105 000 g) поджелудочной железы крупного рогатого скота, по- лученном аналогично [5] (дорожки 1, 2), и во фракциях гомогената, растворимых в неионном (дорожки 3,4) и в смеси неионных и ионного детергента (RIPA-буфере) (дорожки 5, 6, обозначено как суммарный белок). Во всех случаях, включая очищенную триптофанил-тРНК син- тетазу, помимо основной белковой полосы — субъединицы фермента с молекулярной массой 60 000 — выявляются взаимодействующие с Ам1 Рис. 2. Электрофорез в 7—22 %-ном ПААГ экстрактов органов быка ( / , 2) и крысы (4, 5): 1,4 — поджелудочная железа (20 и 300 мкг белка соответственно); 2, 5 — печень (по 300 мкг); 3—ОД мкг очищенной триптофанил-тРНК синтетазы; а — гель окрашен 0,25 %-ным раствором Кумасси G-250 в 7,5 %-ной уксусной кислоте (слева стрелками обозначены положения белков-маркеров; цифры рядом — их молекулярные массы; Ε — положение триптофанил-тРНК синтетазы с молекулярной массой 60000); б—иммуно- блотинг с использованием [ !251]Ам1; экспозиция пленки ΡΤ-1 12 (/ , 2) и 36 ч (3—5) Fig. 2. Gradient polyacrylamide gel electrophoresis (7-22 %) of extracts of various bovine (1 and 2) and rat (4 and 5) organs: 1,4 — pancreas (20 and 300 μg; respectively); 2, 5 — l i v e r (300 μg) ; 3 — purified bovine tryptophanyl-tRNA synthetase (0.1 μg) , a — gel stained with Coomassi G250 in 7.5 % acetic acid. Arrows indicate the positions of protein markers with their molecular weights in kDa; Ε — tryptophanyl-tRNA synthetase (Md. weight — 60 kDa); б—immunob lo t t ing with [ 1 2 5 I ]Aml; film exposure 12 h ( / and 2) and 36 h (3—5) поотеолизовапные фрагменты синтетазы, на долю которых в сумме приходилось не более 10 % радиоактивности, связывающейся с интакт- ной субъединицей. Количества триптофанил-тРНК синтетазы, выделен- ной из поджелудочной железы при различных методах экстракции, приведены в табл. 1. Для анализированной железы содержание фер- мента в падосадочиой фракции гомогената (при 105 000 g) составляет 0,24 %. При более жестких условиях экстракции количество трипто- фанил-тРНК синтетазы на 1 мг белка в экстрактах падает, однако содержание триптофанил-тРНК синтетазы в расчете на 1 мг ткани остается практически постоянным. Это означает, что растворимая фрак- ция клеток, полученная без использования детергентов, содержит прак- тически всю триптофанил-тРНК синтетазу клетки. В дальнейшем анализировали RIPA-экстракты, что помимо удоб- ства в работе снижает уровень эндогенного протеолиза (рис. 1). Сопоставление содержания триптофанил-тРНК синтетазы в под- желудочной железе и в печени крупного рогатого скота подтверждает вывод [5] об очень большом превышении количества фермента в под- желудочной железе по сравнению с другими органами (рис. 2, до- рожки 7, 2; обратите внимание на 15-кратную разницу в количестве суммарного белка). Однако такого феномена не наблюдали для другого вида животных — количества фермента в печени и поджелудочной же- лезе крысы сопоставимы (рис. 2, дорожки 4, 5). Содержание синтетазы как в печени, так и поджелудочной железе различалось для особей одного вида не более чем в 2—3 раза (рис. 3). В среднем для быка, в подтверждение вывода работы [5], наблюдали почти 70-кратное превышение количества этого фермента в поджелу- БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.—Т. 4, До 6 3 - 8-598 293 дочпой железе по сравнению с печенью; для крысы, равно как для кролика и человека, превышение было крайне незначительным — в 1,5—1,6 раза (табл. 2). Количество синтетазы во всех исследованных органах, за исключением бычьей поджелудочной железы, составляло 0,002—0,012 % суммарного белка. Мы приходим к заключению, что аномально высокое содержание триптофанил-тРНК синтетазы в подже- лудочной железе не является общим свойством всех животных; если фермент и выполняет в этом органе какие-то дополнительные функции, Рис. 3. Электрофорез и иммуиоблотинг экстрактов отдельных поджелу- дочных желез крупного рогатого скота (по 10 мкг суммарного белка) Fig. 3. Gel-electrophoresis and immunoblotting of extracts of indi- vidual bovine pancreatic glands (10 [ig of total protein each) отличные от известных, то они могут быть связаны с особенностями физиологии крупного рогатого скота. Содержание триптофанил-тРНК синтетазы в бычьей поджелудоч- ной железе, представленное в табл. 2 в процентах от суммарного белка, можно сопоставить с результатами работы [5], выраженными в про- центах от растворимых белков, с помощью приведенных в табл. 1 данных об экстракции белков буфером А (растворимые белки) и RIPA-буфером (суммарный белок). Поскольку с использованием вто- рого буфера можно извлечь из железы примерно в 3 раза больше белков, содержание триптофанил-тРНК синтетазы, по нашим данным, соответствует около 0,6 % растворимых белков. Эта усредненная вели- чина примерно в 3 раза меньше приведенной в [5]; одним из возмож- ных объяснений данного расхождения может быть вклад неспецифи- ческих взаимодействий при использовании в [5] двух неочищенных компонентов системы антиген — антитело (см. выше). С другой сто- роны, эти различия укладываются в пределы индивидуальных вариа- ций, а количество анализированных в [5] животных неизвестно. Для крупного рогатого скота мы не имели возможности сравнить количества триптофанил-тРНК синтетазы в отдельных органах одного и того же животного. Такое сравнение было сделано на крысах (табл. 3). Соотношение количеств синтетазы в поджелудочной железе и печени одного и того же животного колебалось от 0,7 до 4,5, что, Т а б л и ц а 2 Содержание триптофанил-тРНК синтетазы в поджелудочной железе ( I ) и печени ( I I ) разных животных Content of tryptophanyl-tRNA synthetase in pancreas ( I ) and liver ( I I ) of different mammalians Животные Орган Число независи- мых опре- делений Суммар- ный белок, мкг Содержание триптофанил-тРНК синтетазы % от суммарного белка I/II Крупный рогатый скот I 10 10 20+12 0,20+0,12 66,7 II 8 ЗОО 8 + 6 0,003+0,002 Крыса I 8 ЗОО 25+11 0,008+0,004 1,6 и 8 300 16+10 0,005+0,004 Кролик I 2 ЗОО 9 + 6 0,003+0,002 1,5 Кролик II 2 ЗОО 6 + 3 0,002+0,001 Человек I 2 ЗОО 36+15 0,012+0,005 1,5 и 2 300 2 4 + 3 0,008+0,001 294 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1988.— Т. 4, № б нг скорее всего, отражает вариации в скоростях белкового синтеза в от- дельных органах в зависимости от потребностей организма (см. [3]). Локализацию триптофанил-тРНК синтетазы в клетках поджелу- дочной железы крупного рогатого скота определяли непрямым имму- нофлюоресцентным методом. На срезах, инкубированных с Ам1, наблю- дали четкое и яркое свечение (рис. 4, α, в). О его специфичности можно судить по контрольным срезам, обработанным моноклональ- ными антителами к I и III типам коллагена человека, где основная гч Рис. 4. Выявление триптофанил-тРНК синтетазы в поджелудочной железе быка на се- рийных криостатных срезах (попарно а, б й в, г) непрямым иммунофлюоресцентным методом (ув. 128): а, в — опыт; инкубация с моноклональными антителами Ам1 к бычьей триптофанил-тРНК синтстазе; специфическое свечение в эпителии экзокринной системы; панкреатические островки (а — три и в — один) остаются темными; б, г — контроль; инкубация с моноклональными антителами к I и III типам коллагена чело- века; специфическое свечение соединительнотканных структур (б, г) и стенок сосуда (г, справа) F'ig. 4. Visualization of bovine tryptophanyl-tRNA synthetase at two-serial c.ryostatic sections of pancreatic gland by the indirect immunofluorescent method (magnification X128) : (а, в )—incuba t ion with Ami; specific fluorescence of epithelium of exocrinic part of the gland is visible; Langergands islands (a — 3 and β — 1 ) remain dark; (6 and г) — control; incubation with antibodies against human collagene of types I and III; specific fluorescence of connective structures (6 and г) and blood-vessel walls (г, to the right) Т а б л и ц а 3 Индивидуальные вариации в содержании триптофанил-тРНК синтетазы в поджелудочной железе ( I ) и печени ( I I ) крыс Individual variations in rcit tryptophanyl-tRNA synthetase content in pancreas ( I ) and liver ( I I ) I 1 II ί I I I/II Ι / Ι Ι % от суммарного белка % от суммарного белка Ι / Ι Ι 0 , 0 0 4 0 , 0 0 6 0 , 6 7 0 , 0 1 1 0 , 0 0 3 3 , 6 7 0 , 0 0 6 0 , 0 0 7 0 , 8 6 0 , 0 0 9 0 , 0 0 2 4 , 5 0 0 , 0 0 6 ο , ο ο β 0 , 7 5 0 , 0 0 8 0 , 0 0 8 0 , 7 5 0 , 0 1 1 0 , 0 0 4 2 , 7 5 0 , 0 1 2 0 , 0 0 3 4 , 0 0 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА,— П)88.—Т. 4, № о 2* 2 9 5 часть среза остается темной (рис. 4, г). В последнем случае наблю- дается лишь свечение соединительнотканных структур, что объясняется, судя по всему, наличием общих антигенных детерминант у коллагенов человека и крупного рогатого скота. В печени быка, а также в печени и поджелудочной железе крысы специфического свечения триптофаншь тРНК синтетазы не наблюдалось. Распределение этого антигена, ана- логичное наблюдаемому в поджелудочной железе крупного рогатого скота, но с очень слабым свечением, было отмечено на срезах подже- лудочной железы человека. Полученные отрицательные результаты мо- гут быть связаны с недостаточной чувствительностью иммуноморфоло- гического метода по сравнению с другими иммунологическими тестами. В целом, однако, результаты иммунофлюоресцентного анализа пол- ностью подтверждают сделанный на основании радиоиммунного опре- деления вывод о значительно более высоком содержании триптофанил- тРНК синтетазы в поджелудочной железе крупного рогатого скота в сравнении как с поджелудочной железой других исследованных животных, так и с гомологичной печенью. Поджелудочная железа, как известно, состоит из двух различных по морфофункциональным характеристикам частей — экзо- и эндокрин- ной. Как видно из рис. 4, а, ву триптофанил-тРНК синтетаза выявля- ется в ацинозных клетках экзокринной системы и, видимо, в выводных протоках. Островковый аппарат остается темным с едва контурируе- мыми ядрами; ядра клеток экзокринной системы также не окрашива- ются. Преимущественная локализация триптофанил-тРНК синтетазы в экзокринной части поджелудочной железы, которая с высокой скоро- стью вырабатывает выделяемые в поджелудочный сок гидролитические ферменты [16], в принципе, может свидетельствовать о роли этой синтетазы в обеспечении необходимого уровня белкового синтеза. Уди- вительно высокое содержание триптофанил-тРНК синтетазы, харак- терное для поджелудочной железы именно крупного рогатого скота, может быть связано с особенностями пищеварения у жвачных живот- ных. В работе [5] показано, что содержание другой аминоацил-тРНК синтетазы (метиониновой) несколько выше в печени, чем в поджелу- дочной железе, а количества тРНКТ г р в обоих органах близки между собой и сопоставимы с другими тРНК. Хотя эти результаты не исклю- чают возможности того, что вследствие соотношения кинетических кон- стант и концентраций субстратов in vivo высокие концентрации фер- мента необходимы для аминоацилирования тРНКТ г р в количествах, не лимитирующих белкового синтеза, кажется более вероятным, что трип- тофанил-тРНК синтетаза действительно выполняет какие-то неизвест- ные функции, особенно важные для пищеварения именно жвачных. Иммунолокализация фермента в выводящих протоках заставляет допустить возможность его секреции в составе панкреатического сока. Следует отметить, однако, что речь может идти о секреции не обя- зательно целого фермента, но и его фрагментов, содержащих интакт- ную N-концевую часть молекулы, на которой локализована антигенная детерминанта для Ам1 [7]. К сожалению, проверить гипотезу о секреции триптофанил-тРНК синтетазы на органах крупного рогатого скота не представилось воз- можным. Анализ методом иммуноблотинга с использованием [1251]Ам1 дуоденального содержимого человека, состоящего из смеси желчи, панкреатического и кишечного соков, не выявил присутствия эпитопа фермента; однако, как указывалось выше, поджелудочная железа че- ловека в сравнении с крупным рогатым скотом содержит почти в 20 раз меньше триптофанил-тРНК синтетазы, и эта постановка опыта не поз- воляет сделать окончательного вывода. 296 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.—Т. 4, № б SPECIES AND TISSUE-SPECIFIC VARIATIONS IN DISTRIBUTION OF MAMMALIAN TRYPTOPHANYL-tRNA SYNTHETASE: AN ABNORMAL HIGH CONTENT IN BOVINE PANCREAS O. O. Favorova, T. A. Zargarova, V. S. Rukosuev, S. F. Beresten Institute of Molecular Biology, Academy of Sciences of the USSR, Moscow Institute of Experimental Cardiology of the Ail-Union Cardiological Research Centre, Academy of Medical Sciences of the USSR, Moscow S u m m a r y The content of tryptophanyl-tRNA synthetase has been determined in human, bovine, rat and rabbit liver and pancreatic extracts by direct radioimmunoblotting with 1251-label- led monoclonal antibody. It was in bovine but not in other pancreas that the unusually high amount of tryptophanyl-tRNA synthetase was estimated (about 0.2 %). According to the indirect immunofluorescent method, bovine tryptophaiiyl-lRNA synthetase is located in exocrinic part of the pancreatic gland. 1. Киселев Л. Л., Фаворова О. О., Лаврик О. И. Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-тРНК — М . : Наука, 1984.—408 с. 2. Zamecnik P. Diadenosine 5', б'^-Р1, PMetraphosphate (Ар4А): its role in cellular metabol i sm/ /Anal . Biochem.— 1983.— 134, N 1 — P . 1 — 10. 3. Dang Chuati V., Dang Chi V. Higher eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetases in phy- siologic and pathologic s t a t e s / /Мої . and Cell. Biochem — 1986.— 71 N 2 . — P. 107—120. 4. Chavancy G., Marbaix G., Clauter Y. Effect of tRNA pool balance on rate and uni- formity of elongation during translation of fi,broin mRNA in a reticulocyte cell-free system //Biochimie.— 1981.— 63, N 7 .—P. 611—618. 5. Tryptophanyl-tRNA synthetase is a major soluble protein species in bovine pancreas / M. L. Sallafranque, M. Garret, J.-P. Benedetto et al. // Biochim. et biophys. acta.— 1986,—882, N 2 ,—P. 192—199. M. L. Sallafranque, M. Garret, J.-P. Benedetto et a l . / /B ioch im . et biophys. acta.— 6. Иммуноморфологическое и биохимическое изучение внутриклеточной локализа- ции триптофанил-тРНК синтетазы высших организмов / Ё. Л. Пален, В. Н. Ба- ранов, Η. Е. Зиновьев, Л. Л. Киселев/ /Биополимеры и клетка.— 1985,—1, № 2.— С. 70—79. 7. Моноклоиальные антитела к триптофанил-тРНК синтетазе / С. Ф. Берестень, Т. А. Заргарова, С. В. Костров, О. О. Фаворова/ /Молекуляр. биология.— 1984.— 18, № 5,—С. 1407—1411. 8. Триптофанил-тРНК синтетазы эукариот, прокариот и архебактерий имеют общую антигенную детерминанту / Т. А. Заргарова, С. Ф. Берестень, О. О. Фаворова, Л. Л. Киселев/ /Докл. AFI СССР.— 1985,—285, N° 6.—С. 1484—1486. 9. Kisseleu L. L., Favorova О. О., Kovaleva G. К. Tryptophanyl-tRNA synthetase from beef pancreas / /Met l i . Enzymol.— 1979.—59.— P. 234—257. 10. Bolton A. E. Radioiodination techniques: Review 18/ /Amersham Int.— London: Amersham, 1985.—P. 62. 11. Rudinger J., Ruegg U. Preparation of N-succinimidyl 3-(4-hydroxyphen\i) propiona- te // Biochem. J.— 1973,— 133, N 3.— P. 538—539. 12. Bradford Μ. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye b i n d i n g / / A n a l . Biochem.— 1976.—72, N 1.—P. 248—254. 13. Ohnishi S. Т., Barr I. K. A simplified method of quanti tat ing protein using the Biuret and phenol r eagen t s / /Ana l . Biochem.— 1978.—86, N 1.— P. 193—200. 14. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature.— 1970,— 227, N 5259,—P. 680—685. 15. Laurell С. B. Quantitative estimation of proteins by electrophoresis in agarose gel containing antibodies // Anal. Biochem.— 1966.— 15, N 1.— P. 45—52. 16. Бабкин Б. П. Секреторный механизм пищеварительных желез.— Л. : Медгиз, 1960.— 777 с. Ин-т молекуляр. биологии АН СССР, Москва Получено 07.09.87 Ин-т эксперим. кардиологии ВКНЦ АМН СССР, Москва БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1988.—Т. 4, № 6 297

Institution

Ähnliche Einträge