Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК

80S рибосомы стимулируют первую стадию реакции аминоацилирования – стадию образования аминоациладенилат-ферментного комплекса. Обсуждается возможное функциональное значение взаимодействия аминоацил-тРНК синтетаз и рибосом в клетках высших эукариот...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	1998
Main Authors:	Белянекая, Л.Л., Турковская, Г.В., Коваленко, М.И., Ельская, А.В.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1998
Series:	Биополимеры и клетка
Subjects:	Структура и функции биополимеров
Online Access:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154148
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК / Л.Л. Белянекая, Г.В. Турковская, М.И. Коваленко, А.В. Ельская // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 1. — С. 39-42. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-154148
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1541482019-07-04T21:08:28Z Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК Белянекая, Л.Л. Турковская, Г.В. Коваленко, М.И. Ельская, А.В. Структура и функции биополимеров 80S рибосомы стимулируют первую стадию реакции аминоацилирования – стадию образования аминоациладенилат-ферментного комплекса. Обсуждается возможное функциональное значение взаимодействия аминоацил-тРНК синтетаз и рибосом в клетках высших эукариот 80S рибосоми стимулюють першу стадію реакції алиноацилювання – стадію утворення аміноациладенілат-ферментного комплексу. Обговорюється можливе функціональне значення взаємодії аміноацил-тРНК синтетаз та рибосом у клітинах вищих еукаріот. 80S ribosomes stimulate activity of homologous leucyl-tRNA synthetase on the first stage of tRNA aminoacylation, namely for formation enzyme bound aminoacyl-adenylate. A possible mechanism and functional significance of the interaction between eukaryotic leucyl-tRNA synthetase and ribosomes are discussed. 1998 Article Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК / Л.Л. Белянекая, Г.В. Турковская, М.И. Коваленко, А.В. Ельская // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 1. — С. 39-42. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0004B6 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154148 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Белянекая, Л.Л. Турковская, Г.В. Коваленко, М.И. Ельская, А.В. Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК Биополимеры и клетка
description	80S рибосомы стимулируют первую стадию реакции аминоацилирования – стадию образования аминоациладенилат-ферментного комплекса. Обсуждается возможное функциональное значение взаимодействия аминоацил-тРНК синтетаз и рибосом в клетках высших эукариот
format	Article
author	Белянекая, Л.Л. Турковская, Г.В. Коваленко, М.И. Ельская, А.В.
author_facet	Белянекая, Л.Л. Турковская, Г.В. Коваленко, М.И. Ельская, А.В.
author_sort	Белянекая, Л.Л.
title	Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК
title_short	Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК
title_full	Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК
title_fullStr	Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК
title_full_unstemmed	Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК
title_sort	влияние 80s рибосом на активность лейцил-трнк синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования трнк
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1998
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154148
citation_txt	Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК / Л.Л. Белянекая, Г.В. Турковская, М.И. Коваленко, А.В. Ельская // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 1. — С. 39-42. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT belânekaâll vliânie80sribosomnaaktivnostʹlejciltrnksintetazyvysšihéukariotnapervométapeaminoacilirovaniâtrnk AT turkovskaâgv vliânie80sribosomnaaktivnostʹlejciltrnksintetazyvysšihéukariotnapervométapeaminoacilirovaniâtrnk AT kovalenkomi vliânie80sribosomnaaktivnostʹlejciltrnksintetazyvysšihéukariotnapervométapeaminoacilirovaniâtrnk AT elʹskaâav vliânie80sribosomnaaktivnostʹlejciltrnksintetazyvysšihéukariotnapervométapeaminoacilirovaniâtrnk
first_indexed	2025-07-14T05:45:02Z
last_indexed	2025-07-14T05:45:02Z
_version_	1837599978377183232
fulltext	ISSN 0233-7657 . Биополимеры и клетка. 1998. Т. 14. № 1 Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК Л. Л. Белянекая, Г. В. Турковская, М. И. Коваленко, А. В. Ельская Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины 252143, Киев, ул. Академика Заболотного, 150 80S рибосомы стимулируют первую стадию реакции аминоацилирования — стадию образования аминоациладенилат-ферментного комплекса Обсуждается возможное функциональное значение взаимодействия аминоацил-тРНК синтетаз и рибосом в клетках высших эукариот Введение. Классическая схема реакции, катализи руемой а м и н о а ц и л - т Р Н К синтетазами (АРС, К Ф 6.1.1), включает промежуточное образование проч но связанного с ферментом аминоациладенилата (I этап) и последующий перенос аминокислоты (ак) на т Р Н К (II этап) с образованием соответствующей аминоацил-тРНК (аа -тРНК) [1 ] . АРС + А Т Р + ак <н> АРС • АМР-ак + PPi (I) АРС-АМР-ак + т Р Н К А Р С + AMP + а а - т Р Н К (II) Хотя АРС прокариот, дрожжей и высших эука риот выполняют одинаковую ф у н к ц и ю , осуществ л я я в ы с о к о с п е ц и ф и ч е с к о е а м и н о а ц и л и р о в а н и е т Р Н К , они отличаются по ряду свойств. Для АРС высших эукариот характерны более высокие значе ния молекулярных масс по сравнению с прокарио- тическими аналогами, выраженные гидрофобные свойства, высокое сродство к р Р Н К , функциониро вание в составе высокомолекулярных комплексов (ВМК), ассоциация с рибосомами и системой кле точных мембран [2—4] , Эти свойства АРС вносят вклад в комиартментализацию процесса биосинтеза белка, являющуюся характерным свойством эука- риотической клетки [5 ] . Одним из проявлений компартментализации могут быть так называемые неканонические взаи- © Л. Л. БЕЛМНСКАЯ, Г. В Т У Р К О В С К А Я , М. И. К О В А Л Е Н К О , А. В. Е Л Ь С К А Я , 1 9 9 8 м о д е й с т в и я о т д е л ь н ы х к о м п о н е н т о в а п п а р а т а трансляции. В этом плане значительный интерес представляет возможное взаимодействие АРС и рибосом. В предыдущих исследованиях было показано, что высокоочищенные 80S рибосомы печени кроли ков в 2—3 раза повышают каталитическую актив ность гомологичной л е й ц и л - т Р Н К синтетазы в сум марной реакции аминоацилирования т Р Н К , при этом величина коэффициента Хилла увеличива лась от 1,2 до 1,8. Кроме того, в присутствии рибосом возрастала термостабильность исследуемо го фермента [6, 7 ] . В представленной работе продемонстрирована стимуляция 80S рибосомами реакции А Т Р - [ 3 2 Р ]пи- рофосфатного обмена, катализируемой лейцил- т Р Н К синтетазой в составе ВМК. Эти данные свидетельствуют о том, что стимулирующее дейст вие рибосом проявляется у ж е на первой стадии реакции аминоацилирования — стадии образова ния аминоациладенилат-ферментного комплекса. Материалы и методы. ВМК АРС получали из печени кролей с использованием мягкой, щадящей гомогенизации в гомогенизаторе Поттера и после дующей гель-фильтрации пострибосом ного супер- натанта на сефадексе G-200 [6, 7 ]. Получение 80S рибосом и их субчастиц из печени описано в [8 ]. В основу методики положена схема, включающая препаративное выделение по лисом, преинкубацию последних в условиях, необ- 39 БЕЛЯНСКАЯ Л. Л И Д Р . ходимых для трансляции эндогенных м Р Н К с по следующим добавлением пуромицина, диссоциа цию рибосом на субчастицы и отделение субчастиц от остальных компонентов системы трансляции центрифугированием в градиенте концентрации са харозы в зональном роторе Ті-14 центрифуги «Вес- kman» L-5 (США). Диссоциацию рибосом на субчастицы и очист ку проводили в буфере, содержащем 0,6 М KCL Гомогенность препаратов рибосомных субчастиц определяли аналитическим ультрацентрифугирова нием. 80S рибосомы получали реассоциацией 40S и 60S субчастиц. 90 % полученных 80S рибосом были активны в реакции связывания А с Р п е - т Р Н К Р Ь е в присутствии поли (U) . Определение ферментативной активности лейцил-тРНК синтетазы в составе ВМК АРС в реакции АТР-[32Р)пирофосфатного обмена. При постановке реакции А Т Р - [ 3 2 Р ]пирофосфатного об мена за основу были взяты методики из работ [9, 10] с некоторыми модификациями. Вследствие об ратимости реакции активации аминокислот в при сутствии аминокислоты, специфичной для данной АРС, при добавлении [ 3 2 Р ]пирофосфата равновесие реакции сдвигается в сторону образования меченой АТР . Скорость реакции измеряют по нарастанию количества [ 3 2 Р ] А Т Р . Инкубационная смесь в объеме 100 мкл содер жала 100 мМ трис-HCl (рН 7,5) , 5 мМ MgCl 2 , 10 мМ А Т Р , 1 мМ лейцин, 0,045 ед. А 2 8 0 ВМК АРС, 10 мМ N a F , 3 мМ [ 3 2 Р ]пирофосфат натрия (37 П Б к / м о л ь , Обнинск, Россия), 20 мкг БСА, 0—1,4 мкМ 80S рибосом. Инкубацию проводили в течение 4 мин при 37 °С. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 0,2 М пирофосфата натрия в 5 %-м растворе трихлоруксусной кислоты. Затем в пробы вносили 1 мл 0,2 М водной суспензии активированного угля норит А (50 мг /мл) и остав ляли на 30 мин при 0 °С. Смесь сорбировали на фильтрах G F / C фирмы «Whatman» (Англия), про мывали 60 мл дистиллированной воды и закрепля ли на фильтрах, пропуская 2 мл 10 %-го раствора поливинилового спирта в воде. После высушивания фильтров определяли их радиоактивность на сцин- тилляционном счетчике SL-30 («Intertechnique», Франция) . Следует подчеркнуть, что во всех эксперимен тах по изучению А Т Р - [ 3 2 Р ]пирофосфатного обмена была исследована и учтена неспецифическая сорб ция [ 3 2 Р ] на фильтрах. Результаты и обсуждение . Одним из подходов для изучения I этапа реакции аминоацилирования является определение А Т Р - [ 3 2 Р ]пирофосфатного обмена. Для изучения влияния эукариотических рибо сом на активность л е й ц и л - т Р Н К синтетазы в усло виях, приближенных к условиям in vivo, использо вали ВМК А Р С , полученные после гель-фильтра ции пострибосомного супернатанта на сефадексе G-200. Поскольку в работе использованы препараты ВМК АРС, для подавления эндогенной пирофосфа- тазной активности при постановке реакции А Т Р - [ 3 2 Р ]пирофосфатного обмена применяли 10 мМ N a F [11] . Об активности л е й ц и л - т Р Н К синтетазы в А Т Р - [ 3 2 Р ]пирофосфатном обмене как в присутст вии, так и в отсутствие 80S рибосом, судили по начальной скорости реакции при насыщающих концентрациях А Т Р и аминокислоты. Интересно отметить, что линейная зависимость образования [ 3 2 Р ] А Т Р от времени инкубациии на блюдается на протяжении по крайней мере 60 мин (рис. 1). Т а к а я кинетика обнаружена как в присут ствии, так и в отсутствие рибосом. Как видно из этого рисунка, начальная скорость реакции выше при наличии рибосом в 1,6 раза . Поскольку мы были ограничены наличием [ 3 2 Р ]пирофосфата н а т р и я , и в экспериментах , представленных на рис. 1, 3 , 4, его концентрация составляла 3 мМ, важно было проверить, наблюда ется ли стимуляция рибосомами начальной скоро сти реакции А Т Р [ 3 2 Р ]пирофосфатного обмена при различных концентрациях [ 3 2 Р ]пирофосфата на трия. Как видно из рис. 2, при всех использован ных концентрациях пирофосфата как ниже , так и выше 3 мМ наблюдается стимуляция рибосомами начальной скорости образования [ 3 2 Р ]АТР. Так как на этапе образования аминоациладе- нилата важную роль играет комплекс Mg-ATP и, кроме того, в предыдущих исследованиях была замечена четко выраженная зависимость стимуля ции рибосомами л е й ц и л - т Р Н К синтетазы от кон центрации магния в суммарной реакции аминоаци лирования, была исследована такая зависимость и в реакции А Т Р - [ 3 2 Р ]пирофосфатного обмена. Как видно из рис. 3 , стимуляция рибосомами А Т Р - [ 3 2 Р ]пирофосфатного обмена отмечена при всех исследуемых концентрациях магния. На рис. 4 представлена зависимость образова ния [ 3 2 Р ] А Т Р от концентрации рибосом. Из этого рисунка следует, что добавление возрастающего количества рибосом к стандартной инкубационной смеси приводит к увеличению начальной скорости реакции образования [ 3 2 Р ]АТР. Высокая эффективность белкового синтеза в достаточно большом объеме цитоплазмы эукарио- тической клетки может быть обеспечена за счет компартментализации белоксинтезирущего аппара- 40 В Л И Я Н И Е 8 0 S Р И Б О С О М НА А К Т И В Н О С Т Ь Л Б Й Ц И Л - т Р Н К . С И Н Т Е Т А З Ы мМ Рис. 3. Зависимость активности лейцил-тРНК синтетазы от 3 2 концентрации пирофосфата натрия в реакции АТР- [ Р] пиро фосфатного обмена в присутствии ( / ) и в отсутствие рибосом (2) Рис. 4. Зависимость активности лейцил-тРНК синтетазы от концентрации рибосом в реакции АТР- [ 3 2 Р ] пирофосфатного обмена в присутствии (7) и в отсутствие рибосом (2) та, когда все необходимые для трансляции компо ненты сконцентрированы в одном месте. Это может быть как перманентная ассоциация в мультимоле- кулярные комплексы, например, ВМК А Р С , так и образование временных промежуточных комплек сов, в частности, в случае предполагаемого взаимо действия факторов элонгации и А Р С , а также при ассоциации АРС с рибосомами. В предыдущих исследованиях показана стиму л я ц и я 80S рибосомами печени кроликов каталити ческой активности гомологичной л е й ц и л - т Р Н К синтетазы в составе ВМК в суммарной реакции 41 БЕЛЯНСЖАЯ Л Л. И Д Р - аминоацилирования т Р Н К [6, 7 ] . В данной работе продемонстрировано стимулирующее влияние 80S рибосом на лейцин-зависимый А Т Р - [ 3 2 Р ]пирофос- фатный обмен, катализируемый тем же фермен том, что свидетельствует о стимуляции рибосомами образования лейциладенилата . Эти данные дают возможность уточнить механизм стимулирующего действия рибосом в суммарной реакции аминоаци лирования т Р Н К . Можно предложить два объяснения обнаружен ного факта . Первое основано на том, что стимуля ция лейцил-тРНК синтетазы рибосомами является «видимой» и, возможно, обусловлена стабилиза цией конечного продукта реакции аминоацилиро вания — аминоацил-тРНК. Второе объяснение за ключается в том, что лимитирующей скорость ста дией реакции аминоацилирования может быть диссоциация л е й ц и л - т Р Н К из л е й ц и л - т Р Н К синте тазы, как в случае аспартил-тРНК синтетазы [11, 12] . Однако полученные результаты по стимуля ции рибосомами уже первой стадии реакции ами ноацилирования позволяют исключить предложен ные выше механизмы. Наиболее вероятной причи ной стимулирующего влияния рибосом может быть непосредственное взаимодействие л е й ц и л - т Р Н К синтетазы с рибосомой, в результате которого про исходят конформационные перестройки фермента, приводящие к его активации. Структурно-функциональное взаимодействие отдельных компонентов аппарата трансляции кле ток высших эукариот, в том числе АРС и рибосом, их компартментализация обеспечивают возмож ность поддержания оптимального уровня их ф у н к ционирования, а т акже возможность регуляции функционирования этого аппарата как единого ц е лого. Л. Л. Ылянська, Г. В. Турківська, А/ . Й. Коваленко, Г. В. Єльська Вплив 80S рибосом на активність лейцил-тРНК синтетази вищих зукаріот на першому етапі аміноацилювання тРНК Резюме 80S рибосоми стимулюють першу стадію реакції алиноацилю- вання — стадію утворення аміноациладенілат-ферментного комплексу. Обговорюється можливе функціональне значення взаємодії аміноацил-тРНК синтетаз та рибосом у клітинах вищих зукаріот. L, L. Belyanskaya, Н. V. Turkovskaya, М. I. Kovalenko, А. V. Etskaya Effect of 80S liposomes on higher eukaryotic leucyl-tRNA synthetase activity at the first stage of tRNA aminoacylation Summary 80S ribosomes stimulate activity of homologous leucyl-tRNA synthe tase on the first stage of tRNA aminoacylation, namely for formation enzyme bound aminoacyl-adenylate. A possible mecha nism and functional significance of the interaction between eukary otic leucyl-tRNA synthetase and ribosomes are discussed. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Киселев Л. Л., Фаворова О. О., Лаврик И. О. Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-тРНК.—М.: Наука. 1984 .—408 с. 2. Иванов Л. Л., Коваленко М. И., Турковская Г. В., Ельская А. В. Структурно-функциональные особенности эукарио- тических а м и н о а ц и л - т Р Н К синтетаз / / Биохимия- — 1992 .—57, № 8 .—С. 1 1 2 3 — 1 1 4 1 . 3. Mirande М. Aminoacyl-tRNA synthetase family from proka- ryotes and eukaryotes: Structural domains and their implica tions / / Progr. Nucl. Acids Res. and Мої. Biol.—1991 . — 4 0 . — P. 9 5 — 1 4 2 . 4. Kisselev JL L., Wolfson A. D. Aminoacyl-tRNA synthetases from higher eukaryotes / / Ib id .—1994 .—48 .—P. 86—142 . 5. Ryazanov A. G., Ovchinnikov L. P., Spirin A. S. Development of structural organization of protein synthesizing machinery from prokaryotes to eukaryotes / / Biosystems.—1987.—20.— P. 275—288 . 6. Сана Сара, Мозурайтис P. Ю., Харченко О. В. и др. Взаимодействие эукариотических аминоацил-тРНК син тетаз с рибосомами / / Биополимеры и клетка.—1992.—8, № 1.—С. 101 — 107. 7. Сана Сара, Иванов Л. Л., Турковская Г. В. и др. Влияние рибосом на термостабильность аминоацил-тРНК синтетаз печени кроликов / / Там ж е . — № 3 . — С . 6—9. 8. Потапов А. Я . , Овчаренко Г. В., Солдаткин К. А. Полу чение и характеристика 40S и 60S субчастиц рибосом из печени кролика / / Методы молекуляр. биологии.—Киев: Наук, думка, 1986 .—С. 100—105 . 9. Lemoine К, Waller J.-P, van Rapenbusch R. Studies on methionyl transfer RNA synthetase 1. Purification and some properties of methionyl transfer RNA synthetase from E. coli K-12 / / Eur. J. Bioch.—1968. — 4 . — P . 2 1 3 — 2 2 1 . 10. Овчаренко Г. В., Иванов Л. Л. Методы определения фер ментативной активности аминоацил-тРНК синтетаз / / Ме тоды молекуляр. биологии.—Киев: Наук, думка, 1979.—С. 133—140. 11. Kikuo Ogata, Ayumi Kurahashi, Naoya Kenmochi, Kazuo Terao. Role of 5S rRNA as a positive effector of some aminoacyl-tRNA synthetases in macromolecular complex, with specific reference to methionyl-tRNA synthetase / / J. Bio- chem.—1991 .—110 .—P. 1 0 3 7 — 1 0 4 4 . 12. Reed V. S., Wastney M. E., Yang D. С. H. Mechanisms of the transfer of aminoacyl-tRNA from aminoacyl-tRNA synthetase to the elongation factor la II J. Biol. Chem.—1994 .—269 .— P. 32932—32936 . Поступила в редакцию 25.03.97

Влияние 80S рибосом на активность лейцил-тРНК синтетазы высших эукариот на первом этапе аминоацилирования тРНК

Institution

Similar Items