Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов

Рассмотрены варианты получения окрашенного зонда с использованием металлокомплекса, включающего этаноламино-формальдегидные цепочки, образующие координационные связи с ионом серебра. Модификацию проводили на полностью денатурированной ДНК, частично расплетенных с помощью формальдегида молекулах, а т...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	1996
Main Authors:	Шугалий, А.В., Личина, М.В.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1996
Series:	Биополимеры и клетка
Online Access:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154174
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов / А.В. Шугалий, М.В, Личина // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 5. — С. 29-33. — Бібліогр.: 10 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-154174
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1541742019-06-16T01:29:53Z Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов Шугалий, А.В. Личина, М.В. Рассмотрены варианты получения окрашенного зонда с использованием металлокомплекса, включающего этаноламино-формальдегидные цепочки, образующие координационные связи с ионом серебра. Модификацию проводили на полностью денатурированной ДНК, частично расплетенных с помощью формальдегида молекулах, а также дуплексах зонд – матрица за счет разветвления уже сформированной структуры олигомерных цепочек. С использованием последнего варианта окраски при степени модификации зонда – 10% достигнутая чувствительность детектирования иммобилизованной на нитроцеллюлозных мембранах ДНК составила десятки пикограммов. Розглянуто варіанти отримання забарвленого зонда з використанням металокомплексу, який містить еталонаміно-формальдегідні ланцюжки, що утворюють координаційні зв'язки з іонами срібла. Модифікацію здійснювали на повністю денатурованій ДНК, частково розплетених за допомогою формальдегіду молекулах, а також дуплексах зонд – матриця за рахунок розгалуження уже сформованої структури олігомерних ланцюжків. Застосовуючи останній варіант забарвлення, при ступені денатурації = 10 % досягнута чутливість детектування іммобілізованої на нітроцелюлозних мембранах ДНК склала десятки пікограмів. The different ways of the coloured probe preparation with the use of the metal complex comprising ethanol-amine-formaldehyde chains forming coordination bonds with silver ions have been discussed. The denaturated DNA. partially unwind with formaldehyde molecules, and the probe-template duplexes have been modified on the basis of the branching of oligomer chains already formed. The sensitivity of the detection of 10 % -modified Off A immobilized on nitrocellulose filters has reached dozens of picogramms. 1996 Article Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов / А.В. Шугалий, М.В, Личина // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 5. — С. 29-33. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000445 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154174 577.11.4:577.336 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
description	Рассмотрены варианты получения окрашенного зонда с использованием металлокомплекса, включающего этаноламино-формальдегидные цепочки, образующие координационные связи с ионом серебра. Модификацию проводили на полностью денатурированной ДНК, частично расплетенных с помощью формальдегида молекулах, а также дуплексах зонд – матрица за счет разветвления уже сформированной структуры олигомерных цепочек. С использованием последнего варианта окраски при степени модификации зонда – 10% достигнутая чувствительность детектирования иммобилизованной на нитроцеллюлозных мембранах ДНК составила десятки пикограммов.
format	Article
author	Шугалий, А.В. Личина, М.В.
spellingShingle	Шугалий, А.В. Личина, М.В. Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов Биополимеры и клетка
author_facet	Шугалий, А.В. Личина, М.В.
author_sort	Шугалий, А.В.
title	Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов
title_short	Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов
title_full	Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов
title_fullStr	Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов
title_full_unstemmed	Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов
title_sort	конструирование днк-зонда с использованием соли серебра. 3. дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1996
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154174
citation_txt	Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов / А.В. Шугалий, М.В, Личина // Биополимеры и клетка. — 1996. — Т. 12, № 5. — С. 29-33. — Бібліогр.: 10 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT šugalijav konstruirovaniednkzondasispolʹzovaniemsoliserebra3dozirovannaâmodifikaciâdvunitčatogozondaidostraivaniegibridov AT ličinamv konstruirovaniednkzondasispolʹzovaniemsoliserebra3dozirovannaâmodifikaciâdvunitčatogozondaidostraivaniegibridov
first_indexed	2025-07-14T05:48:58Z
last_indexed	2025-07-14T05:48:58Z
_version_	1837600231682736128
fulltext	ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1996. Т. 12. № 5 Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов А. В. Шугалий, М. В, Личина Институт химической физики в Черноголовке Российской академии наук 142432, Московская обл. Рассмотрены варианты получения окрашенного зонда с использованием метал- локомплекса, включающего этаноламино-формальдегидные цепочки, образую- щие координационные связи с ионом серебра. Модификацию проводили на полно- стью денатурированной ДНК, частично расплетенных с помощью формальдеги- да молекулах, а также дуплексах зонд — матрица за счет разветвления уже сформированной структуры олигомерных цепочек. С использованием последнего варианта окраски при степени модификации зонда **10% достигнутая чувстви- тельность детектирования иммобилизованной на нитроцеллюлозных мембра- нах ДНК составила десятки пикограммов. Введение. В предыдущих работах серии [1, 2] мы проанализировали возможный механизм формирования окраски ДНК за счет образования на амино/имино группах оснований этаноламино-формальдегидных цепочек NC5H1304. В зависимости от условий реакции цвет металлокомплексов менялся от фиолетового (единственная связанная с Ag элементарная цепоч- ка) до оранжево-красного (4—6 цепочек) [1]. На однонитчатой ДНК фиолетовая окраска развивается достаточно быстро, однако наблюдается существенный проигрыш в интенсивности по сравнению с медленноформи- рующейся красно-оранжевой окраской комплекса [2 ]. Кроме выбора окраски и, следовательно, конкретных условий инкуба- ции зонда, следует иметь в виду и такой немаловажный факт, как распределение модифицированных оснований вдоль зонда. При использова- нии денатурированной ДНК мы получаем, очевидно, случайное распределе- ние «меченых» оснований. Присоединение окрашенной цепочки происходит по амино/имино группами, т. е. по тем сайтам оснований, которые участвуют в последующем образовании дуплекса при гибридизации. Подо- бное обстоятельство, естественно, несколько ухудшает как возможность образования «ядра» в процессе поиска комплементарных участков зонд — матрица, так и последующий процесс «зашнуровывания» цепи. Оценки дают различные значения снижения стабильности дуплексов при наличии в них модифицированных оснований, но в среднем это 0,7 °С на 1 % модификации [3]. Указанные обстоятельства — негативные последствия случайного рас- пределения вдоль зонда модифицированных оснований и недостаточная •Correspondence address. © А- В. ШУГАЛИЙ, М. В. ЛИЧИНА, 1996 29 ШУГАЛИЙ А. В., ЛИЧИНА М. В. интенсивность окраски зонда при приемлемых временах инкубации — мы постарались преодолеть благодаря двум приемам. Первый состоит в дозиро- ванной модификации двунитчатого зонда в процессе его расплетания формальдегидом. В ходе реакции модифицируются легкоплавкие, наиболее доступные для расплетания участки при минимальной инициации новых центров расплетания, по крайней мере, за времена для получения 10— 15 % модификации. Этим мы достигаем сгруппированность модифициро- ванных оснований на ограниченных участках молекулы, а протяженные области зонда остаются нативными. Второй прием — это дополнительное окрашивание комплекса («достраивание»), но не в ДНК-зонде, а уже в составе гибрида. Формирование оранжево-красной окраски на зонде, если проводить начальную реакцию в соответствующих условиях, происходит за десятки часов [2]. Кроме того, разветвленная структура металлокомплекса может явиться серьезным стерическим препятствием при комплементарном спаривании. Проведя достраивание, во-первых, мы избегаем какого-либо разветвления цепочки на зонде до гибридизации, а во-вторых — повышаем интенсивность окраски. Материалы и методы. Получение зонда. Р а с п л е т а н и е ДНК ф о- р м а л ь д е г и д о м . ДНК бактериофага Я была расплетена на 10 % с помощью 3,7 %-го формальдегида при 30 °С в течение 40—45 мин. К 0,028 мл 37 %-го формальдегида добавили 0,12 мл MspL-фрагментов ДНК фага Я (» 20 мкг) в 0,05 М боратном буфере, рН 8,5, и 0,131 мл 0,05 М боратного буфера. Оптическую плотность ДНК при расплетании регистри- ровали спектрометрически, после достижения необходимого расплетания препарат диализовали против 0,05 М боратного буфера для удаления свободного формальдегида. О к р а ш и в а н и е ч а с т и ч н о р а с п л е т е н н о й и о д- н о н и т ч а т о й ДНК. Исходная реакционная смесь содержала 5 мл 0,05 М боратного буфера, 0,513 мл этаноламина, 0,475 мл 10 %-й лимон- ной кислоты и 2,5 мг азотнокислого серебра. Этаноламин предварительно разбавляли в 10 раз 0,05 М боратным буфером. Затем к 2,47 мл этой смеси добавляли 0,28 мл частично расплетенной ДНК. Порция содержала 8—10 мкг препарата. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 3 ч, что приводило к желтой окраске раствора. После диализа против 0,002 М Na-ацетатного буфера, рН 7,48, цвет опытных образцов не изменялся. Для окрашивания однонитчатой ДНК к 2,47 мл исходной реакционной смеси (см. выше) добавляли 0,015 мл 30 %-го формальдегида (или 0,008 мл 37 %-го), однонитчатую ДНК в количестве 8—10 мкг и инкубировали при комнатной температуре для достижения нужной степени модификации. Диализ осуществляли так же, как для двунитчатого зонда. Однонитчатую форму ДНК фага Я получали нагреванием ее исходного дуплекса до 95 °С и быстрым охлаждением во льду. Гибридизация гидролизата Mspl/X с окрашенным зондом. Н а н е с е - н и е г и д р о л и з а т а н а н и т р о ц е л л ю л о з н у ю м е м - б р а н у . Гидролизат кипятили в течение 10 мин на водяной бане и охлаждали во льду. Затем на нитроцеллюлозную (НЦ) мембрану наносили по 1 мкл гидролизата разной концентрации для получения суммарных количеств ДНК в пятне (рис. 2). Высушенные мембраны с нанесенным гидролизатом запекали в течение 2 ч при 80 °С в вакуумной печи. П р е д г и б р и д и з а ц и я . НЦ-мембраны с нанесенным гидролизатом Mspl/X вымачивали в 0,015 М растворе ацетата Na и помещали на дно плоскодонной стеклянной емкости. В нее наливали необходимое количество раствора для предгибридизации с таким расчетом, чтобы раствор полностью покрывал поверхность мембраны. Раствор содер- жал 9,0 мл 0,3 М ацетата Na, 1,0 мл 1 %-го фиккола, 0,1 мл фрагменти- 30 КОНСТРУИРОВАНИЕ ДНК-ЗОНДА ДОЗИРОВАННАЯ МОДИФИКАЦИЯ рованной денатурированной ДНК селезенки быка (коммерческий препарат) в концентрации 10 мг/мл. Предгибридизацию проводили при 35 °С в течение 5 ч. Г и б р и д и з а ц и я . Окрашенный зонд денатурировали при 90 °С в течение 3 мин, затем 0,72 мл зонда в концентрации « 4 мкг/мл добавляли в раствор для предгибридизации и инкубировали 110 ч при 35 °С. П р о м ы в к а НЦ-м е м б р а н. Мембраны промывали 0,1 М раствором цитрата Na (из расчета по 1 мл раствора на 1 см2 мембраны) 4 раза по 10 мин при комнатной температуре и 2 раза по 1,5 ч при 30 °С. Дополнительное окрашивание (достраивание) зонда. Раствор для ок- рашивания содержал 0,02 М цитрат Na, 0,1 %-й формальдегид, 0,1 мг/мл азотнокислого серебра. Реакцию проводили при комнатной температуре, изменение окраски пятна в сторону красно-оранжевого цвета и увеличение интенсивности реакции происходило уже через 1—2 ч инкубации. Рестрикция ДНК фага А. Обработку ДНК эндонуклеазой Mspl осуще- ствляли по стандартной методике [4], реакционная смесь включала 10 мМ трис-НС1-буфер, рН 7,4, 10 мМ MgCl2, 6 мМ КС1, 1 мМ дитиотреитол, 100 мг/мл альбумина. Соотношение фёрмент:ДНК составляло 5:1. Окрашенные пятна на мембранах фотографировали при дневном освещении на фотоплен- ку «Микрат-изопан». Результаты и обсуждение. Используя кинетическую кривую развития окраски на денатурированной ДНК (рис. 1, а), мы выбрали время инкуба- ции для достижения 10 %-й модификации, составляющее 2,5 ч. Зондом служили, таким образом, окрашенные MspZ-фрагменты ДНК фага Я. При гибридизации зонда с нанесенным на НЦ-мембрану гидролизатом Mspl/Я получена картина, представленная на рис. 2, а. Минимально детектируемое количество ДНК в пятне составило в данном случае 200 пг. Для повышения чувствительности мы попытались получить меченый зонд, в котором модифицированные основания распределены не по всей длине молекулы, а по возможности сгруппированы на ограниченных участ- ках. Наиболее простой путь — модификация частично деспирализованной ДНК при малых степенях денатурации. Участки локальной деспирализа- ции, доступные для окраски, в этом случае довольно редки и, что наиболее важно, представляют собой дискретные кластеры. Это наглядно демонстри- руют ставшие уже классическими электронно-микроскопические снимки частично деспирализованной фага ДНК Я при малых степенях расплетания Поскольку фиксация подобных состояний при температурной денатура- ции — достаточно трудоемкий и многостадийный процесс [7 ], мы использо- [5, 6]. Рис. 1. Изменение во времени степени окраски денатурированной ДНК, вы- раженной в процентах ее модифика- ции металлокомплексом (а), и деспи- рализация ДНК формальдегидом (б) 31 ШУГАЛИЙ А. В., ЛИЧИНА М. В. Рис. 2. Гибридизация MspL-фрагментов ДНК фага Я с гомологичным зондом, окрашенным в различных условию: а — денатурированная ДНК, модифицированная на 10 %; б — нативная ДНК, расплетенная формальдегидом на 10 %; в — то же, что б, но с последующим достраиванием окрашенного зонда в составе гибрида. Цифры около пятен отвечают количеству нанесенного на мембрану Mspl- гидролизата ДНК Я вали расплетание ДНК формальдегидом. Кроме очевидного удобства полу- чения частично деспирализованных молекул на разных стадиях расплете- ния, для реакции используется тот же реагент, что и при последующей окраске. Начальный участок кривой расплетания ДНК Я представлен на рис. 1, б, время для достижения 10 %-й деспирализации составило в наших экспериментальных условиях 40—45 мин. После этого препарат зонда диализовали, подвергали полной температурной денатурации и использова- ли в гибридизации, как описано в методике. Полученная картина гибридизации представлена на рис. 2, б, достигнут —3-кратный выигрыш в чувствительности по сравнению с вариантом окра- шивания денатурированного зонда. Дальнейшее снижение предела детекти- рования мы получили, проведя дополнительное окрашивание уже образо- ванного дуплекса зонд — матрица, иммобилизованного на мембране (см. методику). Отсутствие в реакционной смеси этаноламина предотвращает инициацию новых цепей на свободных амино/имино группах оснований, что приводит к неспецифическому окрашиванию всех доступных для реакции свободных (не вовлеченных в дуплекс) оснований. В наших условиях реакции мы достигаем только разветвления уже образованных цепей [1 ], при этом интенсивность окраски пятна на мембране заметно увеличивается уже через 1—2 ч инкубации. Фотографии пятен для случая достраивания приведены на рис. 2, в. Детектируется ~20 пг материала в пятне, что на порядок величины меньше, чем при окраске денатурированного зонда (рис. 2, а) и сравнимо с чувствительностью других используемых в практике неизотопных методов, а в некоторых случаях и превосходит их [8, 9]. Лабильность координационных связей Ag — лиганд в металлокомплексе накладывает определенные ограничения на величину рН среды и темпера- турный режим работы с зондом. Формирование окраски происходит при рН 7,4—8,8 [1 ]. В более кислой среде резко повышается скорость гидролиза полиформальдегидной цепочки [10], что смещает равновесие в реакции в сторону диссоциации цепочки на мономерные звенья. В щелочной среде (рН > 9) происходит восстановление серебра и его выпадение в осадок. Нагревание вызывает разрыв координационных связей только после 10—15-мин кипячения, но при последующем охлаждении зсе связи (и, следовательно, окраска зонда) восстанавливаются. Окрашенный зонд не рекомендуется замораживать, сохранять следует при температуре холодиль- ника 5 °С) — он не теряет своих характеристик цветности, по крайней мере, в течение нескольких месяцев. 32 КОНСТРУИРОВАНИЕ ДНК-ЗОВДА ДОЗИРОВАННАЯ МОДИФИКАЦИЯ Таким образом, зонд, содержащий кластерированные участки модифи- кации, которые затем «достраиваются» по предложенной методике, позво- ляет уверенно детектировать количества ДНК на мембране, составляющие десятки пикограммов. Доступность реагентов, устойчивость окраски, про- стота всех операций окрашивания и детектирования являются существенны- ми преимуществами предложенной схемы получения окрашенного зонда, обладающего достаточной чувствительностью для контрастирования средне- и редкоповторяющихся генных участков ДНК животного происхождения. О. В. Шугалій, М. В. Личина Конструювання ДНК-зонда з використанням солі срібла. 3. Дозова модифікація двохнитчатого зонда та добудова гібридів Резюме Розглянуто варіанти отримання забарвленого зонда з використанням металокомплексу, який містить еталонаміно-формальдегідні ланцюжки, що утворюють координаційні зв'язки з іонами срібла. Модифікацію здійснювали на повністю денатурованій ДНК, частково розплетених за до- помогою формальдегіду молекулах, а також дуплексах зонд — матриця за рахунок розгалуження уже сформованої структури олігомерних ланцюжків. Застосовуючи останній варіант забарвлен- ня, при ступені денатурації ~ 10 % досягнута чутливість детектування іммобілізованої на нітроцелюлозних мембранах ДНК склала десятки пікограмів. А. V. Shugalii, М. V. Uchina DNA probe construction with the use of silver salt. 3. Dosed modification of two-stranded probe and additional colouring of hybrids Summary The different ways of the coloured probe preparation with the use of the metal complex comprising ethanol- amine-formaldehyde chains forming coordination bonds with silver ions have been discussed. The denatu- rated DNA, partially unwind with formaldehyde molecules, and the probe-template duplexes have been modified on the basis of the branching of oligomer chains already formed. The sensitivity of the detection of 10 % -modified DNA immobilized on nitrocellulose filters has reached dozens of picogramms. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Личина M. В., Шугалий А. В. Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 1. Образование и характеристика олигомерных окрашенных цепей / / Биополи- меры и клетка.—1994.—10, № 2.— С. 38—44. 2. Личина М. В., Шугалий А. В. Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 2. Окрашивание мономера и однонитчатой ДНК / / Там же.—№ 5.—С. 98—106. 3. Прима В. И., Тарантул В. 3., Шугалий А. ВГазарян К Г. Реассоциация ДНК: физические и биологические аспекты / / Укр. біохім. журн.—1974.—46, № 2.—С. 255— 271. 4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж Молекулярное клонирование.—M.: Мир, 1984.— 479 с. 5. Inman R. В. Denaturation maps of the left and right sides of the lambda DNA molecule determined by electron microscopy / / J. Мої. Biol.—1967.—28, N 1.—P. 103—116. 6. Inman R. ВSchnos M. Partial denaturation of thymine and 5-bromouracil-containing X DNA in alkali / / Ibid.—1970.—49, N 1.—P. 93—98. 7. Шугалий А. В., Маняков В. Ф., Герман А. В. Электронная микроскопия частично денатурированных молекул ДНК / / Молекуляр. биология.—1972.—6, № 6.—С. 902— 907. 8. Бадаиікеева А. Г., Зарытова В. Ф. Меченные биотином олигонуклеотидные зонды в методике молекулярной гибридизации / / Там же.—1989.—23, № 5.—С. 1221—1226. 9. Lee A. S. G., McGee J. О. D. The signal intensity on Southern blots developed by nonisotopic methods is linear with time and quantity of DNA / / Nucl. Acids Res.—1989.—17, N 6.—P. 2364. 10. Чичибабин Л. E. Основные начала органической химии.—М.: ГХИ, 1963.—Т. 1.—910 с. удк 577.11.4:577.336 Поступила в редакцию 16.11.95 33

Конструирование ДНК-зонда с использованием соли серебра. 3. Дозированная модификация двунитчатого зонда и достраивание гибридов

Institution

Similar Items