Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином

Рассмотрены биохимические, химические и физические подходы к изучению строения гирудина и механизма ингибирования им тромбина. Результаты этих исследований открывают путь для создания синтетических ингибиторов тромбина нового типа....

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1992
Автор:	Гершкович, А.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1992
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Обзоры
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154238
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином / А.А. Гершкович // Биополимеры и клетка. — 1992. — Т. 8, № 1. — С. 5-22. — Бібліогр.: 56 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-154238
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1542382019-06-16T01:28:50Z Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином Гершкович, А.А. Обзоры Рассмотрены биохимические, химические и физические подходы к изучению строения гирудина и механизма ингибирования им тромбина. Результаты этих исследований открывают путь для создания синтетических ингибиторов тромбина нового типа. Розглянуто біохімічні, хімічні та фізичні підходи до вивчення будови гірудина і механізму пригнічення їм тромбіна. Результати цих досліджень відкривають шлях до створення синтетичних інгібіторів тромбіна нового типу. Biochemical, chemical and physical methods for study of hirudin-thrombin bounding mechanisms are reviewed. Perspectives of the clinical usage of recombinant hirudin and its small synthetic fragments are observed. The possibility for designing of novel drugs based on the studied hirudin-thrombin interaction mechanisms is shown on example of syntheic hirudin-like inhibitors «hirulogs». 1992 Article Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином / А.А. Гершкович // Биополимеры и клетка. — 1992. — Т. 8, № 1. — С. 5-22. — Бібліогр.: 56 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00030A http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154238 577.157.2 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Обзоры Обзоры
spellingShingle	Обзоры Обзоры Гершкович, А.А. Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином Биополимеры и клетка
description	Рассмотрены биохимические, химические и физические подходы к изучению строения гирудина и механизма ингибирования им тромбина. Результаты этих исследований открывают путь для создания синтетических ингибиторов тромбина нового типа.
format	Article
author	Гершкович, А.А.
author_facet	Гершкович, А.А.
author_sort	Гершкович, А.А.
title	Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином
title_short	Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином
title_full	Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином
title_fullStr	Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином
title_full_unstemmed	Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином
title_sort	молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1992
topic_facet	Обзоры
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154238
citation_txt	Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином / А.А. Гершкович // Биополимеры и клетка. — 1992. — Т. 8, № 1. — С. 5-22. — Бібліогр.: 56 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT gerškovičaa molekulârnyeosnovyvzaimodejstviâgirudinastrombinom
first_indexed	2025-07-14T05:53:57Z
last_indexed	2025-07-14T05:53:57Z
_version_	1837600539237416960
fulltext	H Обзоры УДК 577.157.2 А. А. Гершкович МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГИРУДИНА С ТРОМБИНОМ Рассмотрены биохимические, химические и физические подходы к изучению строения гирудина и механизма ингибирования им тромбина. Результаты этих исследований от- крывают путь для создания синтетических ингибиторов тромбина нового типа. Введение. Тромбин (Е. С. 3. 4. 13) —ключевой фермент системы свер- тывания крови на протяжении многих лет является объектом интенсив- ных научных исследований [1]. В сферу изучения гемостаза попада- ют не только тромбин и другие регуляторные ферменты, но также их природные и искусственные регуляторы — активаторы и ингибиторы. Среди природных ингибиторов тромбина лучшим является гирудин — небольшой белок, производимый слюнными железами медицинской пиявки, Hirudo medicinalis. Гирудин хорошо связывается с тромбином (Kd ~ IO-12 м о л ь / л ) , предотвращая таким образом расщепление фибриногена и образование сгустка. Естественно, ученые возлагают большие надежды на исполь- зование этого отличного антикоагулянта в медицинской практике. Более 100 лет тому назад, в 1884 году, Д . Хэйграфт, работавший в Страсбурге, обнаружил, что медицинские пиявки содержат вещество, обладающее антикоагулянтной активностью [2]. В последующие годы врачи использовали водные вытяжки из пиявок и только в 1904 году Якоби [3] выделил неочищенный гирудин и дал ему название, а очис- тил и охарактеризовал его в 1937 г. известный немецкий ученый Марк- вардт [4]. Основным препятствием для использования гирудина в кли- нике была сложность получения его в больших количествах, поэтому можно утверждать, что отдаленной целью всех описанных ниже иссле- дований было получение искусственным путем гирудина или его ана- логов и активных фрагментов. Эти работы имели также важное значе- ние при изучении природы взаимодействия тромбина с другими высоко- молекулярными субстратами (и ингибиторами): фибриногеном, анти- тромбином, гепарином, тромбомодулином и др. [1]. Кроме того, они вносят весомый вклад в общую проблему белок-белкового узнавания, являющуюся одной из самых важных в современной биоорганической химии и молекулярной биологии. Ввиду того, что гирудин образует с тромбином высокоспецифиче- скпй комплекс, назначение отдельных деталей его строения может быть понято только при изучении взаимодействия этих биополимеров. По- этому целееOOбρ азно начать наш обзор с краткого изложения структур- но-функциональных особенностей тромбина. Протеолитическая специфичность тромбина. В настоящее время тромбин хорошо изучен и описан в ряде монографий и обзоров [1, 5—7]. Он является трипсиноподобной протеазой, но обладает более слабыми ферментативными свойствами, чем трипсин, при расщеплении пептидных связей, образованных остатками аргинина или лизина. Ha- © А. А. ГЕРШКОВИЧ, 1992 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 1 пример, тромбин расщепляет в своем главном физиологическом суб- страте фибриногене только 4 из 376 чувствительных к действию трип- сина связей (причем это четыре связи аргинин — глицин), ЧТО приво- дит к отщеплению двух пар N-концевых пептидов — фибринопептидов А и В от Aa- и Ββ-цепей фибриногена, к образованию фибрина и его дальнейшей полимеризации. Многолетние исследования позволили вы- яснить некоторые особенности строения тромбина, обусловливающие его высокую специфичность: «карман» первичного связывания хуже подогнан к специфическим субстратам, чем у трипсина [6], рядом с активным центром расположен вторичный аполярный связы- вающий участок, который вно- сит значительный вклад в ка- тализ; кроме этих сайтов, Рис. 1. Схематическое изображение связывающих участков тромбина: 1 — к а т а л и т и ч е с к и й центр; 2 — а н и - он-связывающий участок; 3 — апо- лярный связывающий участок; 4 — углеводная цепь; 5 — пептидный суб- страт [8] связывания белковых субст- ратов или «анион-связывающий участок» [7, 8] (рис. 1). Из-за пере- численных особенностей строения тромбин в общем плохо расщепляет связи, соответствующие только его первичной специфичности (опреде- ляемой остатками аргинина или лизина) ; лучше, если субстраты имеют слева от расщепляемой связи (в положении P 3 по классификации Шех- тера и Бергера [9]) гидрофобную аминокислоту, которая взаимодейст- вует с аполярным связывающим центром (вторичная специфичность); и особенно эффективно — субстраты, взаимодействующие по всем трем указанным сайтам. Этому требованию отвечает фибриноген. Рентгс- ноструктурный анализ тромбина человека [10, 11] в целом подтвердил наличие трех вышеуказанных связывающих участков в молекуле и позволил точно локализовать их в трехмерной структуре тромбина. Особый интерес представляет удаленный от активного центра «анион-связывающий участок», отсутствующий в автолитических про- изводных тромбина — его β- и γ-формах, что связывают с выщеплени- ем в них основного пептида — фрагмента В-цепи 63—74 [1, 6, 7]. По- казательно, что β- и γ-тромбины расщепляют эфирные и амидные суб- страты с такой же эффективностью, как и нативный α-тромбин, однако при расщеплении ими фибриногена она уменьшается до величины (kcai/Км), приблизительно в 2500 раз меньшей, чем в случае расщеп- ления а-тромбичом [12]. Поэтому указанные формы тромбина практи- чески не обладают свертывающей активностью. По-видимому, тот факт, что взаимодействие тромбина с гирудином изучалось почти во всех лабораториях, исследующих тромбин, связан с повышенным ин- тересом ученых именно к строению и локализации «анион-связывающе- го участка» в тромбине. Структурные особенности гирудина. Гирудин, 65-членный белок из H. Jfiedicinalis1 впервые был очищен и охарактеризован Марквардтом [4], а его аминокислотная последовательность установлена Додтом с соавт. [13] и уточнена Мао с соавт. [14] (рис. 2) . Молекулярная мас- са гирудина составляет 7000 и несколько колеблется у разных исследо- вателей из-за существования трех типов гомологичных гирудинов: наи- более изученного HVl [13], а также двух других форм — HV2 [15] и HV3 [16], гомология которых по первичной структуре составляет 85— 90 %, причем все они содержат в С-концевой части молекулы сульфи- рованный тирозин. Ввиду того, что большинство исследователей рабо- тало с гирудином H V l , мы будем называть «гирудином» именно эту имеется еще отдаленный участок 16 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 6 форму, в случае необходимости уточняя, с какой формой проводили исследования. Гирудин является одноцепочечным белком, содержащим шесть ос- татков цистеина, соединенных тремя дисульфидными мостиками. По данным работы [14], в положении 33 полипептидной цепи скорее со- держится остаток аспарагина, чем аспарагиновой кислоты. При рас- смотрении первичной структуры гирудина обращают на себя внимание следующие ее особенности: на небольшом отрезке из 9 аминокислот (участок 55—64) содержатся 6 отрицательно заряженных остатков, Рис. 2. Аминокислотная последовательность гирудина: 1 — N-концевой фрагмент; 2 — центральный кор; 3 — последовательность, гомологичная расщепляемому участку в протромбине; 4 — С-концевой участок включая сульфированный Туг-63; участок цепи 6—39 представляет со- бой компактный кор, сшитый дисульфидными мостиками, в то время как С-копцевой участок (40—65) и N-концевая часть молекулы (1—5) являются подвижными относительно кора. Ченг [14] обратил внима- ние на обратную гомологию участка 46—65 с фибринопептидами А и В, а Дегриз с соавт. [18] отметили гомологичность центрального участка гирудина 40—47 расщепляемому тромбином сайту в протром- бине. Таким образом, простой анализ аминокислотной последователь- ности позволил предположить наличие в гирудине по крайней мере двух участков связывания с тромбином: отрицательно заряженного С-концевого сегмента 55—65 и участка 40—50 (при этом допускалось, что остаток Lys-47 связывается в «кармане» активного центра тром- бина [18]). Анализ С-концевого участка по методу Чоу и Фасмана [3] пока- зал возможность образования им α-спиральной конформации. Изобра- жение этого сегмента в виде «колеса Эдмундсона» [3] допускает ве- роятность формы амфифильной искаженной спирали, в которой все гидрофобные остатки расположены по одну сторону спирали, а гид- рофильные— по другую (рис. 3). Авторы этой работы предположили, что такая амфифильная спиральная структура С-концевого сегмента может быть вполне пригодной для взаимодействия с анион-связываю- щим центром тромбина. Более существенные данные о пространственной' структуре гиру- дина получены при его изучении методом ЯМР в водном растворе. Было показано, что молекула состоит из трех доменов: центрального кора, состоящего из остатков 3—30, 37—46 и 56—57; выступающего «штифта» из остатков 31—36, образующих антипараллельную β-струк- туру, и экспонированной наружу петли, формируемой остатками сег- мента 47—55 [19]. Структура каждого домена относительно хорошо разрешена, однако ориентация двух минорных доменов относительно центрального кора не определена, так как в двухмерном ЯМР-спектре дальнодействующие протонные взаимодействия не наблюдались. Цент- ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 7 ральный кор стабилизируется тремя дисульфидными мостиками, име- ются две β-структуры (15—22 и 35—42) и участки нерегулярного клуб- ка 1—5, 13—14 и 42—65 [20]. Так как расчеты методами молекулярной динамики показали возможность свободного перемещения двух минор- IIbix доменов относительно кора, авторы работы [19] предположили, что это может иметь функциональное значение: минорные N- и С-кон- цевые домены способны действовать как «щупальцы» при связывании гирудина с тромбином. Изучение структуры гирудина методом ЯМР позволило позднее получить дополнительные данные [21]. При изучении природного гиру- дина и его рекомбинантного аналога, в котором Lys-47 заменяли на Рис. 3. Д и а г р а м м а фрагмента гирудина 54—65 в виде «колеса Эдмундсона», показы- вающая распределение аминокислот в α-спиральной конформации [3] Рис. 4. Пространственная структура гирудина в водном растворе по данным Я М Р . Стрелками указаны β-складки; в виде ленты показны области петель, образуемых по- липсптидион цепью; пунктирной линией — сегменты, плохо разрешаемые ЯМР, и зиг- загообразными линиями — дисульфидные связи [22] Glu (r-IIir-Glu-47), была хорошо разрешена структура фрагментов 2— 30 и 37—48 и показано, что произведенная замена остатка Lys-47 вы- зывает различимый, но очень слабый эффект на пространственную структуру молекулы. Изучение структуры рекомбинантного десульфированного гируди- на методом ЯМР в растворе было предпринято также Харуйяма с со- авт. [22]. Полученная ими картина очень похожа на описанную нами выше: остатки 3—30 и 37—48 образуют плотный кор с двумя анти- параллельными β-складками и несколькими хорошо определяемыми поворотами. Хорошо идентифицированы также три дисульфидные свя- з и — 6—14, 16—28 и 22—39. Однако метод не позволяет найти пред- почтительную конформацию фрагмента 49—65 и петли, образуемой сегментом 31—36. Пространственная структура гирудина, полученная на основании этих исследований, изображена на рис. 4. Исходя из сведений о первичной и вторичной структурах гирудина (особенности первичной структуры, наличие β-складок, организация компактного центрального кора молекулы и двух подвижных минорных N- и С-концевых доменов) авторы цитируемых работ могли выдвигать довольно правдоподобные гипотезы о механизмах взаимодействия ги- рудина с тромбином, однако достоверными можно считать данные, по- лученные только в результате изучения взаимодействия этих молекул. В следующих разделах будет показано, как решалась эта задача с помощью комплекса современных методов исследования — биохимиче- ских, химических и физических. Результаты таких исследований в на- стоящем обзоре изложены не в хронологическим порядке, а условно разнесены по разделам, так как такой подход, по мнению автора, хо- рошо иллюстрирует возможности каждого метода для решения задач белок-белкового узнавания. Однако следует отметить, что работы с 16 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 8 использованием разных подходов велись параллельно, дополняя и уточняя друг друга. Биохимические методы. В данном разделе изложены результаты изучения взаимодействия гирудин — тромбин как традиционными био- химическими методами (различные модификации фермента или инги- битора и т. п.), так и современными методами получения «мутантных» белков посредством сайт-специфического мутагенеза. Прежде всего рассмотрим исследование влияния различных моди- фицирующих агентов на способность гирудина сохранять связывающую активность по отношению к тром- бину [23]. В этом случае использо- вали надмуравьиную кислоту, нат- рийборгидрид, диазометан, уксус- ный ангидрид, 2, 4-динитрофторбен- зол, циановокислый калий и некото- рые другие агенты. На основании проведенных экспериментов был сделан вывод о том, что для эффек- тивного ингибирования тромбина в Рис. 5. Влияние ионной силы на энергию связывания комплекса гирудин — тромбин: 1 — природный гирудин; 2 •— рекомбинант- ный гирудин; 3 — глутамин 6 2 -гирудин; 4 — глутамин 57- 5 8-гирудин; 5 — глута- м и н 57 , 58 , 6 2 . Г И р у Д И Н ; β глута- м и н 5 7 , 5 8 , 61, 6 2 _ Г И р у д И Н [ 2 4 ] гирудине важна сохранность дисульфидных связей, а также наличие кар- боксильных и, в меньшей степени, аминогрупп, что позволяет предполо- жить важность компактной структуры центрального кора и существен- ный вклад в связывание электростатических сил. Кроме того, было показано, что остаток гистидина, по-видимому, более значителен, чем остаток тирозина и С-концевая аминокислота. Отмечено также, что действие на гирудин денатурирующих агентов (50—100 % этанола, 100 % муравьиной кислоты, 8 M мочевины и щелочи (рН 12)) не влия- ет на его способность связываться с тромбином [29]. На основании этих данных можно сделать вывод об устойчивости молекулы гирудина, которая обусловлена компактностью центрально- го кора, и решающей роли этой структуры в физиологически важной конформации молекулы. Д л я изучения влияния ионной силы на кинетику взаимодействия гирудина с тромбином Стоун с соавт. [24] исследовали взаимодейст- вие различных рекомбинантиых гирудинов (r-Hir) , которые отличались количеством отрицательно заряженных остатков в С-концевой части молекулы и содержали несульфированный тирозин. В частности, сравнивали связывание нативного гирудина (Ніг), рекомбинантного гирудина и четырех его аналогов, в которых остатки глутаминовой кис- лоты заменяли на глутамин: r -Hir-Gln^) ; r-Hir-Gln^57), Gln^58); r-Hir- Gln<57), Glr#2); r-Hir-Gln<57>, Gln<58>, Gln<61), Gln<62). Вклад неион- ных взаимодействий был одинаковым для всех типов исследуемых со- единений, в то время как ионный вклад варьировал с изменением за- ряда молекулы (рис. 5) : каждый остаток глутаминовой кислоты давал приблизительно равный вклад — 4 кДж/моль . Д л я нативного гирудина ионные взаимодействия составляют 32 % от общей связывающей энер- гии (при ионной силе, равной нулю). В работе [25] сделана попытка разделить вклады во взаимодейст- вие с гирудином в районе активного центра тромбина и его анион-евя- зывающего участка. Д л я этого определяли константу диссоциации ги- рудин-тромбинового комплекса, варьируя концентрации гирудина при 16 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 9 постоянных концентрациях тромбина и трипептидного хромогенного субстрата. Зависимость константы диссоциации комплекса от концент- рации субстрата предполагает наличие у тромбина высокоаффинного связывающего участка Д Л Я субстрата, который можно идентифициро- вать с активным центром фермента. Константа диссоциации заметно зависит от ионной силы (что подтверждает важность ионных взаимо- действий) и скорость диссоциации комплекса не зависит от связывания субстрата в активном центре фермента (т. е., по-видимому, гирудин не взаимодействует с активным центром тромбина) . Додт с соавт. [26] изучали кинетику образования гирудин-тромби- нового комплекса, используя различные рекомбинантные гирудины со следующими заменами в аминокислотной последовательности: Пе-27, Glu-27, Ile-36, Glu-36, Ile-47, Glu-47, Leu-5l и Asp-51. Сравнительно с незамещенным рекомбинантиым гирудином отмечалось значительное увеличение константы ингибирования при замене Lys-47 на глутамино- вую кислоту и слабое ее изменение при замене других основных ами- нокислот. Авторы работы [26] предположили, что чувствительность Lys-47 к модификации указывает на влияние этого остатка на стабиль- ность комплекса, определяя возможность его связывания со специфи- ческим «карманом» активного центра тромбина. Предполагается так- же, что большая скорость образования комплекса и ее зависимость от ионной силы свидетельствуют в пользу того, что процесс этот является реакцией, контролируемой диффузией, и включает ионные взаимодей- ствия. Возможно, удаленный участок связывания с тромбином форми- руется протяженной поверхностью гидрофильных и заряженных остат- ков центрального кора с С-концевым сегментом. В одной из первых работ в этом направлении Ченг [17] показал, что удаление С-концевых аминокислот у пативного гирудина фермен- тативным или химическим способами ведет к полной потере ингибитор- ной активности, на основании чего делается вывод о большом значении С-концевого сегмента. В этой работе предполагается наличие в «реак- тивном» центре гирудина остатка Lys-47, что свидетельствует о перво- степенной важности доменной структуры гирудина для взаимодействия с тромбином. Дегриз с соавт. [18] изучали влияние замен в гирудине HV2 ос- татков, гомологичных гирудину HVl ,— в положении 47 в нем находит- ся Asn, а в положении 35 — Lys. Были получены рекомбинантные ана- логи HV2 со следующими заменами: Lys-47, Arg-47, Lys-47 и Thr-35. Ввиду того, что остатки в положениях 35 и 47 находятся в сегменте 40—47, гомологичном расщепляемому тромбином участку протромби- на, предполагалось большое значение этого сегмента для связывания. Кинешческие исследования показали, что константы диссоциации ком- плекса при замене Asn-47 на Lys или Arg уменьшаются в 5—14 раз по сравнению с немодифицированным LIV2, в то время как замена Lys-35 влияния не оказывает. Авторы считают, что эти данные под- тверждают предполагаемую важность отмеченного ими протромбино- подобного домена 40—47 для связывания с тромбином. В работе [27] изучено взаимодействие рекомбинантных гируди- нов, в которых каждый из трех остатков лизина и гистидин заменяли нейтральным остатком глутамина. Замена Lys-47 внесла незначитель- ное изменение в величину константы диссоциации комплекса (увеличе- ние в 9 раз ) , в то время как другие «мутации» были неэффективными. Это указывает на то, что для гирудина в отличие от большинства других ингибиторов сериновых протеаз взаимодействие со специфиче- ским «карманом» в активном центре фермента не имеет решающего значення при ингибировании. Мы рассмотрели модификации гирудина, главным образом, в его центральном и С-концевом участках, однако значительный ш-перес представляют также исследования Уоллэса с соавт. [28] по влиянию модификаций в N-концевой части гирудина на его ингибирующую ак- тивность. Д л я этого использовали сайт-специфический мутагенез и хи- 10 ISSN 0233-7(357. Ы Ю П О Л ILMEPbI II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 1 мические модификации. В рекомбииаитиых аналогах гирудина одно- временно заменяли Lys-27 на Gin, Lys-36 на Gln и Lys-47 на Arg и сравнивали сродство такого модифицированного по трем остаткам ги- рудина к тромбину со сродством его химических модификаций по кон- цевой аминогруппе (уксусным ангидридом, ацетилимидатом и глици- ном). Ацетилирование аминогруппы, как и добавление остатка глици- на, значительно повышало константу ингибирования (соответственно в 6,1 и 2,7 тысячи раз) , в то время как ацетимидирование концевой ами- ногруппы (при этом сохранялся положительный заряд) увеличивало ее всего в 17 раз. При модификации незамещенного рекомбинантного гирудина остатками метионина или глицина К% возрастала соответст- венно в 2,4· IO4 и 2-Ю 3 раз. Особый интерес представляют данные по влиянию на Ki замены гидрофобных остатков валина в положениях 1 и 2 полипептидной цепи (табл. 1). Замещение концевых остатков ва- лина на гидрофильные аминокислоты значительно увеличивает конс- танту ингибирования, тогда как замещение их гидрофобными остатка- ми влияет незначительно. На основании этих данных делается вывод о важности положительного заряда на N-конце молекулы дополнительно к его гидрофобности. Кроме того, в этой работе показано, что умень- шение гидрофобности N-концевой части молекулы гирудина снижает на 30 % неионную составляющую связывающей энергии и практически не влияет на ионную. Анализируя высокий вклад концевого гидрофоб- ного дипептида в энергию связывания с тромбином, авторы [28] делают очень важное предположение о возможности контактов этой части мо- лекулы с аполярным связывающим участком вблизи активного центра тромбина. Кроме того, они допускают, что в активном центре тромби- на должен быть кислый остаток для образования солевого мостика с концевой аминогруппой гирудина. Додт с соавт. [29] определили связывающие участки в тромбине для фрагментов гирудина 1—47 и 48—65, в которых остаток Рго-48 был заменен на Ala. Эти фрагменты получили расщеплением рекомбинант- ного гирудина (r-Hir-Ala48) эндопротеиназой Lys-C. Они ингибировали свертывающую активность тромбина с ICso соответственно 0,6 и 4,9 мкмоль/л (для исходного r-Hir она составляет 2,4 нмоль/л, т. е. со- ответственно в 300 и 2000 раз меньше). Было установлено, что С-конце- вой фрагмент 48—65 связывается тромбином на участке В-цепи 62— 74—-в районе анион-связывающего участка, а N-концевой фрагмент 1—47 — с участком в районе 150—151 В-цепи. В работе [30] также использовали большие фрагменты рекомби- нантного гирудина, в котором остаток Asn-52 заменили на метионин, что позволило расщепить его бромцианом на фрагменты r-Hir 1 - 5 2 и r-Hir5 3 - 0 5 . Изучали кинетику ингибирования этими фрагментами тром- бина с целью идентификации участков, с которыми эти белки взаимо- действуют друг с другом. В результате взаимодействия фрагмента 53—65 с тромбином про- исходит уменьшение константы Михаэлиса в 2,5 раза для гидролиза хромогенного субстрата D-Phe-Pip-Arg-pNA, что, по мнению авторов, вызвано незначительными конформационными изменениями в молекуле Т а б л и ц а 1 Константы ингибирования тромбина аналогами гирудина с различными замещениями, двух N-концевых остатков валина [28] Константа инги- Константа инги- Форма гирудина бирования (К {у Форма гирудина бирования (/C1-). η міль/л пмоль/л r - H i r 0 , 2 3 1 r - H i r - G l v 1 , Gly 2 094 ,000 г -Ніг - І Іе 1 , I l e 2 0 , 0 9 9 r - H i r - G l u 1 , Glu 2 67000 ,000 r - H i r - P h e 1 , P h e 2 0 , 2 3 8 r - H i r - L e u 1 0 , 2 3 5 r-Hir-Leu 1 , L e u 2 9 , 9 1 0 r - H i r - L e u 2 10,300 r - H i r - S e r 1 , Ser2 175,000 r -H i r -G lu 1 2 9 5 , 0 0 0 r - H i r - L y s 1 , Lys 2 152,000 r - H i r - G l u 2 248 ,000 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 11 тромбина, которые влияют на его активный центр. Отмечается низкая кооперативность при одновременном использовании фрагментов 1—52 и 53—65: совместно они ингибируют тромбин в IO5 раз хуже, чем ис- ходный рекомбинантный гирудин. Показано, что фрагмент 53—65 за- щищает тромбин от расщепления его трипсином, а фрагмент 1—52 — от расщепления панкреатической эластазой. Эти данные подтверждают предположение о том, что гирудин связывается с выступающей на по- верхности тромбина петлей, которая имеет отношение к его анион-свя- зывающему участку. Интересные исследования проводили по модификации в гирудине остатков тирозина в положениях 3 и 63 полипептидной цепи [31]. Если десульфирование Туг-63 в рекомбинантном гирудине снижает его ак- тивность по сравнению с природным в 6—10 раз, то нитрование или йодирование Туг-63 восстанавливает ее почти до уровня природного ин- гибитора. Однако нитрование Tyr-З, наоборот, в 4—5 раз снижает ак- тивность. Возможно, механизм изменения активности включает умень- шение величины рК гидроксильной группы тирозина в результате вве- дения в его ароматическое ядро таких электроноакцепторных замести- телей, как I- или NOs-rpynnbi, что приводит к увеличению отрицатель- ного заряда при нейтральных значениях рН. В случае Туг-63 это ведет к имитации сульфирования и увеличению сродства к тромбину за счет лучшего связывания с анион-связывающим участком. Однако при модификации Tyr-З снижение рК ОН-группы увеличивает полярность остатка, что может дестабилизировать его вза- имодействие с аполярным связывающим участком вблизи активного центра фермента. Такой механизм подтверждается тем, что замена вы- сококонсервативного остатка Tyr-З на Phe или Trp почти в 2 раза уве- личивает сродство к тромбину, а их йодирование или нитрование ведет к еще большему увеличению сродства (что, возможно, связано с по- вышением гидрофобности остатков в положении 3 полипептидной цепи гирудина). Полученные в работе [31] результаты подтверждают важ- ность N- и С-концевых сегментов для взаимодействия с ферментом. Д о сих пор мы рассматривали изучение образования гирудин-тром- бинового комплекса с использованием различных модификаций моле- кулы гирудина. В ряде работ изучали взаимодействие гирудина (или его фрагментов) с модифицированным тромбином, что также явилось источником ценной информации. Ввиду того, что большое значение в ингибировании тромбина при- давалось наличию в гирудине нескольких кислых остатков в его С-кон- цевой части, предполагалось, что они должны вступать в ионные взаи- модействия с основными аминокислотами, которые расположены на поверхности молекулы тромбина. Исходя из этого Чэнг с соавт. [32] изучили влияние на связывание гирудина с тромбином модификаций различных остатков лизина в ферменте. Модификация остатков лизина в В-цепи тромбина в положениях 21, 52, 65, 106, 107 или 154 вызвала снижение сродства к гирудину в среднем на 2 0 % . Эти результаты подтверждают, что указанные остатки лизина в ферменте участвуют в связывании с гирудином и расположены внутри или рядом с центром связывания в тромбине. Стоун с соавт. [33] исследовали вклад различных участков α-тром- бина в связывание. Использовали различные модификации тромбина как в районе активного центра (диизогіропилфторфосфат или необра- тимый ингибитор D-Phe-Pro-Arg-CH 2 Cl) , так и в удаленных от него участках (β-, γ- и ε-формы тромбина). Результаты исследований пред- ставлены в табл. 2. Как видно из табл. 2, для связывания гирудина важно окружение активного центра. Хлорметилкетон трипептида, закрывающий аполяр- ный связывающий центр, ингибирует связывание с гирудином в 1000 раз сильнее, чем диизопропилфторфосфат, который модифицирует остаток серина в каталитическом центре. Интересны результаты по ингибированию протеолитическими формами тромбина: ε-тромбин име- 12 ISSN 0233-7G57. БІ Ю П О Л ILMI-PW I! КЛЕТКА. 1992. 'Г. 8. Хя 1 ет разрыв в В-цепи на участке 154—155, ^-тромбин — выщепление в В-цепи двух пептидов — 63—73 и 124—154, а β-тромбин — выщепление только фрагмента 63—73 [1]. Соответственно количеству повреждений в В-цепи тромбина изменяется и его сродство к гирудину, особенно важен участок 63—73. Поэтому авторы делают вывод о его большом значении для образования ионных взаимодействий с гирудином. Интересная информация о природе взаимодействия гирудина с тромбином была также получена при использовании иммунологических методов. Ноэ с соавт. [34] получи- ли поликлональные антитела к син- тетическому пептиду H-Arg-Ile-Gly- Lys-His-Sef-Arg-Tyr - Glu - Arg - ОН, соответствующему выщепляемому фрагменту В-цепи 62—73 в β- и γ- формах. Антитела хорошо связыва- лись как с α-тромбином, так и с его бромциановым фрагментом, содер- жащим последовательность 62—73, конкурентно ингибировали связыва- ние гирудина в пределах концентра- ций от 0 до 43 нмоль/л и не влия- ли на гидролиз тромбином хромо- генного субстрата. Кроме того, они ингибировали отщепление фибрино- нептидов А от двух Αα-цепей фибриногена с Ki- 11 ,7+4 нмоль/л. На основании этих данных делается вывод о том, что антитела экранируют анион-связывающий участок тромбина от его взаимодействия с гирудином. Шлеппи с соавт. [35] получили набор моноклональных антител к природному гирудину, рекомбинантному гирудину и двум его синте- тическим фрагментам 40—65 и 52—65. Только моноклональные анти- тела к рекомбинантному гирудину показали высокое сродство к гиру- дину. Эпитопный анализ показал, что все связывающие домены анти- пептидных антител расположены вблизи С-концевой части молекулы гирудина, так как связь между остатками Glu61 и Glu62 защищена от расщепления стафилококковой лротеазой. Антитела к рекомбинантно- му гирудину предотвращали расщепление связей Glu4 3-Gly4 4 стафило- кокковой гіротеазой и Lys4 7-Prow — лизил-эндопептидазой. Предполага- ется, что этот эпитоп вовлечен в связывание с тромбином. Следующий раздел посвящен изучению взаимодействия гирудина и тромбина с привлечением методов химического синтеза пептидов. Химические методы. Биохимические методы исследования гирудин- тромбинового взаимодействия дали много ценной информации, позво- ляющей предполагать механизмы этого процесса. Дополнительная ин- формация о взаимодействии фрагментов гирудина разной величины с тромбином была получена благодаря использованию в исследованиях большого количества синтетических пептидов. Авторы работы [36] изучали взаимодействие синтетического фраг- мента гирудина 45—65, содержащего несульфированный тирозин и аце- тилированный по концевой аминогруппе, с тромбином. Он способен ингибировать свертывающую активность тромбина, однако активный центр фермента при этом не затрагивает, так как действие пептида не влияет на гидролиз хромогенного субстрата. Пептид связывается с единственным центром в тромбине с константой ассоциации IO5 моль - 1 /л - 1 , что лишь на порядок меньше, чем константа взаимо- действия тромбина с гирудином. Это свидетельствует о том, что фраг- мент 45—65 содержит связывающий домен, узнаваемый ферментом, однако не связывается с его активным центром. В следующей работе этих авторов [3] исследовалось взаимодейст- вие тромбина с серией из 20 синтетических аналогов сегмента 55—65 гирудина. В минимальном участке, необходимом для эффективного Константы диссоциации для взаимодействия различных форм тромбина с гирудином 33] Форма тромбина Константа дис- социации (KcI), моль/л α 2 2 Ί 0 - 1 5 β ( 2 , 9 + 0 , 2 ) -.IO-1Z у ( 1 9 ± 1 ) · 1 0 - 9 ε ( 5 6 ± 7 ) · 1 0 - 1 5 Д и и з о п р о п и л ф т о р ф о с ф а т ( 2 6 ± 6 ) · 1 0 - 1 2 D - P h e - P r o - A r g - C H 2 ( 1 9 ± 2 ) · IO- 9 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 13 ингибирования (сегмент 56—64) свертывающей активности тромбина, остатки Phe-56, Glu-57, Ile-59, Рго-60 и Leu-64 оказались чувствитель- ными к заменам другими аминокислотами. Предполагается, что они необходимы для прямого взаимодействия с ферментом или для поддер- жания нужной конформации ингибитора. Предполагается также воз- можность образования на этом участке амфифильной α-спирали, о чем мы упоминали ранее (см. рис. 3). Обращает на себя внимание важность некоторых гидрофобных остатков, а также тот неожиданный факт, что· из четырех остатков глутаминовой кислоты только один (Glu-57) ока- зался необходимым для эффективного ингибирования. Кроме того, Рис. б. Замещение 1251-меченного фрагмента гирудина 45—65 с тромбин-сефарозы син- тетическими пептидами. Фрагменты гирудина: 1 — 58—65; 2— 57—65; 3— 56—65; 4 — 55—65; 5 — 54—65; 6 — 52—65; 7 — 50—65; 8 — 45—65 [38] Рис. 7. Спектры К Д тромбина и его комплекса с фрагментом гирудина 54—65. Д о б а в - ки фрагмента гирудина: 1 — 2; 2 — 1 нмоль [38] если сульфирование остатка Туг-63 в пептиде приводит к 10-кратному увеличению его ингибирующей способности, то замена его Туг-63 на остаток глутаминовой кислоты снижает ее в 4 раза . Как считают авторы приведенной работы, на основании сравнения последовательностей С-концевой части гирудина и фибринопептидов А и В нельзя сделать вывод о том, что гирудин и фибриноген связываются с одним и тем же участком тромбина и что, если они и используют для связывания некий общий участок, модели взаимодействия с ним гиру- дина и фибриногена могут быть различными. Оуэн с соавт. [37] продолжили изучение синтетических фрагмен- тов сегмента 54—65 для определения оптимальных остатков в положе- ниях 54 и 56 для связывания. Оказалось, что минимально необходимой: последовательностью является 56—64-, содержащая в положении 56 L-аминокислоту. Замена Phe-56 на Tyr не приводит к изменению инги- бирующей активности, в то время как замена его на /г-хлорфенилала- нин или фенилглицин — к ее снижению. Удаление аминогруппы конце- вого остатка Asp-55 (путем замены его янтарной кислотой) также ве- дет к возрастанию активности. Высокая чувствительность аминокисло- ты в положении 56 пептидной цепи гирудина к модификациям свиде- тельствует о ее важности для взаимодействия с тромбином. Мао с соавт. [38] исследовали взаимодействие серии синтетиче- ских фрагментов С-концевого участка гирудина (45—65, 50—65, 52—65, 54—65, 55—65, 56—65, 57—65 и 58—65) методом гель-фильтрации при высоком давлении, а также по их способности вытеснять меченный I125 гирудин из его комплекса с иммобилизированным тромбином (рис. 6) . Сродство фрагментов к тромбину падало при замене Phe-56 на его /)-изомер, Glu или Leu. Проводилось также изучение серии синтетических пептидов, отве- чающих последовательности 45—65 гирудина [39], с целью определе- 14 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 14 ння минимальной длины этого фрагмента, обладающего антикоагулянт- ными свойствами, анализа роли сульфированного Туг-63 и оценки вклада участка 45—64 в связывание с тромбином. Этот фрагмент был активным в зависимости от концентрации при измерении тромбопласти- нового времени нормальной плазмы человека, но не проявил заметной активности при гидролизе хромогенного субстрата. Минимальная дли- на пептида с максимальной антикоагулянтной активностью—12 остат- ков (53—64). При обработке этого пептида серной кислотой в диметил- формамиде в присутствии дициклогексилкарбодиимида получили ана- лог, содержащий сульфированный Туг-63, который был в 10 раз актив- нее несульфированного пептида 53—64, но в 50 раз менее активен, чем природный гирудин. Ввиду того, что сульфированный фрагмент по ингибирующей ак- тивности мало отличается от гирудина, предполагается, что взаимодей- ствие гирудина с некаталитическим центром тромбина является преоб- ладающим в ингибировании физиологической активности фермента. Показано также, что сульфированный фрагмент 53—64 проявляет в 10 раз меньшее сродство к тромбину быка, чем к тромбину человека. Это можно объяснить отсутствием в В-цепи тромбина быка сайта 7-расщепления (Lys-149). Обсуждается вопрос о структуре участка гирудина, ответственного за связывание со специфическим «карманом» активного центра фермента: отрицается возможность связывания участ- ка, содержащего основную аминокислоту, так как в гомологичных ги- рудинах нет пи одного консервативного остатка лизина и отсутству- ет аргинин. Д л я выяснения роли различных участков гирудина в связывании были синтезированы [40] фрагменты, содержащие от 15 до 51 амино- кислотного остатка: 1 —15, 15—42, 15—65, 29—65 и 40—65. С-Концевой фрагмент 40—65 ингибировал только свертывающую активность фер- мента, пептид 15—65 эффективно ингибировал расщепление как фиб- риногена, так и хромогенного субстрата, что свидетельствует о важном вкладе центрального кора для связывания с активным центром фермен- та. Эти результаты согласуются с ранее полученными данными [33] о том, что модификация гистидином активного центра тромбина снижает его сродство к гирудину в IO6 раз. N-Концевой фрагмент 1 —15 ингиби- ровал гидролиз субстрата с такой же эффективностью, как аналог 15— 65, но в качестве ингибитора расщепления фибриногена он оказался более чем в 100 раз менее эффективным. Это доказывает, что N-конце- вая часть молекулы гирудина взаимодействует только с активным цент- ром (или аполярным связывающим участком вблизи него) тромбина. В заключение этого раздела приведем очень интересную работу [41] по использованию синтетического фрагмента 54—64 гирудина д л я специфической метки остатка Lys-149 в тромбине. С этой целью синте- тический пептид алкилировали по аминогруппе бифункциональным реагентом 1, 5-дифтор-2, 4-динитробензолом (DNDFB) , а затем суль- фировали по остатку Туг-63, причем таким образом он метился 35S: DNFB-Gly54-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH64 I 35SO3. При обработке тромбина избытком меченого пептида динитрофтор- бензильная группа пептида реагировала с ε-аминогруппой Lys-149 фер- мента. Образование ковалентной связи пептида с ферментом было до- казано хроматографически путем измерения радиоактивности фермен- та после обработки меченым пептидом. Специфичность ковалентного связывания доказывалась тем, что при добавлении в реакционную сре- ду большого избытка необработанного DNDFB радиоактивного фраг- мента 54—64 выход комплекса значительно снижался за счет конку- ренции за связывание со специфическим участком тромбина. Путем ферментативного расщепления комплекса и разделения фрагментов было показано, что пептид связывался с остатком Lys-149 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 15 в тромбине, который, таким образом, находится рядом с участком свя- зывания гирудина. Это является хорошим экспериментальным доказа- тельством того, что гирудин связывается с ферментом в районе анион- связывающего сайта. Кроме того, это позволило на основании данных рентгеноструктурного анализа тромбина определить, что анион-связы- вающий сайт расположен на расстоянии 1,8—2,0 нм от каталитическо- го центра фермента. Подводя итоги результатов изучения образования гирудин-тромби- нового комплекса биохимическими и химическими методами (а эта ог- ромная работа была проведена в основном за короткий период с 1987 по 1990 год), можно отметить следующее. 1. Показано, что гирудин взаимодействует с тромбином в двух ос- новных сайтах — С-концевой домен, по-видимому, взаимодействует с Рис. 8. Спектры К Д гирудина (а), тромбина (Ь) и их комплекса (с) [42] анион-связывающим сайтом тромбина и это вносит большой вклад в энергию связывания; N-концевой фрагмент и центральный кор взаи- модействуют с аполярным связывающим участком вблизи активного центра фермента, однако, скорее всего, связывающий «карман» тром- бина в этом взаимодействии участия не принимает. 2. Установлено эффективное ингибирование свертывающей актив- ности тромбина небольшим фрагментом 54—64 гирудина, что открыва- ет пути для создания хороших синтетических ингибиторов тромбина нового типа. Однако, если результаты этих исследований прояснили картину взаимодействия тромбина с гирудином в общих чертах, то окончательно механизм этого процесса был установлен с помощью изучения комплекса гирудин — тромбин физическими методами. Физические методы. Изучение строения комплекса гирудина с тромбином физическими методами также было проведено за короткий срок — с 1987 по 1990 гг. и привело к окончательному решению проблемы. В уже упоминавшейся работе Мао с соавт. [38] изучались спект- ры кругового дихроизма (КД) тромбина в присутствии С-концевого синтетического пептида 54—65 и укороченного фрагмента 57—65. Спектры снимали в присутствии пептидов и без них (рис. 7) . Структу- ра тромбина в присутствии фрагмента 54—65 более беспорядочна, что свидетельствует о конформационных изменениях, происходящих при об- разовании комплекса, однако фрагмент 57—65, плохо связывающийся с тромбином, не влияет на спектр КД тромбина. Пептиды брали в та- кой концентрации, чтобы отсутствовало их собственное дихроическое поглощение. Предполагается, что наблюдаемое изменение конформа- ции тромбина может быть причиной снижения свертывающей и других активностей фермента. 16 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 16 Конно С соавт. провели более тщательное исследование спектров К Д комплекса [42]. Они показали, что кривые К Д комплекса гиру- дин — тромбин (рис. 8) отличаются как от спектра КД самого гируди- на или тромбина, так и от их суммарного спектра. Это отклонение от аддитивности особенно велико в области от 210 до 225 нм, что указы- вает на изменение вторичных структур обоих белков при образовании ими комплекса. В процессе титрования тромбина гирудином спектраль- ное отклонение от аддитивности имеет сигмоидальный характер, что подтверждает кооперативность процесса связывания. Гель-фильтрация смеси тромбина и гирудина не показала иного состава комплексов, чем J : 1, однако гель-фильтрация свободного гирудина выявила, что он су- ществует в форме ассоциированных молекул разного состава. Отсюда следует, что кооперативный характер процесса обусловлен взаимодей- ствием тромбина с множественной формой гирудина, причем на второй стадии множественный комплекс диссоциирует в тип 1 : 1 . Это приводит к захметным конформационным изменениям и значительному изменению связывания, что и регистрируется методом КД. Большой интерес представляет изучение в этой работе спектров К Д комплексов гирудина с различными модификациями тромбина (табл. 3). Регистрировали отклонение эллиптичности от аддитивности при 222 нм, чем и характеризовалось связывание. Как видно из табл. 3, наименьшее отклонение (0—5 %) наблюдалось в случае ингибирова- ния тромбина необратимым ингибитором, а при использовании γ-тром- бипа оно составило 30—40 % (для α-формы отклонение условно при- нято за 100 %) . Так как отклонение от аддитивности уменьшалось с ухудшением связывания, сделан вывод о важности как активного цент- ра и его окружения, так и основного участка В-цегіи тромбина 63—74 (отсутствующего в γ-форме) для связывания. Следует отметить, что метод КД является относительно малоин- формативным для изучения вторичной структуры белков, поэтому зна- чительно более ценная информация получена при использовании мето- да ЯМР в растворе. Ни с соавт. [43] исследовали взаимодействие тромбина с синтетическими фрагментами гирудина 52—65 и Ас-55—65 методом одномерного и двухмерного ЯМР. Установлено наличие α-спи- рали на участке гирудина 61—65. Фрагмент 55—65 дает в комплексе с тромбином хорошо разрешаемую структуру. Это отчасти верно и для пептида 56—65, так как наблюдался средний и дальний перенос поля- ризации, обусловленный ядерным эффектом Оверхаузера ( t ransfer red NOE) , между протонами остова полипептидной цепи и боковых остат- ков аминокислот. Отмечается, что структура сегмента 55—65 доволь- но амфифильна, т. е. одна сторона ее полярна и заряжена , а другая гидрофобна. С-Концевые пептиды — фрагменты гирудина — не взаи- модействуют с каталитическим центром фермента. Остатки глутамино- Т а б л и ц а 3 Отклонение от аддитивности спектров КД гирудин-тромбинового комплекса [42] Т а б л и ц а 4 Сравнительная способность к ингибированию тромбина различных фрагментов физиологически важных белков гемостаза \54] Отклонение эллиптичности от аддитивнос- Фрагменты белков Эффективность ингибирования свертывания Состав исследуемых смесей компонентов (IC60), мкмоль/л ти, % Кофактор II гепарина че- ловека (54—75) То же (49—75) Ββ - цепь фибриногена (410—427) Тромбомодулин (426—444) Гирудин десульфированный (54—65) Гирудин природный (54—65) а - Т р о м б и н + г и р у д и н у - Т р о м б и н + г и р у д и н а - Т р о м б и н + г и р у д и н + - j -H-D-Phe-Phe-Arg- CH 2Cl а - Т р о м б и н + г и р у д и н + H-D-Phe-Pro -Arg-CH 2 Cl 100 30—40 38 28 130 140 100-110 0 - 5 0 , 1 7 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 1 2 — 1-744 17 вой кислоты в положениях 58, 61 и 62 обращены в сторону раствори- теля, чем можно объяснить их неучастие в связывании, как указыва- лось ранее [3]. Однако Glu-57 необходима для взаимодействия из-за сближенно- сти с гидрофобным ядром молекулы и поэтому может принимать учас- тие в ионном взаимодействии. Эти структурные особенности реализу- ются за счет изменения направления цепи возле остатков Glu-57 и Glu-58 посредством вытягивания структуры, включая остатки Ile-59 и Рго-60, а также поворотом искаженной α-спирали из остатков от Glu-61 до Glu-65 на полтора оборота. Что нового в понимании механизмов взаимодействия гирудина с тромбином дали эти исследования? Во-первых, они подтвердили не- структурированность С-концевой части гирудина в отсутствие тромби- на, что согласуется с более ранними данными [19]. Во-вторых, под- тверждено образование амфифилыюго кластера сегментом 52—65, что очень похоже на предсказанную ранее амфифильную спираль (см. рис. 3), которая может образоваться в результате взаимодействия с тромбином. Однако решающую роль в физических исследованиях сыграли ра- боты по прямому изучению строения комплекса гирудин — тромбин методом рентгеноструктурного анализа, опубликованные почти одно- временно [44, 45]. На основании данных проведенного анализа крис- таллов комплекса было получено четкое доказательство того, что ги- рудин ингибирует тромбин по неизвестному ранее механизму ингиби- рования сериновых протеаз: в отличие от других известных ингибито- ров специфичность гирудина обусловлена не взаимодействием со спе- цифическим связывающим «карманом» фермента, а, скорее, участками, расположенными как вблизи активного центра, так и на некотором уда- лении от него. В гирудине имеется N-концевой глобулярный домен и протяженный (3,9 нм) С-концевой домен. С-Концевой сегмент 48—65 закручен вокруг молекулы тромбина вдоль предполагаемого апион-свя- зывающего сайта и связан с ним электростатическими силами, в то время как пять последних остатков образуют спиральную петлю, ко- торая может образовывать несколько гидрофобных контактов с ферментом. Анион-связывающий участок тромбина представляет собой длин- ную щель, вытянутую от впадины активного центра тромбина и за- крытую петлями 35—59 и 70—80 в В-цепи. Очень интересные результа- ты получены относительно механизма взаимодействия гирудина с обла- стью активного центра фермента: гирудин связывается с участком вблизи активного центра своими тремя N-коицевыми остатками — Val- і , Val-2 и Tyr-З (как было предсказано в работах, приводимых в предыдущих разделах!) , причем Val-I занимает подцентр S2, а Tyr-З — подцентр S 3 в тромбине [9], т. е. аполярный связывающий участок. По данным рентгеноструктурного анализа, 27 из 65 остатков ги- рудина сближены в пространстве на расстоянии менее 0,4 нм с тром- бином (10 ионных пар и 23 водородные связи), чем можно объяснить высокую аффинность и специфичность гирудина. Предполагается, что N-концевая аминокислота образует водородную связь с гидроксилом се- рина каталитического центра тромбина, но специфический «карман» фермента во взаимодействии с ингибитором участия не принимает. Схема взаимодействия гирудина с тромбином изобоажена на рис. 9. Перспективы практического использования результатов исследова- ний. Выше отмечалось, что основной целью почти 100-летнего изучения ингибитора гирудина было использование его в клинике в качестве ан- тикоагулянта и создание новых препаратов, механизм действия кото- рых основан на тех же принципах, что и ингибирование тромбина гиру- дином. Исследования на лабораторных животных [46, 47] и человеке [48, 49] показали, что гирудин может быть использован в медицинской практике в качестве высокоселективного и эффективного антикоагулянт- ного препарата ввиду его высокого сродства к тромбину, очень низкой 18 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 18 антигенности и возможности быстрого выведения из кровяного русла (время его полужизни в организме около 1 ч). Поэтому гирудин может применяться для лечения тромбозов наряду с широко используемым в клинике естественным ингибитором, содержащимся в организме, гепа- рином [46, 49]. Возникает вопрос, почему до сих пор использование гирудина в клинике не пошло дальше экспериментальных исследований, если его Рис. 9. Схематическая диаграмма гирудьн-тромбинового комплекса по данным рентге- ноструктурного анализа: / — центральный кор гирудина; 2— фибриноген-связывающая щель в тромбине; 3 — первичный связывающий «карман» тромбина; 4 — каталитиче- ский центр фермента; 5 — аполярный связывающий участок тромбина [44] выделение из природного источника (медицинских пиявок) как-будто не составляет большой проблемы? По приблизительным оценкам Марк- вардта [2], ежегодно для научных исследований требуется 50 тыс. пи- явок, однако их количество в природе ограниченно, и к тому ж е недавно они были занесены в список ис- чезающих видов! Значит, нужны другие источники гирудина. В этом большую помощь могут оказать биотехнологические ме- тоды получения рекомбинантного ингибитора. Кроме работ в этом направлении, упомянутых нами ранее, можно указать еще не- сколько публикаций [50—53]. Рис. 10. Схема ингибирования тромби- на пептидом D-Phe -P ro -Arg -P ro -Gly (а) и гирулогами (б) [56] По-видимому, в терапевтических целях можно использовать не только гирудин, но и его небольшие синтетические фрагменты. Напри- мер, Хортин с соавт. [54] приводят сведения о сравнительной антисвер- тывающей активности фрагментов различных природных субстратов и ингибиторов тромбина, имеющих анионную природу и, вероятно, взаи- модействующих с анион-связывающим сайтом фермента (табл. 4). И з таблицы видно, что синтетический фрагмент гирудина 54—65 (и осо- бенно его сульфированный аналог) является гораздо лучшим ингиби- тором, чем все приведенные пептиды. Это особенно важно, если при- нять во внимание, что Хортин [55] получил патент на использование в качестве антитромбинового препарата 22-членного синтетического пептида, соответствующего последовательности 54—75 (с заменой Ser-68 на Ala) кофактора II гепарина человека (см. табл. 4) . ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 1 2— 1-744 9 В заключение обзора следует рассмотреть очень важную и перс- пективную работу по созданию гирудиноподобных ингибиторов тром- б и н а — «гирулогов» [56]. Целью ее было получение эффективного об- ратимого ингибитора тромбина на основе изученных механизмов инги- бирования его гирудином. Д л я взаимодействия с анион-связывающим сайтом тромбина авторы использовали синтетический пептид — ф р а г - мент 54—64 гирудина, а для связывания с активным центром фермен- та — известный синтетический ингибитор D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly, кото- рые связали друг с другом «мостиком» из остатков глицина (рис. 10). Важным в этой работе было то, что авторы использовали информацию о расстоянии между этими двумя связывающими центрами в тромби- не — 18—2,0 нм (табл. 5). Т а б л и ц а 5 Константы ингибирования гидролиза тромбином п-нитроанилида D-гексагидротирозил-аланил-аргинина гирулогами [56] Соединение Аминокислотная последовательность «і. нмоль/л Гнрулог-1 D-Phe-Pro -Agr -P ro - (Gly ) 4 - гирудин (53—64) 2 , 3 Гирулог-2 D-Phe -P ro -Arg -P ro - (Gly) 2 -гирудип (53—64) 6 4 , 5 Гирулог-3 D-Phe-Pro-Arg-Pro- (Gly)б-гирудин (53—64) 3 , 0 Гирулог-4 D-Phe-Pro-Arg-Pro- (Gly)8-гирудин (53—64) 2 , 6 Гирулог-5 H-Phe-Pro-Arg-Pro- (Gly)4 -гирудин (53—64) 156,0 Ингибитор D-Phe -P ro -Arg^Pro -GlyOH > 2 - 1 0 3 Гирудин (53—64) : i : Ac-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu- I le -Pro-Glu-Glu-Tyr- LeuOH > 2 . IO3 * Синтетический фрагмент 53—64 гирудина ускоряет гидролиз хромогенного субстрата. Из табл. 5 видно, что для эффективного ингибирования тромбина достаточно, чтобы мостик был построен из четырех остатков глицина. Этот синтетический пептид проявляет антикоагулянтную активность, сравнимую с активностью гирудина и в 100 раз (!) превосходящую ак- тивность сульфированного фрагмента 53—64. На первый взгляд, боль- шим преимуществом гирудина перед гирулогами является то, что он не взаимодействует со специфическим «карманом» активного центра тром- бина, т. е. в принципе (в отличие от гирулогов) не может ингибировать другие трипсиноподобные ферменты системы свертывания крови. Сле- довательно, при сравнимом сродстве к тромбину гирулоги обладают более низкой селективностью, чем гирудин, что является очень важным фактором при создании терапевтического препарата. Однако опыты по ингибированию гидролиза хромогенного субстра- та фактором X a j плазмином и трипсином показали, что эти ферменты не ингибировались гирулогом-1 даже в концентрациях, в 1000 раз пре- вышающих таковые указанных ферментов. Таким образом, гирулоги обладают достаточно высокой селективностью к тромбину, чтобы явиться примером нового класса его бивалентных ингибиторов. Автор выражает благодарность В. К. Кибиреву за обсуждение ру- кописи обзора и ценные замечания и А. А. Серейской — за предостав- ление некоторых оригинальных работ по теме обзора. Р е з ю м е . Розглянуто біохімічні, хімічні та фізичні підходи до вивчення будови гіру- дина і механізму пригнічення їм тромбіна. Результати цих досліджень в ідкривають ш л я х до створення синтетичних інгібіторів тромбіна нового типу. S u m m a r y . Biochemical, chemical and physical methods for s tudy of h i rud in- thrombin b o u n d i n g mechan i sms are reviewed. Perspect ives of the clinical usage of recombinant hi- rud in and its smal l synthet ic f r a g m e n t s are obsorved. The possibil i ty for des ign ing of novel d r u g s based on the s tudied h i rudin- thrombin interact ion mechan i sms is shown on e x a m p l e of syntheic hirudin-l ike inhibi tors «hirulogs». 2 0 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 20 С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы 1. Bioregulatory func t ions of th rombin / Eds D. A. Walz et al.— New York : Acad. Sci., 1986.—450 p. 2. Markwardt F. P h a r m a c o l o g y of hirudin: one hundred years a f te r the f irs t report of the an t i coagu l an t agen t in medical leeches / / Biomed. and biochini. acta .— 1985.— 44, N 7/8.— P. 1007—1013. 3. Anticoagulant peptides: na tu re of the interact ion of the C- te rmina l region of h i rudin with a noncata ly t ic b ind ing site on thrombin / J. L. Krs tenansky , T. J. Owen , Μ. T. Yates, S. J. Т. М а о / / J . Med. Chem.— 1987.—30, N 7 , - P . 1688—1691. 4. MarkoLUirdt F. Die I so l ie rung und Chemische Charak te r i s i e rung des Hi rud ins // Hop- pe-Sevler ' s Z. Physiol . Chem — 1967.— 308, N 4 , — S . 147—156. 5. Fenton J. ψ. II. Thrombin s p e c i f i c i t y / / A n n . N. Y. Acad. S c i . — 1981. — 3 7 0 . — P. 468—495. 6. Серебряный С. Б. Тромбин: его строение и особенности катализа / / Биохимия жи- вотных π человека.— 1982.— Вып. 6.— С. 14—26. 7. Струкова С. М. Структурно-функциональные особенности т р о м б и н а / / Т а м же.— С. 26—38. 8. Fenton J. W.II, Sonder S. A. Thrombin active-site reg ions and f u n c t i o n s / / A n n . N. Y. Acad. Sci.— 1 9 8 4 . — 4 3 5 . — P . 412—414. 9. Shechter I., Berger A. On the size of the active site in pro teases . 1. P a p a i n / / B i o - chem. and Biophys. Res. C o m m u n s . - 1967.— 27.— P. 157—162. 10. The refined 1,9 A crysta l s t ruc tu re of h u m a n α - th rombin : in terac t ion wi th D-Phe- P ro -Arg chloromethylke tone and s igni f icance of the Tyr -P ro -Pro -Trp inser t ion seg- m e n t / W . Bode, I. Mair , U. B a u m a n n et a l . / / E M B O J . — 1 9 8 9 . — 8, N 11 .— P. 3467—3475. 11. Humnn D - P h e - P r o - A r g - C H 2 - a - t h r o m b i n crys ta l l iza t ion and d i f f rac t ion d a t a / E. Skrzypczak-Jankun , T. Rydel, A. Tul insky et a l . / / J . Мої. Biol. — 1989. — 206, N 4.— P. 755—757. 12. Catalytic competence of h u m a n a - and γ - th rombin in the act ivat ion of f ib r inogen and fac tor XI I I / S. D. Lewis, L. Lorand . J. W. II Fenton , J . A. S h a f e r / / B i o c h e m i s t - r y . — 1 9 8 7 , — 2 6 , N 2 4 , — P . 7597—7603. 13. The complete amino acid sequence of hirudin, a th rombin specific i n h i b i t o r / J . Dodt , H.-P. Muller f U. Seemiiller, J.-Y. C h a n g / / F E B S Lett .— 1984.— 165, N 2 . — P . 180— 184. 14. Rapid pur i f ica t ion and revised amino te rmina l sequence of hirudin: a specific throm- bin inhibitor of the Bloodsuck ing leech / S. J . T. Mao, M. T. Yates, D. T. B lanken- sliip et al. / / Anal. Biochem.— 1987,— 161,— P. 514—518. 15. Cloning and expression of a cDNA coding for an t i coagu lan t hirudin f rom the Blo- odsucking leech, I I i rudo medicinal is / R. P. Harvey , E. Degryse , L. S te fan i et a l . / / Proc. Nat . Acad. Sci. U S A . — 1 9 8 6 , — 8 3 , N 4 , — P . 1084—1088. 16. Isolation and charac ter iza t ion of hirudin isoinhibi tors and sequence ana lys i s of hiru- din PA / J. Dodt, W. Machleidt , U. Seemuller et al. // Biol. Chem. H o p p e - S e y l e r . - 1986,—367, N 6 , — P . 803—811. 17. Chang J.-Y. The func t iona l domain of hirudin, a thrombin specific i n h i b i t o r / / F E B S Lett — 1983,— 164, N 2 , — P . 303—313. 18. Point mu ta t ions mod i fy ing the thrombin inhibiton kinetics and an t i thrombot ic acti- vity in vivo of recombinant hirudin / E. Degryse , M. Acker, G. Def reyn et a l . / / Prote in Eng .— 1989,— 2, N 6 , — P . 459—465. 19. The conformation of hirudin in solut ion: a s tudy us ing nuclear magne t i c resonance , d is tance geomet ry and res t ra ined molecular dynamics / G. M. Clore, D. K. Sukuma- ran, M. Nigles et al. // E M B O J.— 1987,— 6, N 2 . — P . 529—537. 20. Protein nuclear magnet ic resonance s tudy of hirudin: resonance a s s ignmen t and se- condary s t ruc ture / D. K. S u k u m a r a n , G. M. Clore, A. P r e u s s et al. / / B i o c h e m i s t r y . — 1987 — 26, N 2 , — P . 333—338. 21. Solution s t ruc ture of recombinant hirudin and Lys47-^Glu mu tan t : a nuclear m a g - netic resonance and hybrid dis tance geomet ry-dynamica l s imula ted annea l i ng s t u d y / P. J. M. Folkers , G. M. Clore, P . C. Driseoll et a l . / / I b i d . — 1989,— 28, N 6.— P. 2601—2617. 22. Horuyama H., Wilthrich K. Confo rmat ion of recombinant desu l fa toh i rud in in aqueous solution determined by nuclear magne t i c r e s o n a n c e / / I b i d . — N 10.— P. 4301—4312. 23. Tetriti C., De La Liosa P., Jutisz M. Ef fec t des modi f ica t ions chimiques de l 'h i rudine sur son action inhibitrice de Factivitc enzymat ique de la th rombine // Bull. Soc. Chiin. Biol.— 1967.—49, N 12 ,—P. 1837—1843. 24. Stone S. R., Dennis S., Hofstinge J. Quan t i t a t ive eva lua t ion of the cont r ibut ion of ionic in teract ions to the fo rmat ion of the thrombin-h i rudin complex // Biochemist ry .— 1989,— 28, N 17 ,—P. 6857—6863. 25. Stone S. R., Hofsteenge J. Kinetics of the inhibit ion of thombin by hirudin / / ' Ibid.— 1986,— 25, N 16 .—P. 4622—4628. 26. Dodt /., Kohler S., Baici A. In terac t ion of site specific hirudin va r i an t s wi th a- thrombin // F E B S Lett .— 1988,— 229, N 1,— P. 87—90. 27. Use of si te-directed mutagenes i s to inves t iga te the basis for the specificity of hiru- din / P. J . Braun , S. Dennis, J . Hofs teenge , S. R. S t o n e / / B i o c h e m i s t r y . — 1988.— 27, N 17 .—P. 6517—6522. 28. Contribution of the N-tcrminal region of h i rudin to its interaction with t h r o m b i n / A. Wal lase , S. Dennis, J. Hofs teenge , S. R. S tone / / Ibid.— 1989.—'28, N 26.— P. 10079 -10084. ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 1 2— 1-744 21 29. Distinct b inding sites of Ala 4 8 -h i rud in 1 - 4 7 and Ala 4 8 -h i rud in 4 8 - 6 5 on α- thrombin f J. Dodt, S. Kohler, T. Schmitz, B. W i l h e l m / / J . Biol. Chein. — 1990.—265, N 2.— P. 713—718. 30. Use of f r a g m e n t s of hirudin to invest igate thrombin-hirudin interaction / S. Dennis, A. Wallace, J. Hofsteenge, S. R. S t o n e / / E u r . J. Biochem. - 1990.— 188, N 1 . - P. 61—66. 31. Winant R. G., Lazar J. B., Johnson P. H. Chemical modifications and amino acid subst i tut ions in recombinant hirudin that increase hirudin-thrombin a f f in i t y / /B ioche - mis t ry .—1991.—30, N 5 , — P . 1271 — 1277. 32. Chang J.-Y. The hirudin-binding site of human α- thrombin // J Biol. Chem.— 1989.— 264, N 13.— P. 7141—7146. 33. Stone S. RBraun P. JHofsteenge J. Identif icat ion of regions of α- thrombin invol- ved in its interaction with hirudin // Biochemstry.— 1987.—26, N 15.—P. 4617—4624. 34. The use of sequence-specific antibodies to identify a secondary binding site in throm- bin / G. Noe, J. Hofsteenge, G. Rovelli, S. R. S t o n e / / J . Biol. Chem. — 1988.—263, N 2 4 . — P . 11729—11735. 35. Preparation of monoclonal antibodies to hirudin and hirudin peptides. A mehtod for s tudy ing the hirudin-thrombin interacton / J.-M. Schlaeppi, S. Vekemans, H. Rink, J.-Y. Chang // Eur. J. Biochem.— 1990.— 188, N 2 — P . 463—470. 36. Krstenansky J. L., Мао S. J. T. Anti thrombin properties of C-terminus of hirudin us ing synthetic insulfa ted Να-acetyl-hirudin us ing 45—65 / / F E B S Lett.—1987.—· 211, N 1 . — P . 1 0 — 1 6 . 37. N-Terminal requirements of small peptide an t icoagulants based on h i r u d i n 5 4 - 6 5 / T. J. Owen, J. L. Krstenansky, Μ. T. Yates, J. Т. М а о / / J . Med. Chem.— 1988. — N 5 . — P . 1009—1011. 38. Interaction of hirudin with thrombin: identification of minimal b inding domain of hirudin that inhibits c lot t ing activity / S. J. T. Mao, Μ. T. Yates, T. J. Owen, J. L. K r s t e n a n s k y / / B i o c h e m i s t r y . — 1988.—27, N 21,— P. 8170—8173. 39. Anticoagulant activity of synthetic hirudin p e p t i d e s / J . M. Maraganore , B. Chao, M. L. Joseph et al. // J. Biol. Chem.—264, N 15,—P. 8692—8698. 40. Binnie C. G., Erickson B. W., Hermans J. Inhibition of thrombin by synthetic hirudin p e p t i d e s / / F E B S Lett.— 1990.—N 1/2 ,—P. 85—89. 41. Bourdon P., Fetiton J. W. II, Maraganore J. M. Affini ty labell ing of lysine-149in the anion-binding exosite of human α- thrombin with N (dini t rof luorobenzyl)hirudin C- terminal p e p t i d e / / B i o c h e m i s t r y . — 1990.—29, N 27 ,—P. 6379—6384. 42. Konno SFenton J. W. II, Villanueva G. B. Analysis of the socondary s t ructure of hirudin and the mechanism its interaction with thrombin // Arch. Biochem. and Biop- hys.— 1988 — 267, N 1 ,—P. 158—166. 43. Ni F., Konishi Y., Scheraga H. A. Thrombin-bound conformat ion of the C-terminal f r agmen t s of hirudin determined by t ransfer red nuclear Overhauser effects / / Bio- chemistry.— 1990.—29, N 18,—P. 4479—4489. 44. Crystal s t ructure of the thrombin-hirudin complex: a novel mode of serine protease i n h i b i t i o n / M . G. Grutter , J. P. Priestle, J. Rahuel et a l . — / / E M B O J.— 1990.—9, N 8,— P. 2361—2365. 45. The structure of a complex of recombinant hirudin and human α- thrombin / T. J. Ry- del, K. G. Raviehandran, A. Tulinsky et a l . / /Sc ience . — 1990.—249, N 4966.— P. 277—280. 46. The effect of hirudin on endotoxin induced disseminated in t ravascular coagulat ion (DIC) / A . Ishikawa, R. Haf te r , U. Seemuller et a l . / / T h r o m b . Res. — 1980. — 19, N 3 , — P . 351—358. 47. Pharmacological studies on the anti thrombotic action of herudin in experimental a n i m a l s / F . Markward t , J. Hauptmann , G. Novak et a l . / / Thromb. H a e m o s t a s . — 1982,—47, N 3 . — P . 226—229. 48. Pharmacokinetics and ant icoagulant effects of hirudin in m a n / / F . Markwardt , G .No- vak, J. Stiirrebecher et a l . / / I b i d . — 1984.—52, N 2 . — P . 160—163. 49. Markwardt F. Pharmacology of selective thrombin inh ib i to r s / /Now. Rev. Fr. He- matol.—1988.—30.— P. 1 6 1 - 1 6 5 . 50. Cloning and expression in E. coli of a synthetic DNA for hirudin the blood coagula- tion inhibitor in the Leech/ E. For tkamp, M. Reiger, G. Heis terberg-Mautses et a l . / / D N A . - 1986,— 5, N 6,— P. 511—517. 51. Cloning and expression of a cDNA coding for ant icoagulant hirudin f rom the Blo- odsucking leech, Hirudo medicinalis / R. P. Harvey, E., Degryse, L. Stefani et a l . / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1986,— 83, N 4 , — P . 1084—1088. 52. Expression and secretion in S. cereuisiae of biologically leech hirudin / G. Loison, A. Findeli, S. Bernard et al. // Bio / Techonology.— 1988,— 6, N 1 .—P. 72—77. 53. Degryse E. Determinat ion of the specific activity of recombinant h i r u d i n / / T h r o m b . Res.— 1990,—60, N 6 , — P . 433—443. 54. Horlin G. L., Benulto В. M. Inhibition of thrombins clot t ing activity by synthetic peptide segments of its inhibitors and subst ra tes / / Biochem. and Biophvs. Res. Com- muns.— 1990.— 169, N 2 . — P . 437—442. 55. Pat. 299576 USA, IC1 A6IK37/02, С 0 7 K 7/10 / G. L. Hort in (23.01.89) / / Р Ж «Фи- зико-химическая биология и биотехнология».— 1990.— № 10. Реф. 10А208П. 56. Design and character izat ion of hirulogs: a novel class of bivalent peptide inhibitors of t h r o m b i n / J . M. Maraganore , P. Bourdon, J. Jablonski et al. // Biochemistry. — 1990,—29, N 3 0 , — P . 7095—7101. Ин-т биоорг. химии и нефтехимии АН Украины, Киев Получено 30.07.91 2 2 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1992. Т. 8. j\b 1 22

Молекулярные основы взаимодействия гирудина с тромбином

Репозитарії

Схожі ресурси