Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран

Исследовали влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических: мембран тимоцитов с помощью определения анизотропии флюоресценции и тушения флюоресценции остатков триптофана мембранных белков. Данные анизотропии флюоресценции триптофана позволили установить наличие двух участков связы...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1992
Автор:	Древаль, В.И.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1992
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Структура и функции биополимеров
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154245
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран / В.И. Древаль // Биополимеры и клетка. — 1992. — Т. 8, № 1. — С. 78-82. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-154245
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1542452019-06-16T01:28:23Z Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран Древаль, В.И. Структура и функции биополимеров Исследовали влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических: мембран тимоцитов с помощью определения анизотропии флюоресценции и тушения флюоресценции остатков триптофана мембранных белков. Данные анизотропии флюоресценции триптофана позволили установить наличие двух участков связывания АТФ на мембранных белках, определены константы связывания, число мест и энергия связывания. Показано изменение структуры белков плазматических мембран тимоцитов при воздействии ионизирующего излучения. Досліджено вплив АТФ та іонізуючого випромінювання на структуру плазматичних мембран тимоцитів за допомогою визначення анізотропії флюоресценції і гасіння флюоресценції залишків триптофану мембранних білків. Результати анізотропії флюоресценції триптофану дозволили встановити наявність двох ділянок зв'язування АТФ на мембранних білках, знайдено константи зв'язування, число місць та енергію зв'язування. Показано зміну структури білків плазматичних мембран тимоцитів при дії іонізуючого випромінювання. The effect of ATP and ionizing radiation on the structure thymocytes plasma membranes was studied. Using fluorescence quenching technique two plats for ATP binding on membrane proteins were located. The influence of ionizing radiation on plasma membranes thymocytes was shown. 1992 Article Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран / В.И. Древаль // Биополимеры и клетка. — 1992. — Т. 8, № 1. — С. 78-82. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000313 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154245 577.112 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Древаль, В.И. Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран Биополимеры и клетка
description	Исследовали влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических: мембран тимоцитов с помощью определения анизотропии флюоресценции и тушения флюоресценции остатков триптофана мембранных белков. Данные анизотропии флюоресценции триптофана позволили установить наличие двух участков связывания АТФ на мембранных белках, определены константы связывания, число мест и энергия связывания. Показано изменение структуры белков плазматических мембран тимоцитов при воздействии ионизирующего излучения.
format	Article
author	Древаль, В.И.
author_facet	Древаль, В.И.
author_sort	Древаль, В.И.
title	Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран
title_short	Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран
title_full	Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран
title_fullStr	Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран
title_full_unstemmed	Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран
title_sort	влияние атф и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1992
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154245
citation_txt	Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран / В.И. Древаль // Биополимеры и клетка. — 1992. — Т. 8, № 1. — С. 78-82. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT drevalʹvi vliânieatfiioniziruûŝegoizlučeniânastrukturuplazmatičeskihmembran
first_indexed	2025-07-14T05:54:17Z
last_indexed	2025-07-14T05:54:17Z
_version_	1837600560623124480
fulltext	5. Lober GKoudelka J., Smekal Ε. Stacking interactions of ethidium bromide bound to a polyphosphate and phage DNA in situ// Biophvs. Chem.— 1974.— 2, N 1.— P. 158—163. 6. Interaction of phenosafranine with nucleic acids and model polyphosphates / Z. Bal- karova, V. Kleinwachter, J. Koudelka et al. / / Ibid.— 1978.—(8, N 1.—P. 17—25. 7 Ldber G. The fluorescence of dye-nucleic acid c o m p l e x e s / / J . Luminescence— 1981.— 22, N 2 .—P. 221—265. 8. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот.— М. : Мир, 1987.— 584 с. 9. Fluorescence analysis of G—С versus А—T binding of quinacrine to DNA / G. Bal- dini, S. Doglia, G. Sassi, G. L u c c h i n i / / I n t . J. Biol. Macromol.— 1981— 3, N 8 — P. 248—252. 10. Schwarz G. Cooperative binding to linear b iopolymers / /Eur . J. Biochem.— 1970.— 12, N 3 .—P. 442—453. 11. Нечипуренко Ю. Д. Кооперативные эффекты при связывании протяженных лиган- дов с ДНК. II. Контактные взаимодействия между адсорбированными лигандами / / Молекуляр. биология.— 1984.— 18, JVb 4.—С. 1066—1080. Физ.-техн. ин-т низких температур АН Украины, Получено 03.07.91 Харьков УДК 577.112 В. И. Древаль ВЛИЯНИЕ АТФ И ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА СТРУКТУРУ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН Исследовали влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических: мембран тимоцитов с помощью определения анизотропии флюоресценции и тушения флюоресценции остатков триптофана мембранных белков. Данные анизотропии флюо- ресценции триптофана позволили установить наличие двух участков связывания АТФ на мембранных белках, определены константы связывания, число мест и энергия свя- зывания. Показано изменение структуры белков плазматических мембран тимоцитов при воздействии ионизирующего излучения. В проводимых ранее исследованиях было установлено влияние ионизи- рующего излучения на структуру биологических мембран [1, 2] . Одна- ко в литературе отсутствуют данные о динамике конформационных перестроек мембранных белков при воздействии радиации. В настоя- щее время для исследования динамических аспектов структурных пе- рестроек белков широко используется флюоресцентная спектроскопия [3, 4] . Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния ионизирующего излучения на структуру мембранных белков плазма- тических мембран тимоцитов методом тушения триптофановой флю- оресценции белков с применением АТФ. Материалы и методы. В работе использовали плазматические мем- браны тимуса крупного рогатого скота [5]. Флюоресценцию измеряли на спектрофлюориметре «Hitachi MPF-2A» (Япония) при 25 °С в термостатируемых кюветах 1 0 Х 10 мм. Среда инкубации содержала 50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ ЭДТА и 0,4 мг белка/мл. Гидролиз АТФ в эксперименте не наблюдался. Флю- оресценцию остатков триптофана мембранных белков ( Я В озб = 280 нм, Хфл = 340 нм) определяли по методу [6]. Суспензию плазматических мембран тимоцитов облучали на им- пульсном линейном ускорителе электронов энергией 5 МэВ в дозах 10, IO2, IO3 и IO4 Гр. Результаты и обсуждение. Д л я исследования структурной дина- мики белков в качестве тушителя собственной флюоресценции белков использовали АТФ. Поэтому на первоначальном этапе работы было проведено изучение характера взаимодействия АТФ с мембранными © в . И. Д Р Е В А Л Ь , 1992 78 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 1 6 — 1-744 78 белками. В настоящее время для регистрации конформационных изме- нений и структурной динамики белков применяют флюоресценцию трип- тофановых остатков в белках [7, 8], теоретические основы этого метода изложены в работах [4, 9, 10]. Исходя из этого в наших исследованиях при оценке связывания АТФ с белками плазматических мембран мы регистрировали изменение анизотропии флюоресценции триптофановых остатков. Из рис. 1 видно, что по мере титрования мембран АТФ на кривой зависимости анизотропии триптофановой флюоресценции бел- ков от концентрации АТФ отчетливо наблюдаются две ступени в пре- делах концентраций АТФ до 0,65 и 0,65—1,29 мМ. Если анизотропию флюоресценции использовать как меру конформационных перехо- дов в белках, то можно заклю- чить, что структурные изменения в мембранных белках при связы- вании АТФ идут через промежу- точные состояния, ВОЗМОЖНО, CO- соответствующие различным бел- кам со связанным АТФ. Если Рис. 1. Влияние АТФ на анизотропию триптофановой флюоресценции мем- бранных белков допустить, что связывание молекулы АТФ с участком связывания на мембранном белке протекает как бимолекулярная реакция L + B^ ^ L B и вызывает изменение анизотропии флюоресценции остатков триптофана, пропорциональное числу занятых участков, то при флюо- риметрическом титровании мембран с определенной концентрацией бел- ка переменными концентрациями АТФ степень насыщения участков каждого типа приобретает значения от 0 до 1. Это может быть рас- считано как отношение величины изменения анизотропии AA (при дан- ной концентрации АТФ) к величине ДЛ^ах (при насыщении центров сорбции лигандом): ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 1 79 где: [LB] — концентрация участков, занятых АТФ; [Б0] — полная концентрация участков связывания, т. е. N. Получаем: (1) (2) (3) (4) (5> но так как то после преобразований: где: Ka — константа связывания АТФ с центром сорбции; [L] — кон- центрация свободного АТФ; [L0] — о б щ а я концентрация АТФ. То есть: Тогда тангенс угла наклона графика зависимости равен Ka, а отрезок, отсекаемый графиком на оси абсцисс, дает число участков связывания N [11]. Изложенный подход был использован для расчета связывания АТФ с плазматическими мембранами (табл. 1). Можно видеть, что количественно преобладают центры связывания II. В связи с этим возникает вопрос о природе этих центров связывания. Так как в простых равновесных условиях константа Михаэлиса явля- ется константой равновесия реакции диссоциации (т. е. / (α _ 1) [12], то данные о свойствах Са 2 + -АТФазы плазматических мембран тимоцитов свидетельствуют о том, что Ka для субстрата Mg-ΑΤΦ находится в пре- делах (0,25—2,13)-IO3 M - 1 [13]. Это сопоставимо с константой ассоци- ации для центров связывания второго типа. Исследовав связывание АТФ с белками плазматических мембран тимоцитов, мы изучили структурные изменения белков при воздействии Рис. 2. Графики Штерна — Фольмера (а) и модифицированного уравнения Штерна — Фольмера (б) для тушения триптофановой флюоресценции плазматических мембран тимоцитов АТФ в контроле ( / ) и при облучении в дозах (Гр) 10 (2), IO2 (5), IO3 (4) и IO4 (5) ионизирующего излучения. При этом использовали тушение триптофа- новой флюоресценции белков молекулами АТФ. Можно видеть, что тушение флюоресценции остатков триптофана АТФ характеризуется изгибом графиков Штерна — Фольмера к оси абсцисс. Это позволяет заключить, что тушение флюоресценции остатков триптофана, обуслов- ленное связыванием молекул АТФ с определенными мембранными бел- Т а б л и ц а 1 Параметры связывания АТФ с плазматическими мембранами тимоцитов Тип участ- ка связы- вания N, мкмоль/г белка Ka t M-1 кДж/моль I II 30 ,0 2575,0 0 ,76-IO 6 1,02-IO 3 —33,6 — 17,2 П р и м е ч а н и е . N — число участков связывания; Ka — константа связывания АТФ; AGa 0 — изменение свободной энер- гии взаимодействия АТФ с мембраной. Т а б л и ц а 2 Характеристика тушения флюоресценции белков плазматических мембран тимоцитов АТФ Параметр Доза облучения, Гр Параметр 0 10 IO2 IO3 10* KSv> I O - 5 M K M - 1 11,86 5 ,88 5 ,89 6 , 1 5 20,91 h 0 ,26 0 ,32 0 ,36 0 ,37 0 , 7 7 80 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 1 6 — 1-744 80 где: Fо — общая флюоресценция в отсутствие тушителя; F — интенсив- ность флюоресценции в присутствии тушителя; AF = F0 — F; Ksv— константа Штерна — Фольмера; [Q] —концентрация тушителя (АТФ); f ι — д о л я флюоресценции, доступная для тушения. На графике зави- симости FQIAF о т 1/[Q] (рис. 2, б) значение f\ определяли по отсека- емому па оси ординат отрезку, a (f\Ksv)~l — по наклону. В табл. 2 приведены величины /1 и Ksv для тушения флюоресценции остатков триптофана белков плазматических мембран в зависимости от дозы облучения. Результаты позволяют заключить, что облучение мембраны в дозах до IO3 Гр приводит к возрастанию структурной жесткости мем- бранных белков. Вместе с тем дальнейшее повышение дозы до IO4 Гр приводит к увеличению Ksv в среднем в 3,5 раза, что указывает на существенное снижение структурной жесткости белков. Тот факт, что величина /1 возрастает при увеличении дозы излучения, позволяет сде- лать вывод о том, что участки полипептидных цепей, погруженных в липидный бислой, становятся более доступными для АТФ. Очевидно, наблюдаемые изменения доступности остатков триптофана молекулам АТФ при воздействии ионизирующей радиации являются следствием изменения динамического состояния белковой глобулы, возможно, за счет изменения белок-липидных взаимодействий. P е з ю м е. Досліджено вплив АТФ та іонізуючого випромінювання на структуру плазматичних мембран тимоцитів за допомогою визначення анізотропії флюоресценції і гасіння флюоресценції залишків триптофану мембранних білків. Результати анізотро- пії флюоресценції триптофану дозволили встановити наявність двох ділянок зв'язу- вання АТФ на мембранних білках, знайдено константи зв'язування, число місць та енергію зв'язування. Показано зміну структури білків плазматичних мембран тимо- цитів при дії іонізуючого випромінювання. S u m m а г у. The effect of ATP and ionizing radiation on the structure thymocytes plasma membranes was studied. Using fluorescence quenching technique two plats for ATP binding on membrane proteins were located. The influence of ionizing radiation on plasma membranes thymocytes was shown. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Сунгуров Л. 10. Радиационная биология клеточной поверхности.— М. : ВИНИТИ, 1988.— 178 е.— (Сер. Радиац. биология; Т. 7). 2. Поливода Б. П., Конев В. В., Попов Г. /1. Биофизические аспекты радиационного поражения биомембран.— М. : Энергоатомиздат, 1990.— 160 с. 3. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии.— М. : Мир, 1986.— 496 с. 4. Демченко А. П. Люминесценция и динамика структуры белков.— Киев : Наук, дум- ка, 1988,—60 с. 5. Древаль В. И., Назаренко Η. Д. Связывание ионов кальция с плазматическими мембранами тимоцитов//Биол. науки.— 1991.— № 1.— С. 27—31. 6. Fomenko В. SDovgii L. E., Alzoev L. G. The effect of ionizing radiation on trypto- phan fluorescence of thymocyte and erythrocyte plasma m e m b r a n e s / / I n t . J. Radiat. Biol.— 1983.—'44, N 3.— P. 307—311. 7. Исследование равновесной динамики структуры белков клетки методом трипто- фановой фосфоресценции при комнатной температуре / В. М. Мажуль, С. В. Конев, 10. С. Ермолаев и др. / /Биофизика.— 1983.—28, № 6.—С. 980—983. 8. Мажуль В. M., Ермолаев Ю. С., Конев С. В. Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре — новый метод изучения структурного состояния биологи- ческих мембран и белков в клетке // Журн. прикл. спектроскопии.— 1980.— 32, .Nb 5,— С. 903—907. ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 1 6 — 1-744 81 ками, может быть применено для определения той части общей интен- сивности флюоресценции, которая связана с поверхностно локализован- ными остатками. Поэтому тушение флюоресценции анализировали, используя модифицированную форму уравнения Штерна — Фоль- мера [3J : (6) 9. Semisoinov G. V., Zikhertnan K., Kasatkin S. В. Polar ized luminescence and mobili ty of t ryp tophan residues in polypeptide c h a i n s / / B i o p o l y m e r s . — 1981.— 20, N 8.— P. 2287—2309. 10. Буриїтейн Э. А. Собственная люминесценция белка. Природа и применение.— M . : ВИНИТИ, 1977.— 190 е . - (Сер. Биофизика; Т. 7). 11. Эдсолл Дою., Гатфренд X. Биотермодинамика.—М. : Мир, 1986.— 195 с. 12. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты.—М. : Мир, 1982.—889 с. 13. Древаль В. И., Финашин А. В. Влияние периферических белков на активность Са 2 + -АТФазы плазматических м е м б р а н / / У к р . биохим. журн.— 1990.— 62, № 4 . — С. 87—89. Харьков, гос. ун-т Получено 15.03.91 УДК 577.113.6 И. Я. Дубсй, Т. В. Ляпина, Д. М. Федоряк ИССЛЕДОВАНИЕ ПОБОЧНЫХ РЕАКЦИЙ В СИНТЕЗЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК Н-ФОСФОНАТНЫМ МЕТОДОМ Изучены основные побочные реакции, сопутствующие межнуклеотидной конденсации в Н-фосфонатном методе олигонуклеотидного синтеза, и исследована их кинетика в присутствии ряда оснований. Найдены устойчивые модификации гетероциклических оснований пивалоилхлоридом. Показано, что ацилирование P—Н-свяэей приводит к расщеплению олигонуклеотидной цепи в местах, содержащих P—С-связи. Обнаружено, что скорость побочных реакций в несколько раз ниже в хинолине, чем в более основ- ном пиридине. Введение. Последние достижения генетической инженерии и биотехно- логии сопровождались и в значительной степени были обусловлены про- грессом в области химического синтеза фрагментов Д Н К . Доступность олигонуклеотидов заданной последовательности революционизировала биологические исследования на молекулярном уровне. Синтетические олигонуклеотиды используются в химико-ферментативном синтезе ге- нов, при секвенировании Д Н К , для направленного мутагенеза, как гиб- ридизационные зонды при выделении и клонировании генов и т. д.' [1, 2]. Таким образом, спектр применения синтетических фрагментов Д Н К весьма широк и потребность в них постоянно возрастает. В пос- леднее время все большее распространение получает Н-фосфонатный метод олигонуклеотидного синтеза [3, 4] , отличающийся простотой, вы- сокой скоростью и эффективностью (схема 1). Однако существенным 0 0 7 /U П 0 • Pix/гI и J2ZH2U II QO-P-O' + RtOH RO-P-OR' RO-P-OR' H y H 0" RRt-остатки нуклеозидоЬ; Piv- Me3C- СО —j Py-пиридин недостатком метода является протекание побочных реакций, вызыва- емых используемым для активации нуклеотидного компонента конден- сирующим реагентом, что ведет к значительному снижению эффектив- ности синтеза. Этому вопросу был посвящен ряд работ [5, 6], в кото- рых описаны основные типы побочных реакций, сопутствующих Н-фос- фонатной межнуклеотидной конденсации. В настоящей работе продол- жено изучение побочных процессов в присутствии пивалоилхлорида (PivCl) —основного конденсирующего реагента, применяемого в Н-фос- фонатном методе синтеза олигонуклеотидов. Материалы и методы. В работе использованы метилимидазол (MeIm), диметиламинопиридин (DMAP) , PivCl, 2, 6-лутидин («Fluka», Швейцария) , γ-пиколин, 2, 4, 6-коллидин, ацетонитрил для В Э Ж Х © И. я . ДУБЕЙ. Т. В. ЛЯПИНА, Д. М. ФЕДОРЯК, 1992 82 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 1 6 — 1-744 82

Влияние АТФ и ионизирующего излучения на структуру плазматических мембран

Репозитарії

Схожі ресурси