Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4
В соответствии с идеей «прививки» активного центра фермента на поверхность другого белка получен мутантный белок – лизоцим бактериофага Т4 с ожидаемыми заменами Аsp10→Ніs10, Аsn101→Аsp101, Аrg148→Ser148, предположительно имитирующими активный центр сериновой протеазы....
Gespeichert in:
| Datum: | 1989 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154287 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4 / В.В. Леонтьев, О.И. Грязнова, А.Т. Гудков // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 93-95. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-154287 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1542872019-06-16T01:30:13Z Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4 Леонтьев, В.В. Грязнова, О.И. Гудков, А.Т. Краткие сообщения В соответствии с идеей «прививки» активного центра фермента на поверхность другого белка получен мутантный белок – лизоцим бактериофага Т4 с ожидаемыми заменами Аsp10→Ніs10, Аsn101→Аsp101, Аrg148→Ser148, предположительно имитирующими активный центр сериновой протеазы. У відповідності до ідеї «щеплення» активного центра ферменту на поверхню іншого білка отримано мутантний білок – лізоцим бактеріофага Т4 з очікуваними замінами Аsp10 → Ніs10, Аsn101 → Аsp101, Аrg148 → Ser148, які, імовірно, імітують активний центр серинової протеази. Oligonucleotide site-directed mutagenesis of the lysozyme gene of phage T4 was used to carry out three amino acid substitutions. It has been suggested earlier that this can create an active site on the surface of the lysozyme molecule. Two vectors were constructed for expression of the mutant and wild type lysozyme genes. 1989 Article Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4 / В.В. Леонтьев, О.И. Грязнова, А.Т. Гудков // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 93-95. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00009B http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154287 547.963:577.213.3 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Краткие сообщения Краткие сообщения |
| spellingShingle |
Краткие сообщения Краткие сообщения Леонтьев, В.В. Грязнова, О.И. Гудков, А.Т. Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4 Биополимеры и клетка |
| description |
В соответствии с идеей «прививки» активного центра фермента на поверхность другого белка получен мутантный белок – лизоцим бактериофага Т4 с ожидаемыми заменами Аsp10→Ніs10, Аsn101→Аsp101, Аrg148→Ser148, предположительно имитирующими активный центр сериновой протеазы. |
| format |
Article |
| author |
Леонтьев, В.В. Грязнова, О.И. Гудков, А.Т. |
| author_facet |
Леонтьев, В.В. Грязнова, О.И. Гудков, А.Т. |
| author_sort |
Леонтьев, В.В. |
| title |
Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4 |
| title_short |
Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4 |
| title_full |
Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4 |
| title_fullStr |
Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4 |
| title_full_unstemmed |
Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4 |
| title_sort |
целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага т4 |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Краткие сообщения |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154287 |
| citation_txt |
Целенаправленный мутагенез и экспрессия мутантного гена лизоцима фага Т4 / В.В. Леонтьев, О.И. Грязнова, А.Т. Гудков // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 93-95. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT leontʹevvv celenapravlennyjmutageneziékspressiâmutantnogogenalizocimafagat4 AT grâznovaoi celenapravlennyjmutageneziékspressiâmutantnogogenalizocimafagat4 AT gudkovat celenapravlennyjmutageneziékspressiâmutantnogogenalizocimafagat4 |
| first_indexed |
2025-07-14T05:56:26Z |
| last_indexed |
2025-07-14T05:56:26Z |
| _version_ |
1837600695661887488 |
| fulltext |
4 Site directed mutagenesis and the role of the oxianion hole in subtilisin / P. Bryan,
M. W. Pantoliano, S. G. Quill et al. / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1986.—83,
N 11.—P. 3743—3745
5. Птицын, О. Б. Белок как отредактированный статистический сополимер / / Молеку-
ляр. биология.— 1984.—18, № 3.—С. 574—590.
6. Блюменфельд JI. А. Проблемы биологической физики.—М. : Наука, 1977—336 с.
7 .Leatherbarrow R. J., Fersht A. R. Protein engineering / / Protein Eng.— 1986—1,
N 1.—P. 7—16.
8. Конструирование белковых молекул / А. В. Финкелыитейн, Μ. П. Кирпичников,
О. Б. Птицын, К. Г. С к р я б и н / / В е с т . АН СССР.— 1988.—№ 1.—С. 102—111.
9 The protein bank. A computer-based archival file for macromolecular structures /
F. C. Bernstein, T. F. Koetzle, G. J. B. Williams et a l . / / E u r . J. Biochem.— 1977.—
80, N 2,—P. 319—324.
10. Crystal structures of E. coli and L. casei dihydrofolate r e d u c t a s e / J . T. Bolin,
D. J. Filman, D. A. Matthews et a l . / / J . Biol. Chem.— 1982.—257, N 27.—P. 13650—
13655.
11. Remington S. JTen Eyck L. F., Matthews Β. Ψ. Atomic coordinates for T4 phage
lysozyme/ /Biochem. and Biophys. Res. Communs.— 1977.—75, N 2.— P. 265—270.
Ин-т белка АН СССР, Пущино Получено 29.03.88
УДК 547.963:577.213.3
ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ
И ЭКСПРЕССИЯ МУТАНТНОГО ГЕНА ЛИЗОЦИМА ΦΑΓΑ Т4
В. В. Леонтьев, О. И. Грязнова, А. Т. Гудков
Введение. Метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза [1] открывает широкие
возможности для исследования принципов функционирования белков и в перспективе
создания новых белков с заданными свойствами.
В работе [2] теоретически рассматривается возможность «прививки» активного
центра сериновых протеаз на поверхность белковой глобулы. Анализ пространственной
структуры ряда белков показал, что одним из подходящих «носителей» привитого ак-
тивного центра может стать лизоцим бактериофага Т4 [2].
Для экспериментальной проверки такой возможности в гене этого белка нами
проведены нуклеотидные замены, изменяющие смысл кодонов для трех аминокислот
(Aspl0->Hisl0, AsnlOl-^Asp 101, Arg l48-^Ser l48) ; сконструированы плазмиды для
экспрессии мутантного белка и белка дикого типа.
Материалы и методы. В работе использованы штаммы Escherichia coli: JM101
(Macpro, thi, sup Ε, Ff traD36, pro AB, Iachi ΖΔΜ15), IMlOS (Macpro, thi, slrA, endA,
sbcB15, hsdR4, F' traD36, proAB, IacU, ΖΔΜ15), RZ1032 (HfrKL16, PO/45, IysA (61-62),
thi-1, relAl, SpoT 1, dut-1, ung-1, Zbd-279: :Tnl0), векторный бактериофаг M13mpl8.
Олигонуклеотиды синтезированы на автоматическом ДНК-синтезаторе «Gene Assemb-
ler» фирмы «Pharmacia» (Швеция), ферменты рестрикции и лигирования производства
НПО «Фермент» (Вильнюс). Ген лизоцима фага Т4 любезно предоставлен д-ром Тибо-
до (Сиэтл, США).
Общая схема работы представлена на рис. 1. Ген лизоцима, исходно встроенный
в бактериофаг λ 1358 [3], переклонирован в фаг М13тр18 по сайтам XbaI и HindIII.
Так был получен фаг МІЗеІ.
Кольцевую однонитевую Д Н К этого фага выделяли фенольной депротеинизацией
зрелых фаговых частиц [4], выращенных на штамме RZ1032. Выделенная из этого
штамма фаговая Д Н К содержит определенный процент замен T-^U, не приводящих
к изменению кодирующих функций, но делающих ее объектом интенсивной репарации
в обычных штаммах Е. coli [4]. Кольцевую Д Н К отжигали с двунитевой Д Н К роди-
тельского фага М13тр18, выделенной из обычного штамма и рестрицированной по
сайтам HindIII и SmaI, получая, таким образом, «дуплекс с брешью» [5]. Затем к
гену лизоцима с помощью гибридизации одновременно присоединяли три мутагенных
олигонуклеотида:
I (CTAAGACCTTCATCTATAC, Asp 10->His 10), II (GG A A AACC АТАТСААТС A ATGC,
Asn l0 l -^Asp lOl ) , III (CGTTGTAATGACTGATTTTGC, Argl48->Serl48) .
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № 1 93
Оставшиеся однонитевые участки заполняли с помощью фрагмента Кленова ДНК-по-
лимеразы I и лигировали [5].
Полученную таким образом кольцевую двунитевую ДНК очищали фильтрованием
через нитроцеллюлозные фильтры [6] и трансформировали в штамм JMlOL Одна из
двух цепей ДНК, а именно содержащая заме-
ны T->U, в большей степени становится объек-
том репарационных процессов in υίυο; выход
потомства другой (мутантной) цепи увеличи-
вается. Мутантные клоны отбирали путем гиб-
Рис. 1. Введение нуклеотидных замен в ген лизоцима бактериофага Т4 и создание
плазмид для экспрессии мутантного белка и белка дикого типа: в —ген лизоцима;
* — замены нуклеотидов; SmaI/EcoRV — сшивка «тупых» концов, образованных ре-
стриктазами SmaI и EcoRV
Fig. 1. Scheme of mutagenesis and expression vector construction for the lysozyme of
phage T4: e — lysozyme gene; ( * ) — c h a n g e d nucleotides; SmaI/EcoRV — ligation of
SmaI and EcoRV «blunt» ends
Рис. 2. Индукция синтеза мутантного лизоцима и лизоцима дикого типа. Клетки штам-
ма JM105, несущие плазмиды pKKeIII и pKKeIV, растили до оптической плотности 1 и
к среде добавляли изопропилтиогалактозид (0,002 %). Через 1 ч клетки осаждали, под-
вергали лизису в присутствии DS-Na и наносили аликвоты на форез: а — стандарты
молекулярной массы; б, в — клетки, несущие pKKeIII до и после индукции соответст-
венно; г — клетки, несущие pKKeIV после индукции. JI — лизоцим
Fig. 2. Induction of synthesis of the mutant and wild type lysozymes. Strain JM105
with pKKeIII and pKKeIV plasmids were grown until the optical density reached 1 and
then IPTG (0.002 %) was added. 1 hour later the cells were precipitated, lysed with
DS-Na with the subsequent electrophoresis: a — standards of molecular weight; б, в —
cells with pKKeIII before and after induction, respectively; г —cells with pKKeIV after
induction, л — lysozyme
ридизации их ДНК с 32Р-меченными олигонуклеотидами I—III на нитроцеллюлозных
фильтрах [7]. Эффективность мутагенеза по данным гибридизации составляла око-
ло 40 %.
Результаты и обсуждение. По результатам повторной гибридизации был отобран
клон МІЗеІІ, содержащий все три нуклеотидные замены. Для получения мутантного
белка в препаративных количествах на основе плазмиды рКК223-3 («Pharmacia») бы-
ла сконструирована плазмида pKKeIV. С помощью олигонуклеотида IV
(TATATTCATGATATCTCCTAAG) в Д Н К фага МІЗеІІ непосредственно перед иниции-
рующим кодом ATG гена лизоцима был введен сайт рестрикции для рестриктазы
EeoRV (GATATC) для отделения от гена нуклеотидной последовательности, фланки-
рующей его с 5'-конца. Эта последовательность, предположительно, играет негатив-
ную роль в трансляции мРНК лизоцима [8], что может понизить уровень экспрессии
94 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № 1 94
белка. В результате введения нового сайта рестрикции был получен фаг M13eIV.
Используя новый EcoRV-cam: и сайт рестрикции для рестриктазы HindIIIt ген лизо-
цима вырезали из фага МІЗеІУ и встраивали в плазмиду рКК223-3 по сайтам HindIII
и SmaI. Исходная плазмида содержит гибридный регулируемый /ас-промотор, а также
сигналы терминации транскрипции и последовательность Шайна — Дальгарно. В по-
лученной плазмиде эта последовательность отделена от инициирующего кодона лизо-
цима фрагментом Д Н К длиной 17 нуклеотидов. Аналогичным образом сайт рестрик-
ции для рестриктазы EcoRV был введен в Д Н К фага MlЗеї и получена плазмида
pKKeIII, содержащая ген лизоцима дикого типа.
Плазмидами pKKelll и pKKeIV трансформировали клетки штамма JM105 (рис. 2) .
Клоны, содержащие эти плазмиды, после индукции изопропилтиогалактозидом (1—2 ч)
продуцируют белок в количестве около 15 % общей массы белков клеточного лизата
(по результатам денситометрирования гелей, окрашенных Кумасси). В настоящее
время ведется работа по выделению мутантного белка и исследованию его фермента-
тивной активности и физико-химических характеристик.
SITE-DIRECTED MUTAGENESIS AND EXPRESSION
OF MUTATED LYSOZYME GENE OF PHAGE T4
V. V. Leont jev , О. I. Gryaznova, A. T. Gudkov
Institute of Protein Research,
Academy of Sciences of the USSR, Pushchino, Moscow Region
S u m m a r y
Oligonucleotide site-directed mutagenesis of the lysozyme gene of phage T4 was used
to carry out three amino acid substitutions. It has been suggested earlier that this can
create an active site on the surface of the lysozyme molecule. Two vectors were con-
structed for expression of the mutant and wild type lysozyme genes.
1. Leatherbarrow R. JFersht A. R. Protein engineering (review) / / P r o t e i n Eng.—
1986.—1, N 1.—P. 7—16.
2. Финкельштейн А. В. Можно ли привить белковой глобуле «чужой» активный
центр? / /Биополимеры и клетка.— 1989—5, № 1.— С. 89—93.
3. Owen J. E., Schulz D. W., Taylor A. Nucleotide sequence of the lysozyme gene of
bacteriophage T 4 / / J . Мої. Bio l— 1983.—165, N 2 .—P. 229—248.
4. Kunkel T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selecti-
o n / / P r o c . Nat. Acad. ScL USA.— 1985.—82, N 2 .—P. 488—492.
5. Cramer W., Schughart K., Fritz H.-J. Directed mutagenesis of DNA cloned in fila-
mentous phage. Influence of hemimethylated GATC sites on marker recovery from re-
striction f r a g m e n t / / N u c l . Acids Res.— 1982.—10, N 20.—P. 6475—6485.
6. Taylor J. W., Ott J., Eskstein F. The rapid generation of oligonucleotide-directed mu-
tations at high frequency using phosphothiolate-modified D N A / / I b i d . — 1985.—13,
N 24.— P. 8765—8785.
7. Zoller M. J., Smith M. Oligonucleotide-directed mutagenesis using Af/5-derived vectors:
an efficient general procedure for production of point mutation in any f ragment
D N A / / I b i d . — 1982.—10, N 20 .—P. 6487—6500.
8. Perry L. J., Heynecker H. L., Wetzel R. Non-toxic expression in Escherichia coli of
a plasmid-encoded gene for phage T4 l y s o z y m e / / G e n e . — 1985.—38, N 1/3 —
P. 259—264.
Ин-т белка АН СССР, Пущнно Получено 29.03.88
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № 1 95
|