Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением
Структурная динамика тетрамерного мелиттина в растворе и комплекса мелиттина с фосфолипидными мембранами изучалась методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Установлены существенные различия спектральных зависимостей среднего времени жизни триптофановой флюоресценции белка в раст...
Gespeichert in:
| Datum: | 1989 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154297 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением / А.С. Ладохин, Н.В. Лебедева, А.Ю. Чикишев // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 100-102. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-154297 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1542972019-06-16T01:29:41Z Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением Ладохин, А.С. Лебедева, Н.В. Чикишев, А.Ю. Краткие сообщения Структурная динамика тетрамерного мелиттина в растворе и комплекса мелиттина с фосфолипидными мембранами изучалась методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Установлены существенные различия спектральных зависимостей среднего времени жизни триптофановой флюоресценции белка в растворе и комплексе с липосомами. Структурну динаміку тетрамерного мелітину в розчині і комплексу мелітину з фосфоліпідними мембранами вивчали методом флуоресцентної спектроскопії з часовим розділенням. Встановлено істотні відмінності спектральних залежностей середнього часу життя триптофанової флуоресценції білка в розчині і комплексі з ліпосомами. Structural dynamics of tetrameric melittin in solution and of the melittin-phospholipid membrane complex was studied by time-resolved fluorescence spoctroscopy. Significant differences in the spectral dependences of the mean tryptophan fluorescence lifetime of protein in solution and in the complex with liposomes were established. 1989 Article Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением / А.С. Ладохин, Н.В. Лебедева, А.Ю. Чикишев // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 100-102. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00009D http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154297 577.32 ru Биополимеры и клетка Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Краткие сообщения Краткие сообщения |
| spellingShingle |
Краткие сообщения Краткие сообщения Ладохин, А.С. Лебедева, Н.В. Чикишев, А.Ю. Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением Биополимеры и клетка |
| description |
Структурная динамика тетрамерного мелиттина в растворе и комплекса мелиттина с фосфолипидными мембранами изучалась методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Установлены существенные различия спектральных зависимостей среднего времени жизни триптофановой флюоресценции белка в растворе и комплексе с липосомами. |
| format |
Article |
| author |
Ладохин, А.С. Лебедева, Н.В. Чикишев, А.Ю. |
| author_facet |
Ладохин, А.С. Лебедева, Н.В. Чикишев, А.Ю. |
| author_sort |
Ладохин, А.С. |
| title |
Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением |
| title_short |
Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением |
| title_full |
Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением |
| title_fullStr |
Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением |
| title_full_unstemmed |
Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением |
| title_sort |
изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Краткие сообщения |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/154297 |
| citation_txt |
Изучение мелиттин-мембранного комплекса методом флюоресцентной спектроскопии с временным разрешением / А.С. Ладохин, Н.В. Лебедева, А.Ю. Чикишев // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 100-102. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT ladohinas izučeniemelittinmembrannogokompleksametodomflûorescentnojspektroskopiisvremennymrazrešeniem AT lebedevanv izučeniemelittinmembrannogokompleksametodomflûorescentnojspektroskopiisvremennymrazrešeniem AT čikiševaû izučeniemelittinmembrannogokompleksametodomflûorescentnojspektroskopiisvremennymrazrešeniem |
| first_indexed |
2025-07-14T05:56:55Z |
| last_indexed |
2025-07-14T05:56:55Z |
| _version_ |
1837600726010822656 |
| fulltext |
УДК 577.32
ИЗУЧЕНИЕ МЕЛИТТИН-МЕМБРАННОГО КОМПЛЕКСА
МЕТОДОМ ФЛЮОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
С ВРЕМЕННЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ
А. С. Ладохин, Н. В. Лебедева, А. Ю. Чикишев
Бурный прогресс пикосекундной лазерной техники, наблюдаемый в последние годы,
открыл новые возможности в исследовании быстрой динамики биологических
объектов.
Настоящая работа посвящена изучению кинетики затухания собственной три-
птофановой флюоресценции мелиттина в водном растворе и в комплексе с фосфоли-
ишдными мембранами. Установлены существенные различия спектральных зависимос-
тей среднего времени жизни флюоресценции тетрамерной формы мелиттина в раство-
ре и мелиттина, встроенного в липосомы.
Мелиттин — основной компонент пчелиного яда — состоит из 26 аминокислотных
остатков и содержит единственный триптофанил (Тгр-19). В растворе мелиттин мо-
жет существовать в форме неупорядоченного мономера (при низкой ионной силе) и
в виде высокоспиральной упорядоченной тетрамерной структуры (при высокой ион-
ной силе) [1]. Стационарный спектр флюоресценции и количество α-спиралей у тет-
рамерного мелиттина в растворе и белка, встроенного в мембрану, близки [2].
Мелиттин получали согласно [3]. Липосомы из димиристоилфосфатидилхолина
(ДМФХ) готовили озвучиванием. Работали в 50 мМ трис-НС1-буфере, рН 7,4, со-
держащем 2 M NaCl. Флюоресценцию регистрировали с помощью пикосекундного
лазерного спектрофлюориметра, работающего в режиме однофотонного счета. Под-
робно экспериментальная установка описана в [4]. Длина волны возбуждения со-
ставляла 266 нм, полуширина аппаратной функции ~ 0 , 3 не. Кинетика затухания
флюоресценции описывалась по биэкспоненциальному закону (интенсивность (время,
0 ~ A 1 е х р ( — t / т і ) + A 2 е х р ( — t / T 2 ) ) . Параметры такого описания для тетрамерного ме-
литтина в растворе и в комплексе с липидом приведены в таблице. Из этих данных
следует, что затухание флюоресценции во всех случаях существенно немоноэкспонен-
циально. Этому противоречат данные Георгиоу и др. [5], что может быть связано
с более низкими характеристиками спектрального и временного разрешения применя-
емой этими авторами установки. Причины такой немоноэкспоненциальности могут
быть различными: структурная гетерогенность, наносекундные перестройки окруже-
ния хромофоров и т. д. В связи с этим весьма непросто, если возможно, приписывать
какой-либо физический смысл быстрой и медленной компонентам затухания, и в
дальнейшем мы будем оперировать средним временем жизни флюоресценции, опре-
деляемом следующим образом:
^ A 1 X 2 + A2X2
2
A1X1+ A2τ2 '
На рисунке приведены зависимости <т> от длины волны регистрации излучения
Яет для тетрамерного мелиттина в растворе и в комплексе с липосомами (темпера-
Параметры затухания собственной флюоресценции мелиттина
Fluoroscence decay parameters of melittin as a function of emission wavelength
Длина волны регистрации излучения X e m , нм
Мелиттин Параметр
310 330 350 370
Тетрамер, 2М
NaCl, 40 °С
T1, HC
X2, HC
A1IA2
2,61
0,86
0,28
3,16
1,11
0,23
4,45
1,40
0,14
4,97
1,37
0,18
Комплекс с ДМФХ-липосомами, T1, HC 4,46 4,04 5,20 6,50
R* = 2 0 0 , 2 M NaCl, 29 °С T2 , HC 1Д6 1,20 1,22 1,33
A1ZAt 0,34 0,15 0,11 0,13
* Ri — молярное отношение липид/белок.
100 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № 1
На рисунке приведены зависимости <τ> от длины волны регистрации излучения
Яет для тетрамерного мелиттина в растворе и в комплексе с липосомами (темпера-
тура выше температуры фазового перехода в липиде). Видно, что характер этих
зависимостей принципиально различен. Для тетрамера в растворе характерно моно-
тонное возрастание <τ> с увеличением Хеш. Этот эффект может объясняться прояв-
лением наносекундной дипольно-ориентадионной релаксации окружения триптофани-
лов, наличие которой установлено как стационарными [3],
так и кинетическими [6] спектроскопическими методами.
Напротив, для мелиттина, встроенного в мембрану, зави-
симость <τ> от Xem имеет явно выраженный минимум при
335 нм. Возможное объяснение такой зависимости может
быть следующим. Структура мелиттин-мембранного комп-
Спектральная зависимость среднего времени жизни флюо-
ресценции <τ> для тетрамерного мелиттина в растворе и
комплекса мелиттина с ДМФХ-липосомами (светлые и
темные кружки соответственно)
Spectral dependence of the mean fluorescene lifetime <t> for
tetrameric melittin in solution <0> and bound to liposo-
mes < · >
лекса гетерогенна (что подтверждается данными по тушению флюоресценции иоди-
дом [7]) :
— возрастание <τ> на длинноволновом краю спектра определяется дипольно-
ориентационной релаксацией окружения триптофанилов, локализованных в более по-
лярной области (аналогично тетрамеру в растворе);
— триптофанилы, локализованные во внутренней неполярной области, имеют бо-
лее коротковолновое излучение и меньшую безызлучательную дезактивацию (т. е.
большое время жизни). Фотоотбор этого класса хромофоров и приводит к увеличе-
нию среднего времени <τ> на коротковолновом краю спектра.
Полученные результаты свидетельствуют о принципиальном различии кинети-
ческих флюоресцентных параметров, а, следовательно, и структурно-динамической ор-
ганизации тетрамерного мелиттина в растворе и комплекса мелиттина с мембраной.
Выявление этих различий стало возможным благодаря уникальному пикосекундному
лазерному спектрофлюориметру, сочетающему высокое временное разрешение с удоб-
ным для белковой спектроскопии возбуждением (266 нм).
Авторы глубоко признательны Е. Г. Костржевской и Г. А. Корнейчук, без по-
мощи которых эта работа была бы невозможна.
STUDY OF MELITTIN-MEMBRANE COMPLEX
BY TIME-RESOLVED FLUORESCENCE SPECTROSCOPY
A. S. Ladokhin, Ν. V. Lebedeva, A. Yu. Chikishev
Α. V. Palladin Institute of Biochemistry,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
Μ. V. Lomonosov State University, Moscow
S u m m a r y
Structural dynamics of tetrameric melittin in solution and of the melittin-phospholipid
membrane complex was studied by time-resolved fluorescence spoctroscopy. Signifi-
cant differences in the spectral dependences of the mean tryptophan fluorescence life-
time of protein in solution and in the complex with liposomes were established.
{.Conformational change and self-association of monomeric m e l i t t i n / J . C. Talbot,
J. Dufourcq, J. de Bony et a l . / / F E B S Lett.— 1979.—102, N 1.—P. 191—193.
2. Демченко А. П., Костржевская E. Г. Мелиттин: структура, свойства, взаимодейст-
вие с м е м б р а н о й / / У к р . биохим. журн.— 1986—58, JMb 5 — С . 92—103.
3. Структурно-динамические свойства окружения триптофанового остатка в мелитти-
н е / А . П. Демченко, А. С. Ладохин, Е. Г. Костржевская, Т. Л. Д и б р о в а / / М о л е -
куляр. биология.— 1987.—21, JMb 3.—С. 663—671.
4. Лазерный субнаносекундный флюоресцентный спектрометр со счетом одиночных
фотонов / В . Ф. Камалов, А. П. Разживин, Б. Н. Толеутаев и д р . / / К в а н т о в а я
электроника.— 1987.—14, JMb 6.—С. 1303—1308.
101 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № 1
5 Georghioa S., Thompson M., Mukhopadhyay А. К. Melittin-phospholipid interaction
studied by employing the single t ryptophan residue as an intrinsic f luorescent pro-
b e / / B i o c h i m . et biophys. acta.— 1982.—688, N 2 .—P. 441—452.
6 Каналов B. Φ., JIadoxun А. С., Толеутаев Б. Н. Наносекундная внутримолекуляр-
н а я динамика м е л и т т и н а / / Д о к л . АН СССР.— 1987 . -296 , № 3.—С. 7 4 2 - 7 4 5 .
7. Ладохін О. СКостржевська О. Г., Демченко О. П. Взаємодія меліттіну з фосфо-
ліпїдним бішаром. «Поверхнева» і «внутрішня» форми б і л к а / / Д о п . AH УРСР.—
1988.—№ 11.—С. 65—68.
Ин-т биохимии им. А. В. Палладина АН УССР, Киев Получено 20.06.8Я
МГУ им. М. В. Ломоносова
УДК 577.113.4
МЕТИЛФОСФОНАТНЫЕ АЛКИЛИРУЮЩИЕ
ПРОИЗВОДНЫЕ ОКТАТИМИДИЛАТА
Н. В. Амирханов, В. Ф. Зарытова
Серьезным недостатком олигонуклеотидов с природной фосфодиэфирной связью и их
реакционноспособных производных, используемых для направленного воздействия на
генетический аппарат клетки [1, 2], является их плохое проникновение через цито-
плазматические мембраны и подверженность гидролизу клеточными нуклеазами [3].
Более перспективным с этой точки зрения является использование неионных анало-
гов олигонуклеотидов, особенно метилфосфонатных [3—9]. Однако реакционноспо-
собные производные последних не были получены и их свойства не исследовались.
Поскольку введение метилфосфонатных группировок в олигонуклеотид приводит к
образованию смеси диастереомеров, способных образовывать комплементарные комп-
лексы различной стабильности [7, 8], то изучение влияния таких группировок на ре-
акционную способность аналогов необходимо проводить на индивидуальных изомерах.
Из реакционноспособных аналогов олигонуклеотидов наиболее широко изучены алки-
лирующие, содержащие остаток 4-[(Н-2-хлорэтил, N-метил) амино] бензиламина
(ClRCH2NH-), производные.
Целью данной работы было получение индивидуальных диастереомеров алкили-
рующих (содержащих СЩСН2КН-остаток) производных октатимидилата, включаю-
щих три чередующиеся метилфосфонатные группировки, и исследование свойств по-
лученных аналогов.
Нами были получены пять октатимидилатных производных: (Tp)8Ri (I) ;
TP(TPTP)3TPR1 (П) ; T p H W b T p R l ( I I I ) ; T p n W b T p R 1 (IV) HTp(Tp) 6 TpR 1 (V)
(где R 1 = a) - S C H 3 , б) — О Н , в) - N H C H 2 R C l ; ρ — фосфодиэфирный остаток,
ρ — метилфосфонатный остаток), исходя из полностью защищенных динуклеотидов:
(MeO)2TrTp (SCH 3 )Tp (SCH3 , CNEt) (VI), (MeO)2TrTp (CH3)Tp (SCH3 , CNEt) (VII) ,
(MeO) 2 TrTp ' (CH 3 )Tp(SCH 3 , CNEt) (Vi la ) , (MeO) 2 TrTp"(CH 3 )Tp(SCH 3 , CNEt) (VII6) ,
(MeO)2TrTp (SCH3) Tp (CH3, CNEt) (VIII) и (MeO)2TrTp (CH3) Tp (CH3, CNEt) (IX).
Динуклеотиды были синтезированы по обычной триэфирной схеме [10] с использо-
ванием в качестве конденсирующего реагента смеси TPS (0,3 Μ) и MeIm (0,6 Μ)
в абсолютном пиридине (20 °С, 30—60 мин) при 0,1 M концентрациях нуклеозидного
и нуклеотидного компонентов. Полученные динуклеотиды выделены хроматографией
на силикагеле. Динуклеотид (VII) , содержащий два асимметричных атома фосфора
и соответственно четыре изомера с помощью препаративной силикагельной хромато-
графии разделяли на два продукта, которые обозначены как р ' ( ( V i l a ) ,
R(MeO)2TrT = 0 , 8 2 ; 3 1 P-HMP; 6 = 32,2; 30,2; 30,0 м. д.) и р " ( (VII6) , R (MeO) т г т = 0 , 7 2 ;
С о к р а щ е н и я : (MeO)2Тг — п, /г'-диметокситритил; CNEt — 2-цианэтил; TPS —
2,4,6-триизопропилбензольсульфохлорид; MeIm-N-метилимидазол ; TEA — триэтиламин;
(PyS) 2 2,2'-дипиридилдисульфид; R C i - C 6 H 4 N - ( C H 3 ) C H 2 C H 2 C I ; р ' и р" — энантио-
мерные конфигурации заместителей при атоме фосфора (см. в тексте). Символ d в обо-
значениях нуклеотидов опущен, так как использовались только нуклеотиды дезоксиряда.
102 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № 1
|